Diagnostic D'Infection PDF

DIAGNOSTIC D'INFECTION *Vendredi 18 oct* I. [METHODE DE DIAGNOSTIC ] 1. [Isolement par la culture] (fig 1) Technique très utilisée **Milieu sélectif** [très approprié] pour permettre les [isolement sélectif] de [diff pathogènes]. **Caractérisations** de **structure** et **métabolisme** comp...

DIAGNOSTIC D'INFECTION *Vendredi 18 oct* I. [METHODE DE DIAGNOSTIC ] 1. [Isolement par la culture] (fig 1) Technique très utilisée **Milieu sélectif** [très approprié] pour permettre les [isolement sélectif] de [diff pathogènes]. **Caractérisations** de **structure** et **métabolisme** complète les caractérisations de ces pathogènes. Les **approches moléculaires** permettent aussi **d'affiner** les **diagnostic** et de les **réaliser + rapidement** Les techniques d'identifications sont (presque) toute les mêmes 2. [Technique omiques ] (fig 2) Ces dernières années, des techniques se sont développées afin d'identifier plus facilement et rapidement les pathogènes dans les échantillons biologiques complexes. Complexité est réduite + facile d'isoler le microorg *[Inconvénients des anciennes techniques]* : techniques très longue (pls jours/ ; semaines) Afin d'aller + vite création **[technique omiques]** **Omique = technique à haut débit = capable d'acquérir bcp d'informations en même temps** *[4 types de molécules pour faire la techn]* : **[ADN]**, **[Protéine]**, **[ARN]**, **[Métabolite]** - *[2 approches chez ADN : ]* On voit des microorg actif (vivant)et inactif (mort) **[Métagénomique]** = échantillon microbien complexe, séquençage de **TOUT** les ADN approche génomique direct **approche de SHOGUN** Peut reconstruire des génomes complet appelé MAG ***[A]* **: séquençage sans a priori ; identification très précis (on a tt les marqueurs) ; Identification microorg + complet ; capable d'identifier les gènes de résistance des antibio et de virulence ***[I]*** : + couteuse ; demande + d'expertise en bio-informatique ; **[Métabarcoding]** = ciblage d'un marqueur d'identification (le + souvent chez les bact : marqueur phylogénétique(gène ADNr 16S). Séquençage d'amplicons. Technique de séquençage la + utilisé aujourd'hui : technologie Illumina - *[technologie Illumina]* (technologie de 2^ème^ génération) [***A*** ]: tech simple ; peu couteuse ; à haut débit identification rapide ; bonne résolution (précis) ***[I]*** : biais d'identification lecture de séquence très courte(150-300bases)( limite la taille des séquençage), - *[Pacbio]*, *[Oxford narospore]* (3^ème^ génération) **[*A* ]**: séquençage de longs fragments d'ADN ***[I]*** : très couteuse ; qualité des séquences -- bonnes à cause des petite région séquencer cela ne permet pas d'avoir une bonne résolution - *[Approche ARN :]* **[Metatransciptomique]** : transcription de tt les ARN, ***[A ]***: par rapport à ADN, on regarde des microorg qui sont actif ***[I]*** : on voit que les gènes exprimé ; ARN est + sensible à la dégradation compliqué d'avoir de l'ARN de bonne qualité Tech avec ADN semblable. ARNr : on a 95-99% donc 1-5% d'ARNm Procaryote on enlève les ARNr ; eucaryote on récupère les ARNm - *[Approche protéine :]* **[Métaprotéomique]** : ensemble des protéines, on extrait les protéines de la communauté microbienne Approche par [spectro de masse] **Protéine casser en peptide spectro donne les caractéristiques des peptides** ***[A ]***: identification de tte les prot exprimée ***[I]*** : on extrait pas tte les prot, besoin de faire pls expériences ; base de données ne sont pas aussi riche (on peut pas tout identifier) ; tech couteuse ; il fait des compétences en bio-informatique pour analyser résultats nécessaire - *[Approche métabolite :]* **[Métabolomique]** : extrait de tte les métabolite de la communauté microbienne [Spectro de masse] ***[A ]***: info direct des métabolite actif ***[I]*** : on peut pas extraire tt les métabolite, tt les métabolite ne sont pas identifier ; tech couteuse ; besoin de compétences en bio-informatique pour analyser les données Approche de volatolomique : on caractérise tt les composé volatile, on regarde que les composé volatile Approche de volatolomique : on caractérise tt les composé volatile on regarde que les composé volatile (fig 3)  3. [Caractérisations des souches bactériennes ] Permet d'avoir un niv de résolution au-dessus de la résolution d'espèces (taxonomie) **[Core génome]** : **ensemble des gènes communs à un grp d'organisme** **[Pangénome]** : **ensemble de tous les gènes présent dans un grp d'organismes, chez une même espèces** (**core génome + génome accessoire**(gène présent que chez certaines souches) Ces gènes accessoire apporte des [adaptabilité spécifiques chez ces souches] (fig 4) La complexité supplémentaire de la caractérisation des microorg réside dans le fait qu'il existe bcp de transfert de gènes entre les diff espèces. Ces transferts de gène appelée « **[transfert horizontaux]** » ou « **[transfert latéraux]** » **[de gènes]** en opposition, le **[transfert verticale = transfert de génération en génération]** Ces [transfert latéraux] participe à [l'évolution] et [adaptation des microorg] les pathogènes utilisent largement ces transferts notamment pour les gènes de virulences et pour les gènes résistance aux antibio donc important de bien caractérisé ces mécanismes de transferts  Il existe *[4 grand mécanismes de transferts :]* (mécanisme latérale de gène) 1. **Mécanisme de transformation** : de l'ADN libre ds l'env des bact, peut être récupéré par certaines bact : « **bactérie compétente** », [l'ADN est transféré dans la cell], peut être **[ADN génomique]** ou **[ADN plasmidique]** 2. **Mécanisme de transduction**, ici se sont les **virus qui véhicule les gènes de [l'espèce vers une autre espèce.]** 3. **Mécanisme de conjugaison**, **[permet d'établir un contact entre 2 bact grâce à un filament]** appelé « **[Pili]** », ce filament est **codé par des gènes** porté par un **plasmide** : **[plasmide F]** plasmide Fertility (plasmide de fertilité) En effet la conjugaison est assimilée, historiquement, la sexualité bactérienne, sauf que chez les bact il existe pas de gamètes, ici on parle [d'échange de matériels génétique]. La découverte de la conjugaison a été à la base des découverte en génétique bactérienne. Lors de la conj il y a **transfert de l'ADN** depuis une **[bact donneuse]** vers une **[bact receveuse]**, l'ADN transféré peut être **intégré à nouveaux dans le génome dans la bactérie receveuse**, s'il s'agit de **[plasmide]**, le plasmide pourront **se répliquer** dans cette bact receveuse 4. **Mécanisme « Vésicule de la membrane externe » ***(« Outer membrane vesicle »)* (découvert récemment), fait appel à des **[vésicule membranaire]**, ces vésicules sont form**[ées à partir de la mb externe des bact GRAM-]**, lors de leur formation les **fragments ADN peuvent être englobé**, ces **vésicules** libéré peuvent être ensuite **être récupérer par des bact receveuse**, l'ADN peut être [de nouveaux intégré] dans le génome de cette bactérie receveuse II. [MICROBIOTES] 1. [Définition ] **Ensemble de microorg et d'entité biologique, qui comprend des bactérie, des archées, des micro-eucaryote et des virus.** Quand on parle de microbiome, historiquement cela fait référence au communauté microbienne dans une env biologique déterminé càd, le **biome**. Pour certains, cette notion est aussi utilisée pour décrire l'ensemble des génomes d'une communauté, mais il est préférable, dans ce cas de figure d'utilisé le terme de **métagénome**. [Notion diff peuvent apporté pour un même terme] Ce sont les améliorations des technique de séquençage qui permettent maintenant une meilleur description de ces [microbiote], [microbiome], [métagénome] (fig 5) On parle **d'holobionte** quand on fait réf à **un hôte et à la qualité de vie d'un hôte** Notre corps héberge un très grande diversité de microorg diff, ce sont ces caractéristique du biome qui influence la diversité microbienne. **[Paramètre physico chimique]** et **[molécule bioactive]** ; on comprend qui si on fait référence à un microbiote de la peau par rapport à un autre microbiote, les [paramètres physico-chimique] ne sont [pas les même]. On peut retrouver dans **l'estomac des microorg capable de survivre à des pH très acides** La présence de **molécule bioactive**, de ressource alimentaire, [conditionnent] aussi les [trajectoires] [microbienne], *cas du tractus digestif + grd diversité microbienne* L'ensemble de ces facteurs structurant va conduire à des microbiote adapté à leur env **Firmicute = [bacillota]** [Bact aérobie strict au niv du microbiote] **[Eubiose] = microbiote équilibré** **[Dysbiose] = microbiote déséquilibré** Connaitre le passage de « healthy control » au patient, permet d'avoir une meilleur stratégie. *[Stratégie pouvant être utilisé] :* **[transplantation fécale]** (on utilise la communauté microbienne complète), **[probiotique]**, **[prébiotique]** (,symbiotique (association de probiotique)) Pour *[diabète de type 2]* on voit différence de microbiote marqueur de l'évolution et de l'efficacité du traitement, car nouvelle stratégie thérapeutique au fil du temps Le microbiote montre les patient qui [réponde bien] au [traitement médicamenteux] : **personne répondeuse** ; et le [personne qui réponde pas] ; **personne non répondeuse** Ce sont des microbiotes différent qui fait qu'il y a des répondeuse et non répondeuse **[Chaque individu a son propre microbiote]** (mais avant on penser qu'on avait tous le mm microbiote) *[Entérocolite nécrosante]*, cette pathologie est rencontrée **chez les enfant prématuré**, **[microbiote déséquilibré]**, **[atteinte sévère du sys digestif]**, [parfois intervention chirurgicale] nécessaire avec grave [séquelle tt le long de la vie] Pathologie a progression rapide (en qlq heure) Mise en place d'un traitement constamment. Mais pas de véritable stratégie thérapeutique, qui peut-être pas efficace Actuellement, qlq soit la pathologie, il est recherché un lien direct ou indirect avec les diff microbiote, par le microbiote intestinal. On étudie son rôle, et les patho digestives (cancer digestive, maladie de Crohn) Le [microbiote pulmonaire] est caractérisé pour [l'identification de tt type de cancers]. Il a été montré récemment que pour [tt type de tumeurs] [diff microbiote observés], [diff microorg. nouveaux champs pronostic, thérapeutique.] Les idées de la stérilité, ont été bousculé avec les découvertes de ces diff microbiotes. Pendant longtemps [on penser que le sys pulmonaire été stérile] A cause d'un déséquilibre, On sait qu'il est responsable de nombreuse pathologie : asthmes.. On sait qu'il y a microbiote urinaire. On pense qu'il existe un microbiote sanguin, mais on est pas sûr, il faut des preuves supplémentaires. 2. [1000 premiers jours de la vie] Période critique d'acquisition de microbiote : intestinale, pulmonaire, urinaire... (fig 6) [Pendant longtemps], le **fœtus a été considéré comme stérile**, certains **patho peuvent aller contaminé le fœtus** **Avant on savait pas qu'il y avait un microbiote chez le fœtus, càd de microorg favorable à l'enfant** On voulait donc savoir l'origine des microorg colonisant le corps humain, hypothèse avancé grâce à des travaux récent de séquençage, selon, laquelle il pourrait y avoir un microbiote qui s'installe chez le fœtus, donc un travers une [transmission par la mère lors de la grossesse] Ces études ont été contre dite par d'autre études. Ces recherches sont très difficiles, car les bio race microbienne sont très faible, bcp de contamination lors des expérimentation, situation difficile car on est entouré d'un monde microbien. La grde majorité de la communauté scientifique, pensé qu'il n'y a pas de microbiome placentaire, pas de microbiome chez le fœtus, donc il pense que le fœtus est stérile. Ils se demande comment se fait le cheminement de la contamination bactérienne. (fig 7) **[Kitome] = contamination par l'ADN** **[Splashome] = on sait qu'on va avoir une contamination dû au microorg dans l'env** *[Le microbiote est au stade mature après **2-3 ans de vie** ]* (fig 8) [La mère va transmettre un certains nbr de microorg a son enfant]. **[La voie de naissance va influencé le type de colonisation]** : **voie basse** ou **césarienne**. **[En voie basse]** : On retrouve des **[microorg vaginales]** et **[microorg intestinales]** Par **[césarienne]** conduit à des **[microbiote cutané]** Colonisation chez l'enfant grâce à la mère est **l'alimentation** Lors de **l'alimentation**, le **[lait maternelle est la meilleur source d'alimentation pour l'enfant]**. Le **lait** présente un **nbr important de molécule bio active**, en **[prébiotique]** : **[HMO]**, **oligosaccharide présent dans le lait chez la femme** Ces **[HMO]** ne **peuvent être métabolisé que par des microorg du sys digestif**, il sont trop complexe pour assimilé directement pat l'enfant lors de l'alimentation. Il existe une grd diversité de molécules, les [laits maternelles] sont donc [différents], donc des [contaminations] aux [microorg diff], le ***[lait contient aussi un grd nbr de molécules anti microbienne ou modulant aussi l'immunité.]*** Cette période de la vie est donc cruciale aussi pour la **[création du sys immunitaire]**. A la **naissance**, le **sys intestinale est immature,** faut l'éduquer. Il **faut donc certains microorg, tolérer les microorg du microbiotes, et éliminé les microorg qui seront [pathogènes]** Il faut donc **habitué l'enfant au microorg** *(les personnels hospitaliers, couveuse, famille, animaux de compagnies, tte surface).* L'ensemble de ces source contribue à la **structuration du microbiote**. **L'alimentation** poursuit la structuration, cette alimentation, tt au long de la vie participe à la **structuration du microbiote **; de façon générale, le **[mode de vie influencera la mise en place et la stabilité de ce microbiote]** Lundi 21 oct  Dynamique de la colonisation digestive de ce microbiote. A la **naissance**, **l'enfant est stérile**, il va être en **contact avc de nbreux microorg** qui vont **initier la colonisation**. Cette colonisation deviens de + en + complexe avec des associations de très nbreux microorg. Ce microbiote ressemblera à un **microbiote adulte vers l'âge de 3 ans**. ***[L'alpha diversité]*** montre une complexification du microbiote. [Microbiote le + diversifié, le + complexe]. La ***[beta diversité]***, qui **compare les microbiote entre eux**, vas avoir une [grde différence, en fonction des souches de microorg], [l'organisation est diff]. Au cours du temps on voit une **réduction de la beta diversité car on tend vers un microbiote immature.** Même pour des microbiotes immatures, il existe une très grd diversité inter-individuelle. Cette période des **[8 premier mois]** est donc critique, pour **[l'acquisition d'un microbiote pouvant remplir tte les fonctions est garantissant une bonne santé tt au long de la vie].** Il existe une succession remise en place de microorg pendant cette période, qui va être dépendante des conditions physico chimique de l'env colonisé. [A la naissance], le sys digestif montre une **présence de dioxygène (O~2~)**, ce seront donc des bactéries **aérobie** **stricte** ou **aéroanaérobie facultatif** qui seront favorisé tel que les protéobactérie. Ces protéobactérie, en se multipliant, vont utiliser le dioxygène conduisant en un accomplissement, **ce qui crée un [env anaérobie]** Cette **env anaérobie**, **dépourvu de dioxygène**, va **favoriser la croissance d'autre microorg**. Les anaérobie stricte, tel que les [bacteroidetes], maintenant appelé [bacteriodota] Les [firmicutes] très diversifié reste **particulièrement dominant tt au long de la mise en place du microbiote**. Firmicutes maintenant appelé [bacillota]. Le **[virome]**, est lui aussi très diversifié, à la **naissance peu de virus**, logiquement du fait de la situation de **stérilité**, du nouveau-né à la naissance. Les communauté virale, vont se complexifie tt au long de la mise en place de ce microbiote. Cette diversité touche des bact mais aussi des cell humaine Les virome sont de + en + étudié pour comprendre leur influence sur l'ensemble d'une communauté microbienne. Les **micro eucaryotes**, mais particulièrement le **mycobiote** *(càd les champi)* sera bien **moins diversifié** et **dominant que les bact**. Cependant il existe une **[diversification progressive]** De la mm manière, il peut exister **certains individus**, une **colonisation par des Archées**. Notamment, des **[Archées méthanogènes]** *[Le **microbiote digestif** est donc **composé** d'une complexité de **bact** **d'Archée**, de **micro eucaryotes**, de **virus**, voire de **particules ressemblant à des virus**.]* Une bonne mise en place de ce microbiote conditionne une bonne santé tt au long de la vie Une meilleure connaissance de ce microbiote, permet de mieux le moduler ds le cadre de pathologie Les donnée reste parcellé et nécessite *[l'établissement de cohorte]* à très large échelle Les [autres microbiotes] , se mettront en [place progressivement], ils seront influencés par l'env. Parmi tt ces microbiotes, on peut trouver des [microorg qui pourront devenir pathogènes] on parle de : **[pathobionte]** Si ce **[microbiote ne joue pas son rôle de barrière contre les patho]**, ces dernier pourront **facilement** **colonisé** **diff issu, diff organes**, il est donc important de pouvoir identifier [spécifiquement] et [rapidement] les pathogène au sein de microbiote complexe, il faudra aussi déterminer pour ces patho, leur résistance antibiotique pour des traitement adaptés. 3. [Infections urinaires ] **[ECBU] = examen cytobactériologique des urines, est l'un des examens le + demandé à un laboratoire de bactériologie.** Il aide à poser le **diagnostic d'infection urinaire**, en isolant le microorg responsable ***[L'objectif est d'isoler est d'identifier le pathogène responsable]*** (le + souvent : les bactérie ou levure (parfois des micro eucaryotes)) ; et ***[permet de déterminer la sensibilité de la/des bactérie(s) isolées aux antibio]*** ( **[antibiogramme]**) Dans la pop, ces infections urinaires sont très fréquentes (2^ème^ infection communautaire) après les infections pulmonaires, et niv hospitalier, 1^ère^ cause d'infection lié au soins (fig 9) Il existe diff patho responsable des infections urinaires Dans la pop, *[E.coli]* est **très souvent responsable de ces infections urinaires**, ds le milieu hospitalier ces proportion vont changer la fréquence d'infection à *[E.coli]*, car dans cet env il existe une forte dominance des autres pathogène, de plus les *soins et les sensibilité des patients peuvent favoriser les autres patho.* Il y a un grde vigilance dans les hôpitaux du fait des [multirésistance]. (fig 10) Exam bactériologique : pls tech utilisé **Anse calibré** anse qui prélève 10µL de l'urine en UFC/mL **Lame immergé** lame avec 2 milieu diff de chaque côté : 1 avec **CLED**(non-sélectif), l'autre **Mac Conkey** (sélectif) en UFC/mL A partir des colonie isolé, d'autre tests sont effectués. Pls façon d'identification (gram-api-test...) (par spectro de masse) (approche moléculaire : séquençage) Antibiogramme nécessité pls jours Des nouvelles approches de séquençage essaye d'identifier rapidement les résistance à l'antibio, avec l'ADN cela démontre pas que ces résistances sont exprimées. (fig 11) En fonction des patho, cela va permettre de définir 4 grp différents, avec des **seuil de significativité** différents Beta-hémolyse = hémolyse complète - *[Transport et conservation des urines :]* - Doit être [acheminée rapidement] au labo - Ne **doit pas rester [+ de 2heures] l'échantillon à [T° ambiante]** - Peut **[être conservé 24heures à +4°C]** sans modification de la **bactériurie** *(en sachant que la réfrigération ne préserve pas les leucocytes[(on ne peut pas mesure les GB))]* - Pour avoir de bonne interprétation on doit avoir une [vigilance au niv du prélèvement] et de [l'acheminement] - Des milieux de transport contenant de **[l'acide borique]** (=bactériostatique) permet de **conserver** Le seuil de ***leucocyturie*** est inchangé **\> 10^4^/mL** Le **[seuil de *bactériurie*]** significative **dépend de l'espèce bactérienne** en **[cause du sexe du patient]** Pour la *[femme]*, il n'y a *pas de [distinction de seuil]* selon qu'il s'agit d'une **[cystite]** ou d'une **[PNA]** *(pyélonéphrite aiguë)* (fig 12) Ces modif au niv urinaires, permette l'évolution technologique des caractérisations des microorg, il a été montré qu'il existe un **microbiote urinaire naturelle** : **[urobiome]** [Donc l'urine est plus considérée comme étant stérile] *[Pourquoi on fait des amplification que de quelques régions et pas tout en entier ?]* =\> car la **tech de séquençage** (*Illumina(2^ème^ génération*)) utilisé fait des séquençage de **petite taille, + rapide** **BLAST = *B****asic **L**ocal **A**lignment **S**earch **T**ool* - *[Lors des ECBU plusieurs milieux sont utilisés :]* - Gélose **Mac Conkey** - Milieu **d'isolement**, **sélectif** des **bacilles GRAM- exigeante** - ***[Inhibiteur de croissance des bact GRAM+]*** : **désoxycholate de sodium** ; **cristal violet** - *[Caractère lactose des bact grâce à]* : **lactose** ; **rouge neutre** - Colonies rose/rouges = acidification du milieu par fermentation du lactose = lactose + - Colonies incolores ou jaunes = pas d'acidification du milieu = lactose -- - Gélose **Chocolat enrichies** - Milieu **d'isolement**, **non sélectif** des **bactéries exigeante** (tel que *[Neisseria]*, *[Haemophilus]*, *[Streptococcus pneumoniae]*) - ***[Adapter pour analyse :]*** des **sécrétions bronchopulmonaires** ; **prélèvements** **ORL** ; **liquides** **céphalorachidiens** ; **hémocultures** - **Hémoglobine** apporte **facteur X** (***[hémine]***) , **polyvitex** apporte le **facteur** **V** (***[NAD]***), à la culture *[Haemophilus influenzae]* - Gélose **Columbia CNA** - **Riche en nutriments** contenant **5% de sang défibriné** **[fournit + de nutriments, + capacité de présenter des réactions hémolytiques]** - *[Divers agents antimicrobiens utilisés]* : *colistine*, *acide nalidixique* *inhibe croissance des GRAM-*