Fisiologia e Trasduzione - Appunti PDF

Fisiologia e Trasduzione – Lezione 1 – 10/10/22 Sbobinatore: Matilde Picchi PRINCIPI GENERALI L’evoluzione degli organismi multicellulari dipende dalla capacità delle cellu...

Fisiologia e Trasduzione – Lezione 1 – 10/10/22 Sbobinatore: Matilde Picchi PRINCIPI GENERALI L’evoluzione degli organismi multicellulari dipende dalla capacità delle cellule di comunicare una con l’altra. La comunicazione intercellulare regola lo sviluppo dei tessuti, controlla la crescita e la divisione e la sopravvivenza cellulare, coordina le diverse attività cellulari. Negli animali e nelle piante superiori la comunicazione intercellulare è più complessa, in quanto molti geni sono coinvolti nel suo controllo. È un fenomeno che invece non riguarda gli organismi unicellulari che comunicano con altre metodiche. Interessa tutti gli esseri viventi multicellulari, in quanto la comunicazione è una garanzia che si trova alla base dello sviluppo dei tessuti. Controlla eventi di fenomeni che vanno dalla crescita, alla proliferazione, all’apoptosi, alla necrosi, alla sopravvivenza della cellula, e a tutte le attività che la cellula ha da mettere in essere. La comunicazione intercellulare è direttamente proporzionale alla complessità dell’organismo. I geni coinvolti nel sostenere la comunicazione tra le cellule non sono ancora stati scoperti completamente (aver codificato l’intero genoma non vuol dire conoscere la funzione di tutti i geni). Questo fenomeno è talmente complesso che il controllo, ad oggi, è solo in parte conosciuto. La sequenza che porta ad una risposta cellulare parte da un segnale che viene ricevuto, amplificato e poi trasdotto; si passa quindi tappa dopo tappa all’impiego di strumenti e linguaggi diversi da parte delle cellule che portano ad una riposta cellulare. Noi analizzeremo uno alla volta queste tappe. La risposta cellulare che le cellule danno, a sua volta va ad influenzare il fenomeno della segnaletica, della recezione e della trasduzione. È un circolo vizioso. * Foto riguarda tutte le cellule (adulte e staminali) Le cellule rispondono ai segnali per sopravvivere, differenziarsi, dividersi, morire. Questi segnali si chiamano segnali extracellulari multipli, in quanto sono tanti e ancora non del tutto conosciuti, inoltre i fenomeni si adattano a circostanze diverse: una cellula abituata a rispondere ad alcuni segnali non è detto che non debba cimentarsi a rispondere ad altri segnali nel corso della sua vita, per questo si parla di sistema dinamico. Quest’ultimo è caratteristico dell’organismo umano (nostro principale oggetto di studio), delle piante superiori, degli animali. L’informazione può essere più o meno spinta sia in senso positivo che in senso negativo (diversi L’informazione deve essere convertita: il segnale arriva alla cellula bersaglio che lo recepisce, integra e amplifica e poi lo converte. Per cui qualsiasi segnale esterno dà una reazione alla cellula che non differisce con il segnale di partenza da un punto di - vista chimico, strutturale etc. segnale deve imbuto essere quando non serve più 1  CLASSIFICAZIONE DELLE SEGNALAZIONI Le classificazioni possono essere: - Molto specifiche: è presente una complementarità tra segnale e recettore; - Estremamente sensibili: i recettori hanno un’alta affinità nei confronti delle molecole segnale, per cui la cellula è predisposta a percepire nel microambiente piccole modifiche a partire da qualsiasi potenza di segnale, che sia forte o flebile. L’alta affinità permette alla cellula di non rimanere legata in modo permanente al segnale. Per cooperatività si intende che più volte una molecola si lega al recettore più l’interazione sarà facilitata. Sono capaci di amplificare il segnale I segnali possono essere di vario tipo: 1. Endocrino: produzione e secrezione di molecole nel torrente circolatorio da parte di una ghiandola endocrina. Es. Glucagone Il signaling endocrino è a distanza: i bersagli sono distanti dal punto di origine della secrezione del segnale. 2. Paracrino: la cellula secerne dei segnali che vengono recepiti da una cellula bersaglio adiacente. Fa parte di questo tipo di segnale il signaling sinaptico: il neurotrasmettitore viene rilasciato a livello di una sinapsi, dove la cellula bersaglio viene stimolata da una cellula vicina che ha rilasciato il neurotrasmettitore; è un signaling locale, in quanto la cellula che produce e quella che riceve sono vicine. 3. Autocrino: i siti bersaglio sono sulla stessa cellula che produce il segnale, le molecole vengono rilasciate e recepite dalla stessa cellula che espone i recettori. 4. Signaling attraverso proteine attaccate alla membrana plasmatica: la cellula segnale espone un ligando proteico – non un fattore solubile (acquoso) – attaccato alla membrana plasmatica. Successivamente una cellula bersaglio adiacente esporrà un recettore in modo appropriato; questa interazione permetterà il passaggio del segnale. COMUNICAZIONE La comunicazione può avvenire: 1. Tramite comunicazione diretta attraverso giunzioni comunicanti: in questo caso la connessione tra cellula che produce e cellula che riceve fa in modo che non ci sia un intermedio rappresentato dallo spazio interstiziale. Sono coinvolte delle proteine transmembrana, le connessine, che creano un canale proteico attraverso il quale viaggiano ioni, molecole più complesse, aminoacidi, cAMP… dal citoplasma di una cellula a quello di un’altra. 2  2. Tramite messaggeri chimici: il messaggero chimico è un segnale solubile che viene sciolto nel microambiente cellulare. È presente una cellula che produce e cellula che riceve. La cellula bersaglio risponderà influenzata da alcune circostanze: w o Numero di recettori attivati dal ligando: la cellula bersaglio può avere tanti o pochi recettori. Questo fa si che Alcuni di questi vengono attivati dalla presenza del messaggero chimico stesso. > - o Concentrazione del ligando (diverso dalla quantità) nei confronti del recettore che risente della concentrazione. Da un punto di vista medico, nel pensare allo sviluppo di farmaci o di terapie mirate verso una cellula che può cambiare il suo comportamento in condizioni fisiopatologiche, bisogna tener conto se i recettori sono recettori attivi o meno, se sono capaci di rispondere ad una certa concentrazione molecolare… Cellule differenti possono rispondere diversamente allo stesso segnale. Una stessa molecola non produce gli stessi effetti in tutte le cellule. L’acetilcolina è un neurotrasmettitore (acetilCoA + colina, derivato amminoacidico di biosintesi nelle giunzioni sinaptiche). A livello miocardico Ach + recettore induce una frequenza e una forza di contrazione ridotta. L’interazione dell’Ach con il recettore delle ghiandole salivari implica invece l’aumento della secrezione di queste cellule ghiandolari. L’interazione con una cellula muscolare scheletrica porta ad un certo tipo di contrazione. Una cellula è dotata di un corredo di recettori diversi capaci di rispondere all’esigenza di sopravvivere, dividersi, differenziarsi e morire. Una proteina può essere subito esposta, subire modificazioni post- traduzionali o contenuta in vescicole per poi essere liberata al momento opportuno (ex GLUT). CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DI MESSAGGERI CHIMICI Messaggero paracrino: sostanza chimica secreta da una cellula per agire su cellule presenti nelle sue immediate vicinanze. Messaggero autocrino: la molecola segnale agisce sulla stessa cellula che l’ha secreta. Molte cellule tumorali presentano una iperproduzione non controllata di fattori di crescita che stimolano l’accrescimento delle cellule tumorali stesse. Questi due tipi di messaggero raggiungono il loro bersaglio per diffusione, attraverso il liquido interstiziale (fattori di crescita, di coagulazione, istamina, citochine…). Sono tutte proteine e vengono prodotte dai ribosomi del RER. > - Raggiungono la maturazione non nella sede di produzione Neurotrasmettitori: vengono rilasciati dal terminale assonico dei neuroni nello spazio sinaptico e rappresentano il tramite chimico mediante il quale si realizza la comunicazione sinaptica. La cellula che libera il neurotrasmettitore è detta neurone presinaptico, mentre la cellula bersaglio è definita cellula postsinaptica (altro neurone o cellula muscolare). Ormoni: esistono ormoni idrofili e lipofili, d vengono rilasciati dalle ghiandole endocrine Lontane dalle cellule bersaglio - Hanno bisogno del corrente circolatorio nel liquido interstiziale e da qui diffondono nel sangue. Attraverso la circolazione sanguigna gli ormoni raggiungono le rispettive cellule bersaglio, che possono essere localizzate anche a notevole distanza dal punto di secrezione. Il circolo ematico distribuisce gli ormoni virtualmente in tutti i tessuti dell’organismo, ma solo le cellule dotate del recettore specifico per un dato ormone sono capaci di rispondere ad esso. Neurormoni: vengono secreti da neuroni con meccanismo simile a quello del rilascio dei neurotrasmettitori. Al pari degli ormoni, vengono 3  rilasciati nel liquido interstiziale e da qui diffondono nel sangue, attraverso cui raggiungono le relative cellule bersaglio. etico Ripasso codice gen.it/ himica-online https://www.c genetico.htm ce- biologia/codi CLASSIFICAZIONE CHIMICA DEI MESSAGGERI Più piccolo Messaggeri amminoacidici: sono degli aminoacidi (Glu, Asp, Gly) o di derivazione amminoacidica (GABA) che funzionano da neurotrasmettitori e vengono sintetizzati dai neuroni. Glutammato, aspartato e glicina sono degli alfa-aminoacidi, ovvero sono impiegati per la sintesi delle proteine. Il GABA invece è un gamma-aminoacido, in quanto viene sintetizzato a partire dal glutammato. Messaggeri amminici: le ammine sono messaggeri chimici derivati dagli aminoacidi. Prendono questo nome perché contengono un gruppo amminico (NH2). Anche gli aminoacidi sono quindi importantissime molecole di segnalazione, in quanto sono precursori di molecole segnale: esistono infatti metabolismi specifici per la biosintesi e la trasformazione degli alfa-aminoacidi in molecole segnale. La funzione degli aminoacidi non è solo la sintesi proteica. La tirosina viene legata nel contesto degli ormoni tiroidei alla tireoglobulina, va incontro ad un processo di iodinazione producendo due molecole che poi si accoppiano a formare i due ormoni tiroidei: T3 e T4. Le reazioni di questo processo sono catalizzate da enzimi ben specifici, dove un loro malfunzionamento compromette la segnalazione. Dall’istidina si produce l’istamina tramite la reazione diretta catalizzata dall’istidina decarbossilasi. Messaggeri peptidici\proteici: i messaggeri peptidici sono composti da 50 aa. In entrambi i casi parliamo di una molecola che deriva da un’espressione genica. Il Glutatione è un peptide molto piccolo, un tripeptide, per cui la sua biosintesi deriva da un processo bi- enzimatico, non esiste il gene del glutatione. Gli ormoni peptici o proteici vengono sintetizzati come pre-proormoni inattivi in dimensioni più grandi e poi subiscono tagli proteolitici in uno o più punti per attivarsi. Viene eliminata la sequenza segnale nella porzione N-terminale. Questo meccanismo è favorito perché la cellula predispone la risposta rapida, in quanto deve adattarsi in maniera precisa e rapida ai cambiamenti ambientali, ovvero al microambiente in cui vive. La sintesi proteica è un processo genomico lungo, mentre in questo modo la cellula ha già a disposizione la molecola segnale pronta in forma inattiva. I pre-proormoni sono di peso molecolare (KDa, misurato con Western Blot) più grande rispetto alla molecola attiva. È possibile quindi determinare in modo sperimentale se delle cellule sono ricche di proteina attiva o inattiva sottoforma di pro-ormone poiché ne battezzo il peso. (Western Blot: separazione di molecole proteiche su un gel di poliacrilamide in base al peso molecolare. A fianco è presente un marcatore. Dopo le dovute interpolazioni e curve varie di taratura viene letta la banda che compare in seguito all’ibridazione del filtro che si ottiene dopo il trasferimento del gel ad un filtro di microcellulosa, ibridandolo con un anticorpo specifico per quella proteina.) Messaggeri steroidei: sintetizzati a partire dal colesterolo, sono molecole lipofile in grado di attraversare la membrana per diffusione. Non possono pertanto essere immagazzinate all’interno delle vescicole, come nel caso degli ormoni peptidici, ma vengono liberati continuamente nel liquido 4  interstiziale man mano che vengono sintetizzati. Pertanto, vengono sintetizzati solo quando richiesti e subito rilasciati, al contrario degli ormoni peptidici o amminici. Il colesterolo fa parte della struttura membranosa della cellula e degli organelli. Dal colesterolo derivano gli ormoni steroidei e gli acidi biliari che servono per emulsionare i grassi a livello dell’intestino. La goccia lipidica viene separata in tante piccole goccioline, così da aumentare la superficie per l’attacco enzimatico delle lipasi, in quanto i grassi non essendo idrofili tendono ad unirsi tra loro esponendo quelle poche parti idrofiliche e raggruppando al loro interno le code idrofobiche. La bile prodotta dalla cistifellea riceve gli acidi biliari dal fegato, che ha prodotto dal colesterolo. Attraversano la membrana Messaggeri eicosanoidi: messaggeri paracrini, prodotti da quasi tutte le cellule dell’organismo. Anche loro essendo lipofili attraversano facilmente le membrane plasmatiche. Catena di atomi di C dotate di un gruppo terminale carbossilico La loro biosintesi parte dall’acido arachidonico, acido grasso di 20 atomi di carbonio che si trova nei fosfolipidi di membrana. La fosfolipasi A2 catalizza la scissione dell’acido arachidonico dal fosfolipide di membrana. Successivamente se catalizzato dalla ciclossigenasi si otterranno prostaglandine, prostacicline e trombossani. Se invece prende la via della lipossigenasi si produrranno i leucotrieni. (La ciclossigenasi COX2 viene inibita dall’acido acetilsalicilico, principio attivo dell’aspirina). SEGNALAZIONE VESCICOLARE I segnali possono viaggiare anche sottoforma di vescicole. Non si può parlare di comunicazione cellulare se non si parla delle vescicole. Esistono vari tipi di vescicole in base alla loro grandezza: Vengono caratterizzati anche per la modalità di rilascio: Fusione: la cellula target accoglie nel suo citoplasma tutto il contenuto della vescicola che si incolla alla membrana cellulare. La cellula target non aumenta poiché è presente un equilibrio di membrana. Endocitosi: la cellula target acquisisce la vescicola per intero e questa come tale segue la via del lisosoma. Interazione con il ligando: la vescicola viene riconosciuta da un recettore esposto sulla cellula target. 5 La vescicola si rompe e rilascia nello spazio extracellulare il suo contenuto, che interagisce con i vari componenti. La matrice è dinamica e va sempre incontro ad un rimodellamento continuo, come ad esempio la matrice cellulare ossea. La cellula impiega molta energia per far fuori uscire il suo contenuto in maniera controllata. Le vescicole si formano dentro la cellula per vescicolazione della stessa membrana cellulare o per vescicolazione interna a partire dagli endosomi che originano una quantità importante di vescicole. Questo processo può essere ESCRT-dipendente o ESCRT-indipendente. ESCRT è una machinery che si mette in moto attraverso complessi citoplasmatici e proteine accessorie che guidano la fuoriuscita delle vescicole endosomiali. La membrana cellulare, molto dinamica, è ancor più dinamica grazie a questi fenomeni. Attraverso modalità diverse la cellula crea delle gemmazioni a ridosso della membrana oppure prodotte e rilasciate abbastanza velocemente. È tutto un lavoro di gemmazione per generare vescicole che subito, o quando servono, vanno a interagire con la cellula ricevente con una delle modalità descritte prima. Il contenuto di queste vescicole è un segnale: contengono proteine, miRNA (piccolo RNA con funzione regolativa), RNA, non-coding RNA… Il miRNA è importante da un punto di vista biotecnologico: Essendo di piccole dimensioni si può sintetizzare molto facilmente e sempre facilmente si può sintetizzare un antagomir con sequenza complementare, si può creare quindi un farmaco basato sulla sequenza del miRNA o sulla sequenza complementare; Sono importanti come sistema diagnostico: gli RNA circolanti se superano un certo livello possono essere indice di un danno tissutale, di neoplasie… Fanno parte del cargo di molte vescicole e servono a regolare l’attività delle cellule riceventi. Quindi il contenuto vescicolare non è di scarto come si pensava qualche anno fa, al contrario la cellula ricevente che ne accoglie il cargo vescicolare ne trae beneficio. Sulla membrana vescicolare si trova il patrimonio di derivazione della cellula che l’ha generata: troviamo antigeni, molecole MHC (molecole di isto compatibilità), molecole di trasporto, dei CD cluster differenziativi che servono a volte a riconoscere molecole self da quelle non-self, altre volte a mettere in comunicazione le cellule tra loro… Dal punto di vista biotecnologico, è possibile isolare e caratterizzare le vescicole prodotte da cellule e tessuti specifici, caratterizzando in questo modo il cargo vescicolare. In questo modo è possibile costruire vescicole a scopi biotecnologici, le vescicole biologiche rappresentano infatti un benefit per la cellula ricevente: - È possibile strumentalizzare le vescicole da un punto di vista terapeutico, aggiungendo al cargo un prodotto specifico per curare una patologia specifica; 6  - È possibile indirizzare la vescicola verso un unico target, in quanto è possibile anche caricarle esternamente di un antigene che è riconosciuto unicamente dal recettore specifico di una cellula patologica (es. tumorale); si parla quindi di una terapia mirata. Attualmente viene molto studiato il secretoma di alcuni tipi di cellule per le loro proprietà antinfiammatorie, pro-differenzianti (mRNA, miRNA, fattori di trascrizione) e antiossidanti. La categoria di cellule in assoluto più studiata è quella delle cellule staminali, con capacità di secernere queste sostanze. In conseguenza a ciò, è nato l’interesse di studiare la segnalazione delle cellule staminali, per sviluppare degli approcci terapeutici innovativi ma anche facilmente targettabili verso le cellule malate. Molecole antiossidanti: glutatione, enzimi come la superossido dismutasi, la catalsi, glutatione perossidasi, enzimi che diminuiscono l’impatto che le molecole pro-ossidanti hanno sulle cellule. Inoltre, vitamine (vitamina C) assunte con la dieta. Un tessuto degenerato e sdifferenziato è sinonimo di tessuto patologico. Guidare le cellule a riappropriarsi del proprio fenotipo è un benefit incredibile, per ottenere ciò bisogna però conoscere i segnali pro- differenzianti. Studiando i differenziamenti secondo i loro vari linage (osteogenico, miogenico…) è possibile promuovere la rigenerazione, la riparazione (attraverso la spinta differenziativa) e quindi conoscere gli elementi alla base del differenziamento. Il secretoma delle cellule staminali è ricco di queste sostanze. Esistono già studi di “Terapia basata sulle cellule staminali”. Ovviamente è più facile creare una terapia sul prodotto di segnalazione delle cellule staminali che sulle cellule staminali stesse (è più facile da manipolare e da gestire). L’articolazione del ginocchio, la cartilagine, se danneggiata non può guarire da sola, perché la cartilagine non è un tessuto irrorato né innervato. L’osso invece guarisce da solo, si aiuta solo con una ingessatura, ma riceve tutti i segnali differenziativi e positivi tramite il torrente ematico. Fattori di trascrizione pro-differenzianti: Osso: RUNX2 Cartilagine: SOX9 7  Fisiologia e trasduzione – Lezione 2 – 13/10/22 Sbobinatore: Elena Agostini I RECETTORI I recettori si dividono in base alla loro posizione: - Recettori di membrana; - Recettori citoplasmatici; - Recettori nucleari. Indipendentemente dalla loro posizione essi presentano delle proprietà comuni: Alta affinità col ligando: permette alle cellule di rispondere a basse concentrazioni di ligando. Il concetto di affinità rimanda al concetto di Km, che indica quanto un substrato è affine ad un enzima. In una rappresentazione di cinetica enzimatica - in un grafico che mette in relazione la velocità di reazione con la concentrazione del substrato - si ricava la Km, relativa alla concentrazione di substrato che è necessaria per avere metà della velocità massima. La velocità massima è la velocità a cui tutti i siti di un enzima sono saturati. Alla Vmax:2 corrisponde quella concentrazione di substrato che è la Km. Tanto più è grande il valore della Km tanto più bassa è l’affinità per il substrato perché vuol dire che ci vuole più substrato per raggiungere quella velocità. Il discorso dell’affinità si può traslare a tanto altro, ad esempio all’emoglobina che lega l’ossigeno. L’ossigeno ha un’affinità per l’emoglobina più bassa rispetto a quella della mioglobina dato che l’emoglobina deve trasportare e poi essere in grado di rilasciare l’ossigeno, mentre la mioglobina è una proteina di deposito. La stessa cosa può essere traslata al concetto di recettore-ligando. Se l’affinità per un ligando è elevata significa che la cellula è progettata per percepire anche una concentrazione bassa di ligando, la cellula è quindi capace di rispondere a piccole variazioni. Sono selettivamente specifici per il loro ligando, riconoscono solo una molecola. Il legame tra ligando e recettore è reversibile, i legami che si instaurano tra ligando e recettori sono legami deboli come legami ad idrogeno, forze di Van der Waals e legami idrofobici. Il legame non deve essere forte perché il ligando deve essere legato solo quando è necessario che la cellula risponda in quella situazione. I ligandi idrofilici sono quelle molecole che sono solubili in acqua e possono restare solo esternamente alla cellula, hanno quindi bisogno di un recettore esposto sulla membrana cellulare, quindi di un recettore extracellulare. Classicamente sono ligandi idrofilici le proteine che si trovano nel liquido interstiziale, poiché sono grandi e non possono entrare nella cellula. Al contrario i recettori intracellulari sono quelli che servono a molecole che hanno una natura lipofila. Essendo liposolubili queste riescono ad attraversare la membrana cellulare ma agiscono solo dove trovano un recettore. L’interazione tra le molecole segnale e i recettori provoca cambiamenti conformazionali ai recettori che subiscono transizioni allosteriche. Il recettore cambia la sua struttura tridimensionale adattandola al ligando e questo porta ad esporre dei siti sulla molecola recettoriale che prima non erano esposti. Una volta avvenuto il cambiamento allosterico si scatena la risposta cellulare. L’allosterismo è quel fenomeno che caratterizza molecole proteiche formate da più unità che sono suscettibili a sentire piccole molecole che si legano ad un sito diverso da quello per il ligando. 1  I RECETTORI INTRACELLULARI I recettori intracellulari agiscono attivando un processo genomico. Dal fluido extracellulare ricevono l’ormone liposolubile che trova il recettore o nel citoplasma o nel nucleo. Questi recettori si dividono in due categorie: Recettori che si trovano nel citoplasma; Recettori che si trovano già sul DNA, sulla regione regolativa dei geni bersaglio degli ormoni, ma non in forma attiva. L’attivazione avviene solo in conseguenza del legame con il ligando: solo dopo che si forma il complesso ormone-recettore avviene l’interazione col DNA. In alternativa, l’interazione con il DNA può riguardare già la proteina recettoriale, ma questa diventa attiva solo quando si lega il ligando. Questo porta ad una modulazione dell’espressione genica: viene attivata la trascrizione, viene prodotto un mRNA che poi processato esce dal nucleo e dà origine ad una proteina. Come avviene l’interazione tra proteina e DNA? Ci sono geni responsivi agli ormoni che legano il complesso ormone-recettore, in particolare la parte di questo complesso che prende contatto con il DNA è la parte proteica. Sono stati descritti tutta una serie di modelli di conformazioni che vengono adottate da queste proteine (es. zinc finger, beta turn helix… generalmente i recettori per gli ormoni steroidei si comportano utilizzando il modello a zinc finger). La relazione riguarda alcuni tipi di amminoacidi che si vanno a legare alle basi azotate del DNA. Nell’immagine viene mostrata la sequenza proteica di vari recettori di ormoni steroidei. Da uno studio è emerso che, a partire dalla duplicazione di un gene ancestrale, vengono ottenuti una serie di geni che si assomigliano tra loro, ovvero che svolgono la stessa funzione. Allineandoli uno sotto l’altro si vede che c’è un’omologia di sequenza soprattutto in certe regioni. Questo studio ha inoltre portato ad identificare alcuni domini all’interno di questi recettori. Una regione della proteina che una volta tolta mantiene la sua funzione Che cos’è il dominio di una proteina? È una parte di proteina che ha una sua funzione e una volta isolata dalla proteina mantiene la sua funzione. Si possono costruire delle molecole proteiche ibride che derivano dall’unione di domini che derivano da proteine diverse. Il dominio che lega il DNA, comune a tutti i recettori intracellulari (evidenziato in verde), è uno dei punti a più alta omologia, è uno zinc finger, ed è la porzione della proteina che lega il DNA. Un altro dominio riconoscibile in queste proteine è il dominio subito a valle di quello che lega il DNA, che lega il ligando ed è specifico per ogni ligando. 2  Ci sono inoltre altre zone che vengono definite domini di transattivazione. Quando si utilizza il concetto di “poter essere modulati da altre molecole” significa che è possibile identificare aree di contatto con qualcos’altro, ovvero con domini di transattivazione. Questi si possono trovare sia al dominio ammino terminale che al carbossi terminale, dove ci sono numerose e variabili zone di contatto con molecole effettrici negative o positive, che vanno ad inibire o attivare la funzione del recettore stesso. Queste zone sono meno conservate rispetto a quelle che legano il DNA poiché ogni recettore ha la sua caratteristica specifica di interagire con alcune molecole. Queste proteine possono essere fosforilate in siti specifici e questa fosforilazione va a modulare l’attività stessa del recettore. Solo quando si lega il ligando, assieme ad un’altra serie di coattivatori, allora si crea il complesso ormone-recettore che va a legarsi e ad attivare quella sequenza evidenziata in rosso, a monte del sito di inizio di trascrizione del gene bersaglio. Il gene bersaglio viene categorizzato come bersaglio di quell’ormone: ci sono quindi geni responsivi agli estrogeni, al cortisolo, all’aldosterone ecc. I RECETTORI DI MEMBRANA I recettori di membrana rispondono secondo la maniera qui schematizzata: legano un segnale extracellulare che dentro la cellula prende il nome di pool di proteine di segnalazione. Si parla di pool perché le proteine di segnalazione intracellulare che rispondono al recettore attivato dalla molecola segnale sono molte. A loro volta queste proteine hanno dei target che possono essere: alin g y/Wound he Scratch assa ratch viene utilizzato Enzimi metabolici; Il saggio sc migrazione la per studiare cellulare e la guari gio ne delle ede Proteine che regolano i geni; ocedura prev ferite. La pr un graffio sulla l'esecu zio ne di un monostr ato di Proteine del citoscheletro. superficie di nti, per creare lue cellule conf io tra le cellule, spaz uno stretto una ferita. come se si trattasse di Nel primo caso verrà modulato il metabolismo in senso positivo o negativo. La risposta non è mai tutto o niente quindi non ci sarà uno stop o un’attivazione totale, ci sarà un rallentamento o un aumento. Una via metabolica non è mai spenta o sempre al massimo; si parla di modulazione. Nel secondo caso si ha una modulazione dell’espressione genica: qui può valere la regola tutto o nulla, perché il genoma è uguale in tutte le cellule ma, ad esempio, non troveremo mai il gene della transaminasi nella cornea (perché è un enzima * Audio 2 epatospecifico) e quindi l’espressione sarà tutta nulla. Quantità di un Quantità di Microscopio enzima proteine Nel terzo caso con le proteine del citoscheletro avremo la Scratch assay & Wound healing modulazione della forma della cellula o una modulazione del movimento cellulare. Le cellule dinamiche migrano, soprattutto per quanto riguarda le cellule staminali. Queste hanno una forte necessità di migrazione da una nicchia in cui si trovano ad un altro sito. Allo stesso modo la modulazione del citoscheletro non è rigida ma dinamica e condizionando la forma della cellula viene condizionata anche la funzione. Questi concetti sono importanti per quello che riguarda l’ingegneria tissutale, cioè l’ingegnerizzazione dei tessuti, ovvero la produzione in laboratorio di porzioni di tessuti basati sulle cellule staminali, che si fonda sulla possibilità di modificare il lineage differenziativo verso un certo tipo di differenziamento che dipende anche dalla morfologia e dal citoscheletro. I recettori di membrana, a differenza di quelli intracellulari che non hanno una classificazione vera e propria a parte di quella fisiologica (recettori per mineralcorticoidi, per ormoni sessuali…) possono essere suddivisi in tre classi: 3  1. Recettori ionotropici: detti anche recettori-canale; 2. Recettori metabotropici che si suddividono a loro volta in: a. Recettori a 7 domini transmembrana; b. Recettori operanti per via enzimatica; 3. Cell adhesion molecules (CAM). Promuovono adesione cellula/cellula RECETTORI IONOTROPICI O CANALE Quando il canale è chiuso, la morfologia impedisce l’entrata degli ioni. La vicinanza della molecola induce un cambiamento conformazionale del recettore. Dei legami verranno rotti e altri verranno creati per legare la molecola facilitando la funzione stessa del recettore. Ciò permette a ioni specifici di muoversi secondo il proprio gradiente elettrochimico. Il tempo di risposta di questi recettori è estremamente rapido ed è caratteristico delle sinapsi. A loro volta questi recettori si suddividono in 6 classi: 1. Recettori nicotinici per l’Ach (Na+/K+); 2. Recettori del GABA (Cl-); 3. Recettori ionotropi per il glutammato (Na+/Ca+) (NMDA, AMPA, Kainato); 4. Recettori P2X (purinergico) per l’ATP (Na+, K+, Ca+); 5. Recettori 5HT per la serotonina (Na+, K+, Ca+); 6. Recettori per la glicina. Sono molto importanti poiché rappresentano importanti target terapeutici. I recettori purinergici sono recettori che legano l’ATP e si comportano da recettori ionotropici associati alla progressione tumorale. L’espressione di questi recettori aumenta all’aumentare della gravità della neoplasia, alla gravità dell’infiammazione e della degenerazione di un tessuto. Si può pensare quindi di sviluppare degli antagonisti per bloccarne l’attività. 4 RECETTORI METABOTROPICI Recettori accoppiati a proteine G; Recettori legati ad enzimi: la molecola segnale quando si lega attiva un dominio catalitico e questo scatena delle risposte. In alternativa può accadere che la molecola segnale si lega al recettore e questo di per sé non ha un’attività enzimatica ma va ad attivare un enzima ad esso associato. La famiglia dei recettori accoppiati a proteine G è la famiglia più numerosa. Nello schema sono evidenziati i 7 domini di transmembrana. Nella porzione extracellulare è presente un dominio ammino terminale che contiene il dominio di legame per il ligando. Nella porzione intracellulare è presente una parte di proteina che rappresenta il dominio di interazione con la proteina G e tutta una serie di siti regolatori. Le proteine G funzionano come collegamento tra il recettore e altre proteine, queste altre proteine prendono il nome di proteine effettrici, le quali possono essere di natura diversa, con funzioni diverse. Le proteine G sono proteine trimeriche formate da tre subunità: alfa, beta e gamma. La subunità alfa lega il GDP; quando il ligando lega il recettore il GDP viene spezzato e alla subunità alfa rimane legato il GTP. A questo punto la subunità alfa con legato il GTP si dissocia dalle altre due subunità. Successivamente si riassocerà il GDP e si riprenderà il ciclo della proteina G attivata o disattivata. È importante ricordare che non è solo la proteina alfa con il GDP legato ad avere un effetto, ma anche le altre due subunità hanno per conto loro degli effettori che ne mediano la funzione. Sono tutte e tre coinvolte nel dare una risposta all’interno della cellula. GLI EFFETTORI DELLE PROTEINE G Per quanto riguarda le proteine G e la regolazione di canali ionici, si prenda come esempio il rallentamento del battito cardiaco. Si immagini che il ligando, l’acetilcolina (che deriva dall’acetil-CoA e dalla colina tramite l’enzima acetil-trasnferasi), leghi il recettore con i sette domini transmembrana. Si ha così un’attivazione della subunità alfa che lega il GTP. Il canale per il potassio che prima era chiuso diventa aperto in seguito al fatto che la subunità legata al GTP ha portato all’attivazione indiretta di questo complesso beta-gamma che è la parte che prende contatto con il canale per il potassio per aprirlo e consentire l’entrata del potassio. Quando poi il gruppo fosfato si allontana dal GTP e rimane il GDP la proteina G torna inattiva, trasferisce l’inattività alle subunità beta-gamma e il canale per il potassio torna ad essere chiuso. 5 Per quanto riguarda invece le proteine G e l’attivazione di enzimi di membrana, la subunità alfa attivata prende direttamente contatto con la proteina effettrice, che una volta attivata trasforma delle molecole substrato in molecole di secondi messaggeri. I secondi messaggeri vengono chiamati così perché il primo messaggero è il ligando. I secondi messaggeri si diffondono in tutta la cellula e agiscono su tanti bersagli. Tra gli enzimi attivati da proteine G troviamo l’adenilato ciclasi - che catalizza la produzione di cAMP - e la fosfolipasi C, responsabile della produzione di inositolo trifosfato e diacilglicerolo. Il cAMP deriva dall’ATP, quindi l’ATP non è solo una molecola energetica di scambio, ma è anche il substrato per un enzima che produce un secondo messaggero come il cAMP. È inoltre un donatore di gruppi fosfato, substrato di enzimi importanti nella segnalazione: le chinasi, enzimi che trasferiscono il gruppo fosfato dall’ATP ad accettori variabili. L’adenilato ciclasi ha la funzione di ciclizzate a livello del carbonio 3 e 5 la molecola dando il cAMP. Come esiste l’adenilato ciclasi che produce il secondo messaggero esiste la cAMP fosfodiesterasi specifica che attraverso un’idrolisi scinde questo legame e porta la molecola ad essere adenosina-5-monofosfato, interrompe quindi la segnalazione. Questo enzima è importante perché una volta prodotto il secondo messaggero, questo deve rimanere solo per il tempo necessario. 6 Quando si aggiunge ad un enzima l’aggettivo “specifico” significa che l’enzima lega solo quel substrato. La specificità fa parte del sistema di regolazione del metabolismo. Per esempio, l’esochinasi (il primo enzima della via glicolitica) non è un enzima specifico per un solo substrato. Il prefisso “eso” indica che ha come substrati gli zuccheri a sei atomi di carbonio, gli esosi. L’esochinasi catalizza la fosforilazione del glucosio in glucosio-6-fosfato. La prima reazione della glicolisi è catalizzata in tutti i tessuti dalla esochinasi tranne nel fegato che è invece catalizzata dalla glucochinasi. Che differenza c’è tra questi due enzimi? Entrambi catalizzano la stessa reazione ma la glucochinasi ha una Km molto alta e quindi una bassa affinità per il glucosio. Questo perché il fegato usa la glicolisi solo quando c’è in circolo tanto glucosio, perché il fegato utilizza per produrre ATP gli acidi grassi tramite la beta ossidazione degli acidi grassi. Il fegato invece utilizza la glicolisi o gluconeogenesi per ristabilire la glicemia. Quando c’è molto glucosio allora anche il fegato lo consuma attraverso una glucochinasi specifica e allo stesso tempo produce glicogeno per immagazzinarlo. Il glicogeno verrà poi utilizzato in caso di digiuno. C’è invece un altro organo che deposita glicogeno ma non lo fa uscire ed è il muscolo, dato che non è dotato dell’enzima che defosforila il glucosio. Attraverso la pirofosfatasi inorganica vengono scissi legami ad alta energia che spingono la reazione verso la produzione del cAMP. Il cAMP andrà a legarsi alla PKA (proteina chinasi cAMP dipendente) che è formata da quattro subunità: due regolatrici e due catalitiche. Le subunità quando sono tutte e quattro legate tra loro impediscono alla PKA di funzionare. Solo quando c’è il cAMP vi è un cambiamento conformazionale da parte delle subunità regolatrici che vengono spiazzate dalla due subunità catalitiche che così sono libere di funzionare come chinasi. Dal punto di vista tridimensionale la PKA è regolata in maniera allosterica da parte del cAMP: le 4 molecole di cAMP infatti si legano due alla volta alle subunità regolatrici permettendone il distacco. La PKA attiva ha molteplici bersagli: Enzimi metabolici; Modificazione del metabolismo -> Effetti rapidi Fattori trascrizionali; Modificazione espressione genica ->Effetti lenti Proteine del citoscheletro. Modificazione della morfologia ->Effetti rapidi La risposta è rapida tranne nel caso della modificazione dell’espressione genica tramite fattori trascrizionali. Ovviamente la modificazione dell’espressione genica è un effetto genomico e quindi è lento. L’attivazione della PKA induce una fosforilazione. La fosforilazione è il meccanismo attraverso il quale dei residui amminoacidici con l’OH libero (serina, treonina e tirosina) ricevono un gruppo fosfato. Non necessariamente fosforilato significa attivo e defosforilato inattivo. Transizione funzionale reversibile grazie alle fosfatasi La PKA metabolicamente parlando i implicata nel metabolismo del glicogeno, caratterizzato da una cascata di fosforilazioni e defosforilazioni. Gli enzimi chiave sono la glicogeno sintasi, che sintetizza il glicogeno, e la glicogeno fosforilasi, che degrada il glicogeno. 7 La PKA va a fosforilare la glicogeno fosforilasi chinasi attivandola. L’attivazione di questa chinasi ha come obiettivo l’attivazione della glicogeno fosforilasi. La glicogeno sintetasi è inibita dalla fosforilazione e la protein fosfatasi viene inibita dalla fosforilazione. Il tutto perché la PKA deve andare a favorire la demolizione del glicogeno. Il risultato finale dell’ormone che porta all’attivazione della PKA, che è il glucagone, è l’attivazione degli enzimi della glicogenolisi con liberazione di glucosio nel sangue. Il glucagone è un ormone proteico che è rilasciato durante il digiuno. La PKA attiva va a inattivare la sintesi del glucosio andando a fosforilare la glicogeno sintetasi che diventa inattiva, mentre fosforila la fosforilasi chinasi attivandola che a sua volta fosforila la glicogeno fosforilasi rendendola attiva. Questo produce una degradazione del glicogeno in glucosio-1- fosfato che diventa glucosio-6-fosfato che diventa glucosio libero ad opera della glucosio-6-fosfatasi. Il glucosio è mantenuto all’interno della cellula perché fosforilato, solo il fegato ha la capacità diliberare glucosio nel sangue perché possiede l’enzima glucosio-6-fosfatasi che rimuove questo gruppo fosfato. Al tempo stesso (dal punto di vista didattico gli argomenti sono separati ma contemporaneamente la PKA oltre a svolgere effetti veloci svolge anche effetti lenti) la PKA una volta attivata può passare attraverso i pori nucleari ed andare a fosforilare target nucleari. Un target nucleare è un fattore di trascrizione che è normalmente presente nel nucleo ma non è attivo. La fosforilazione lo rende attivo. La fosforilazione cambia la conformazione della proteina e la proteina espone quel dominio che va a legare il DNA. Questo porta alla trascrizione di quegli enzimi che sono indispensabili. Gli enzimi rispetto alle proteine strutturali hanno un half life più bassa e questo fa parte dell’attività enzimatica. Una volta attivati i processi rapidi sul metabolismo gli enzimi devono comunque essere rimpiazzati. Il glicogeno si esaurisce a digiuno in 24 ore, ci sarà quindi bisogno di continuare a fare enzimi legati ad altri processi metabolici. Dopo la glicogenolisi in caso di digiuno prolungato entra in gioco un altro processo metabolico, che porta al deperimento organico: la gluconeogenesi, ovvero la creazione di glucosio da precursori non saccaridici come intermedi del ciclo di Krebs e amminoacidi. Qui viene messo in evidenzia l’attivazione trascrizionale del fattore CREB. Ci sono molti ormoni come LH, ACTH e TSH che vanno ad attivare la PKA attraverso il sistema della proteina G o dell’adenilato ciclasi. 8  cAMP response element-binding protein > - La PKA attiva CREB che, come molti altri fattori trascrizionali, una volta fosforilato è in grado di legare molte altre proteine. In rosa in basso è mostrata una proteina che si lega a CREB e fa da coattivatore. La machinery di trascrizione è un meccanismo molto complesso che vede la partecipazione non solo di molecole che legano il DNA e i fattori di trascrizione che legano (attraverso il DNA binding domain) i promotori, ma anche di proteine che si legano ad altre proteine che hanno un’importanza fondamentale per la trascrizione. I fattori di trascrizione si trovano sempre nel nucleo? No, si possono trovare anche nel citoplasma ma non sono funzionali, quindi la localizzazione è importante. Attraverso quale metodica si può determinare la localizzazione di una proteina e giudicare se la localizzazione è adeguata alla sua funzione? Si possono separare i nuclei dal citoplasma e poi fare un western blot. Oppure utilizzando una metodica più semplice si può utilizzare un’immunocitochimica: si marca con un anticorpo, che può essere fluorescente, la proteina che si vuole analizzare e la cellula viene utilizzata per intero senza separare nucleo e citoplasma. Si va a vedere poi se l’anticorpo reagisce nel nucleo o nel citoplasma. Con l’immunoistochimica si va invece ad analizzare un tessuto tramite l’uso di anticorpi per studiare per esempio il grading di un tumore. Per quanto riguarda la quantificazione si può utilizzare un western blot per valutare il peso delle proteine. Un altro tipo di analisi per proteine, sempre utilizzando anticorpi, è il FACS. Un altro effettore delle proteine G è la fosfolipasi C, una lipasi che scinde un legame estereo che collega glicerolo e acidi grassi. In particolare, in questo caso scinde un legame fosfoesterico. La fosfolipasi produce il diacilglicerolo (DAG) e l’inositolo 1,4,5-trifosfato (IP3). Queste due molecole hanno funzione di trasdurre il segnale: il DAG attiva la PKC, un altro tipo di chinasi, e l’IP3 invece va a favorire il rilascio del Ca2+ dal reticolo endoplasmatico. Il precursore di un fosfolipide è l’acido fosfatidico. Gli acidi grassi per essere attivati devono essere legati all’acetil-CoA o alla C protein. 9 La molecola segnale lega il recettore legato alla proteina G. La subunità alfa (prende nomi diversi a seconda del tessuto e della molecola che la induce) va ad attivare la fosfolipasi C associata alla porzione interna della membrana plasmatica. Una volta attivata produce DAG e IP3. La fosfolipasi C si trova associata alla membrana plasmatica perché qui trova il suo substrato che è il fosfatidil inositolo 4,5-bisfosfato (PIP2). Normalmente le fosfolipasi possono anche servire a distruggere i fosfolipidi quando c’è il normale turn over delle cellule. Le lipasi digestive invece sono prodotte a livello pancreatico, dal pancreas esocrino. L’IP3 favorisce l’apertura dei canali del calcio associati al reticolo endoplasmatico. I livelli di calcio dentro la cellula solitamente sono molto bassi. Il calcio si libera nel lume della cellula e va ad attivare la PKC (attivata anche dal DAG), c’è una doppia attivazione. La PKC attivata fosforila tutta una serie di proteine bersaglio e il Ca2+ avrà un’attività ulteriore di secondo messaggero. Calcio La PKC fa parte di una famiglia di serin/treonina chinasi ed è costituita da una subunità catalitica e da una subunità regolatrice. La subunità regolatrice è la calmodulina, una proteina regolata dal calcio. E’ una maggior garanzia per la cellula che una molecola come questa senta due effettori, poi in base al tessuto si ha la prevalenza di uno o dell’altro. Il recettore può legare diversi tipi di ligandi come ormoni, fattori di crescita, neurotrasmettitori… che hanno tutti come obiettivo finale quello di attivare la PKC. La PKC quindi è dipendente da tanti primi messaggeri. Un altro effettore delle proteine G è la fosfolipasi A2. È sempre una fosfolipasi ma ha un altro significato, agisce infatti sulla trasduzione mediata dall’acido arachidonico, che deriva dalla demolizione di fosfolipidi di membrana ad opera della fosfolipasi A2. 10 La produzione di acido arachidonico ad opera di questa attività catalitica attiva due vie: Via della COX2 o ciclossigenasi: produce prostagladine e trombossani. Via della lipossigenasi: produce leucotrieni. Questi sono categorizzati come prodotti della cascata di segnalazione dell’acido arachidonico perché loro funzionano come segnalatori in quanto vanno a mediare il processo infiammatorio. Si può spegnere l’infiammazione attraverso l’aspirina che va ad inibire la ciclossigenasi. La cosa importante è ricordare che ci sono molecole che possono competere per il substrato e legarsi ad esso in modo reversibile ed irreversibile. Ci possono essere inibitori suicidi, come nel caso della chemioterapia che si basa sul fatto che l’enzima una volta legato dall’inibitore, produce un prodotto che va a inibire sé stesso. Questo prodotto non deriva dal substrato originario ma dal substrato inibitore. 11  Fisiologia e Trasduzione – Lezione 3 – 14/10/22 Sbobinatore: Barbieri Isabella Elisa Ferri I SECONDI MESSAGGERI Sono quelle molecole che vengono prodotte in seguito all’interazione del recettore con il proprio ligando. AMP ciclico: attivato dal segnale che porta all’attivazione della protein chinasi A (PKA); GMP ciclico: è molto simile al cAMP, è sempre di derivazione nucleotidica; 1,2-Diacilglicerolo; Inositolo trifosfato; Calcio (Ca2+). AMP CICLICO Il cAMP innesca processi veloci che durano qualche secondo o al massimo qualche minuto – relativamente alle modificazioni post-traduzionali. Il cAMP va ad attivare chinasi che hanno funzioni molto diverse fra di loro; la famiglia di protein chinasi A infatti è molto ampia. Relativamente al metabolismo queste chinasi si comportano da modulatori del metabolismo degli acidi grassi, poiché vanno a modulare l’attività della trigliceride lipasi impattando la produzione degli acidi grassi e la relativa demolizione. La stessa cosa vale per i carboidrati: vanno a modulare l’attività della glicogeno sintasi ma anche della glicogeno fosforilasi. A seconda del microambiente in cui la cellula si trova a vivere e a seconda dell’esigenza dell’organismo viene attivato un pathway metabolico piuttosto che un altro poiché uno è l’opposto dell’altro. Il cAMP ha anche la possibilità di attivare chinasi che lavorano nel citoplasma per regolare l’assemblamento o il disassemblamento dei microtubuli. Impatta sul citoscheletro, su chinasi che hanno un ruolo nel trasporto di membrana, nel reticolo endoplasmatico e a livello nucleare. Piccole variazioni di cAMP possono avere impatti enormi sul destino della cellula. 1 I livelli di cAMP non variano soltanto nelle cellule mature, ma anche nelle cellule progenitrici. Queste cellule, chiamate anche cellule precursori, sentono la variazione dei livelli dei secondi messaggeri in funzione del loro destino, che può essere quello di rimanere nella loro quiescenza o di differenziarsi. Questo differenziamento non è già predestinato per tutti i tipi di progenitori; anche qui ci sono gradi diversi di progenitori. Le variazioni dei secondi messaggeri inducono quindi delle vie del segnale che portano le cellule progenitrici a prendere una direzione invece che un’altra. Queste cellule progenitrici possono differenziarsi verso diversi lineage. All’interno del midollo osseo sono presenti cellule staminali ematopoietiche (HSC), una popolazione dalla quale derivano le cellule mature ematopoietiche. Nel midollo osseo vivono anche delle altre cellule staminali: le MSC, cellule staminali mesenchimatiche, in grado di differenziarsi per diventare osso, cartilagine o tessuto adiposo. Queste cellule si differenziano in modo diverso in base ai segnali che percepiscono. I secondi messaggeri determinano quindi il destino delle cellule, anche di quelle progenitrici. FOSFATIDILINOSITOLO (PI) CALCIO Il calcio ha una funzione importantissima soprattutto nelle cellule nervose, endocrine e muscolari, fortemente sensibili a questo messaggero. Il calcio ha la capacità di indurre fenomeni come l’esocitosi – nelle cellule nervose ed endocrine – mente nei miociti è in grado di indurre la contrazione muscolare. In tutti i casi i livelli di calcio intracellulare hanno una concentrazione bassa mantenuta attraverso specifici canali: - Pompa del Ca2+ della membrana plasmatica; - Pompa del Ca2+ della membrana del RE; - Pompa del Ca2+ del mitocondrio. Delle molecole segnale (neurotrasmettitori, ormoni) andranno ad attivare questi canali permettendo l’entrata o la fuoriuscita del calcio. Quando i livelli di calcio all’interno della cellula aumentano leggermente sono presenti delle proteine specifiche deputate al suo rilevamento. 2 La proteina principale è la calmodulina, essa presenta dei siti specifici di legame per il calcio che comportano una modificazione della sua conformazione quando il calcio aumenta, facendo in modo che si leghi ad altre proteine bersaglio andando a modularne l’attività. Il fattore trascrizionale NFATC1, appartenente alla famiglia degli NFAT è sensibile al calcio. Di solito, si trova nel citoplasma. Viene trasferito al nucleo quando aumentano i livelli di questo secondo messaggero. Questa è una segnalazione molto ben studiata dalla cellula che di per sé ha la quantità corretta della proteina, ma non nella posizione giusta: NFATC1 funziona solo quando i livelli di calcio corrispondono al bisogno di doverla attivare. Due popolazioni cellulari, pur avendo livelli paragonabili di proteina, avranno due espressioni diverse (fisiologiche e non fisiologiche). Una classe importante delle proteine bersaglio è detta chinasi CaM, o protein chinasi Ca2+/calmodulina dipendenti. Ricordare che: Il calcio esce dalla cellula grazie alla calcio ATPasi localizzata nella membrana plasmatica. Il calcio può essere accumulato nel RE attraverso una calcio ATPasi che lavora al contrario rispetto a quella della membrana. In entrambi i casi ciò costa molta energia alla cellula, molte molecole di ATP che usa la cellula sono destinate a mantenere costante la concentrazione di ioni. È presente uno scambiatore passivo sodio- calcio; Il calcio su accumula nel mitocondrio; Ci sono i recettori che lavorano con il calcio rispondendo alle molecole segnale. Recettori che intervengono nella modifica del metabolismo RECETTORI METABOTROPICI LEGATI AD ENZIMI Dominio immunoglobunilico somiglianza con le immunoglobiline (proteine necessarie per la difesa immunitaria) Questi enzimi sono caratterizzati dall’avere un singolo dominio transmembrana (al contrario di quelli analizzati in precedenza che ne presentano 7), un’importante porzione extracellulare e una più piccola porzione intracellulare. La parte rivolta nel citoplasma è quella con attività enzimatica, mentre la porzione extracellulare è diversa da recettore a recettore. - Il recettore dell’EGF ha domini caratteristici ricchi di cisteina, questa porzione di proteina sarà quindi in grado di fare un enorme ponte disolfuro con i ligandi. - Anche il recettore per l’insulina è in grado di creare ponti disolfuro. - Il recettore NGF, PDGF, FGF e VEFG, presentano un dominio immunoglobulinico, che assomiglia a quelli portati dalle immunoglobuline. 3  I recettori, informa inattiva, presentano i due monomeri separati. Il legame di un ormone induce dimerizzazione e autofosforilazione dei recettori che in talvmodo si attivano (possibile grazie all’attività enzimatica nel recettore) in questo modo si viene a creare un sito di riconoscimento sulla porzione citoplasmatica del recettore per altre proteine. In questo modo viene innescata all’interno della cellula la segnalazione Per disattivare il sistema entrano in atto le protein tirosin fosfatasi o in certi casi i recettori attivati vengono portati per endocitori ai lisosomi digeriti In sistema però deve essere disattivato Nella maggior parte dei casi, l’attività enzimatica dei recettori è localizzata nella porzione intracellulare e riguarda la capacità di fosforilare su residui di tirosina, attraverso i recettori tirosinchinasici. Mentre gli altri enzimi possono andare a fosforilare tutti e tre gli amminoacidi possibili (serina, treonina e serina) questi sono in grado di agire solo su residui di tirosina. La molecola segnale induce una stimolazione dell’attività chinasica inducendo contemporaneamente l’avvicinamento dei due monomeri recettoriali. Il recettore autofosforilato è capace di attivare a sé delle proteine segnale che vanno a legarsi a delle tirosine fosforilate, esponendo così i siti capaci di interagire con le proteine bersaglio. Quindi, il cambiamento conformazionale che segue il legame con la molecola segnale ha come obiettivo quello di attirare nel posto e momento giusto le proteine bersaglio. Queste proteine bersaglio rappresentano il segnale intracellulare che può scatenare la risposta di trasduzione del segnale (trasduzione del segnale che era fuori). Non bisogna confondere le molecole segnale dalle proteine segnale. È un fenomeno che riguarda posizioni diverse (fuori dalla cellula, e dentro la cellula). Si parla sempre di segnali ma completamente diversi. Il segnale così viene propagato dentro la cellula, però al momento giusto deve essere interrotto. Per disattivare questo segnale vengono staccati questi gruppi fosfato in risposta ad un cambiamento di esigenza della cellula (cambia il microambiente). Questa azione viene compiuta dall’enzima protein tirosin fosfatasi, fosfatasi specifica che stacca il gruppo fosfato attraverso l’idrolisi. Questo sistema è il più rapido, ma in altri casi questi recettori fosforilati vengono disattivati attraverso un’endocitosi che li porta nei lisosomi. Non agiscono utilizzando secondi messageri RECETTORI CAM (Cell Adhesion Molecules) 4  Questi recettori di superficie hanno la funzione di sostenere i processi di adesione cellulare. Sono fondamentali per trasferire l’informazione dalla matrice extracellulare all’interno della cellula e per far si che le cellule aderiscano fra di loro a formare i tessuti. La matrice cellulare è un sistema ricco di segnali, di fattori che servono alla comunicazione out-in: la cellula internamente riceve il messaggio portato dalla matrice e lo fa attraverso questi recettori, principalmente le integrine. La matrice extracellulare è fatta principalmente da collagene (ne esistono almeno 25 tipi), da molecole non collageniche strutturali, da fattori di crescita… tutti questi componenti devono avere una direzione specifica, affinché la matrice svolga il suo ruolo. La matrice deve essere ben organizzata anche per presentare correttamente ai recettori le molecole che devono essere “sentite”. Nell’osso si trova il collagene di tipo 1, nella cartilagine si trova il collagene di tipo 2. Ricostruire in laboratorio un qualcosa che assomiglia a quello che si trova nell’ambiente fisiologico è importante per utilizzarlo per correggere un difetto o rimpiazzare una perdita di tessuto in seguito ad un trauma. La matrice extracellulare può essere utilizzata nell’ingegnerizzazione dei tessuti. Ad esempio, i danni della cartilagine per patologie, in seguito a traumi o per invecchiamento non possono essere guariti (a contrario dell’osso che è vascolarizzato e può guarire). Trovare soluzioni terapeutiche efficienti è indispensabile. Tra i tanti studi, uno è quello dell’utilizzo della matrice extracellulare. Come è possibile ricreare in vitro la matrice extracellulare? La matrice deve essere privata dei fibroblasti, deve essere quindi decellularizzata ma senza perdere i componenti di cui si hanno bisogno. Le matrici extracellulari più adatte a fare un biomateriale ispirato biologicamente e ingegnerizzato sono i tessuti perinatali (cordone ombelicale, placenta, amnios). Questi sono tessuti di scarto che solitamente vengono buttati, ma da cui è possibile isolare le cellule staminali e soprattutto la matrice, che è non immunogenica (non dà reazione al ricevente). I tessuti perinatali donati non possono essere usati per scopi personali per futuri impieghi per il bambino o consanguinei, ma solo per scopi di ricerca. I recettori CAM hanno i domini extracellulari molto diversi tra loro. Tutti tranne l’N-CAM hanno dei siti di riconoscimento (pallini rossi) di legame per il calcio extracellulare. Il riconoscimento del ligando passa anche attraverso il legame del calcio extracellulare. Inoltre, sono dotati di un unico dominio transmembrana, tranne nel caso del recettore integrinico che è un eterodimero alfa-beta, fatto da due porzioni. All’interno della cellula il recettore si fonde in una posizione che non è così grande come nei recettori visti fino ad ora. Il grosso è riservato all’interazione con componenti extra-cellulari. In presenza di Ca2+ sono capaci di stabilire un legame con i residui sialici del glicocalice di un’altra cellula. È stato compreso il ruolo fondamentale che queste Le principali classi di proteine adesive sono: giunzioni comportano a livello cellulare, permettendo di riconoscere ciò che è self da cio che non lo è. Inoltre, permette alle cellule di aderire le une alle altre grazie Neuroni - N-CAM: quasi espressa solo nelle cellule nervose; all’interazione e fra le proteine glicosilate esposte sulla superficie delle cellule - Selettine: legano prevalentemente glicoproteine esposte dalla proteina di membrana della cellula con cui deve aderire. Hanno ruolo importante nell’adesione dei leucociti all’endotelio dei capillari preliminare alla loro fuoriuscita verso il sito di reazione infiammatoria; - Integrine: sono recettori eterogenei che svolgono un ruolo importante nell’interazione out-in. Legano moltissime molecole della matrice extracellulare. A seconda della loro combinazione (sono dei dimeri) riconoscono vari componenti extracellulari. svolgono un ruolo fondamentale nelle interazioni tra membrana plasmatica e matrice extracellulare (ECM); i loro domini esterni si legano al collagene o 5 alla fibronectina della ECM. Permettono alle cellule di “farsi sentire” e di garantire la trasmissione allinternondella cellula il cambiamento esterno Queste proteine interagiscono tutte con il citoscheletro, le Si tratta di molecole che presentano siti di legame per il Ca cui proteine vengono modificate, portando ad un extracellulare. Si tratta di punti precisi a livello dei quali le proteine cambiamento nella forma della cellula e portando a vengono attivate dagli ioni calcio. modifiche genomiche. Le proteine del citoscheletro sono legate a proteine dell’envelope nucleare, le quali risultano a contatto con la cromatina (flusso di informazione che parte dall’esterno della cellula e arriva fino alla cromatina rendendola piu rilassata) - Caderine: partecipano alle giunzioni strette delle cellule. Qui entra in gioco un meccanismo di trasduzione del segnale mediato dalla proteina WMP. Un esempio di recezione di un segnale che viene trasdotto per arrivare ad una risposta è la demolizione del glucosio: partendo da un segnale extracellulare mediato dal glucagone (agisce nel fegato – regolazione della glicemia) o dall’adrenalina (agisce nel muscolo – produzione di energia). Una singola molecola di adrenalina porta alla produzione di centinaia di milioni di molecole di glucosio-1-fosfato in modo rapidissimo. Questo glucosio-1-fosfato va a finire nella glicolisi per poi essere trasformato in glucosio-6-fosfato. Da qui procede la degradazione ossidativa con perdita di elettroni da queste molecole che vengono trasferite ai trasportatori di elettroni che andranno nella catena di trasporto degli elettroni per la fosforilazione ossidativa. La glicolisi è una prima parte dove c’è una produzione minima di ATP in condizioni anaerobiche, mentre la fosforilazione ossidativa utilizza l’ossigeno che viene trasformato in acqua. L’energia che porta alla fosforilazione viene ricavata da milioni di H+ accumulati nello spazio tra le due membrane mitocondriali. È questa forza elettromotrice che viene usata quando gli H+ passano dallo spazio intermembrana alla matrice mitocondriale, luogo dove avviene la fosforilazione ossidativa. DESCRIZIONE DI SPECIFICHE VIE DEL SEGNALE Una cellula è dotata di numerosissimi recettori quindi, contemporaneamente, va incontro alla responsività di diverse molecole. A seconda della risposta che la cellula deve dare saranno prevalenti alcuni segnali rispetto ad altri: la trasduzione del segnale è in funzione all’esigenza della cellula. Ogni tipologia di cellula ha un diverso tempo di crescita. 6 Il fatto che un recettore induca diverse tipologie di segnale spingerà la cellula a sentire l’esigenza di: 1. Proliferare o sopravvivere: questi due termini sono diversi. In laboratorio viene usata una metodologia particolare per capire se una cellula è viva o morta: sistema calceina propidio ioduro. La calceina è un colorante permeabile alla membrana. Non è di per sé fluorescente, ma emette una forte fluorescenza verde una volta idrolizzato in una cellula vitale. Quindi, la sua fluorescenza indica la vitalità delle cellule. Al contrario, il colorante ioduro di propidio può raggiungere il nucleo solo passando attraverso la membrana danneggiata delle cellule morte. Quindi, la sua fluorescenza indica la morte delle cellule. Poiché sia la calceina che il propidio ioduro possono essere eccitati con luce a 490 nm, è possibile il monitoraggio simultaneo delle cellule vive/morte con un microscopio a fluorescenza con singola eccitazione. Per capire quanto le cellule proliferano si usa la conta cellulare nella camera di Burker. Ogni tipologia di cellula ha un doubling time, ovvero un tempo di crescita che raddoppia che è specifico per ogni tipologia cellulare. Diverse sono le linee cellulari rispetto a colture primarie. Le linee cellulari sono cellule che derivano dal tumore, cellule trasformate che continuano a proliferare per un tempo indefinito. Queste non sono utili per avere risposte aderenti a quello che si vuole scoprire. Le colture primarie, invece, sono cellule che possono essere messe in coltura da una biopsia umana o animale. Il vantaggio è quello di avere a che fare con cellule che provengono dall’organismo. Il limite è che queste non proliferano in modo indefinito, non sono semplicemente manipolabili. Questo è per dire che i risultati che si ottengono possono derivare da una serie di pianificazioni sperimentali che prevedono modelli sperimentali che possono avere anche dei limiti. Un altro limite importante della scienza è che le cellule sono coltivate in una piastra monostrato con solo due dimensioni, mentre noi viviamo in tre dimensioni. La responsività di cellule cresciute in monostrato è completamente diversa rispetto alle cellule in tridimensionalità. L’obiettivo è quello di andare verso la realizzazione di modelli sperimentali tridimensionali il più vicino possibile al fisiologico utilizzando colture primarie e non linee cellulari e mimando il microambiente cellulare (con tutte le sue popolazioni cellulari). 2. Differenziare o aderire; 3. Migrare o cambiare il tipo di metabolismo. I recettori possono essere tanti o pochi: - Se sono pochi sulla superficie cellulare, il segnale che la cellula riceverà sarà basso o non ci sarà, nonostante ci sia abbondanza di ligando. - Se sono tanti il segnale ci sarà e sarà sostanzioso. Sperimentalmente parlando, non è detto che la presenza del ligando significa che la cellula è in grado di rispondere. La cellula risponde solo se c’è una quantità adeguata di recettori e questi non sono alterati. 7 RTK - recettori tirosin chinasici I recettori tirosina chinasi trasmettono segnali attraverso la membrana plasmatica dall’esterno all’interno della cellula attraverso una transautofosforilazione Di solito attraversano la membrana con un’unica α elica, non subiscono cambiamenti conformazionali ma, una volta attivati da un segnale extracellulare, inducono la formazione di dimeri Signaling indotto dai recettori tirosin chinasici Dimerizzazione indotta dal ligando Autofosforilazione La fosforilazione nel dominio catalitico incrementa l’attività chinasica La fosforilazione al di fuori del dominio catalitico crea i presupposti per legare altre proteine.  I recettori tirosin chinasici attivano la proteina Ras, che lega il GTP. Normalmente Ras è inattiva ed è legata al GDP. La proteina attivatrice di Ras viene attivata grazie al legame di un Fisiologia e Trasduzione – Lezione 4 – 17/10/22 adattatore preoteico, attivato dal legame con una proteina attivata riconoscendo il Sbobinatore: Sara Sorrentino recettore tirosin chinasici attivato, a cui si è legata la molecola segnale Revisore: Brigida Pantaleo DESCRIZIONE DI SPECIFICHE VIE DEL SEGNALE RECETTORI TIROSIN CHINASICI Meccanismo d’azione della proteina Le tirosine fosforilate traslano la posizione RAS: del loop di attivazione, Questa classe di recettori attiva la proteina Ras esponendo il sito di legame con gli la quale lega il GTP. effettori e attivano il recettore (nel sito che prima la teneva Essa è coinvolta nel controllo di diverse spenta a causa del GDP, viene legato il attività cellulari tra cui: la proliferazione GTP e Ras si attiva) cellulare. Qui RAS viene attivato in seguito a fattori di crescita, segnali che provengono dall’ambiente extracellulare, ovvero l’insieme dei segnali legati alla proliferazione cellulare. Una volta che il ligando entra in contatto con il sito attivo, si verifica l’attivazione del recettore TK (Tirosin Kinasi) in seguito al fenomeno di fosforilazione. Esistono proteine adattatrici che vanno ad attivare un ulteriore proteina, in questo caso rappresentata dalla “proteina adattatrice di RAS” che attiva la proteina Ras inattiva, spostando il GDP facendo legare il GTP, come conseguenza abbiamo l’attivazione della proteina Ras. Quest’ultima esplicherà una serie di attività volte a propagare il segnale soprattutto a livello della proliferazione cellulare. Grazie alla fosforilazione del recettore vengono esposti dei siti della proteina recettoriale che prima erano nascosti e che in questo caso permettono il riconoscimento ed Una volta attivata Ras innesca una fosforilazione a il legame con questo adattatore proteico. cascata, dove una serie di protein chinasi si attivano in sequenza. Questa cacata Una volta attivata, Ras innesca una porta il segnale della membrana plasmatica al fosforilazione a cascata, dove una serie di nucleo ed è chiamata cascata MAP(Mitogen Activated protein-chinasi si attivano in sequenza. Protein). Ras attivata, attiva Raf, che fosforila MEK che Questa cascata, definita cascata MAP fosforila ERK. Erk attivata trasloca nel nucleo dove (Mitogen Activated Protein), ovvero proteine fosforila fattori di trascrizione che modulano attivate da segnali mitogenici, trasferisce il l’espessione di quei geni coinvolti nell’attivazione del ciclo cellulare. segnale dalla membrana plasmatica al nucleo. La prima chinasi è la chinasi RAF, che va ad attivare una chinasi MEK che a sua volta attiva una chinasi ERK. Questi passaggi sono ATP dipendenti (donatrice di gruppi fosfato). Erk è la proteina che trasmette il segnare più a valle, capace di attraversare il nucleo dove fosforila una serie di unità proteiche target, che posso essere ad esempio: - Concetto genomico: fattori di trascrizione, che sono stati fosforilati e assumono la capacità di interagire con i cis-element dei geni target, ciò porta a variazione dei livelli dell’espressione genica; - Concetto di modificazione del livello di attività proteica: le proteine bersaglio rappresentano la categoria che in seguito a fosforilazione modificano la loro attività. 1  La via delle MAP chinasi può promuovere la proliferazione cellulare, attivando la trascrizione di alcuni geni che codificano per le cicline G1. Il gene Myc promuove la proliferazione di diversi geni, proteine coinvolte nel ciclo cellulare tra cui la famiglia delle CICLINE e proteine ad esse associate. Questa trasduzione mediata dalla cascata delle MAP chinasi attiva, sotto lo stimolo di Ras, il fattore di trascrizione Myc che porta ad una modificazione del ciclo cellulare. La via RAS/RAF/MEK/ERK è la classica via di segnalazione RAS/MAPK implicata nella proliferazione, differenziazione e morte cellulare mediata da fattori di crescita. Forme mutanti di RAS portano a neoplasie per proliferazioni incontrollate. Fasi del ciclo cellulare: partecipazione di proteine come la Ciclina A-B-D-E, le chinasi associate ad esse prendono corrispettivamente il nome di: Cdk 2-1-4-2. RB = proteina retino blastoma. 2 EGF (Epidermal growth factor) Tra i vari fattori che promuovono l’attivazione di Ras, troviamo: EGF = fattore di crescita epiteliale (anche altri tipi di cellule). Quando EGF si lega al suo recettore si scatena un fenomeno di fosforilazione inducendo un legame con proteine citosoliche con domini SH2 (Src homology 2). Tutte le proteine con questo dominio sono capaci di legare sequenze di tirosina fosforilate, ad esempio: - PLCγ, la quale dopo essere entrata in contatto con EGF, lega la porzione del recettore fosforilato con tirosina e attiva la produzione di InsP 3 (inositolo) e DAG (Diacilglicerolo). Via FosfolipasiC mediata, che non ha come obiettivo l’attivazione di Ras. - GRB2 lega la proteina Sos ma in modo non produttivo. Questa via diventa attiva quando GRB2 riconosce nel recettore i residui fosforilati in tirosina; in seguito, GRB2-Sos indurrà l’attivazione di RAS. L’attivazione della MAPK innesca la famiglia Ap-1, all’interno della quale troviamo diversi fattori di trascrizione. Quando un ligando si lega ad un recettore la loro interazione scatenerà contemporaneamente una serie di risposte all’interno della cellula. Entrambe le molecole precedenti sono proteine con domini SH2 (non è detto che tutte queste tipologie di ↳ dominio proteico altamente conservato e presente in + di 100 diverse proteine attivano RAS). proteine (la + importante legame il è l'oncoproteina suc I la funzione del dominio è ((PLC). alle sea. di trosine fosforilate su altre proteine , come l a fosfolipos al recettore la GRB2 si legano e ↳ il diCR2 inducel'attivazionediSoscheattive legame di PLC induce la ↳ i l legame e Domini delle proteine coinvolte nella segnalazione dei recettori TK. sua attivazione e la produzione DAG (crescita cellulone) di IPz e I recettori TK mediano una segnalazione che vede il coinvolgimento di proteine che hanno il dominio SH2 per il riconoscimento della porzione fosforilata ma troviamo anche altri domini che servono loro per funzionare (attività enzimatica, quelli che legano la membrana, proteine target). A cosa serve fosforilare le tirosine? Perché il recettore deve autofosforilarsi? In quanto il recettore deve cambiare conformazione e permettere il riconoscimento con un qualcosa che prima non era esposto. Comprendere l’attività di una proteina passa attraverso i suoi domini; quindi, quale porzione svolge quella determinata funzione. Fosfotirosina Colori diversi per Funzioni diverse dei diversi domini 3 Risulta esse molto importante spegnere il segnale. Per disattivare il sistema entrano in gioco protein tirosin fosfatasi o in alcuni casi i recettori attivati vengono portati per endocitosi ai lisosomi e digeriti. [Non tutte le proteine con domini SH2 attivano, ovvero permettono la trasmissione del segnale. Alcune posso essere coinvolte nello spegnimento/inibizione del segnale costituendo un feed-back negativo.] CBL (E3 ubiquitin-protein ligase) è la ligasi del complesso che invia tutto al proteasoma. Può interagire con i RTK attivati e promuovere la loro “monoubiquitinazione”. Tale processo favorisce l’endocitosi e la degradazione dei recettori nei lisosomi. L’endocitosi sembra essere mediata da proteine endocitiche che, attraverso interazioni con l’ubiquitina, riconoscono i RTK monoubiquitinati e li inviano nelle vescicole rivestite di clatrina (proteina) ed infine ai lisosomi. Questa vescicolazione non porta necessariamente alla morte del recettore; A volte il recettore TRK utilizza questa via per essere mediatore di una risposta all’interno di organelli, dentro un compartimento cellulare: il compartimento endosomiale. ENDOCITOSI DEI RECETTORI TIROSINA CHINASI -Viaggio di RTK al lisosoma- La clatrina si lega quando sente il segnale di endocitosi e resta legata per permettere al processo di compiersi. La proteina CBL (puntino giallo) monoubiquitina il recettore. Quest’ultimo scatena la formazione di una vescicola rivestita da clatrina (tutte le volte che c’è questa proteina significa che dall’altra parte il recettore ha un sito di riconoscimento per essa). Es: Se il recettore per le LDL è mutato e non presenta il sito di riconoscimento per la clatrina, le LDL non entrano nell’ epatocita e il colesterolo resta all’interno del sangue questo può portare ad ipercolesterolemia (questione genetica, in quanto per mutazione il recettore non riconosce questa determinata proteina). Si forma un early endosoma dove non solo CBL continua ad essere associato al recettore ma troviamo altre proteine che partecipano al fenomeno dell’endocitosi, che variano da tessuto a tessuto e che accompagnano il viaggio di RTK. Ci saranno diversi destini: - digestione del recettore; - continuo della segnalazione all’interno dell’endosoma; - recicling del recet