Parasitología en el Laboratorio PDF

2. MODOS DE TRANSMISIÓN 13 Conocer la existencia de una posible exposición de riesgo así como la zona geográfica donde el paciente podría haber adquirido la infección es fundamental para orientar la búsqueda (tabla 1). Tabla 1: Modos de transmisión de las pri...

2. MODOS DE TRANSMISIÓN 13 Conocer la existencia de una posible exposición de riesgo así como la zona geográfica donde el paciente podría haber adquirido la infección es fundamental para orientar la búsqueda (tabla 1). Tabla 1: Modos de transmisión de las principales parasitosis Exposición Proceso infecciosos asociado Contacto con agua dulce Esquistosomiasis, amebiasis Contacto directo con tierra (caminar Anquilostomiasis, estrongiloidosis, larva descalzo) migrans cutánea Amebiasis, criptosporidiosis, ciclosporosis, Consumo de agua no tratada giardiasis Consumo de alimentos crudos o poco Triquinosis, amebiasis, toxoplasmosis, cocinados cestodiasis Picadura mosquito Malaria, filariasis Tripanosomiasis africana, leishmaniasis, Picadura moscas oncocercosis Picadura triatómidos Tripanosomiasis americana Histoplasmosis Cuevas 14 3. RECOGIDA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS 15 Las consecuencias de una muestra mal tomada y/o mal enviada pueden suponer un fracaso en la identificación del agente etiológico Lo ideal es que las muestras se transporten al laboratorio dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Para asegurar la integridad de las posibles formas parasitarias que pueden estar presentes es importante el uso de medios especiales de conservación, o de soporte para el transporte de las muestras que se retrasen más de 30 minutos. Si las muestras no se pueden procesar en cuanto se reciben en el laboratorio, se deben almacenar a temperatura ambiente, o refrigeradas, según el tipo de muestra (tabla 2). Tabla 2: Recogida y tipos de muestras Muestra Contenedor Utilidad diagnóstica Miniparesp o bote de Heces Helmintos y protozoos boca ancha Test de Graham Cinta adhesiva Enterobius vermicularis Giardia, Strongyloides, Aspirado duodenal o Bote de boca ancha Clonorchis, yeyunal Enterobius.vermicularis Sangre Tubo con EDTA Plasmodium, microfilarias EDTA: etilediamiotetraacetato 16 3.1 Miniparasep Las muestras de heces se recomienda recogerlas empleando frascos con medio de transporte para asegurar la viabilidad de las posibles estructuras parasitarias existentes. Uno de los sistemas disponible es el sistema Miniparasep (figura 1) y para su correcto uso se deben seguir las instrucciones del fabricante. Figura 1: Sistema Miniparasep Fuente: Elaboración propia 3.2 Bote de boca ancha Se emplearán estos botes cuando en las heces se visualiza la expulsión de cualquier forma que pudiera ser un parásito o para introducir el aspirado duodenal/yeyunal. 3.3 La técnica de Graham El test de Graham es una técnica relativamente sencilla de realizar que nos permite el estudio de Enterobius vermicularis y, en ocasiones, de Taenia spp. En el caso de E. vermicularis, las hembras de este nematodo realizan la puesta de huevos en la zona anal del paciente, normalmente por las noches, lo cual genera un intenso picor. Y en el caso de Taenia spp., a veces se produce la salida a través 17 del esfínter anal de anillos llenos de huevos o proglótides, lo cual facilita el depósito de estos huevos en la región perianal. Para llevar a cabo este test es necesario tener en cuenta unas recomendaciones durante el proceso de recogida de muestras, que deben ser correctamente explicadas a los pacientes que se vayan a someter al test: - Las muestras se deben recoger por la mañana, nada más levantarse, y antes de realizar el aseo matinal. - La noche anterior a la recogida de las muestras no se debe aplicar crema ni pomada en la región perianal. - La cinta adhesiva que se utilice para la recogida de la muestra debe ser transparente para poder visualizarlo posteriormente en el microscopio. - Se aconseja entregar al paciente un soporte (portaobjetos) para pegar la cinta adhesiva una vez recogida la muestra, así como un contenedor para la misma, de manera que el transporte al laboratorio sea el adecuado. Pasos para la recogida de la muestra (figura 2): 1. Debemos pegar un fragmento de la cinta adhesiva sobre el extremo terminal del portaobjetos. Con el resto sobrante de cinta adhesiva será con lo que recogeremos la muestra para posteriormente pegarla a lo largo del portaobjetos. 2. Para recoger la muestra, debemos separar los glúteos del paciente de manera que visualicemos bien la región perianal, y entonces iremos pegando la cinta adhesiva (pegada al porta) por los márgenes y pliegues del ano varias veces. 3. Cuando estemos seguros de haber pasado la cinta adhesiva por la totalidad de la región perianal, con mucho cuidado pegaremos la cinta adhesiva utilizada en el resto del portaobjetos. De esta forma, la muestra ya está lista para su observación al microscopio. 4. Para finalizar, la persona que ha recogido la muestra debe lavarse las manos muy bien para evitar cualquier posible contagio. 18  Figura 2: Pasos para recoger la muestra para el test de Graham 3.4 Sangre Para la obtención de la sangre que será objeto de estudio se deben tener en cuenta unas recomendaciones:  La sangre se extraerá por punción de la pulpa del dedo o por punción venosa  Si la obtenemos a por punción pulpar, es preferible utilizar los dedos anular o cordial de la mano izquierda.  En el caso de la punción venosa se aconseja no utilizar anticoagulante en los tubos de extracción de la misma, pero si fuera necesario usarlo, se recomienda que éste sea EDTA.  Como en otros casos de análisis parasitológicos, la muestra debe ser procesada y examinada al microscopio lo más rápidamente posible tras su extracción. Ese aconseja que el límite de tiempo para su estudio no sobrepase una hora. Esto es importante porque el tiempo es un factor que altera la morfología de los hematíes y por lo tanto la de los posibles parásitos que existan en la muestra. 19 En cuanto a la técnica de laboratorio seleccionada para el estudio del paludismo, las principales técnicas son la extensión de sangre y la gota gruesa. La gota gruesa nos permite estudiar mayor cantidad de sangre, Identificación de Plasmodium Sangre en tubos con EDTA Identificación de filarias Se aconseja remitir una muestra de sangre anticoagulada de 10 ml para procesarlo por técnicas microscópicas. Si se sospechan filarias linfáticas también debe remitirse una muestra de sangre extraída de noche 20 4. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO 21 Las pruebas diagnósticas que el médico debe solicitar al laboratorio van a depender de los síntomas del paciente. Por citar algunos ejemplos, ante cuadros de diarrea prolongada se recomienda solicitar un estudio parasitológico de heces en el que se buscarán huevos de platelmintos, sus larvas, quistes y ooquistes de protozoos. En todo paciente febril procedente o visitante de zona endémica se recomienda descartar malaria. En pacientes con fiebre y hemólisis procedentes de los Estados Unidos de Norteamérica y en pacientes esplenectomizados con o sin historia de viajes debe descartarse Babesia. Ante cuadros de fiebre de origen desconocido en ausencia de exposición a zonas endémicas por la posibilidad (remota pero potencialmente grave) de malaria de aeropuerto, o de adquisición por transfusión de sangre (Leishmania spp. y otros), concentrado de hematÌes (Plasmodium spp. y Babesia spp o de plaquetas (Trypanosoma spp.). Otro punto importante en el laboratorio de Parasitología es el manejo del microscopio. Por norma general, cuando realicemos el enfoque de la muestra siempre debemos comenzar con el objetivo de 10X, con el cual podremos visualizar la mayoría de los parásitos que estudiemos (protozoos intestinales, huevos y larvas de helmintos, microfilarias, etc). Después, en función del organismo que estemos buscando, será más adecuado continuar con el objetivo de 40X (protozoos intestinales y tisulares, huevos y larvas de helmintos, microfilarias, cultivo de Strongyloides, etc.) y finalmente el objetivo de 100X será necesario para la observación de protozoos intestinales y tisulares, así como para las microfilarias. En ocasiones es necesario disponer de un medidor para la correcta identificación de los quistes y/o huevos. 22 4.1 RECOMENDACIONES El estudio de las muestras fecales nos permite detectar la presencia de protozoos y larvas o huevos de helmintos. Para obtener un buen resultados en un examen parasitológico se deben tener en cuenta diferentes aspectos, como por ejemplo: - El empleo de técnicas adecuadas según el parásito del que se sospeche. - La recogida de la muestra debe hacer durante tres días diferentes debido a que la eliminación de huevos o larvas no es constante, por lo que con el estudio de una sola muestra podríamos obtener un diagnóstico equivocado. - Un correcto transporte de la muestra (está indicado recoger las muestras de heces en material de plástico, nunca en material absorbente como puede ser el papel). - Las muestras se deben procesar con rapidez. - Se debe realizar un estudio macroscópico de la muestra, ya que a veces se pueden observar estructuras visibles a simple vista, como por ejemplo las proglótides de las tenias, gusanos adultos de Enterobius vermicularis o de Ascaris lumbricoides. - La observación al microscopio debe ser ordenada y sistemática. - Se debe tener en cuenta la consistencia de la muestra (si es diarreica o no) y escoger la parte de la misma que sea más adecuada para el estudio. - La experiencia del observador en una parte muy importante en el estudio parasitológico ya que en las muestras fecales existen numerosas partículas, llamadas artefactos, que pueden ser confundidas con huevos o larvas de parásito. A continuación describiremos las técnicas de laboratorio más utilizadas en el estudio de los parásitos en heces, centrándonos en el estudio microscópico de la muestra. Como hemos comentado al inicio de este libro, tratamos de reunir la información necesaria para llevar a cabo el análisis parasitológico en pequeños laboratorios, es decir, de realizar una introducción al análisis parasitológico. Por este motivo no vamos a profundizar en aquellas técnicas que requieren material especial (microscopios de fluorescencia, centrífugas especiales, etc.) ya que este tipo de análisis se suelen realizar en los laboratorios de referencia, sino que vamos describir las técnicas de diagnóstico más comunes mediante las cuales podemos confirmar una sospecha clínica. 23 4.2 ESTUDIO MICROSCÓPICO DE LA MUESTRA Existen diferentes métodos de estudio en el análisis de heces, algunos de los cuales incluyen colorantes especiales. 4.2.1 EXAMEN EN FRESCO Este tipo de examen se utiliza para la observación de las formas móviles de los protozoos intestinales, lo que conocemos como trofozoitos. En este estudio es muy importante realizar el procesamiento lo más rápidamente posible desde la obtención de la muestra ya que de otra manera la muestra se seca y los trofozoitos perderían la movilidad. El tiempo recomendado para llevar cabo un análisis satisfactorio se estima entre 20 y 30 minutos tras su emisión. También es importante rechazar aquellas muestras que hayan sido mantenidas o guardadas en nevera. Para realizar el examen en fresco de la muestra es aconsejable tener en cuenta la consistencia de las heces, por lo que diferenciaremos entre heces de consistencia líquida o diarreica y heces de consistencia normal. Heces de consistencia líquida o diarreica Para el estudio de las heces diarreicas debemos colocar un gota de la muestra entre un porta y un cubreobjetos y observarla al microscopio utilizando el objetivo de 40X. Las estructuras que observaremos son, principalmente formas móviles: - Trofozoitos de Amebas - Trofozoitos Giardias - Trofozoitos de Balantidium - Sangre y pus Heces de consistencia normal Cuando la consistencia de las heces es normal, debemos mezclar una pequeña cantidad de heces con una gota de suero fisiológico sobre un portaobjetos. Con una varilla debemos homogeneizar la mezcla lo máximo posible. La observación al microscopio tenemos que hacerla con el objetivo de 10X y con el de 40X. Con el objetivo de 10X podremos visualizar huevos y larvas de Helmintos. Con el objetivo de 40X, y si además añadimos una gota de Lugol, observaremos: 24  - Quistes de Amebas - Quistes de Giardias - Quistes de Balantidium - Levaduras - Isospora y otros El uso de Lugol facilita la visualización de estas estructuras considerablemente, por lo que es aconsejable utilizarlo si está a nuestra disposición. 25 4.3 TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN DE HECES Este tipo de técnicas se aplicarán cuando el número de parásitos presentes en la muestra pueda ser limitado, ya que su objetivo es aumentar la sensibilidad de análisis parasitológico. Entre las diferentes técnicas de concentración de heces existentes vamos a mencionar la Técnica de Ritchie, el Método de Allen and Ridley y la Técnica de Kato-Katz. 4.3.1 Técnica de Ritchie Está técnica también es conocida como técnica de formol éter y su uso está estandarizado en la mayoría de los laboratorios de Parasitología. La técnica se basa en la separación de las heces en dos partes, conteniendo una de ellas los parásitos presentes en la muestra y en la otra los restos fecales no útiles para nuestro estudio. Esta técnica está indicada para la investigación de huevos y larvas de helmintos, así como quistes de protozoos. La técnica consiste: 1. En un mortero o en un tubo de boca ancha, tenemos que mezclar aproximadamente 1 gramo de heces (o una porción de muestra de 1cm de diámetro) con 10 ml de Formol al 10%. Con ayuda de una varilla debemos remover la mezcla hasta obtener una consistencia homogénea. 2. Dejamos reposar la muestra durante 10-15 minutos. 3. A continuación, debemos colar la muestra con ayuda de un embudo, al cual hemos colocado previamente una gasa extendida que nos ayude a filtrar, en un tubo de centrífuga. 4. Centrifugar y eliminar el sobrenadante 5. Añadimos ahora 5 ml de alcohol tamponado a ph7 y agitamos. 6. Añadimos 5 ml de solución de éter, tapamos rápidamente y agitamos con fuerza durante 1 minuto (con precaución). 7. Destapamos el tubo y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 5 minutos. 8. Al finalizar este tiempo, decantamos el sobrenadante y limpiamos las paredes superiores del tubo con un escobillón para que los restos fecales que están adheridos no contaminen el sedimento. 26  9. Para terminar, debemos observar al microscopio el sedimento obtenido tras la centrifugación. Para ello, lo diluimos con unas gotas de suero y lo examinamos al microscopio a 10X en un principio, y posteriormente a 40X. 10. Para optimizar la visualización al microscopio podemos añadir Lugol al portaobjetos en el que depositemos la muestra. 4.3.2 Método de Allen and Ridley Este método es muy parecido al anterior, de hecho los tres primeros pasos son iguales. Una vez coladas las heces, se debe añadir 3 ml de éter etílico y una vez tapado el tubo, agitar vigorosamente. A continuación lo centrifugamos a 2000 rpm durante 5 minutos y después decantamos el sobrenadante. Para la observación al microscopio podemos diluir el sedimento con un par de gotas de suero fisiológico. 4.3.3 Técnica de Kato-Katz Esta técnica es adecuada para el estudio de helmintos así como para clarificar un sedimento demasiado espeso. El material que necesitamos para llevar a cabo esta técnica es:  La solución de Kato, que está constituida de:  Glicerina (100 ml)  Agua destilada (100 ml)  Verde malaquita al 3% (1 ml)  Papel celofán en trocitos de aproximadamente 2x4 cm. Estos trocitos se introducirán en un recipiente que contiene la solución de Kato durante 24 horas antes de ser utilizados. Los pasos a seguir a continuación son: 1. Realizar una extensión de la muestra de heces sobre un portaobjetos intentando que la extensión sea moderadamente extensa. 2. Colocar encima de la extensión un papelito impregnado de la solución de Kato y eliminar las burbujas de aire que se puedan generar. 3. Dejamos la preparación bajo la acción de calor ligero (por ejemplo debajo de la luz de un flexo) durante 10 minutos. 27 4. La observación al microscopio se realizará al cabo de 20-30 minutos y con el objetivo de 10x. 28 4.4 TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN DE HECES POR FLOTACIÓN 4.4.1 Método de Willis (concentración por flotación de la muestra fecal) Este método está recomendado para la investigación de protozoos y helmintos. La técnica consiste en: 1. Extraer una muestra de heces de aproximadamente el tamaño de un garbanzo y colocarla en un tubo de boca estrecha 2. Añadir una pequeña cantidad de solución de cloruro sódico a saturación para disolver la muestra. Una vez disuelta la muestra debemos llenar el recipiente hasta el borde con la misma solución. 3. Colocamos un porta sobre el extremo del recipiente de tal forma que contacte con el líquido intentando no dejar burbujas de aire entre porta y líquido. 4. A los 15-20 minutos, retiramos el porta y colocamos un cubre para poder observarlo al microscopio. El principio de esta técnica se basa en que los huevos de helmintos tienen un peso específico menor que el de la solución saturada de cloruro sódico por lo que tienden a subir y pegarse en el portaobjetos. 29 4.5 MÉTODOS DE FIJACIÓN DE HECES 4.5.1 Método MIF (Mertiolato/Yodo/Formol) Esta técnica es útil para fijar formas vegetativas de protozoos a la misma vez que se tiñen, lo que facilita la visualización al microscopio. Los reactivos que utilizamos son dos, la solución de Mertiolato/Formol y la solución de Yodo. La solución de Mertiolato/Formol está compuesta por: - Glicerina (5 ml) - Formol 37% (25 ml) - Tintura de Mertiolato (200 ml) - Agua destilada (250 ml) La composición de la solución de Yodo es: - Yodo (5 g) - Yoduro potásico (10 g) - Agua destilada (100 ml) La solución MIF se obtiene mezclando 9,40 ml de solución de solución de Mertiolato con 0,60 ml de solución de Yodo. Lo más cómodo es preparar tubitos de la solución MF que contengan 4,7 ml cada uno. Se deben conservar en oscuridad y el tiempo de estabilidad es de un mes aproximadamente. Con la solución de yodo hacemos lo mismo, preparamos tubitos que contengan 0.30 ml cada uno. 1. Mezclamos el contenido del tubito MF con el del tubito que contiene la solución de yodo. 2. Con ayuda de una espátula extraemos una muestra de heces del tamaño aproximado de un garbanzo y lo introducimos en un tubo que contenga la mezcla realizada en el paso 1. 3. Homogeneizamos la muestra correctamente y lo agitamos. Dejamos el tubo en reposo durante media hora antes de iniciar el estudio microscópico. A continuación observaremos la mezcla al microscopio, y si existen protozoos en la muestra, los observaremos teñidos con una tonalidad verde-amarillenta intensa debido a la solución MIF. 30 4.5.2 Método de Formol Para realizar esta técnica necesitamos solución acuosa de formol al 10%. Debemos preparar tubos individuales que contengan 5 ml de esta solución. 1. Cogemos una muestra de heces de aproximadamente el tamaño de un garbanzo y lo introducimos dentro de uno de los tubos que contiene 5 ml de solución de formol. 2. Homogeneizamos la muestra lo máximo posible. A partir de esta mezcla podemos realizar técnicas de concentración como las de formol-éter y tinciones permanentes. 31 4.6 CULTIVO DE LARVAS DE Strongyloides Los pasos a seguir son: 1. Mezclar unos 50 gr de heces con agua hasta conseguir una mezcla homogénea 2. Añadir un volumen de carbón vegetal granulado similar al utilizado en el paso número 1 y mezclar homogéneamente. 3. Preparamos una placa de Petri con un disco de papel vegetal humedecido en agua en su superficie, y a continuación vertemos sobre éste la mezcla preparada en el paso 2 4. Guardar la preparación en la oscuridad e ir examinándola a diario para observar si hay crecimiento. Si se secase, se puede ir añadiendo agua. 5. A los 5-6 días se añade un poco de agua a la placa de Petri y se observan los borden del disco de papel de filtro con una lupa, o bien al microscopio con el objetivo de 40X. 32 4.7 TINCIÓN PARA Cryptosporidium, Isospora y Cyclosporidium (ZIEHL-NEELSEN MODIFICADO) Con esta tinción observaremos los ooquistes teñido de color rojo intenso, sobre un fondo verde. Otra tinción recomendada para el estudio de estos parásitos es la Tinción de Auramina, pero para visualizar los resultados, es necesario disponer de un microscopio de fluorescencia. Los pasos que hay que realizar son los siguientes: 1. En primer lugar se debe realizar una técnica de concentración de parásitos en heces como puede ser la técnica del formol-éter comentada anteriormente. 2. A partir del material obtenido en el paso 1, haremos una extensión que dejaremos secar. 3. Fijar con alcohol metílico durante 3 minutos 4. Cubrir la preparación con fucsina fenicada durante 3 minutos, calentando tres veces el colorante hasta que observemos la emisión de vapores. 5. Lavar en agua y proceder a la decoloración de la extensión cubriéndola con ácido sulfúrico al 7% durante 1 minuto. 6. Lavar y colorear con verde malaquita durante 5 minutos 7. Finalmente, lavar y secar al aire para poder observarla al microscopio, con el objetivo de inmersión. 33 4.8 INVESTIGACIÓN DE PARÁSITOS EN SANGRE Los hemoparásitos, así como los vectores que los transmiten, producen enfermedades que están ampliamente distribuidas en toda la zona tropical. El aumento del turismo y la inmigración son fenómenos que actualmente están favoreciendo el aumento de este tipo de enfermedades en zonas no endémicas. En la investigación de parásitos en sangre, al igual que el caso de los parásitos en heces, es muy importante tener en cuenta los puntos que hemos comentado al principio de este libro (historia clínica, antecedentes epidemiológicos, periodo de incubación, periodicidad del parásito, etc.), ya que toda esta información nos permitirá escoger la técnica más adecuada para llevar a cabo el estudio de manera favorable. Para el diagnóstico de los parásitos en sangre existen técnicas inmunológicas basadas en la presencia de anticuerpos o sustancias derivadas del microrganismo, y técnicas parasitológicas que se basan en el estudio directo de la muestra y la demostración de la presencia del parásito en la misma. Estas últimas son las que desarrollaremos a continuación. Los parásitos que se pueden identificar en muestras de sangre son los Plasmodios, las Microfilarias, las Leishmanias, las Babesias y los Tripanosomas. La investigación de este tipo de parásitos se puede llevar a cabo con el análisis en fresco de la muestra o mediante la realización de la gota gruesa con la posterior tinción, que nos facilitará la visualización al microscopio. 4.8.1 EXAMEN EN FRESCO Esta técnica se usa para agilizar el estudio de la muestra y poder observar así las formas móviles de los parásitos presentes en ella. Para ello, la muestra de sangre debe ser reciente. Para realizar el examen en fresco de una muestra únicamente debemos colocar una gota de la misma entre un cubre y un portaobjetos, y a continuación observarla al microscopio. Con el objetivo de 10X observaremos las Microfilarias y con el objetivo de 40X podremos visualizar los Tripanosomas. 4.8.2 EXAMEN EN GOTA GRUESA La técnica de la gota gruesa es una técnica de concentración que es útil para la búsqueda de varios parásitos como son los Plasmodios, las Microfilarias, los Tripanosomas y las Babesias. Esta técnica es importante en aquellos casos en los 34 que no existe una parasitación elevada (cuando existe, es fácil localizar a los parásitos en la extensión sanguínea). Esta técnica es muy fácil de realizar. Los pasos a seguir son: 1. Colocar una gota de sangre en el centro de un portaobjetos 2. Con el vértice de otro porta debemos remover la gota depositada durante aproximadamente 1 minuto. El objetivo de este paso es desfibrinar, es decir, evitar la formación de fibrina en el proceso de coagulación 3. Secar la preparación al aire 4. Deshemoglobinizar colocando el porta dentro de un reciepiente con agua destilada en posición vertical 5. Fijar con alcohol metílico de 2-5 minutos 6. Decantar 7. Teñir Para teñir la gota gruesa hay diferentes técnicas, algunas de las cuales comentaremos a continuación. Tinción de Giemsa para Gota Gruesa Los reactivos que utilizaremos para esta tinción son  Giemsa  Agua tamponada (pH 7.2) Los pasos a seguir son: 1. Diluir al 10% el Giemsa con agua tamponada 2. Cubrir la totalidad de la gota con Giemsa durante 30-45 minutos. 3. Lavar y secar 4. A continuación enjuagar la preparación con agua, con mucho cuidado para no perder la muestra. 5. Secar la preparación al aire. 6. Observar al microscopio con el objetivo de 100X y aceite de inmersión. Tinción de Field para Gota Gruesa El material necesario es: 35   Tinción A y B de Field  Agua destilada Los pasos a seguir son: 1. Sumergir la preparación de la gota gruesa durante 5-10 segundos en la solución Field A. 2. Lavar la preparación con agua limpia durante 3-5 segundos. 3. Sumergir la preparación en la solución Field B durante 3-5 segundos. 4. Volver a sumergirla en agua limpia para eliminar los restos de colorante. 5. Secar la preparación al aire y observar al microscopio con el objetivo de 100X. 4.8.3 FROTIS O EXTENSIÓN SANGUÍNEA La preparación de la extensión sanguínea es exactamente igual que la que hacemos en Hematología para la observación de sangre periférica. Una vez hecha la extensión, hay que dejar secarla y a continuación teñirla con Giemsa. En el caso del paludismo, el frotis sanguíneo es la técnica que nos permitirá identificar la especie de Plasmodium, lo cual es primordial para descartar la infección por P. falciparum, que es el que mayor repercusiones pronósticas tiene sobre el desarrollo de la enfermedad. Tinción de Giemsa para el frotis Los pasos a seguir son: 1. Fijar la preparación con Metanol durante 3 minutos. 2. Cubrir la preparación con Giemsa y agua destilada durante 30-45 minutos. 3. Aclarar con agua, con cuidado de no arrastras la muestra, y dejar secar la preparación al aire. 4.8.4 TÉCNICA DE LEUCOCONCENTRACIÓN CON SAPONINA PARA MICROFILARIAS A excepción de Onchocerca volvulus y Mansonella streptocerca cuya localización se sitúa en la piel y ojos y por lo tanto es necesario realizar una biopsia para confirmar el diagnóstico, el resto filarias es posible localizarlas en sangre periférica. 36 Aunque para el diagnóstico de filariasis se pueden utilizar diferentes técnicas, algunas ya mencionadas, como la gota gruesa, extensión sanguínea, examen en fresco, etc., la técnica más rentable es la de leucoconcentración. Esta técnica consiste en: 1. Poner en un tubo de centrífuga 3 ml de sangre con un anticoagulante diferente a la heparina. 2. Añadir 6 ml de suero fisiológico y de 4 a 6 gotas de solución de saponina al 2%. (La saponina no mata a las microfilarias, por lo que si están presentes las podremos ver móviles). 3. Tapar y agitar el tubo. De esta forma facilitaremos la hemólisis en el cono del extremo terminal del tubo de centrífuga. 4. Centrifugamos a 1.500 rpm durante 10 minutos. 5. Eliminamos el sobrenadante 6. Y finalmente recogemos el sedimento con una pipeta para realizar una preparación entre porta y cubre. 4.8.5 TÉCNICA DE MICROFILARIAS CON HEMATOXILINA Con la hematoxilina podemos teñir la vaina de Loa-Loa, que no se tiñe con Giemsa. Esta técnica es exactamente igual que la técnica de Leucoconcentración, sólo se diferencia en la existencia de un último paso, que consiste en la tinción de la extensión obtenida con Hematoxilina durante 10 minutos, calentando suavemente el colorante. Después sólo es necesario lavar con agua y dejar secar. 4.8.6 MEMBRANAS DE NUCLEOPORE El principio de esta técnica se basa en que el tamaño del poro de estas membranas permite el paso de la sangre pero no el de las microfilarias. Es una técnica muy fácil de realizar. Tenemos un cilindro con una membrana interna por la cual se hace pasar la sangre problema (de 3 a 5 ml). Finalmente extraemos la membrana y la observamos al microscopio sobre un porta con el objetivo de 10X. 37