Microbiologia PDF - Lezione 1 & 2

MICROBIOLOGIA Lezione 1 I microrganismi sono stati i primi organismi comparsi sulla Terra ed hanno esercitato un profondo impatto sulla formazione della biosfera. Testimonianze geochimiche e fossili indica...

MICROBIOLOGIA Lezione 1 I microrganismi sono stati i primi organismi comparsi sulla Terra ed hanno esercitato un profondo impatto sulla formazione della biosfera. Testimonianze geochimiche e fossili indicano che la produzione di ossigeno sia da attribuire all’attività fotosintetica svolta dai cianobatteri. I microrganismi sono in grado di sopravvivere a condizioni di vita estreme, ad esempio alcuni batteri noti come estremofili vivono in ambienti inospitali come sorgenti termali, saline, aree desertiche e ghiacciai. I batteri estremofili possiedono l’enzima tac polimerasi, enzima termoresistente sfruttato nel processo della PCR. I membri del mondo microbico sono: ▪ le cellule procariotiche: prive di nucleo e di membrana nucleare, hanno dimensioni ridotte (diametro 0,5-1um), una struttura semplice e non possiedono organelli (strutture circondate da membrana). Il batterio più grande ad oggi conosciuto è il Thiomargarita con un diametro superiore ai 50um. I batteri più piccoli sono invece i micoplasmi con un diametro di 0,3um, essi sono privi di parete cellulare ma presentano una membrana plasmatica trilaminare. ▪ le cellule eucariotiche: possiedono un nucleo racchiuso da una membrana nucleare, sono morfologicamente più complesse e generalmente più grandi delle cellule procariotiche (diametro 5-20 um), possiedono gli organelli (es. mitocondri, apparato di Gogi). Le cellule vegetali e i funghi possiedono una parete cellulare formata da chitina. Ogni organismo vivente appartiene ad un proprio dominio: dominio bacteria (procarioti), dominio archea (procarioti) e dominio eukarya (eucarioti). Non rientrano in nessun dominio i virus in quanto non sono organismi viventi ma bensì delle strutture biologiche. I virus, parassiti endocellulari obbligati, non possiedono le strutture necessarie alla propria riproduzione per questo motivo infettano altri organismi allo scopo di riprodursi. L’infezione subita dal virus può compromette, a volte gravemente, l’organismo infetto tanto da causarne la morte. Per questo motivo alcuni virus sono in grado di provocare malattie, alcune delle quali molto gravi. Proprio per la loro caratteristica dipendenza da strutture più complesse come le cellule, alcuni studiosi li identificano come strutture confine tra il vivente e il non vivente. CARATTERISTICHE DEI BATTERI I microrganismi sono ubiquitari, popolano ogni luogo della Terra. Grazie alle loro dimensioni ridotte le sostanze nutritive ed i prodotti di scarto entrano ed escono più velocemente (in una cellula molto grande il processo di diffusione può limitare il metabolismo rendendola quindi non più competitiva). La velocità di trasporto è in parte funzione della superficie di membrana disponibile e le cellule più piccole hanno una maggiore superficie disponibile rispetto a quelle grandi. Tipiche forme di cellule e aggregati batterici Oltre a queste forme ricorrenti esistono anche batteri pleomorfi che possono mutare la propria morfologia. Lactobacillus bulgaricus Il batterio ha complesse necessita nutrizionali, inclusa l’incapacità di far fermentare altri zuccheri differenti dal lattosio, da cui produce acido lattico, che conferisce allo yogurt il sapore aspro, coagula le proteine del latte e agisce da conservante. È spesso utile per gli intolleranti al lattosio, il cui sistema digerente non è dotato degli enzimi che scindono il lattosio in zuccheri più semplici. Facendo fermentare il latte, produce acetaldeide, uno dei principali componenti aromatici dello yogurt. Leptospira interrogans Leptospira è un genere di batteri. Ha forma di filamento elicoidale ed estremità uncinate e possiede due flagelli che lo rendono mobile. Alcune specie sono patogeni che (leptospiropsi), altre sono semplicemente saprofitiche. La leptospirosi è una malattia acuta sistemica. È una zoonosi, l’infezione è spesso trasmessa da urina animale o acqua che la contiene e che entra in contatto con abrasioni o tagli sulla pelle, o negli occhi, nella bocca, nel naso o nella vagina.  Lezione 2 Gli organismi viventi sono composti di cellule aggregate a formare tessuti, dai quali si formano a loro volta gli organi, sono quindi pluricellulari. I microrganismi sono cellule viventi autonome. Una singola cellula microbica può avere un ‘esistenza indipendente. Tutte le cellule sono costituite da almeno 4 componenti chimici: ▪ proteine: polimeri costituiti da unità monomeriche dette amminoacidi. Sono presenti ovunque nella cellula con ruoli sia strutturali sia catalitici (enzimi). ▪ acidi nucleici: polimeri costituti da nucleotidi. Nelle cellule si trovano come DNA e RNA. ▪ lipidi: hanno proprietà idrofobiche. Rivestono un ruolo fondamentale sia nella struttura della membrana sia come deposito per l’accumulo di carbonio in eccesso. ▪ polisaccaridi: sono polimeri costituiti da zuccheri semplici e sono presenti prevalentemente nella parete cellulare. (glicogeno: deposito cellulare di carbonio ed energia) COMPONENTI DEI BATTERI Citoplasma Il citoplasma o protoplasma o matrice citoplasmatica è la porzione della cellula che giace all’interno della membrana citoplasmatica. È finemente granulare per la presenza dei ribosomi e delle inclusioni citoplasmatiche. Contiene soprattutto acqua (70%) e proteine strutturali e funzionali (enzimi), polisaccaridi di riserva (amido e glicogeno) oltre a piccole molecole organiche. Recentemente sono stati identificati nei batteri filamenti citoscheletrici che partecipano alla divisione cellulare, dispongono le proteine in determinati siti all’interno della cellula, determinando la morfologia cellulare. Il citoplasma contiene parecchi costituenti cellulari e al suo interno avvengono parecchie delle funzioni della crescita cellulare, del metabolismo e della replicazione. Il citoplasma contiene: ▪ nucleoide: il DNA dei procarioti è una molecola elicoidale a doppio filamento (cromosoma batterico) che appare come un materiale fibroso immerso nel citoplasma. Non è circondato da membrana. ▪ plasmidi: piccole molecole circolari di DNA extracromosomico a doppio filamento che non contengono materiale genetico essenziale per la crescita del microrganismo ma sono dotati di quelle caratteristiche che favoriscono la sopravvivenza del microrganismo in un ambiente particolare. (es. plasmide F e R) ▪ ribosomi: piccole strutture preposte alla sintesi delle proteine, sono composti da RNA. Citoscheletro dei batteri L'unico elemento del citoscheletro presente nei batteri a forma sferica, come ad esempio S. aureus, è FtsZ, la proteina della divisione cellulare simile alla tubulina, che si localizza in un anello al momento della divisione, ne definisce il piano e recluta le altre proteine della divisione. Molti batteri di forma bastoncellare contengono anche una o più proteine simili all'actina chiamate MreB, che assumono una struttura elicoidale e sono essenziali per il controllo della forma cellulare. C. crescentus, un batterio a forma di vibrione, contiene un terzo elemento del citoscheletro, la crescentina, simile ai filamenti intermedi e necessaria alla curvatura della cellula. Nel momento della divisione cellulare in C crescentus, MreB si localizza ad anello nel setto di divisione insieme a Ftsz. Membrana cellulare La membrana cellulare è l’area della cellula che circonda il citoplasma ed è la struttura più conservata negli esseri viventi. Ha uno spessore di 8 nm. Separa l’interno cellula dall’esterno e consente alla cellula di interagire selettivamente con l’ambiente. Le membrane sono altamente organizzate ed asimmetriche, hanno due facce con diverse tipologie e funzioni. La membrana è costituita da un doppio strato fosfolipidico (struttura più conservata dell’evoluzione) e proteine. I fosfolipidi contengono un gruppo carico solitamente un fosfato attaccato ad uno scheletro di glicerolo. La parte terminale con il fosfato è idrofila ed è attratta dall’acqua. Gli acidi grassi sono idrofobici e si allontanano dall’acqua. Sono molecole bipolari (anfipatiche). Questa proprietà consente ai lipidi di formare nelle membrane un doppio strato: estremità polare idrofilica rivolta verso l’esterno, code idrofobiche non polari rivolte verso l’interno. Le proteine di membrana sono di due tipi: ▪ proteine periferiche (20-30%): debolmente associate con la membrana e facilmente rimuovibili, sono solubili ▪ proteine integrali (70-80%): sono inserite nella membrana per questo non si rimuovono facilmente e sono insolubili. I batteri hanno più proteine di membrana rispetto agli eucarioti, perché non hanno organelli. La membrana plasmatica è dinamica, si adatta ai cambiamenti delle condizioni ambientali. Le proteine ed i fosfolipidi hanno un’elevata libertà di movimento (movimento ordinato). A differenza della membrana plasmatica degli eucarioti i procarioti sono privi di steroli, contengono invece opanoidi, molto simili. Gli opanoidi esercitano un effetto stabilizzante sulle membrane cellulari in virtù della loro configurazione chimica planare rigida. La membrana plasmatica svolge differenti funzioni: 1. separazione della cellula dall’ambiente: contenere il citoplasma. Se la membrana si rompe, l’integrità della cellula viene distrutta, il contenuto interno diffonde e la cellula muore (lisi cellulare). 2. barriera selettivamente permeabile: la membrana impedisce la fuoriuscita di componenti cellulari ma consente il passaggio di altre molecole dentro e fuori la cellula. I sistemi di trasporto aiutano il movimento delle molecole. I microrganismi vivono in genere in ambienti dove sono disponibili praticamente tutti i nutrienti, anche se a basse concentrazioni. Per questo le cellule devono possedere meccanismi atti ad accumulare nutrienti a livelli molto più elevati di quelli presenti in natura. I microrganismi hanno pertanto sviluppato dei meccanismi che consentono loro di concentrare all'interno della cellula nutrienti (zuccheri, cationi, ecc.) a livelli mille volte superiori rispetto alla concentrazione ambientale (proteine di trasporto). La membrana presenta una permeabilità selettiva dovuta alla natura idrofoba del doppio strato lipidico. Alcune molecole possono passare senza assistenza (piccole molecole idrofobiche, molecole non polari ed alcune piccole molecole polari, l'acqua). Le molecole non polari si dissolvono nello strato lipidico. Le molecole idrofiliche e polari, gli ioni idrogeno non riescono ad attraversare la membrana. Gli aminoacidi, gli acidi organici ed inorganici vengono trasportati specificamente da proteine. Ad esempio, l’acqua può passare incuneandosi tra le molecole fosfolipidiche oppure attraverso le acquaporine (sistema di trasporto più rapido). Sono proteine  (trasportatori) che costituiscono dei canali attraverso la membrana e trasportano l'acqua fuori e dentro la cellula (es. Agp di E. coli) 3. luogo di processi metabolici cruciali (respirazione, fotosintesi, sintesi dei lipidi e dei costituenti della parete cellulare, segregazione cromosomica) 4. ricezione e risposta a prodotti chimici dell'ambiente con l'aiuto di speciali molecole recettori localizzate sulla membrana 5. generazione di energia: parecchie cellule usano la respirazione per ricavare energia. Durante la respirazione composti organici ed inorganici che contengono elettroni ad alta energia vengono trasformati e rilasciano elettroni per produrre lavoro. Questi elettroni vanno alla membrana e vengono passati a diversi accettori. Durante questa operazione i protoni vengono trasferiti all'esterno della membrana. L'esterno si carica positivamente e l'interno negativamente. Questo gradiente protonico energizza la membrana come una batteria. L'energia viene usata direttamente per lavorare, cosiddetta forza proton-motrice oppure serve per essere indirizzata al canale dell'ATPasi e produrre ATP. La separazione di cariche (potenziale elettrochimico) attraverso la membrana citoplasmatica è una forma di energia potenziale che può essere paragonata alla batteria di una macchina o di una torcia che fornisce corrente per avviare l'accensione o per produrre luce. Funzioni della membrana riguardano anche le funzioni di biosintesi di: ▪ sintesi della membrana ▪ assemblaggio della parete cellulare ▪ secrezione di parecchie proteine Mesosomi: sono invaginazioni della membrana citoplasmatica che sembrano intervenire nei processi di divisione cellulare e di segregazione del cromosoma. Osservati in molti batteri fotosintetici ed in procarioti con forte attività respiratoria.  Lezione 3 ASSORBIMENTO DEI NUTRIENTI Per poter assimilare i nutrienti essenziali per la crescita e la riproduzione, il microrganismo si avvale di sistemi di trasporto. Trasporti passivi ▪ diffusione semplice: le molecole si muovono dalla regione a più alta concentrazione a quella a più bassa per agitazione termica. L’acqua, l’ossigeno e l’anidride carbonica spesso passano per le membrane in questo modo. Richiede un gradiente di concentrazione e il tasso di diffusione passiva dipende dall’entità del gradiente. ▪ diffusione facilitata: è simile alla diffusione passiva, il movimento di molecole non è energia dipendente, le molecole si muovono dalla zona a più alta concentrazione a quella a più bassa concentrazione. La diffusione facilitata (uniporto) ha bisogno di una proteina che lega la molecola ed è perciò specifica. Non richiede energia ma dipende da una modificazione a carico della conformazione della proteina di trasporto. Nella diffusione semplice il flusso aumenta all’aumentare della concentrazione esterna della sostanza, nella diffusione facilitata la velocità di ingresso è elevata, anche a basse concentrazioni estreme di soluto. La velocità aumenta fino alla saturazione del trasportatore, una volta raggiunta la saturazione la velocità non può aumentare ulteriormente. Trasporti attivi Oltre ai trasporti passivi troviamo anche i trasporti attivi, sono processi energia-dipendente (utilizzano ATP o forza proton motrice), muovono le molecole contro gradiente di concentrazione ed implicano l’utilizzo di proteine carrier. Tra i trasporti attivi troviamo: ▪ traslocazione di gruppo L’enzima I e l’Hpr sono componenti non specifici, ovvero valgono per zuccheri diversi mentre l’enzima IIa, IIb e IIc sono specifici per il glucosio. ▪ trasporto semplice ▪ sistemi trasportatori ABC Trasporto del ferro Il ferro disponibile in natura si presenta soprattutto nella forma ossidata insolubile, come lo ione ferrico, e pertanto non disponibile per il trasporto nella cellula. I siderofori sono agenti chelanti a basso peso molecolare. Essi vengono secreti dai batteri quando vi è scasa disponibilita di ferro nell’ambiente. Il complesso sideroforo-ferro viene legato da uno specifico recettore presente nel rivestimento cellulare; da qui il ferro i viene trasferito attraverso la membrana citoplasmatica tramite particolari proteine di trasporto (es enterobactina di E. Coli)  Lezione 4 La parete è un elemento essenziale per i microrganismi che la producono. La concentrazione dei soluti all’interno della cellula sviluppa una notevole pressione, per sopportarla i batteri sono provvisti di parete. La parete conferisce alla cellula forma e rigidità, sottrae la cellula dalla lisi osmotica, può contrastare la penetrazione di sostanze tossiche all’interno della cellula e può contribuire alla patogenicita, solo pochissimi procarioti ne sono privi (es. protoplasti) I batteri si dividono in due gruppi in base al colore che assumono con la colorazione di Gram: ▪ gram+ si colorano di viola ▪ gram- si colorano di rosso La diversa colorazione è dovuta alla diversa struttura della parete. La parete cellulare dei batteri Gram- è una struttura complessa e multistratificata, mentre quella dei batteri Gram+ consiste di un singolo tipo di molecola ed è molto più spessa. Il principale costituente della parete cellulare è il peptidoglicano o mureina. Peptidoglicano È una complessa sostanza polimerica contenente amino zuccheri ed aminoacidi. Ogni suo strato è una sottile lamina costituita da due derivati polisaccaridici, l’N-acetilglucosamina e l’acido N-acetilmuranico (derivati del glucosio) e da un piccolo gruppo di amminoacidi (L-alanina, D-alanina, acido D-glutammico e L-lisa, o in alternativa acido mesodiaminopimelico). Questi costituenti sono assemblati in modo da formare un’unità di ripetizione: il glican tetrapeptide. Il peptidoglicano è presente solo nei batteri. La porzione glicanica è uniforme. La regione maggiormente variabile è il ponte peptidico. La struttura generale, comunque, è la medesima in tutte le molecole: la glucosamina e l’acido muranico formano lo scheletro. Le molecole di acido muranico sono legate mediante ponti peptidici. Le catene di glicano sono intercalate tra loro da aminoacidi mediante legami crociati peptidici. Questo dona robustezza alla struttura peptidoglicanica. Nei batteri gram- i legami sono rappresentati da un legame peptidico diretto. nei batteri gram+ i legami crociati sono generalmente costituiti da un ponte peptidico. Parete Gram+ È composta essenzialmente di peptidoglicano, può contenere anche grandi quantità di acido teicoico. Alcuni batteri gram+ possiedono uno strato di proteine sulla superficie del peptidoglicano, coinvolte nelle interazioni fra la cellula e il suo ambiente. Gli acidi teicoici sono formati principalmente da alcol (glicerolo, ribitolo). Esistono due classi di acidi teicoici: ▪ acidi lipoteicoici: attraversano il peptidoglicano legandosi ai lipidi della membrana citoplasmatica ▪ acidi teicoici della parete: si arrestano solo allo strato di peptidoglicano Essi hanno carica negativa per cui possono legare e controllare lo spostamneto di ioni positivi dentro e fuori la cellula. Intervengono nella crescita della cellula, prevengono la sua rottura, contribuiscono a stabilizzare la struttura della parete. Gli acidi teicoici rappresentano i principali antigeni di superficie dei batteri gram+ che li contengono; ciò rende possibile identificare i batteri. Spazio periplasmatico dei batteri gram+ Si trova tra la membrana plasmatica e la parete cellulare ed è più sottile di quello dei gram-. Il periplasma contiene relativamente poche proteine. Gli enzimi secreti dai batteri gram+ si definiscono esoenzimi. Essi vengono implicati nei processi di degradazione delle sostanze nutrienti che sarebbero, altrimenti, troppo voluminose per poter essere trasportate attraverso la membrana citoplasmatica. Parete Gram- È più complessa della parete dei batteri gram+. Consiste di uno strato sottile di peptidoglicano (2-5% del suo peso), circondato da una membrana esterna. La membrana esterna è composta da lipidi, lipoproteine e lipopolisaccaridi (LPS). Non contiene acidi teicoici. Lo spazio periplasmatico rappresenta il 20-40% del volume cellulare, contiene molti enzimi idrolitici e proteine di trasporto implicate nell’assimilazione di nutrienti, altre contribuiscono alla conservazione di energia. ▪ membrana esterna: possiede carica negativa che conferisce resistenza nei confronti delle difese dell’ospite, fornisce una barriera nei confronti di alcuni antibiotici (es. penicillina), contro gli enzimi digestivi come il lisozima, contro i metalli pesanti, i sali biliari e alcuni coloranti. ▪ lipolisaccaridi (LPS): è costituito da una porzione polisaccaridica in cui gli zuccheri funzionano da antigeni (antigene O) che innescano la risposta immunitaria ma può essere modificata per eludere le difese dell’ospite e da una porzione lipidica (lipide A) detto anche endotossina. Il lipo polisaccaride si associa a varie proteine a formare la metà esterna della membrana. I LPS favoriscono l’adesione del batterio alle superfici (biofilm), costituiscono una barriera selettiva e limitano l’ingresso di sostanze tossiche. Sul lato interno è presente una lipoproteina (piccolo polipeptide contenente una porzione lipidica) che forma saldi legami tra la membrana esterna e il peptidoglicano. Il periplasma nei gram- Il periplasma (spessore 1-71nm) è situato tra la membrana citoplasmatica e la membrana lipopolisaccaridica, contiene molti enzimi idrolitici che servono alla degradazione di molecole nutritive, proteine di legame che innescano i processi di trasporto dei substrati, e i chemorecettori, proteine coinvolte nella risposta chemiotattica. Molte proteine raggiungono il periplasma attraverso il sistema di trasporto SecYEG. Questo è un sistema di traslocazione costituito da proteine in grado di esportare all’esterno altre proteine o di inserire proteine in membrana nel giusto orientamento. Il lisozima Il lisozima fu descritto la prima volta nel 1922 da Alexander Fleming, un batteriologo scozzese, scopritore della penicillina. Scoprì il lisozima quasi per caso durante le sue ricerche atte a scoprire nuovi farmaci antibiotici. Un giorno, mentre aveva un forte raffreddore, aggiunse una goccia del suo muco nasale in una coltura batterica e con suo gran stupore notò che i batteri di li a poco morirono. Esperimenti successivi fatti con altro muco o con lacrime gli dimostrarono che era presente in questi liquidi una sostanza ad azione antibatterica. Le caratteristiche di questi liquidi erano dovute ad un enzima, che "lisava" (dal greco Lysis, dissoluzione) certi microbi: da qui il nome lisozima. Aveva di fatto scoperto una delle nostre difese naturali contro le infezioni. L'intento di Fleming era quello di trovare nuovi farmaci, ma il lisozima non è utilizzabile come medicinale in quanto è una molecola troppo grande per muoversi tra le cellule e può essere applicato solo localmente poiché non può diffondere per tutto il corpo. Inoltre, fu scoraggiato dal fatto che il lisozima non aveva alcun effetto sui tipi di batteri più pericolosi. Quando si applica il lisozima o penicillina alle cellule gram- di solito la parete non viene completamente distrutta, inoltre, rimane una parte della membrana esterna. In questo caso si parla di speroplasto. I batteri privi di parete I micoplasmi, un gruppo di microrganismi patogeni, sono privi di parete cellulare. Sono dei protoplasti liberi in grado di sopravvivere perché possiedono una membrana citoplasmatica inusuale oppure perché vivono in habitat osmoticamente protetti (es. uomo). Alcuni possiedono nella loro membrana steroli che conferiscono forza e rigidità. Possono assumere diverse forme che li rendono difficili da identificare, i micoplasmi possono anche essere difficili da coltivare in laboratorio e spesso per questa ragione possono non essere riconosciuti come causa patogena di malattie. La colorazione di gram Il cristal violetto penetra nel citoplasma di entrambi i tipi di cellule, lo iodio (il mordenzante) si complessa col colorante e forma dei grossi cristalli che non sono in grado di uscire dalla parete cellulare. L'alcol disidrata la parete dei Gram-positivi, per cui i pori del peptidoglicano si restringono impedendo al complesso cristal- violetto- iodio di fuoriuscire. Nei batteri Gram-negativi il solvente scioglie la membrana esterna e il sottile strato di peptidoglicano non riesce ad ostacolarlo, cosicché il complesso cristal-violetto- iodio viene facilmente rimosso.  Lezione 5 COMPONENTI ESTRENI ALLA PARETE CELLULARE I componenti esterni della parete sono implicati nella protezione cellulare, adesione alle superfici, interazione fra le cellule e movimento cellulare. Fimbrie e pili Sono strutturalmente identici: costituiti da molecole proteiche a subunità ripetitive disposte in catene a simmetria elicoidale (piline). Le fimbrie sono più corte dei flagelli e più numerose. Sono fino a 1,000/cellula. Si pensa possano essere coinvolte nei meccanismi di adesione alle superfici (tessuti animali, bioflm). Alcune fimbrie (di tipo IV) servono per la motilità, lo scivolamento o per la contrazione. I pili sono più lunghi delle fimbrie e sono presenti in una o più copie. Essi possono essere osservati al microscopio elettronico quando sono rivestiti da particelle virali che li utilizzano come recettori. Sono coinvolti nel processo di coniugazione nei procarioti. Il glicocalice Molti procarioti secernono sulla loro superficie una sostanza chiamata glicocalice. Glicocalice (che significa rivestimento di zucchero) è il termine generale utilizzato per le sostanze che circondano le cellule. Il glicocalice batterico è un polimero viscoso (appiccicoso) gelatinoso esterno alla parete cellulare e composto da polisaccaride, polipeptide o entrambi. La sua composizione chimica varia ampiamente a seconda della specie. Per la maggior parte, è prodotto all'interno della cellula e secreto sulla superficie cellulare. Se la sostanza è organizzata e saldamente attaccata alla parete cellulare, il glicocalice è descritto come una capsula. La presenza di una capsula può essere determinata utilizzando una colorazione negativa. Se la sostanza è disorganizzata e solo debolmente attaccata alla parete cellulare, il glicocalice è descritto come uno strato di melma (mucillagine extracellulare). Un glicocalice fatto di zuccheri è chiamato polisaccaride extracellulare (EPS). L'EPS consente a un batterio di sopravvivere attaccandosi a varie superfici nel suo ambiente naturale per sopravvivere. Lo strato paracristallino-S-layer Sono presenti nei batteri gram+ e gram- ma soprattutto negli Archea, sono costituiti da subunità glicoproteiche ed hanno una struttura cristallina con simmetria esagonale. Nei batteri lo strato S è esterno alla parete cellulare: nei gram - aderisce direttamente alla membrana esterna, nei gram + è associato alla superficie del peptidoglicano. Negli Archea può essere la sola struttura di parete. In genere gli strati S sono composti da proteine insolubili in acqua, debolmente acide, con un alto contenuto di acido glutammico, acido aspartico, lisina e aminoacidi idrofobici. La loro funzione principale non è del tutto chiara ma si pensa che funzionino come barriera esterna di permeabilità (escludendo il passaggio di macromolecole), protezione dalle fluttuazioni ioniche e di ph, dallo stress osmotico, dall’azione enzimatica, adesione cellulare. Alcuni microrganismi patogeni li possiedono come protezione dalle difese dell’ospite.  Lezione 6 LA LOCOMOZIONE MICROBICA La motilità permette alle cellule di raggiungere regioni diverse nel loro microambiente. Nella lotta per la sopravvivenza, potersi spostare in una nuova posizione può offrire alla cellula nuove opportunità e nuove risorse nutrizionali. Come per ogni processo fisico, il movimento cellulare richiede energia. I flagelli Sono appendici cellulari lunghe e sottili, libere a un’estremita e intimamente legate alla cellula dall’altra. Sono molto sottili (circa 20nm- lunghezza fino a 15-20um) e possono essere visualizzati al microscopio ottico solo dopo colorazione con coloranti che ne aumentano il diametro (colorante Leifson). Sono facilmente visibili al microscopio elettronico. In base alla distribuzione dei flagelli distinguiamo: ▪ monotrichi: un solo flagello (quando è localizzato all’estremità della cellula è detto flagello polare) ▪ anfitrichi: un flagello ad ogni polo cellulare ▪ lofotrichi: un gruppo di flagelli ad una o ad entrambe le estremità cellulari ▪ peritrichi: flagelli diffusi sull’intera superficie I flagelli hanno una forma elicoidale e sono costituiti da tre parti: ▪ filamento: si estende dalla superficie cellulare all’estremità, è un cilindro cavo e rigido, è composto da numerose subunità di flagellina. Alcuni procarioti presentano una guaina intorno al filamento. ▪ l’uncino: lega il filamento al corpo basale ▪ corpo basale: serie di anelli (anello L, anello P e anello MS) che fanno funzionare il motore flagellare. Struttura del flagello di un batterio gram- Il flagello è costituito da tre parti: il filamento flagellare, l'uncino e il corpo basale. Il flusso protonico attraverso la membrana citoplasmatica determina la rotazione del rotore e del filamento flagellare. CCW e CW indicano la rotazione del filamento in senso antiorario (counterclockwise) e orario (clockwise), rispettivamente. Cap: proteina necessaria per l'assemblaggio delle subunità di flagellina. Sintesi del flagello È un esempio di auto-assemblaggio (avviene senza l’intervento di enzimi o altri fattori). Si tratta di un processo complesso che coinvolge molti geni e prodotti genetici. La sintesi inizia con l'assemblaggio dell'anello MS nella membrana. Questo è seguito dalla formazione degli altri anelli, l'uncino e il cappuccio. A questo punto, la proteina flagellina (sono necessarie circa 20.000 copie per creare un filamento) scorre attraverso l'uncino per formare il filamento. Le molecole di flagellina sono guidate in posizione dalle proteine del cappuccio per garantire che il filamento in crescita si sviluppi in modo uniforme. Il movimento flagellare Ogni singolo flagello è una struttura rigida che non si flette ma si muove per rotazione, come un’elica. Il movimento flagellare è impartito dal corpo basale che funziona come motore. L’energia richiesta per la rotazione proviene dalla forza proton-motrice. La dissipazione del gradiente protonico attraverso la membrana mediata dal complesso Mot fa ruotare il flagello. Generalmente la rotazione anti-oraria provoca il movimento in avanti mentre la rotazione oraria blocca l’avanzamento provocando una capriola. Altri tipi di motilità ▪ Spirochete: il movimento avviene grazie alla contrazione e rotazione del filamento assiale composto di flagelli periplasmatici (movimento in materiali vischiosi). ▪ Motilità per scivolamento: le cellule scivolano lungo le superfici solide, in questa tipologia non è stata individuata nessuna struttura esterna. Chemotassi Movimento verso un composto chimico attraente o allontanamenti da un composto chimico repellente. La chemotassi è un processo complesso che coinvolge diversi eventi regolati a livello genetico e biochimico. Il meccanismo molecolare della chemotassi coinvolge delle proteine sensore localizzate nella membrana o nello spazio periplasmatico, i chemiorecettori in grado di rilevare un gradiente chimico nel tempo e interagire con delle proteine citoplasmtiche che condizionano la direzione del motore. In presenza di una sostanza attraente il batterio si muove in avanti mentre in presenza di una sostanza repellente il movimento sarà contrario. Fototassi È tipica dei microrganismi fototrofi. Permette ad un microrganismo fototrofo di orientarsi per fotosintetizzare meglio. Sembra siano coinvolti i sistemi regolativi che controllano la chemotassi. Per esempio, sembra intervengano alcune proteine citoplasmatiche che controllano la direzione di rotazione del flagello, in seguito all’interazione col fotorecettore. Esistono inoltre altre tassie, tra le quali l’aerotassi (avvicinamento o allontanamento dall’ossigeno) e l’osmotassi (concentrazione di ioni).  Lezione 7 LE INCLUSIONI CITOPLASMATICHE Sono granuli presenti all’interno del citoplasma che fungono da depositi di riserva. ▪ granuli metacromatici: sono granuli di polifosfati e rappresentano una riserva di fosfato inorganico che può essere utilizzato per la sintesi di acidi nucleici, fosfolipidi, ATP. Sono anche detti granuli di volutina. ▪ granuli di polisaccaridi: riserve di carbonio polimerico (glicogeno e amico), prodotti quando il carbonio è in eccesso. ▪ inclusioni lipidiche: costituite da poli-b-idrossibutirrato (PHB), composto lipidico formato da unità ripetute di acido B idrossibutirrico (si trova solo nei batteri). Tramite tali inclusioni è possibile l’accumulo di energia e riserva di materiali per la sintesi delle strutture cellulari. ▪ granuli solforici: tipici dei solfobatteri che ricavano la loro energia dall’ossidazione dello zolfo. ▪ magnetosomi: costituitosi da Fe3O4 (magnetite), essi creano nella cellula un dipolo magnetico permanete, rendendola capace di rispondere a un campo geomagnetico. Guidano i batteri acquatici verso il sedimento dove la concentrazione di O2 è più bassa. ▪ carbossisomi: sono inclusioni che contengono l'enzima ribulosio 1,5-difosfato carbossilasi. I batteri fotosintetici usano l'anidride carbonica come unica fonte di carbonio e necessitano di questo enzima per la fissazione dell'anidride carbonica. Tra i batteri che contengono carbossisomi ci sono batteri nitrificanti, cianobatteri e tiobacilli. ▪ vacuoli gassosi: Sono cavità vuote presenti nei microrganismi che vivono in superficie nei mari e nei laghi (cianobatteri, batteri fototrofi purpurei e verdi, archea). Conferiscono alla cellula la capacità di galleggiare. Hanno una funzione di motilità e permettono alla cellula di spingersi in alto e in basso lungo una colonna di acqua in risposta a stimoli ambientali (ad es. luce). Ogni vacuolo consiste di diverse file di vescicole gassose, che sono dei cilindri cavi ricoperti da proteine. Sono strutture di natura proteica, vuote ma rigide, localizzate nel citoplasma, permeabili ai gas e impermeabili all'acqua. Le endospore Sono delle caratteristiche strutture cellulari resistenti e quiescenti. Sono prodotte da alcuni batteri gram- come i generi Bacillus, Clostridium e Sporosarcina. L’endospora è uno stadio quiescente che si forma all’interno della cellula durante il processo di sporulazione. I batteri che formano le endospore si incontrano generalmente nel suolo e in ambienti rocciosi. Le endospore sono resistenti a lunghi periodi di essiccazione e alle alte temperature ma anche alla radiazione ultravioletta e alla disinfezione (acidi, disinfettanti chimici, ebollizione). Esse aiutano la sopravvivenza della specie in ambienti scarsamente dotati di umidità e di nutrienti. Appaiono al microscopio ottico come strutture fortemente rifrangenti, sono impermeabili ai coloranti. Nella colorazione di gram appare incolore. Possono essere colorate con procedure speciali. Schaeffer-Fulton: le endospore vengono colorate scaldando il preparato con il verde di malachite, dopo di che le altre parti della cellula vengono liberate del colorante mediante lavaggio con acqua e trattate con un colorante di contrasto come la safranina. I batteri formanti endospore hanno 2 fasi di crescita: ▪ Crescita vegetativa ▪ Sporulazione La sporulazione è un processo finemente regolato, in grado di reagire in modo specifico alla limitazione di nutrienti, quando la densità della popolazione è alta. La cellula batterica madre è detta sporangio. La spora può essere dislocata all'interno dello sporangio in maniera diversa (a seconda della specie): posizione centrale, vicino ad una estremità (subterminale) o terminale. Talvolta provocando un rigonfiamento dello sporangio. La struttura dell’endospora La spora è costituita da diversi strati di rivestimento: ▪ l’esosporio, strato più esterno, è lasso e sottile ▪ il cortex occupa metà del volume della spora ed è costituita da peptidoglicano ▪ il core strutture convenzionali come la parete cellulare, la membrana citoplasmatica e il citoplasma nucleoide ▪ la tunica, struttura composta da numerosi strati proteici. È impermeabile e conferisce resistenza alle sostanze chimiche. L'endospora è parzialmente disidratata (10-30% di acqua rispetto alla cellula vegetativa); ciò conferisce termoresitenza, resistenza alle radiazioni e ad alcune sostanze chimiche. Ha un pH più basso di quello della cellula vegetativa. A livello del core troviamo l’acido dipicolinico. Gli ioni calcio si complessano con l'acido dipicolinico per formare dipicolinato di calcio. Si pensa che sia responsabile della resistenza al calore. Esso stabilizza gli acidi nucleici sporali. L’endospora è una struttura quiescente ciò implica una attività enzimatica ridotta, un metabolismo ridotto, un assente sintesi di macromolecole e ridotto o assente mRNA. Germinazione della spora Un'endospora può rimanere inattiva per molti anni. La riconversione a cellula vegetativa coinvolge tre stadi: ▪ attivazione: è innescata da un danno chimico, ma più spesso fisico rappresentato da una breve esposizione al calore (65-80°C per alcuni minuti). E' un processo reversibile. ▪ germinazione: gli enzimi dell'endospora rompono la tunica e l'acqua entra, ciò implica la perdita della rifrangenza microscopica, della resistenza al calore e alle sostanze chimiche, erdita del dipicolinato di calcio e aumento della capacità di essere colorata. Questa fase è quindi essenzialmente catabolica. ▪ esocrescita: rigonfiamento del citoplasma sporale dovuto all’assorbimento di acqua, ripresa dell'attività metabolica: sintesi di nuovo RNA, proteine e DNA, inizio del metabolismo respiratorio. La cellula emerge dal rivestimento sporale iniziando infine la divisione cellulare.  Lezione 8 EFFETTI DELLE CONDIZIONI AMBIENTALI SULLA CRESCITA MICROBICA I microrganismi possono tollerare condizioni ambientali decisamente sfavorevoli, a volte impossibili per la vita degli organismi superiori. I fattori ambientali che condizionano la crescita e la vita dei microrganismi sono: la temperatura, il ph, la disponibilità di acqua e l’ossigeno. Temperatura All’aumenrtare della temperatura aumentano la velocità delle reazioni chimiche ed enzimatiche della cellula, quando però si supera la temperatura critica si va incontro alla denaturazione. Temperature cardinali: ▪ minima, al di sotto non si ha crescita, la membrana plastica si irrigidisce a tal punto da bloccare le attività di trasporto ▪ ottimale, massima velocità di crescita ▪ massima, al di sopra non si ha più la crescita microbica La temperatura ottimale è solitamente più vicina alla temperatura massima che alla minima. Ogni microrganismo ha temperatura cardianli caratteristiche, che però possono venire modificate da fattori ambientali. In base alla temperatura ottimale i microrganismi si di distinguono in: ▪ psicrofili, vivono a temperature basse (0-20°C; optimum 15°C) ▪ mesofili, vivono a temperature medie (20-45°C; optimum 30-37°C) Animali a sangue caldo, vivono in ambienti con climi temperati e tropicali. Sono responsabili dei cicli della materia, delle malattie, della fermentazione, del deterioramento del materiale e di numerose altre attività fondamentali per l’uomo. ▪ termofili, vivono a temperature elevate (45-80°C; optimum 55°C). I microrganismi termofili possiedono enzimi e proteine costituite da pochi amminoacidi ciò rende la struttura quaternaria più resistente alle alte temperature. La loro membrana citoplasmtica è ricca di acidi grassi saturi, essi formano legami idrofobi i molto più forti, contribuendo a mantenere la stabilità. ▪ ipertermofili, vivono a temperature estreme (70-110°C; optimum 90-100°C) pH Ogni specie microbica tollera, per la crescita, un intervallo di ph che copre 3-4 unità. Come per quanto riguarda la temperatura anche in base al ph suddividiamo i microrganismi in 3 categorie. ▪ acidofili, crescita ottimale a ph compresi tra 1,0-5,5 ▪ neutrofili, crescita ottimale a ph compreso tra 5,5-8,0 ▪ basofili, crescita ottimale a ph compreso tra 8,5-11,5 La maggior parte dei batteri e dei protozoi sono neutrofili. Molti funghi invece preferiscono ambienti debolmente acidi a ph 4-6. Il ph cellulare è sempre mantenuto intorno alla neutralità. I microrganismi modificano il ph dell’ambiente in cui vivono nei terreni di crescita sono sempre presenti delle sostanze tampone (in genere si utilizzano i sali di fosfato) Pressione osmotica Alti valori di pressione osmotica sottraggono acqua necessaria per la crescita della cellula. Quando una cellula microbica si trova all’interno di una soluzione con una concentrazione di soluti più alta rispetto a quella dell’interno della cellula (ambiente ipertonico) l’acqua della cellula esce attraverso la membrana verso l’esterno e si ha la plasmolisi. Soluti ed attività dell’acqua L'acqua rappresenta circa l'80-90% del peso di una cellula e pertanto la sua presenza è un prerequisito essenziale per la vita di tutti gli organismi. L'acqua disponibile per una cellula non dipende solo da quanta ce n'è in un ambiente, ma anche dalla concentrazione dei soluti (sali, zuccheri ecc.) presenti in essa. Tali soluti, infatti, legandosi alle molecole di acqua riducono l'acqua libera disponibile per le cellule. La disponibilità di acqua è espressa dal parametro attività dell'acqua, che corrisponde al rapporto tra la pressione di vapore di una soluzione e quella dell'acqua pura. Per pressione di vapore di una sostanza si intende la pressione parziale a cui si verifica l'equilibrio tra la fase liquida e la fase gassosa. All'equilibrio, quindi, il numero di molecole che, per unità di tempo, abbandonano il liquido (evaporazione) è in media uguale a quello delle molecole che vi rientrano (condensazione). Il raggiungimento di tale equilibrio è dipendente dalla temperatura. Alofilia e alotolleranza Alcuni organismi, chiamati alofili estremi, si sono adattati così bene alle alte concentrazioni di sale che in realtà ne hanno bisogno per crescere. In questo caso, possono essere definiti alofili obbligati. Gli organismi provenienti da acque saline come il Mar Morto spesso richiedono quasi il 30% di sale e l'ansa di inoculazione (un dispositivo per la gestione dei batteri in laboratorio) utilizzata per trasferirli deve prima essere immersa in una soluzione salina satura. Più comuni sono gli alofili facoltativi, che non richiedono alte concentrazioni di sale ma sono in grado di crescere a concentrazioni di sale fino al 2%, una concentrazione che inibisce la crescita di molti altri organismi. Alcune specie di alofili facoltativi possono persino tollerare il 15% di sale. Ossigeno Il parametro dell’ossigeno suddivide i microrganismi in 5 classi: ▪ aerobi, crescono in presenza di ossigeno alla tensione naturale ▪ microaerofili, utilizzano l’ossigeno a livelli ridotti rispetto a quello atmosferico ▪ anaerobi facoltativi, crescono in condizioni sia aerobiche che anaerobiche ▪ anaerobi obbligati o stretti sensibili a tracce di ossigeno ▪ anaerobi ossigeno tolleranti non lo utilizzano ma possono crescere in sua presenza Forme tossiche dell’ossigeno ▪ Ossigeno singoletto (O2-); è una forma di ossigeno molecolare normale caratterizzata da una maggiore energia. È molto reattivo (potente ossidante). Viene convertito nella forma non tossica dai carotenoidi. ▪ Radicale superossido: si forma durante la normale respirazione, viene neutralizzato dalla superossido dismutasi O2+ O2 + 2H+→ H2O2 + O2 ▪ Perossido di idrogeno: prodotto durante la normale respirazione, è tossico, un enzima che lo neutralizza è la catalasi 2H2O2 → 2H2O + O2 Oppure la perossidasi (che non produce ossigeno e richiede una molecola riducente) H2O2+ NADH + H+→ 2 H2O + NAD+  ▪ Radicale idrossile (OH ) è un'altra forma intermedia dell'ossigeno ed è la più reattiva. Si forma in seguito all'azione delle radiazioni ionizzanti. Viene prodotto durante la respirazione aerobia in piccole guantità ed è una forma di transizione Pressione La pressione atmosferica normale ha valore di 1 atm. ▪ barotolleranti, sono colpiti dall’aumento della pressione non così gravemente come lo sono gli organismi non barotolleranti ▪ organismi barofili, necessita o crescono più rapidamente in presenza di alta pressione, ad esempio nei fondali marini 600-1100 atm.  Lezione 9 LA NUTRIZIONE MICROBICA I microrganismi procariotici si distinguono l'uno dall'altro per il tipo di nutrizione, che rappresenta l'insieme dei processi con cui gli organismi assumono ed utilizzano gli alimenti per ottenere energia e materiali da impiegare nelle sintesi di base (carbonio). Nei Batteri e Archaea le necessità nutrizionali variano da specie e specie. I microrganismi possono utilizzare come fonte di nutrienti qualsiasi sostanza contenente carbonio/energia: ▪ composti monomerici semplici come gli zuccheri o gli aminoacidi ▪ proteine e polisaccaridi complessi ▪ composti non associati a cellule viventi (CO, metano, cianuro, acido ▪ acetico, glucosio). ▪ composti aromatici (benzene) ▪ composti di sintesi come i pesticidi. Le cellule sono costituite principalmente da macromolecole ed acqua ed hanno bisogno di nutrienti per produrre i monomeri che costituiscono le macromolecole. Essi sono le sostanze utilizzate nei processi di biosintesi e nella produzione di energia. Nel caso in cui si voglia indurre la crescita batterica in laboratorio, bisogna comunque fornire al batterio tali nutrienti nel terreno di coltura. I macroelementi (o macronutrienti) sono richiesti in grande quantità; i microelementi (micronutrienti) sono richiesti in quantità minore o addirittura in tracce. I macroelementi includono carbonio, ossigeno, idrogeno, azoto, fosforo, zolfo, potassio, magnesio, calcio, sodio, cloro, ferro. I primi sei sono i componenti dei carboidrati, dei lipidi, delle proteine e degli acidi nucleici (le macromolecole biologiche). I microelementi o elementi in tracce comprendono manganese, cobalto, molibdeno, nickel, rame, selenio, tungsteno, vanadio. Carbonio Il carbonio è il macronutriente più abbondante in quanto, insieme a idrogeno e ossigeno, costituisce lo scheletro di base di tutte le molecole organiche. L'approvvigionamento di carbonio rappresenta pertanto uno dei processi più cospicui nel metabolismo di una cellula in fase di crescita. In funzione della fonte di carbonio utilizzata, gli organismi (inclusi i microrganismi) si suddividono in due classi: autotrofi ed eterotrofi. Gli organismi autotrofi utilizzano carbonio inorganico (CO, la forma più ossidata del carbonio, stato di ossidazione +4) come principale fonte di carbonio. Affinché il carbonio contenuto nella CO, possa essere utilizzato per la sintesi di molecole organiche è necessario che venga ridotto al livello di ossidazione del carbonio organico che, a seconda dei composti, si trova in uno stato di ossidazione inferiore. Tale processo (detto organicazione del carbonio o assimilazione riduttiva del carbonio o fissazione della CO,), richiede un notevole apporto di energia chimica e di potere riducente e gli organismi autotrofi utilizzano a tale scopo la maggior parte dell'energia ottenuta dalla luce o dall'ossidazione di composti inorganici. Gli organismi eterotrofi, invece, utilizzano come fonte di carbonio composti organici in cui il carbonio ha livelli di ossidazione compresi tra +3 e -4. In tal caso il substrato organico può essere trasformato nei componenti organici cellulari senza un preliminare processo di assimilazione riduttiva e può essere direttamente utilizzato come fonte di carbonio. La maggior parte degli organismi eterotrofi utilizza composti organici anche come fonte di energia (chemiorganotrofia). Ossigeno e idrogeno Ossigeno e idrogeno sono due elementi molto abbondanti in tutte le cellule, in quanto costituenti dell'acqua e dei composti chimici organici e inorganici. Per gli organismi eterotrofi, che utilizzano molecole organiche come fonte di carbonio, la stessa molecola funge anche da fonte di idrogeno e ossi- geno. Gli organismi autotrofi, che usano la CO, come fonte di carbonio, ottengono contemporaneamente anche l'ossigeno, ma devono utilizzare altre molecole come fonti di idrogeno. Oltre ad essere utilizzato come costituente di quasi tutte le molecole che costituiscono un organismo, I’ ossigeno molecolare viene anche utilizzato come accettore finale di elettroni durante la respirazione per il metabolismo energetico di molti organismi. Altri elementi ▪ azoto (essenziale per la sintesi di aminoacidi, purine, pirimidine, cofattori) viene fornito in molti modi: sotto forma di aminoacidi, ammoniaca, nitrato, azoto atmosferico ▪ fosforo è presente in acidi nucleici, fosfolipidi, nucleotidi cofattori, è generalmente assorbito in forma di fosfato inorganico ▪ zolfo (sintesi di cisteina e metionina, biotina e tiamina), fornito come solfato, è ridotto durante l'assimilazione. ▪ potassio: è necessario per l'attività di un certo numero di enzimi. ▪ calcio: contribuisce, tra le altre cose, alla termoresistenza delle endospore batteriche; aiuta a stabilizzare la parete cellulare batterica. ▪ sodio: è coinvolto insieme al cloruro nella regolazione della pressione osmotica; interviene nell'assunzione dei soluti in alcune specie dotate di sistemi di trasporto Na+ dipendente, è molto importante per i batteri marini. ▪ magnesio: funge da cofattore per molti enzimi, si complessa con l'ATP e stabilizza i ribosomi e le membrane cellulari. Parte integrante della clorofilla. ▪ ferro: svolge una respirazione cellulare, costituisce il centro reattivo delle proteine contenenti l'eme (citocromi, catalasi, ecc) e componente di altre proteine coinvolte nel trasporto degli elettroni. I siderofori sono degli agenti chelanti il ferro (Fe III) che lo solubilizzano e lo trasportano nella cellula (es. idrossamato, enterobactine) Fattori di crescita Sono composti organici specifici di peso molecolare relativamente basso, la cui presenza è indispensabile nel terreno di crescita di alcuni microrganismi incapaci di sintetizzare tali sostanze. Appartengono a tre categorie: ▪ vitamine: piccole molecole organiche che in genere formano i coenzimi (parte catalitica non proteica) di alcuni enzimi. ▪ aminoacidi: le proteine sono composte da 21 alfa-aminoacidi. alcuni batteri e archaea non sono in grado di sintetizzare uno o più di tali composti che devono pertanto essere presenti nel terreno di crescita. (esempio staphylococcus epidermidis, lactobacillus). ▪ purine e pirimidine: sono necessarie per la sintesi degli acidi nucleici. Classificazione In base alla fonte energetica fototrofi: utilizzano la luce come chemiotrofi: utilizzano l'energia fonte di energia. proveniente dall'ossidazione di composti organici o inorganici. In base alla fonte di elettroni litotrofi: utilizzano come fonte di organotrofi: utilizzano come elettroni composti inorganici ridotti. fonte di elettroni composti organici In base alla fonte di eterotrofi: in grado di utilizzare solo autotrofi: in grado di utilizzare carbonio il carbonio organico la CO2 (carbonio inorganico) come fonte di carbonio  Lezione 10 COLTURA DEI MICRORGANISMI Nella microbiologia è importante isolare e coltivare specie microbiche in coltura pura (coltura axenica). Il terreno di coltura è composto da materiali biologici o sintetici capaci di fornire un ambiente ottimale per la crescita dei microrganismi. I componenti dei terreni comuni possono comprendere estratti di cuore e cervello bovino, sangue o siero interi, estratto di lievito, peptone (idrolisi parziale di proteine), triptone (idrolisi di caseina: proteina del latte) o ancora estratti dal suolo. Questi terreni chimicamente indefiniti vengono detti terreni complessi. Questi materiali complessi possono fornire ad un organismo sorgenti di carbonio e di energia, tutti i minerali necessari e fattori di crescita. I terreni complessi vengono utilizzati nei test diagnostici poiché spesso offrono tutti i componenti necessari per la crescita di microrganismi diversi. I terreni definiti o sintetici sono terreni di cui si conosce esattamente la composizione chimica. Sono formati da composti chimici puri a concentrazione nota e variabili in funzione delle esigenze nutrizionali dei microrganismi. Questo terreno viene spesso utilizzato per studiare le richieste nutrizionali di un organismo o quando si devono analizzare vari processi metabolici. Componenti dei terreni ▪ peptoni: idrolizzati di proteine preparati per digestione parziale di varie fonti proteiche ▪ estratti: estratti acquosi, generalmente di bue o di lievito ▪ agar: polisaccaride solfato usato per solidificare i terreni liquidi ▪ fattori di crescita organici: sono composti essenziali per le funzioni cellulari che alcuni microrganismi non sono in grado di sintetizzare autonomamente (es. vitamine, amminoacidi, purine, pirimidine) Tipologie di terreno (stato fisico) I microrganismi possono essere coltivati in terreni liquidi (brodi) o terreni semisolidi e solidi (terreni agarizzati). Per allestire un terreno solido occorre aggiungere al terreno liquido un agente gelificante come l’agar, un polisaccaride complesso che contiene zuccheri solfatati, estratto da un'alga che cresce negli oceani Pacifico e Indiano e nel mar del Giappone. Non viene digerito dalla maggior parte delle specie microbiche. Si liquefa alla temperatura di 100°C e rimane allo stato liquido fino a 45°C. Per solidificare un terreno si usa l'agar all' 1,5%. Per terreni semisolidi si usa agar allo 0,5%. Non viene degradato dai microrganismi ed è trasparente per cui aiuta a visualizzare le colonie cresciute sulla superficie o nell'agar stesso. Un importante svantaggio è il contenuto di impurità che a volte interferiscono con gli studi nutrizionali e inibiscono persino la crescita. Tipi funzionali di terreni ▪ terreni generali per ogni scopo: sostengono la crescita di molti microrganismi (es. tryptic soy agar) ▪ terreni arricchiti: terreni generali arricchiti con sangue o altri nutrienti speciali (es. agar sangue) ▪ terreni selettivi: favoriscono la crescita di alcuni microrganismi ed inibiscono quella di altri (es. MacConkey agar contiene sostanze tossiche per i batteri gram+ come il cristalvioletto e i sali biliari) ▪ terreni differenziali: permette di distinguere i diversi gruppi di microganismi sulla base delle loro caratteristiche biologiche (es. agar sangue differenzia i batteri emolitici dai non emolitici oppure MacConkey differenzia tra i batteri gram- quelli fermentanti del lattosio come E.coli da non fermentanti come Salmonella) Terreno: Agar sangue L'agar sangue permette la crescita di molti batteri esigenti. Questi possono essere caratterizzati in base alla loro capacità di produrre le emolisine, proteine che lisano i globuli rossi del sangue. ▪ streptococchi - alfa emolitici: in terreni agar sangue, gli streptococchi a-emolitici presentano colonie circondate da alone verde dovuto ad un'emolisi incompleta e dall'ossidazione del ferro dell'emoglobina (colorazione verdastra). (es. S. Pneumoniae, S. Mitis) ▪ streptococchi-beta emolitici: in terreni agar sangue, gli streptococchi ß-emolitici presentano colonie circondate da un alone trasparente dovuto alla rottura completa dei globuli rossi. (es. S. Pyogenes) ▪ streptococchi-gamma emolitici: (detti anche anemolitici) non generano alcuna emolisi Terreno: Baird parker agar Litio cloruro e potassio tellurito sono inibenti per la flora contaminante, glicina e sodio piruvato facilitano lo sviluppo degli stafilococchi; la riduzione del tellurito a tellurio (nero) e la chiarificazione del giallo d'uovo permettono l'identificazione presuntiva delle colonie. Le colonie nere sono dovute alla riduzione del tellurito a tellurio, mentre la chiarificazione attorno alla colonia è dovuta alla digestione del rosso d’uovo. Terreno: Mannitol salt agar Mannitol Salt Agar è un terreno indicato per l'isolamento il conteggio e l'identificazione presuntiva degli stafilococchi. Il terreno, preparato in accordo con la formula descritta da Chapman, contiene una elevata concentrazione di sodio cloruro (7.5%) che inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi, fatta eccezione per gli stafilococchi. La produzione di acidi, dovuta alla fermentazione del mannitolo, provoca una modificazione del ph del mezzo e un viraggio dell'indicatore presente nel terreno (rosso fenolo) da rosso a giallo. Il terreno Mannitol salt agra differenzia i batteri mannitolo fermentanti, virano la colorazione del terreno da rosso a giallo, dai mannitolo non fermentanti dove il terreno rimane rosso. Il batterio Sttaphylococcus aureus possiede un enzima noto come coagularsi, il quale cea un coagulo di fibrina che protegge la cellula dalla fagocitosi messa in atto dall’organismo in vaso per difesa. Terreno: Mac Conkey agar È un terreno di coltura solido differenziale selettivo per i batteri gram-. In questo terreno sono presenti sia il cristalvioletto che i sali biliari, i quali sono in grado di inibire la crescita dei batteri Gram positivi (ed anche quella dei Gram negativi più esigenti dal punto di vista nutrizionale). L'agar MacConkey contiene, inoltre, il lattosio come unica fonte di carboidrati ed il rosso neutro (un colorante che vira al rosso quando il pH del mezzo scende al di sotto di 6,8). I batteri che fermentano il lattosio si presentano sotto forma di colonie con varie sfumature di rosso poiché producono acidi misti che fanno scendere il pH. I batteri che non fermentano il lattosio, invece, formano colonie trasparenti ed incolori. A seconda dell'intensità della fermentazione si possono distinguere vari gruppi di batteri: ▪ batteri fortemente fermentanti il lattosio che producono colonie rosse con un'area circostante di precipitazione dei sali biliari (es. Escherichia), ▪ batteri fermentanti il lattosio seguendo la via 2,3-butilenglicole producono colonie rosse senza la precipitazione dei sali biliari (es. Enterobacter, Klebsiella) ▪ batteri debolmente fermentanti il lattosio che formano colonie che possono apparire, dopo 24 ore, incolore per pol diventare lievemente rosate tra le 24 e le 48 ore (es. Citrobacter, Providencia, Hafnia e Serratia).  ▪ batteri dei generi Proteus, Edwardsiella, Shigella e Salmonella danno colonie incolori o trasparenti (anche se raramente può non essere così) Terreno: Pseudomonas agar F Pseudomonas Agar F favorisce la produzione di fluorescina da parte di Pseudomonas e inibisce la produzione di piocianina (pigmento antibiotico di colore blu, prodotto dal batterio gram- Pseudomonas aeruginosa). Le colonie che hanno prodotto fluorescina appaiono o prive di colore o con colorazione tendente al giallo se osservate con luce normale, di colore giallo fluorescente se osservate sotto luce ultravioletta. Terreno: Agar eosina blu di metilene (EMB) Due coloranti, l'eosina Y e il blu di metilene inibiscono la crescita di batteri Gram-positivi. Inoltre, reagiscono con i prodotti acidi rilasciati da alcuni batteri Gram-negativi quando utilizzano il lattosio o il saccarosio come fonti di carbonio ed energia. Le colonie dei batteri Gram-negativi, che producono elevate quantità di prodotti acidi, hanno una lucentezza metallica verde (es. E.coli). Morfologia delle colonie batteriche Le colonie tendenzialmente crescono più velocemente ai bordi della piastra Petri in quanto qui l’ossigeno e i nutrienti sono più disponibili.  Lezione 11 CRESCITA BATTERICA L’aumento dei costituenti cellulari è conseguente all’aumento del numero di cellule o all’aumento delle dimensioni delle cellule. I microbiologi studiano generalmente la crescita di popolazioni e non di cellule individuali. Ciclo cellulare procariotico Il ciclo cellulare è la sequenza di eventi che vanno dalla nascita di una nuova cellula fino alla sua successiva divisione cellulare. La maggior parte delle cellule batteriche si divide per scissione binaria (fissione binaria). Durante il ciclo cellulare avvengono due processi: ▪ replicazione e partizione del DNA ▪ citochinesi, processo di formazione di due cellule figlie (settazione), tale fase è favorita dal mesosoma La scissione binaria comporta all’aumento del volume della cellula microbica madre che si divide in due cellule figlie, di dimensioni pressoché uguali. Affinché si formino due cellule distinte, nella cellula madre abbiamo la formazione del setto trasverso, ai pioli opposti della cellula si formano 2 invaginazioni, per deposito di materiale di membrana e di parete queste crescono all’interno della cellula fino a dividerla completamente. Curva di crescita Per costruire una curva di crescita in laboratorio bisogna: ▪ inoculare un terreno di crescita ▪ incubare alla temperatura adeguata ▪ determinare ad intervalli di tempo il numero degli organismi ▪ riportare i dati su una carta semilogaritminca (asse x=tempo; asse y= logaritmo in base 10) Il ciclo di crescita è diverso per ogni specie batterica ed è variabile per uno stesso microrganismo a seconda delle condizioni nutrizionali ed ambientali. Graficamente la curva di crescita è caratterizzata da quattro fasi: ▪ fase di latenza (fase lag): non si osserva un aumento del numero di cellule. Durante questa fase la cellula sintetizza i nuovi componenti per rifornirsi dei materiali necessari (es. cellule vecchie e prive di ATP, per adattarsi al nuovo terreno o ad altre condizioni). In alcuni casi la fase lag può essere molto corta oppure assente, nel caso in cui inoculiamo una coltura giovane in un terreno con la stessa composizione; in altri casi può essere molto lunga se la coltura inoculata è senescente. ▪ fase di crescita esponenziale (fase log): qui il tasso di crescita è alla massima velocità, la popolazione è uniforme in termini di proprietà fisico-chimiche. In questa fase le cellule sono in crescita bilanciata, i costituenti cellulari vengono prodotti a tasso costante l’uno rispetto all’altro. Dal punto di vista microbiologico questa fase è essenziale per studiare la fisiologia, e le necessita  nutrizionali della coltura. In questa fase i batteri producono i metaboliti secondari quali antibiotici ed enzimi. ▪ fase stazionaria: a seguito della fase log abbiamo un declino causato dall’esaurimento dei nutrienti essenziali e all’accumulo di prodotti di rifiuto (sistema chiuso). Dopo questo declino il numero delle cellule vitali rimane costante (10 9 cellule). Durante la fase stazionaria le cellule metabolicamente attive potrebbero smettere di riprodursi e il tasso di riproduzione potrebbe bilanciarsi con il tasso di mortalità (graficamente vediamo una retta). Alcuni batteri come E.coli attivano i geni sur e fenomeni di protezione dai danni ossidativi. La fase stazionaria è causata da: a. nutrienti limitati b. limitata disponibilità di ossigeno c. accumulo di rifiuti tossici d. raggiungimento di una densità di popolazione critica Tempo di generazione e velocità di crescita Il tempo di generazione è il tempo necessario per la duplicazione di una cellula, esso può essere direttamente ricavato utilizzando il grafico semilogaritmico della curva di crescita. La velocità di crescita corrisponde al numero di generazioni per unita di tempo in una coltura in crescita esponenziale. Crescita diauxica La curva in rosso rappresenta la crescita di un microrganismo in un sistema chiuso e in presenza di due fonti di carbonio ed energia (glucosio e lattosio). Inizialmente è utilizzato solo il glucosio e, dopo un arresto della crescita, questa riprende a spese del lattosio. La curva in blu indica l'attivita dell'enzima P-galattosidasi, necessario alla cellula per utilizzare il lattosio. Il gene codificante per tale enzima (/acZ) non è espresso finché il glucosio e presente all'esterno della cellula. Colture in continuo Sono colture mantenute in un ambiente costante per un lungo periodo di tempo, questo sistema viene utilizzato su larga scala a livello industriale.  Lezione 12 MISURA DELLA CRESCITA MICROBICA Metodi diretti, valutazione del numero di cellule ▪ microscopia ▪ conteggio di colonie Metodi indiretti, valutazione della massa microbica ▪ massa cellulare ▪ densità cellulare Metodi chimici, si sfrutta come parametro l’ATP Conta vitale Si tratta di uno dei metodi di conta più utilizzati, è un metodo che consente di valutare il numero di colonie che si formano su un opportuno terreno di crescita, previa incubazione. Il presupposto è che ciascuna cellula microbica presente nel campione o in una sua diluizione si sviluppi dando origine ad un’intera colonia batterica, distinta dalle altre. Questa metodica è anche chiamata conta in piastra o conta delle colonie. Questo sitema risulta molto semplice, molto sensibile e consente di stimare esclusivamente le cellule vitali contenute nel campione. Tecniche di piastramento Il campione di batteri opportunamente diluito è piastrato sulla superficie di agar solidificato o mescolato con agar e versato nella piastra petri. Dopo l’incubazione il numero dei microrganismi è determinato mediante conta del numero di colonie moltiplicato per il fattore di diluizione. I risultati sono espressi come unità formanti colonia (CFU). Semina in superficie 1. 100ul della sospensione batterica o di una sua diluizione su un opportuno terreno di crescita 2. incubazione 3. conteggio Semina per inclusione 1. 1ml della sospensione batterica o di una sua diluizione miscelato col terreno agarizzato, ma ancora liquido 2. incubazione 3. conteggio Limiti Se il numero di cellule nel campione è elevato si formeranno meno colonie, esse non avranno lo spazio adeguato per poter crescere adeguatamente (sottostima). Se invece il numero di cellule nel campione è troppo piccolo, il conteggio ottenuto ha una bassa significativa statistica. Un conteggio valido può essere effettuato in quelle piastre che contengono un numero di colonie compreso tra 20 e 300. Il conteggio finale viene espresso in CFU, piuttosto che in numneroi di cellule vitali. Filtrazione su membrana La tecnica della filtrazione su membrana viene utilizzata principalmente per campioni acquatici (analisi delle acque). Conta diretta delle cellule (microscopia) Una sospensione batterica può essere osservata direttamente al microscopio tramite apposite camere di conta come la Camera di conta di Petroff-Hausser (camera di Burker). Metodi indiretti La misura della massa cellulare può essere ricavata attraverso: ▪ peso secco, misurazione che richiede tempo e non è molto sensibile ▪ quantificazione di un particolare costituente cellulare (es. proteine, DNA e ATP o clorofilla) ▪ misure turbidometriche (deviazione della luce) Valutazione della torbidità Tramite l’utilizzo dello spettrofotometro è possibile rilevare il grado di dispersione della luce, dovuto alla presenza di cellule batteriche. Si possono adottare diverse lunghezze d’onda della luce che passa attraverso la sospensione batterica, in genere sono comprese tra 400 e 600nm. Esiste una relazione lineare matematica, la legge di Lambert- Beer, tra l’assorbanza di una soluzione (valore indicato dallo spettrofotometro) e la concentrazione del soluto (sospensione batterica). L’entità della dispersione della luce è direttamente proporzionale alla concentrazione della sospensione microbica. Per poter ricavare il numero di cellule batteriche presenti in una sospensione conoscendo l’assorbanza di quest’ultima, è necessario disporre di una curva standard che metta in relazione il numero di cellule (conta vitale) con i valori di assorbanza. Assorbanza (densità ottica) = A log (I0 /I) I0 (intensità della luce incidente) I (intensità della luce trasmessa) Il metodo della spettrometria è rapido e di facile esecuzione, non danneggia ne distrugge il campione ma risulta essere meno sensibile del conteggio su piastra. Misura del peso umido/secco Un terreno liquido contenete le cellule in coltura viene centrifugato. Il peso umido delle cellule viene misurato ponendole in un recipiente di peso noto. Per rilevare invece il peso secco bisogna incubare la sosensione batterica in un terreno liquido, separare e lavare il contenuto per centrifugazione e provvedere con la disidratazione (trattamento over-night a 100-105°C). Il peso secco di una popolazione batterica, in genere, è circa il 20% del peso umido. La misura del peso secco viene spesso utilizzata per il conteggio di particolari specie microbiche come funghi e attonimiceti. Analisi chimica di un costituente cellulare La biomassa totale può anche essere calcolata determinando la quantità di un costituente cellulare. L’azoto che costituisce il 14% delle cellule può essere misurato attraverso il lavaggio delle cellule e successiva digestione con acido solforico, tramite una reazione chimica l’azoto cellulare viene convertito in ammoniaca. Il quantitativo di NH3 + viene rilevato tramite reazione colorimetrica. Per rilevare il quantitativo di carbonio cellulare, le cellule digeriscono un forte agente ossidante, il dicromato di potassio in acido solforico. La quantità di carbonio presente è proporzionale al dicromato ridotto.  Lezione 13 CONTROLLO DELLA CRESCITA MICROBICA Il controllo della crescita microbica si effettua in due modi: uccidendo i microrganismi oppure inbendo la crescita dei microrganismi. Gli agenti che uccidono le cellule sono chiamati citocidi (es. battericidi e fungicidi), mentre quelli che inibiscono la crescita sono agenti citostatici (es. batteriostatici) In passato venivano utilizzati trattamenti quali, l’essicazione o la salagione (rischio di proliferazione dello Stafilococcus Aureus) per le carni, i pesci e i vegetali per aumentare la conservabilità dell’alimento. Altri alimenti facilmente deperibili come il latte producono prodotti fermentati, che abbassano il ph dell’alimento inibendo la crescita di microrganismi. Controllo della crescita microbica nel 1800 ▪ Joseph Lister, adottò tecniche di asepsi per prevenire le contaminazioni microbiche delle ferite chirurgiche utilizzando soluzioni diluite di fenolo per le medicazioni chirurgiche. ▪ Ignaz Semmelweis, pioniere nell’utilizzo di antisettici nell’ostetrica, ridusse in modo significativo la mortalità delle partorienti per febbre attraverso un accurato lavaggio delle mani con cloruro di calcio (battericida). In passato venivano eseguite numerose autopsie sui cadaveri e il chirurgico non lavando adeguatamente le mani fungeva da veicolo di patogeni, causando la morte di numerosissime pazienti, soprattutto donne gravide. ▪ Louis Pasteur, studiò l'uso del calore come agente per la conservazione di vino, birra, aceto, latte (pastorizzazione). Ha inventato l’autoclave. ▪ Nicolas Appert, fu l'inventore del processo di conservazione chiamato appertizzazione che consiste nel portare l'alimento, inscatolato o imbottigliato a chiusura ermetica, a circa 120°C per 15-30 minuti. Sterilizzazione È la completa distruzione o eliminazione di tutte le forme microbiche vitali. (le forme vitali maggiormente resistenti sono le endosppre batteriche). Il calore (sottoforma di calore umido, calore secco e fuoco) è l'agente maggiormente impiegato per uccidere i microrganismi. In particolare, per quanto riguarda i batteri, con la sterilizzazione vengono eliminati sia i batteri non sporigeni (tutti termosensibili) e sia gli sporigeni (sia le forme vegetative, termosensibili, sia le endospore, termoresistenti). Oltre al calore, altri metodi di sterilizzazione sono l'impiego di radiazioni e la filtrazione (per rimuovere i microrganismi da substrati liquidi). ▪ "sterilizzazione" commerciale: sono trattamenti termici sufficienti a distruggere le spore di Clostridium botulinum (che produce una tossina letale) cui vengono sottoposte le conserve alimentari (in realtà non si ha la completa sterilizzazione). Nella maggior parte dei casi non è necessaria, infatti, la completa sterilizzazione ma è sufficiente l'eliminazione dei microrganismi patogeni (piatti, posate, ferite chirurgiche) ▪ disinfezione: distruzione dei microrganismi patogeni mediante agenti chimici, radiazioni ultraviolette, acqua bollente, vapore acqueo (non si ottiene sterilità). Viene effettuata su superfici inerti. Permette di ridurre il quantitativo di microrganismi, non li elimina tutti. ▪ antisepsi: trattamento effettuato su un tessuto vivente. Si utilizzano agenti chimici (es. alcoli).  ▪ degermazione: è una forma di antisepsi. Consiste nella rimozione fisica della maggior parte dei microrganismi da un'area limitata (es. cute strofinata con alcol prima di un'iniezione). ▪ sanitizzazione: è una forma di disinfezione. Diminuzione del numero di microrganismi a livelli di sicurezza per la salute pubblica (es. lavaggio delle stoviglie ad alte temperature e/o con detergenti). I fattori che infuenzano la sterilizzazione sono la presenza di materiale organico, la presenza di microrganismi più resistenti e il ph (in un terreno acido il calore si dimostra essere più efficace). Metodi per il controllo della crescita microbica Metodi fisici: Metodi chimici: ▪ calore (sterilizzazione) ▪ fenolo e composti fenolici ▪ filtrazione (sterilizzazione) ▪ clorexidina ▪ radiazione (sterilizzazione) ▪ alogeni ▪ freddo ▪ alcoli ▪ metalli pesanti ▪ alte pressioni ▪ tensioattivi ▪ disidratazione ▪ acidi organici ▪ pressione osmotica Calore Il calore disgrega le componenti essenziali della cellula ▪ calore: il più importante e più utilizzato. Le endospore sono considerate le più termoduriche, perciò, la loro eliminazione garantisce la sterilità. ▪ incenerimento: brucia gli organismi e li distrugge fisicamente. Utilizzato per aghi, vetreria e per oggetti che non si distruggono durante l'incenerimento. Controllo microbico con il calore 1. bollitura: acqua bollente, trattamento a vapore fluente (non sterilizza). 2. autoclave (calore umido: vapore sotto pressione): a 121°C per 15 minuti. Ottima per sterilizzare quasi tutto, ma le sostanze labili al calore possono essere denaturate. Nell’autoclave non è la pressione a provocare la morte dei microrganismi, ma l’elevata temperatura che può essere raggiunta in condizioni di vapore a una pressione superiore a quella atmosferica. L’elevata temperatura provoca la coagulazione (denaturazione) delle proteine. La pressione supplementare aumenta il punto di ebollizione dell’acqua incrementando il suo potere per uccidere.  Esistono degli indicatori, come ad esempio gli scotch/strisce che ci indicano se il processo di sterilizzazione è avvenuto adeguamtente oppure no. Questi indicatori esistono anche per la sterilizzazione in stufa. 3. calore secco: 160°C per 2 ore o 170°C per 1 ora. Utilizzato per vetreria (è molto comodo in quanto la vetreria esce già asciutta e già da subito utilizzabile mentre utilizzando l’autoclave la vetraia uscirà umida e non potrà essere ulizzata sin da subito), metallo, e altri oggetti termostabili. Il calore secco viene generato tramite l’ausilio della stufa. (Viene utilizzato per sterilizzare polveri ed è sconsigliato o per la sterilizzazione dei terreni in quanto ha un basso potere di penetrazione). Il calore secco uccide i microrganismi mediante effetti di ossidazione come il flambaggio e la stufa. 4. pastorizzazione 63°C per 30 minuti, uccide la maggior parte delle forme vegetative inclusi i patogeni quali Streptococchi, Stafilococchi e Mycobacterium tuberculosis (non sterilizza). Metodo messo a punto da Pasteur per prevenire le alterazioni della birra e del vino. Venne poi usata per uccidere i microrganismi patogeni nel latte. Questa tecnica permette anche di abbassare le concentrazioni dei microrganismi presenti del latte, in modo da prolungarne la sua conservazione in frigorifero. Metodo tradizionale: 63°C per 30 min (tempo di morte termica del microrganismo più pericoloso: Coxiella burnetii): pastorizzazione bassa. Trattamento di pastorizzazione ad alta temperatura per tempi brevi (HTST): 72°C per 15 secondi Trattamento UHT: 140°C per meno di un secondo Il calore umido ha un potere di penetrazione maggiore del calore secco e permette di ottenere, a una data temperatura, una riduzione più rapida del numero degli organismi vitali. Filtrazione La filtrazione è la rimozione fisica di tutte le cellule in un liquido o gas, specialmente per sterilizzare soluzioni che verrebbero denaturate dal calore. Esistono filtri di dimensioni e materiali differenti. Possono essere realizzati con acetato di cellulosa, nitrocellulosa o policarbonato. Il diametro dei pori varia tra 0,1 um a 2um. (non è possibile filtratere più di 100ml perché il filtro si intasa). La filtrazione viene utilizzata per antibiotici, sostanze iniettabili, amminoacidi, vitamine e zuccheri in quanto utilizzando l’autoclave andremmo a danneggiare il contenuto biochimico. Radiazioni Le radiazioni hanno diversi effetti sulle cellule, a seconda della lunghezza d'onda, intensità e durata. Le radiazioni che distruggono i microrganismi (radiazioni sterilizzanti) sono di due tipi: ▪ ionizzanti (raggi y, raggi X, fasci di elettroni ad alta energia) con 2< 1 nm: espellono elettroni dalle molecole ionizzandole. Radiazioni ionizzanti: alta energia e potere di penetrazione negli oggetti (es. contenitori); vengono usate per la sterilizzazione e la decontaminazione delle strumentazioni mediche, degli oggetti monouso da laboratorio, dei farmaci e nelle industrie alimentari (spezie e carne fresca) ossia per gli elementi sensibili al calore e non filtrabili. I raggi gamma (cobalto-60) e le altre radiazioni ionizzanti uccidono la cellula in seguito alla formazione di radicali liberi altamente reattivi (OH ) oppure causando la rottura di uno o ambedue i filamenti di DNA. ▪ non ionizzanti (raggi ultravioletti) con 2> 1 nm: causano danni al DNA (dimeri di timina). Sono utili per disinfettare superfici esposte, aria e altri materiali (es. superfici di cappe biologiche), hanno una scarsa capacità di penetrazione attraverso vetro o superfici solide ed opache. Altri metodi fisici per il controllo della crescita microbica La disinfezione Ha lo scopo di ridurre drasticamente il numero dei microrganismi patogeni o indesiderati. Gli agenti chimici sono usati su tessuti viventi (es. antisettici) o oggetti inanimati (es. disinfettanti). Pochi agenti chimici raggiungono la sterilità. Metodi chimici per il controllo microbiologico Le due maggiori categorie di agenti sterilizzanti sono: 1. agenti alchilanti: sono altamente reattivi e interagiscono con molte strutture cellulari. Ossido di etilene (gas) denatura proteine, enzimi e acidi nucleici. Alto potere di penetrazione. Viene usato per sterilizzare dispositivi medici, oggetti di gomma e di plastica, tessuti e carta. Formaldeide (gas o liquida [37%]). Alchilazione degli acidi nucleici e interazione con le proteine. Utilizzato per sterilizzare le superfici. 2. agenti ossidanti: biossido di cloro (gas) agisce sulle proteine ma non sugli acidi nucleici. Usato nella sterilizzazione di lenti a contatto e nella sterilizzazione secondaria di confezioni di materiale di sutura. Ozono (gas) trattamento delle acque e dell'aria. Perossido di idrogeno (gas) usato per sterilizzare endoscopi e dispositivi odontoiatrici. (Liquido) antisettico. Tipologie di disinfettanti ▪ fenolo: a concentrazioni > 1% ha azione antibatterica (es. disinfettant per la gola). Svantaggi: elevata tossicità, irritante ed ha un cattivo odore. ▪ composti fenolici: meno irritanti, disgregano le membrane citoplasmatiche (lipidi), azione persistente. Vengono utilizzati contro i micoplasmi. Non attivi contro endospore. ▪ bifenoli: es. esaclorofene (pelle dei neonati), triclosan (conservante sapone, shampoo e dentifrici), sono efficaci nei confronti dei gram+. ▪ biguanidine: cloroexidina, usato sulla pelle e sulle mucose prima degli interventi chirurgici ▪ alogeni: cloro, iodio e bromo; efficace potere antimicrobico tintura di iodio: soluzione idroalcolica al 7% iodofori: iodio combinato con carriers cloro gassoso trattamento delle acque ipoclorito di sodio; candeggina ipoclorito di calcio: disinfezione utensili nell'industria lattiero-casearia, ristoranti. Liberano cloro attivo libero. Sono forti agenti ossidanti. ▪ aldeidi: elevata reattività chimica, agenti alchilanti, che provocano modificazioni irreversibili nelle molecole. Glutaraldeide usata come disinfettante per endoscopi. Ortoftaraldeide: aldeide aromatica molto attiva e stabile, non tossica o irritante. Formaldeide: Poco usata, molto tossica. ▪ alcoli: esercitano la loro azione denaturando le proteine e sciogliendo i lipidi. Nelle tinture migliorano l’efficacia di altri prodotti chimici antimicrobici. Come disinfettanti vengono utilizzati etanolo acquoso (60-70% massima attività) e isopropanolo. In soluzione acquosa sono più efficaci (l'acqua facilita la denaturazione delle proteine). ▪ metalli pesanti: l’argento, il mercurio, il rame e lo zinco sono usati come germicidi. Lo ione argento è il più efficace. Esercitano la loro azione antimicrobica attraverso l'azione oligodinamica. Quando gli ioni dei metalli pesanti si combinano con i gruppi sulfidrilici (SH), le proteine vengono denaturate. Il mercurio è tossico per l’ambiente e le cellule. I composti mercuriorganici sono meno tossici e irritanti, di questi il più diffuso è il mercurocromo e il sale sodico della dibromoidrossimercurifluoresceina. Tensioattivi I tensioattivi (surfattanti) diminuiscono la tensione superficiale delle molecole di un liquido. Sono dei detergenti (pulizia delle superfici). ▪ anionici (azione detergente nell'anione): sapone, scarso valore come antisettici, elevata capacità di rimozione meccanica dei microrganismi. Lavaggio utensili nell'industria lattiero-casearia ▪ cationici (azione detergente nel catione): Sali dell'ammonio quaternari (derivati dallo ione ammonio tetravalente NH4*). Potenti battericidi soprattutto nei confronti dei G+. Esempi: cloruro di benzalconio e cetilpiridino cloruro. Agenti ossidanti Il perossido di idrogeno. Al 3% (10 Vol) usato per la disinfezione e la detersione delle ferite sporche e delle lenti a contatto.  Lezione 14 LA STRUTTURA DEL DNA NEI BATTERI ▪ DNA: acido deossiribonucleico contiene l’informazione genetica nella sequenza di basi ▪ RNA: acido ribonucleico è una macromolecola con funzione di intermediario. Può servire da molecola informazione di transizione (messaggero), costruire parte attiva del macchinario tradizionale della cellula. ▪ Gene: elemento di informazione che specifica la sequenza di amminoacidi della proteina Il DNA all’interno della cellula è superavvolto, il super avvolgimento è uno stato in cui i filamenti a doppia elica vengono ulteriormente attorcigliati. Gli enzimi che modificano lo stato topologico del DNA sono detti topoisomerasi. Alcuni enzimi batterici, come la DNA girarsi, possono diminuire il valore Lk di una molecola di DNA tagliando i due filamenti e rilevandoli dopo averli srotolati (topoisomerasi di tipo II). La DNA girarsi è l’unica topoisomerasi in grado di superavvolgere negativamente la molecola di DNA. L’enzima si lega a un DNA a doppia elica e lo super avvolge introducendo circa 100 super avvolgimenti per minuto. La forma super avvolta del DNA ha un’energia libera maggiore della forma rilassata e l’energia necessaria per compiere la conversione è fornita dall’idrolisi dell’ATP. Tutte le topoisomerasi sia procariote che eucariote, incluse quelle di tipo I che tagliano una singola elica e la rilegano nella nuova configurazione topologica, rilassano il DNA superavvolto. L’informazione genetica è contenuta nella sequenza di basi azotate della catena del DNA. Le basi azotate sono 4: adenina, guanina, citosina e timina. Il genoma dei procarioti è costituito da un'unica molecola di DNA circolare chiusa coralmente presente nel citoplasma. I due filamenti sono disposti in senso antiparallelo e sono avvolti l’uno interno all’altro a formare una doppia elica.  Lezione 15 LA REPLICAZIONE DEL DNA Gli enzimi che catalizzano le reazioni di accrescimento della catena di DNA sono le DNA polimerasi, le quali sintetizzano il filamento nella direzione 5'→3'. Le DNA polimerasi non sono in grado di iniziare una nuova catena di DNA ma solo di aggiungere un nucleotide ad un gruppo 3-OH preesistente. Al fine di iniziare la sintesi di una nuova catena è necessario un innesco. In genere l'innesco costituito da una breve sequenza di RNA (RNA PRIMER) che viene polimerizzata da un enzima (primasi) nelle fasi iniziali del processo di replicazione. L'innesco viene successivamente rimosso. 1. Svolgimento della doppia elica per separare i due filamenti singoli: elicasi (utilizzano ATP) 2. I filamenti separati vengono mantenuti a singolo filamento grazie a proteine specifiche SSBs (Single-Strand DNA Binding) 3. Lo svolgimento della doppia elica può portare alla formazione di supertorsioni dell'elica. La Topoisomerasi I allenta le supertorsioni prodotte durante la replicazione Il DNA viene replicato in modo continuo dalla DNA polimerasi Ill quando viene copiato il filamento guida. Il filamento lento viene replicato in modo discontinuo. In primo luogo, una speciale RNA polimerasi detta primasi sintetizza un corto innesco di RNA. La DNA polimerasi III copia poi il filamento lento di DNA iniziando dall'estremità 3' dell'RNA innesco e continua ad aggiungere nucleotidi finché non raggiunge il DNA precedentemente sintetizzato. Questi frammenti sono detti frammenti di Okazaki. A questo punto la DNA polimerasi III si ferma e interviene la DNA polimerasi I la quale rimuove un nucleotide per volta dall'RNA innesco (attività esonucleasica) e riempie la parte vuota sintetizzando DNA complementare allo stampo. Infine, la DNA ligasi forma un legame tra l'estremità 3'-idrossile del filamento in crescita e quella 5'-fosfato di un frammento di Okazaki. Sul filamento guida è necessario un solo innesco a livello dell'origine. La DNA polimerasi IlI è quella che ha il ruolo principale nella replicazione sebbene sia aiutata dalla DNA polimerasi I. Si pensa che le polimerasi I e Il partecipino ai processi di riparazione del DNA danneggiato ▪ il cromosoma circolare batterico contiene un'origine di replicazione costituita da una sequenza specifica di circa 300 basi che viene riconosciuta da proteine specifiche.  ▪ in corrispondenza dell'origine di replicazione si forma la forcella di replicazione. Spesso la replicazione è bidirezionale per cui si forma una struttura caratteristica detta forma teta (0) ▪ entrambi i filamenti si duplicano e man mano che la replicazione procede la forcella si muove lungo il DNA. ▪ Le due molecole neoformate si separano Modello di replicazione a cerchio rotante Utilizzato durante la coniugazione e dai batteriofagi. 1. viene introdotto un taglio (nick) su uno dei due filamenti della doppia elica. 2. gli enzimi replicativi sintetizzano nuovo DNA a partire dall'estremità libera 3'-idrossile usando come stampo il filamento intatto 3. mentre l'estremità 3' viene allungata e il punto di crescita gira attorno allo stampo circolare l'estremità 5' si allontana e forma una coda che progressivamente diventa più lunga. 4. la coda, che è a filamento singolo, può essere convertita a DNA a doppio filamento mediante la sintesi del filamento complementare.  Lezione 16 TRASCRIZIONE DEL DNA La sequenza di RNA prodotto dalla trascrizione è complementare a quella dello stampo. La trascrizione produce tre tipi di RNA: 1. RNA messaggero (mRNA) che contiene il messaggio per la sintesi proteica. L’mRNA procariotico è un RNA a singolo filamento di lunghezza variabile che contiene le istruzioni per la sintesi di uno o più polipeptidi. 2. RNA transfer (tRNA) funge da trasportatore di aminoacidi durante la sintesi proteica 3. RNA robosomale (rRNA) sono componenti dei ribososmi Performance della trascrizione e traduzione nei batteri In una cellula devono essere polimerizzati in media almeno 300000 amminoacidi/secondo. In momenti particolari poi, in risposta a cambiamenti fisico-chimici dell’ambiente in cui vive la cellula, è necessario aumentare il tasso di sintesi. Questa performance quantitativa e qualitativa è il frutto dell’evoluzione di una nanomacchina (il ribosoma) che consente di sostenere non solo il tasso medio di sintesi proteica, ma anche eventuali richieste aggiuntive. Queste esigenze di sintesi proteica sono ampiamente garantite da circa 20000 ribosomi, ciascuno dei quali è in grado di polimerizzare fino a 20 amminoacidi/secondo (un tasso di sintesi 10 volte superiore rispetto ai ribosomi eucarioti). Si calcola che oltre il 40% dell’energia totale della cellula sia utilizzata dai ribosomi durante la sintesi proteica. RNA messaggero All'estremità 5' della molecola di mRNA, prima del codone di inizio, c'è una sequenza non tradotta detta sequenza leader, lunga da 25 a 50 basi. Oltre a questa, gli mRNA poligenici (quelli che portano l'informazione per la sintesi di più polipeptidi) hanno regioni spaziatrici che separano quelle che codificano i singoli polipeptidi. I polipeptidi codificati da messaggeri poligenici fanno parte in genere della stessa via metabolica. All'estremità 3' del filamento di RNA, subito dopo il codone di terminazione c'è una coda non tradotta. L'RNA messaggero viene sintetizzato, sullo stampo di DNA, dall'enzima RNA polimerasi con una reazione simile a quella della DNA polimerasi. Anche la sintesi dell'RNA procede in direzione 5'→ 3' Un gene corrisponde a un segmento o sequenza di DNA che codifica per un polipeptide, un RNA o un RNA. Sebbene il DNA possieda due filamenti complementari, la RNA polimerasi copia solamente lo stampo o filamento senso. Quindi, la sequenza corrispondente a un gene è localizzata solo su una delle due eliche complementari: l'elica senso. La RNA polimerasi apre la doppia elica e trascrive il filamento senso per produrre un RNA che è copia complementare e antiparallela rispetto allo stampo. Escherichia Coli La RNA polimerasi di E. coli è una molecola molto grande composta da 4 tipi di catene polipeptidiche: a, B, B'e o. Il nucleo enzima è composto di 4 catene (a, B, B') e catalizza la sintesi di RNA. Il fattore o non ha alcuna attività enzimatica ma aiuta il nucleo enzima a riconoscere l'inizio dei geni. Una volta iniziata la sintesi di RNA, il fattore o si dissocia dal complesso nucleo enzima-DNA ed è disponibile per autare un altro nucleo enzima. La regione di DNA a cui la RNA polimerasi si lega con l'aiuto del fattore o, si chiama promotore e la sua sequenza non viene trascritta. In tutti i promotori batterici c'è una sequenza di 6 basi, circa 35 paia di basi prima del sito di inizio della trascrizione e una sequenza TATAAT o Pribnow box, circa 10 paia di basi prima del sito di inizio della trascrizione. La RNA polimerasi riconosce queste sequenze, si lega al promotore e srotola un breve segmento di DNA che inizia più o meno alla sequenza Pribnow. RNA polimerasi interazione con il DNA Contrariamente alla DNA polimerasi, che necessita di un "innesco" (primer) preformato per iniziare la replicazione del DNA, l'RNA polimerasi è in grado di sintetizzare il primo dinucleotide della molecola di RNA partendo da due monomeri trifosfato. Sotto il profilo topologico la reazione è molto più complessa. La RNA polimerasi deve: 1. identificare il sito dove iniziare il processo, grazie alla forte affinità del suo fattore o per le sequenze del promotore; 2. separare le due eliche di DNA per raggiungere il sito di ini-zio della trascrizione sull'elica stampo; 3. abbandonare il promotore e avanzare sull'elica stampo sro-tolando la doppia elica di DNA mentre polimerizzal'RNAA; 4. terminare il processo alla fine dell'unità trascrizionale. In tutti questi passaggi l'RNA polimerasi interagisce con diversi fattori che segnalano lo stato fisiologico della cellula e regolano di conseguenza il processo trascrizionale. Per svolgere tutte queste funzioni, la RNA polimerasi è necessariamente un enzima complesso. Terminazione Esistono dei segnali di terminazione che segnalano la fine di un gene o di una sequenza di geni. Essi vengono detti terminatori e contengono una sequenza che codifica un segmento di RNA capace di formare legami idrogeno ripiegandosi e dando luogo ad una forcina del tipo stelo-anello. (sequenze palindromiche ricche in GC seguite da sequenze ricche in AT(sequenza poli-U) detti terminatori intrinseci. Vi sono geni che codificano molecole di RNA che non vengono tradotte quali gli rRNA e i tRNA. rRNA: 3 tipologie RNA 16S, RNA 23S e RNA 5S. I geni per ciascuno di questi RNA sono raggruppati in un cluster. Questi geni vengono cotrascritti dando luogo a una singola molecola di RNA. I geni del tRNA sono spesso cotrascritti uno con l'altro o con i geni dell'RNA. Tutti questi trascritti devono poi essere processati prima che vengano prodotte molecole di RNA o tRNA mature e funzionali. Nei procarioti l'unico RNA che molto spesso è funzionale già così come ottenuto dalla trascrizione è l'RNA messaggero. | tRNA e gli rRNA sono sintetizzati prima come lunghe molecole di RNA precursore che viene poi tagliato per dare origine agli RNA maturi. Inoltre, nel tRNA diverse basi subiscono una modificazione dopo la trascrizione. Nei procarioti una singola molecola di mRNA speso codifica più proteine che sono correlate funzionalmente e viene detto RNA policistronico. Un operone è un'unità completa di espressione genica, che spesso contiene geni che codificano polipeptidi diversi su un'unica molecola di mRNA (policistronico) oppure geni che codificano RNA. La trascrizione dell'operone è sotto il controllo di una particolare regione di DNA detta promotore localizzata a monte della sequenza codificante il primo gene dell'operone. Il promotore può essere represso o attivato tramite sequenze geniche.  Lezione 17 LA SINTESI PROTEICA Il codice genetico Codone: sequenza di 3 basi che nell’mRNA codifica per un aminoacido Ci sono 64 possibili codoni di mRNA: codoni specifici per i diversi aminoacidi e codoni speciali per l’inizio e per la fine della traduzione. Degenerazione del codice: la maggior parte degli aminoacidi sono codificati da triplette diverse ma correlate tra loro (trasferimento unidirezionale dell’informazione). ▪ codoni non senso o di stop: segnali di terminazione della traduzione di un gene che codifica una specifica proteina (UAA – UAG – UGA) ▪ codone di inizio: punto di inizio della traduzione AUG che codifica per la N-formil metionina (Batteri). E’ fondamentale per una corretta fase di lettura cioè quella che fornisce la proteina specifica per quel gene E’ essenziale che venga individuato dal ribosoma il corretto codone di inizio L’RNA transfer Molecola corta (73-93 nucleotidi), a singola elica, costituita da regioni variabili e da regioni conservate. Alcune basi sono metilate dopo la trascrizione. Il filamento di tRNA si ripiega su se stesso formando degli appaiamenti. Osservato in due dimensioni ha forma a quadrifoglio. L’anticodone è una regione variabile, l’estremità 3’ è l’estremità accettrice (CCA). All’adenina si lega l’aminoaci