Dasar Teori Peroksidasi Lipid PDF

# Dasar Teori - Tubuh memproduksi radikal bebas oksigen melalui jalur enzimatis dan non enzimatis. - Radikal ini mampu menyerang asam lemak tak jenuh pada membran sel biologis sehingga menyebabkan peristiwa peroksidasi lipid dan menghasilkan lipid peroksida diantaranya adalah kelompok aldehyde (MDA)...

# Dasar Teori - Tubuh memproduksi radikal bebas oksigen melalui jalur enzimatis dan non enzimatis. - Radikal ini mampu menyerang asam lemak tak jenuh pada membran sel biologis sehingga menyebabkan peristiwa peroksidasi lipid dan menghasilkan lipid peroksida diantaranya adalah kelompok aldehyde (MDA), keto Hydroksil, karbonil dll. - Malondialdehyde (MDA) yang ditemukan dalam tubuh berasal dari dua sumber: makanan yang dikonsumsi dan peroksidasi lipid yang terjadi dalam jaringan. - Pembentukan MDA dan skala serta laju oksidasi lipid dalam jaringan organisme hidup dipengaruhi oleh beberapa faktor endogen dan eksogen. - MDA dihasilkan dalam proses peroksidasi asam lemak tak jenuh ganda yang ada dalam fosfolipid membran, menunjukkan reaktivitas tinggi terhadap protein dan asam nukleat. - Dari daerah pembentukannya, mampu menembus dengan mudah ke jaringan lebih jauh dan karena kemampuan untuk membentuk ikatan kovalen menyebabkan dapat mengubah struktur dan sifatnya. # Perubahan yang dihasilkan dalam sifat-sifat sel membran menyebabkan - hilangnya integritas. - Hal ini dapat mengarah pada gangguan fungsi dan hasil yang tepat dalam disfungsi organ individu. # Dampak biologis dari peroksidasi lipid lain misalnya: - hilangnya potensi proliferasi sel, - perubahan ekspresi gen, - mutasi, - heterogenitas molekuler, - gangguan komunikasi antar sel, - dan disfungsi organ. - Disamping itu bisa juga menghambat enzim yang terkait dengan pertahanan sel melawan stres oksidatif. - Hal ini menyebabkan oksidatif yang lebih besar berdampak pada kerusakan sel-sel. - Akumulasi kerusakan ini dapat mengubah metabolisme sel, yang mengarah ke kehilangan integritasnya, menganggu hidrofobisitas lipid interior, dan struktur membran lapis ganda terganggu. - Peroksidasi lipid tidak hanya yang terjadi proses berkontribusi pada pengembangan banyak penyakit, tetapi mereka juga merupakan bagian dari proses penuaan. # Tubuh mempertahankan diri sampai batas tertentu terhadap efek radikal bebas dengan menjebak/menangkap dan menetralisirnya. - System tubuh yang menetralisir radikal bebas diantaranya adalah antioksidan. - Sumber utama antioksidan adalah produk makanan yang berasal dari tumbuhan. - Gaya hidup, komponen di antaranya adalah pola makan dan aktivitas fisik, merupakan elemen penting dalam menjaga kesehatan. - Kebiasaan diet dan diet kaya antioksidan merupakan faktor yang dapat dimodifikasi yang tidak hanya mencegah penyakit terkait usia, tetapi juga menunda proses penuaan. # MDA merupakan produk yang stabil sehingga,_pengukuran jumlah MDA dapat menggambarkan tingkat peroksidasi lipid dan juga menggambarkan tingkat kerusakan sel secara langsung. - Konsentrasi MDA dalam serum dianggap menjadi ukuran peroksidasi lipid. - Peningkatan kadar MDA terlihat pada plasma dan serum darah pasien dengan status pre kanker dan kanker payudara, paru, ovarium, thyroid, dan mulut. - Peningkatan Kadar MDA pada pasien berkorelasi dengan tingkatan phase cancer paru. - Kadar MDA salivaris lebih tinggi secara signifikan terdapat pada pasien karsinoma sel squamosal dan pasien pre kanker. # Peroksidasi lipid adalah degradasi lipid yang terjadi sebagai akibat dari kerusakan oksidatif dan merupakan penanda yang berguna untuk stres oksidatif. - Lipid tak jenuh ganda rentan terhadap serangan oksidatif, biasanya oleh spesies oksigen reaktif, menghasilkan reaksi berantai yang jelas dengan produksi produk akhir seperti malondialdehid (MDA). - Peroksidasi lipid dapat berkontribusi pada patologi banyak penyakit termasuk aterosklerosis, diabetes, dan Alzheimer. - Peroksidasi lipid ditentukan oleh reaksi MDA dengan asam tiobarbiturat (TBA) untuk membentuk produk kolorimetri (532 nm)/ fluorometrik (ex = 532/xem = 553 nm), sebanding dengan MDA yang ada. # Petunjuk Pelaksanaan ## Alat - Pipet 10,200ul, pipet tip, stir bar, tabung mikrosentrifugasi poliprolena, semi-mikrokuvet, spektrofoometer, vortex, magnetic stirrer, water bath, tabung reaksi ## Bahan - 2-thiobarbiturat acid, asam asetat glacial, natrium hidroksida, malondialdehida bis dan aquabides (0.9% NaCl) or PBS (0.01 M, pH 7.4), Absolute ethanol # Cara Kerja - Komponen bahan dan penyimpanan | Nomor Reagen | Keterangan | Volume dan Penyimpanan | |---|---|---| | Reagen 1 | Klarifikan | 24 mL, 2-8°C; 6 bulan | | Reagen 2 | Reagen asam | 12 ml, 2-8°C; 6 bulan | | Reagen 3 | Serbuk agen chromatogenic | 2 vials; 2-8°C ; 6 bulan, botol gelap | | Reagen 4 | Lar. Standart 10 nmol/mL | 5mL, 2-8°C; 6 bulan | - Reagen harus disimpan sesuai dengan petunjuk ## Persiapan reagen 1. Reagen 1 akan mengeras saat cuaca dingin, harap hangatkan 37° penangas air sampai cairan berubah menjadi transparan sebelum percobaan. 2. Larutan reagen 2 - Encerkan reagen 2 dengan aquabidest dengan perbandingan 1,2:34 dan aduk rata. 3. Larutan reagen 3 (agen kromogenik) - Larutkan botol bubuk dengah 30 mL aquabidest 9(0° ~100°), lalu tambahkan 30 mL asam asetat glasial, aduk rata dan dinginkan hingga suhu kamar. - Larutan yang disiapkan dapat disimpan pada 2-8° C dengan botol gelap selama 1 bulan. ## Persiapan sampel - Sampel harus disiapkan. Sampel dapat berupa serum atau plasma. ## Pengenceran sampel - Disarankan untuk mengambil 2~3 sampel dengan perbedaan besar yang diharapkan untuk dilakukan pra-eksperimen sebelum eksperimen formal dan encerkan sampel sesuai dengan hasil pra-eksperimen dan rentang deteksi (0,38-133,33 nmol/ml). ## Langkah-langkah penggerjaan: 1. **Tabung kosong:** Ambil 0,1* mL etanol absolut ke dalam tabung (blanko) reaksi kaca 10 mL. 2. **Tabung standar:** Ambil 0,1* mL dari 10 nmol/mL Standar ke dalam gelas uji kaca 10 mL tabung. 3. **Tabung sampel:** Ambil 0,1* mL Sampel yang diuji ke dalam gelas uji 10 mL. 4. **Tabung kontrol:** Ambil 0,1* mL Sampel yang diuji ke dalam gelas uji 10 mL. 5. Tambahkan 0,1* mL reagen 1 ke dalam setiap tabung Langkah 1. 6. Tambahkan 3 mL larutan aplikasi reagen 2 ke dalam masing-masing tabung Langkah 2. 7. Tambahkan 1 mL larutan reagen 3 aplikasi ke dalam tabung blanko, tabung standar, tabung sampel, tambahkan 1 mL asam asetat glasial 50% ke dalam tabung kontrol. 8. Campur sepenuhnya dan tutup tabung dengan film plastik, tusuk lubang kecil dengan jarum. Kemudian inkubasi tabung pada 95-100°C selama 40 menit. 9. Dinginkan tabung hingga suhu kamar dengan air mengalir, sentrifus tabung pada 3100 g selama 10 menit. 10. Ambil 3 mL supernatan masing-masing tabung. Atur spektrofotometer ke nol dengan air suling ganda dan mengukur nilai OD pada 532 nm dengan 1 cm kuvet jalur optik (presipitasi tidak dapat ditambahkan ke kuvet). ## KETERANGAN : 1. 0,1\* mewakili volume sampel, standar, etanol absolut dan reagen 1, mereka adalah sama. - Misalnya, volume pengambilan sampel adalah 0,1 mL, volume standar, absolut etanol dan reagen 1 adalah 0,1 mL untuk masing-masing. - Jika volume pengambilan sampel adalah 0,2 mL, volume standar, etanol absolut dan reagen 1 adalah 0,2 mL untuk masing-masing. 2. Secara umum, 1-2 tabung standar dan blanko dibuat untuk setiap batch. - Jika sampel serum (plasma) tidak ada hemolisis atau lipidemia, tabung kontrol dapat dilepas, hanya perlu membuat tabung kosong. 3. Volume pengambilan sampel referensi: - Serum (plasma): 0,1-0,2 mL, - Suspensi lipoprotein densitas rendah: 0,1-0,2 mL, - Jaringan hati, miokardium, jaringan otot: 5% atau 10% jaringan homogen, 0,1-0,2 mL. # Tabel Pencampuran | | blangko | Standart | Sampel | kontrol | |---|---|---|---|---| | Etanol absolute (mL) | 0.1 | 0.1 | | | | 10 nmol/mL Standar (mL) | | 0.1 | | | | Sampel (mL) | | | 0.1 | 0.1 | | Reagen 1 (mL) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | | Larutan aplikasi reagen 2 (mL) | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | | Larutan aplikasi reagen 3 (mL) | 1.0 | 1.0 | 1.0 | | | 50% asam asetat glasial (mL) | | | | 1.0 | ## Campur sepenuhnya dan kencangkan mulut tabung dengan film plastik, tusuk lubang kecil dengan sebuah jarum. Kemudian inkubasi tabung pada 95-100° C selama 40 menit. Dinginkan tabung untuk suhu kamar dengan air mengalir, sentrifus tabung pada 3100 g selama 10 menit. ## Ambil 3 mL supernatan masing-masing tabung. Atur spektrofotometer ke nol dengan air suling ganda dan ukur nilai OD pada 532 nm dengan jalur optik 1 cm kuvet (presipitasi tidak dapat ditambahkan ke kuvet). # Perhitungan - Untuk serum dan plasma= Kadar MDA Plasma = $ \frac{ A 1 }{ A 2 } $ x C x f (nmol/mL) ## Catatan: - A1: ODSample - ODControl - A2: ODStandar - ODBlank - c: Konsentrasi standar, 10 nmol/mL. - f: Faktor pengenceran sampel sebelum diuji. ## Catatan 1. Kit ini hanya untuk penelitian. 2. Instruksi harus diikuti dengan ketat, perubahan operasi dapat mengakibatkan hasil yang tidak dapat diandalkan. 3. Masa berlaku kit adalah 6 bulan. 4. Jangan gunakan komponen dari kumpulan kit yang berbeda.