Cours sur les Enzymes PDF

Spécificité des protéines (rappels) La spécificité des protéines pour leur ligand est assurée du fait que les interactions protéine/ligand sont stabilisées si de nombreuses liaisons faibles peuvent s’établir entre la protéine et son ligand. Or celles-ci ne s’effectuent qu’à courte distance lorsque...

Spécificité des protéines (rappels) La spécificité des protéines pour leur ligand est assurée du fait que les interactions protéine/ligand sont stabilisées si de nombreuses liaisons faibles peuvent s’établir entre la protéine et son ligand. Or celles-ci ne s’effectuent qu’à courte distance lorsque les surfaces sont complémentaires. + Forces de v der W 4 types de liaisons faibles interviennent dans Une protéine ne peut pas s’associer l’association réversible entre une protéine et avec 2 énantiomères différents son ligand  Importance de la structure des protéines pour leur fonction (rappels) Pour être fonctionnelle, une protéine doit adopter une structure tridimensionnelle correcte cad être dans sa conformation native. Une protéine dénaturée est inactive. Protéine fonctionnelle Protéine non fonctionnelle  Les enzymes : définitions Certaines protéines sont des catalyseurs : on les appelle alors enzymes. enzyme substrat produit Caractéristiques communes à tous catalyseurs : - Augmente la vitesse de réaction (en abaissant la barrière d’activation de la réaction) - N’agit pas sur le sens de réaction (peut en théorie catalyser une réaction dans les 2 sens) - N’intervient pas dans le bilan final de la réaction  Les enzymes sont des catalyseurs exceptionnels 1) Elles sont très efficaces en conditions réactionnelles douces (fonctionnement en conditions physiologiques à pH et T° donnés) et agissent à faible concentration (économie pour la cellule). 2) Elles sont spécifiques d’un (ou d’un petit nombre de) substrat(s) particulier(s) et accélèrent un seul type de réaction → dans la cellule le devenir d’un métabolite est déterminé par la nature des enzymes activées dans cette cellule. 3) Leur quantité et leur activité peut-être régulée ce qui permet de répondre aux besoins de la cellule. → Elles facilitent des réactions complexes qui, sinon, ne se produiraient pas dans la cellule Ex : synthèse protéique dans les ribosomes  Classification des enzymes selon les réactions qu’elles catalysent Dans une cellule eucaryote, il y a plus de 5.000 enzymes différentes. Dans les années 60, ces enzymes ont été classées en 6 groupes principaux qui indiquent le type de réactions qu’elles catalysent :  Le site actif est composé d’aa réactifs Site actif = le site de l’enzyme sur lequel se fixe le substrat. Il renferme des aa qui jouent un rôle dans la catalyse en interagissant avec le substrat. Ces aa présentent des groupes fonctionnels réactifs qui vont intervenir dans la réaction à catalyser. Ex : - OH d’une sérine, -COOH d’un aspartate, le cycle imidazole de l’histidine… Conséquence d’une modification du site actif NB : Les aa réactifs peuvent être éloignés dans la structure Ir des (par exemple induit par une mutation du protéines et être rapprochés dans la gène codant pour la protéine) ?? structure tridimensionnelle de la protéine.  Importance des enzymes pour un vétérinaire Comprendre comment une cellule/organisme peut s’adapter à différentes conditions→ Illustration avec une enzyme clé qui régule les activités métaboliques. l’AMP kinase (AMPK) est une enzyme dont l’activité augmente lorsque [AMP] augmente. Elle phosphoryle alors des enzymes clés du métabolisme, ce qui modifie leur activité : -elle active les voies métaboliques qui produisent de l’ATP (transport de glucose, glycolyse, oxydation des acides gras) -elle inhibe les voies métaboliques qui consomment de l’ATP (synthèse d’acides gras, de cholestérol, de protéines…) -elle permet une augmentation de la prise L’AMPK agit au niveau cellulaire mais permet la alimentaire régulation des dépenses énergétiques de l'organisme entier ainsi que la modulation de la prise alimentaire.  Importance des enzymes pour un vétérinaire Comprendre le mode d’action de certains médicaments. L’aspirine est un anti-inflammatoire utilisé en cas d’inflammation, de douleur, de fièvre… Comment agit-elle ? Pourquoi ne faut-il pas utiliser l’aspirine s’il y a un risque d’hémorragie ?  Attention !! L’activité catalytique dans les cellules n’est pas seulement l’apanage des protéines Les ribozymes sont des ARN ayant des propriétés catalytiques. Exemple : la ribonucléase P qui clive les a. nucléiques (maturation des ARNt)  COURS d’enzymologie 1. Coenzimas y co-factores 2. Mecanismos 3. Cinética 4. Regulación  Certaines enzymes nécessitent des co-facteurs ou des co-enzymes Il existe une grande diversité des réactions catalysées. Elles sont catalysées : - par des protéines simples Ou - par des protéines complexes (quand le répertoire de chaînes latérales des aa n’est pas suffisant pour équiper le site actif de manière optimale), l’enzyme s’associe alors à des : → Co-facteur = substance chimique non protéique → Co-enzyme = molécule organique complexe Dans ces conditions, l’environnement protéique a souvent pour fonction de positionner convenablement le substrat et de favoriser chimiquement l’activité du co-facteur ou de la co-enzyme.  Exemples de co-facteurs : les ions métalliques des métalloenzymes Dans les métalloprotéines, l’ion métallique est directement complexé aux chaînes latérales des aa. Fonctions possibles du co-facteur métallique : -Orientation du substrat -Masquage ou stabilisation de charges -Catalyseur acide-base -Accepteur ou donneur d’électrons (réaction d’oxydoréduction = réaction redox) -… Exemples de co-facteur Exemples d’enzyme Rôle de l’ion métallique Fe2+ ou Fe3+ NADH déshydrogénase Réaction redox Cu2+ Cytochrome c oxydase Réaction redox Zn2+ Carboxypeptidas A Compensation de charges Mg2+ ARN polymérase Fix° du substrat Mo6+ Nitrogénases (bactéries) Réaction redox Le besoin en oligos-élements (Fe, Zn, Cu…) s’explique souvent par leur rôle de co-facteur enzymatique.  Exemples de co-enzymes Fonctions possibles : ATP : - Donneur ou accepteurs d’électrons, d’ions (hydrures H-...) - Donneur de groupe fonctionnel (ex : ATP) - … Exemples de co-coenzyme Rôle du co-enzyme Hème Transfert d’électrons Nicotinamide adénine dinucléotide : NAD+ et Transfert d’ions et d’électrons la flavine adénine dinucléotide : FAD Adénosine triphosphate : ATP Transfert de groupement phosphate Beaucoup de précurseurs de co-enzymes (ex : B3, B5, B6…) et même certaines co-enzymes sont des vitamines (que l’organisme ne sait pas synthétiser et qui doivent donc se trouver dans l’alimentation).  NAD+ est une co-enzyme participant à des réactions d’oxydo-réduction du métabolisme nicotinamide réduction Nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) : ✓ Co-enzyme d’oxydoréduction permettant le transfert de 2e- NB : Peut exister sous la forme phosphorylée : NADP+ Le NAD+ et le NADH ont des spectres d’absorption différents Le NAD+ et le NADH ont des spectres d’absorption différents. Il est possible de quantifier le NADH en solution par spectrophotométrie à 340nm. FAD est une co-enzyme participant à des réactions d’oxydo-réduction du métabolisme Réduction 1 Réduction 2 La flavine mononucléotide (FMN) est un dérivé de la riboflavine (vitamine B2) La flavine adénine dinucléotide (FAD) et la FMN : ✓ Permettent le transfert d’un ou de deux e- NB. C’est un colorant alimentaire désigné par E101a  FMN et FAD s’associent aux flavoprotéines Les flavoprotéines s’associent au FAD ou au FMN et peuvent catalyser des réactions d’oxydo-réduction → Déshydrogénases: catalyseur de réactions d’oxydation → Réductases : catalyseur de réactions de réduction  Co-facteurs ou des co-enzymes → Co-fateurs = substance chimique non protéique (ex : les ions métalliques) → Co-enzymes = molécules organiques complexes (ex : hème, NAD+, FAD, l’ATP…) → Classification des molécules qui s’associent à une enzyme en fonction de leur nature mais il existe d’autres types de classification  Co-substrat et groupement prosthétique → Co-substrat : molécule associée à une protéine de manière transitoire → Groupement prosthétique : molécule associée à une protéine de façon permanente  COURS d’enzymologie 1. Coenzimas y co-factores 2. Mecanismos 3. Cinética 4. Regulación  II/ Les mécanismes des réactions enzymatiques enzyme A+B C+D La catalyse enzymatique est permise car l’enzyme : 1) Fournit des conditions favorables à une réaction → favorise la rencontre des réactifs dans une orientation optimale pour la réalisation de la réaction chimique 2) Stabilise de l’état de transition  II/ Les mécanismes des réactions enzymatiques 1) L’enzyme fournit des conditions favorables à une réaction → favorise la rencontre des réactifs dans une orientation optimale pour la réalisation de la réaction chimique  II/ Les mécanismes des réactions enzymatiques 1) L’enzyme fournit des conditions favorables à une réaction → favorise la rencontre des réactifs dans une orientation optimale pour la réalisation de la réaction chimique Lactate déshydrogénase Substrat A Substrat B Site actif Produit C Lactate déshydrogénase Pyruvate + NADH,H+  Lactate + NAD+  Quelques rappels de chimie Dans une cellule, les réactions du métabolisme se déroulent en permanence → leur équilibre n’est pas atteint. Soit la réaction : A+B C+D [C] x [D] A l’équilibre, on aura : K= [A] x [B] [C] x [D] Dans la cellule, l’équilibre n’est pas atteint donc: K≠ [A] x [B] [C] x [D] Si < K alors la réaction se produit spontanément vers la droite A+B C+D [A] x [B] [C] x [D] Si > K alors la réaction se produit spontanément vers la gauche C+D A+B [A] x [B] Pour décrire ce phénomène plus rigoureusement, on fait appel à la notion d’énergie libre G. TOUT SYSTEME HORS D’EQUILIBRE EVOLUE SPONTANEMENT DANS LE SENS D’UNE DIMINUTION D’ENERGIE LIBRE  Energie libre d’une réaction [C] x [D] Soit une réaction A+B C+D ayant pour constante de réaction K = [A] x [B] L’énergie libre de cette réaction (à pH=7) est : Gº’ = - RT ln K K : constante de la réaction, R : constante des gaz parfaits et T : température) Gº’ indique si une réaction est spontanée ou non : Gº’ < 0 : réaction spontanée : « réaction libérant de l’énergie » Gº’ > 0 : réaction non spontanée : « réaction nécessitant un apport d’énergie » Gº’ définit le rapport de concentration entre les réactifs et les produits, à l’équilibre. Attention: Gº’ n’indique pas la vitesse avec laquelle cet équilibre sera atteint mais seulement les concentrations des produits et des réactifs lorsque l’équilibre est atteint.  Etat de transition et barrière énergétique On considère une réaction spontanée : S → P (Gº’ < 0). Gº’ = GP - GS indique si la réaction est possible thermodynamiquement et dans quel sens. Si Gº’ < 0 dans alors GP < GS  Etat de transition et barrière énergétique On considère une réaction spontanée : S → P (Gº’ < 0). G°’ = GP - GS indique si la réaction est possible thermodynamiquement et dans quel sens. L’énergie libre d’une réaction spontanée ne suit pas un chemin constant « en descente » : il existe un maximum d’énergie libre à franchir : la barrière d’activation. Elle correspond au passage des molécules au cours de la réaction par un état de transition. Cet état de transition correspond à un corps très instable, à plus haut niveau d’énergie libre, que les molécules de départ. + La barrière énergétique qui doit être franchie = énergie libre d’activation G+ Plus la barrière énergétique augmente plus la vitesse de réaction diminue  Les enzymes réduisent l’énergie libre d’activation des réactions Dans la cellule, l’énergie libre d’une réaction est fixée. Elle dépend des caractéristiques du substrat et du produit. Les enzymes ne modifient donc pas l’énergie libre d’une réaction. S+E ES EP P+E Les composés intermédiaires (ES et EP) sont stabilisés par l’enzyme : ils correspondent à des valeurs d’énergies libres faibles et qui diminuent régulièrement. La barrière énergétique à franchir pour passer d’un intermédiaire à l’autre est diminuée par l’enzyme. Le passage d’un intermédiaire au suivant est donc facilité. Les enzymes stabilisent l’état de transition et abaissent donc l’énergie libre d’activation et accélère l’établissement de l’équilibre réactionnel.  L’enzyme stabilise l’état de transition S+E SE PE P+E L’enzyme stabilise les intermédiaires de réactions en établissant avec eux des liaisons faibles. NB. Dans les enzymes, les liaisons faibles ont donc plusieurs rôles : -stabiliser la structure tridimensionnelle de l’enzyme -stabiliser l’association enzyme-substrat ce qui permet d’orienter le substrat -stabiliser les intermédiaires de réactions et donc accélérer la réaction COURS d’enzymologie 1. Coenzimas y co-factores 2. Mecanismos 3. Cinética 4. Regulación  III/ Cinétique enzymatique ✓ Estudio de la velocidad de las reacciones enzimáticas ✓ Ecuación de Michaelis-Menten ✓ Transformaciones ✓ Parámetros cinéticos  Concepts basiques de la cinétique réactionnelle K, la constante d’une réaction, indique les concentrations en substrats et en produits à l’équilibre [C] x [D] Soit une réaction A+B C+D ayant pour constante de réaction K = [A] x [B] mais K NE PREDIT PAS LA.VITESSE DE LA REACTION → Comment peut-on connaître la vitesse d’une réaction ?  Concepts basiques de la cinétique réactionnelle La cinétique réactionnelle : étude de la vitesse de la réaction 1) S⇌P [S] [P] 0 Vitesse initiale de la réaction V0 : t t consommation du substrat par unité de temps ou la formation du produit par unité de temps V0 = -d [S]/dt = d [P]/dt dans les conditions initiales (V tend vers zéro lorsqu’on atteint l’équilibre) NB. La vitesse initiale dépend de plusieurs facteurs : - Le temps nécessaire à l’enzyme pour convertir le substrat en produit - La quantité d’enzyme par rapport à la quantité de substrat → Comment évolue V0 lorsque la concentration initiale en substrat augmente?  Etude de la vitesse de réaction en fonction de la concentration en substrat Détermination expérimentale de la cinétique réactionnelle en mesurant la vitesse initiale de la réaction Vo à différentes concentrations de substrat → Obtention d’une courbe hyperbolique passant par l’origine et dont l’asymptote horizontale indique Vmax de la réaction. Au début de la courbe, la vitesse de réaction augmente linéairement avec [S] : la probabilité de rencontre entre le substrat et l’enzyme augmente ce qui favorise la réaction. A forte concentration de substrat : la vitesse de la réaction s’approche de Vmax : toutes les molécules d’enzymes sont complexées en permanence avec le substrat → saturation Vitesse initiale Vo  Détermination de l’équation de la courbe V0 en fonction de la concentration en substrat Vmax et Km caractérisent l’enzyme étudiée Equation de Michaelis Vmax. [S] Vmax / 2 Vo = [S] + Km Km ✓ Relaciona V0, Vmax y [S] a través de Km ✓ Km es la [S] a la que se alcanza la velocidad semimáxima ✓ Km engloba a las constantes de velocidad de la reacción  Concepts basiques de la cinétique réactionnelle K, la constante d’une réaction indique les concentrations en substrats et en produits à l’équilibre mais NE PREDIT PAS LA VITESSE DE LA REACTION. Comment peut-on connaître la vitesse d’une réaction ? La cinétique réactionnelle : étude de la vitesse de la réaction 1) S⇌P Vitesse de la réaction V0 : consommation du substrat par unité de temps ou la formation du produit par unité de temps V0 = -d [S]/dt = d [P]/dt dans les conditions initiales (V tend vers zéro lorsqu’on atteint l’équilibre) Au début de la courbe, la vitesse de réaction augmente linéairement avec [S] donc dans les conditions initiales : Equation de vitesse : V0 = k [S] attention ne pas confondre k et K !! k = constante de vitesse (en s-1) k est une constante qui indique la vitesse à laquelle la réaction peut se produire dans les conditions initiales. k est indépendante de la concentration en substrat.  Equation de Michaelis-Menten (1) Les résultats expérimentaux suggèrent que la réaction S → P s’effectue en 2 étapes, par l’intermédiaire de la formation d’un complexe enzyme-substrat (ES). k1 k2 E+S k-1 ES k-2 E+P ES : complexe enzyme substrat = complexe de Michaelis Or dans les conditions initiales, k-2 est négligeable (au début de la réaction, il y a trop peu de produit formé pour qu’il réagisse en sens inverse) donc : k1 k2 E+S k-1 ES E+P Vitesse de formation du produit dépend de [ES] V0 = k2 ES   Equation de Michaelis-Menten (2) k1 k2 E+S k-1 ES E+P ES se forme par association de E et de S ES est consommé par formation du produit ou par dissociation de E et S Vitesse de formation de ES: V = k1 [E] [S] Vitesse de dissociation de ES: V’ = k-1 [ES] + k2 [ES] Hypothèse de l’état quasi-stationnaire : quand [S]>> [E] , il se forme autant de complexes ES qu’il en disparaît. D’où : V =V’ donc k1 [E] [S] = k-1 [ES] + k2 [ES] Par ailleurs, [Et] : concentration totale en enzyme Avec [E] : concentration en enzyme libre D’où : [E] = [Et] - [ES]  Equation de Michaelis-Menten (3) Rappels : k1 [E] [S] = k-1 [ES] + k2 [ES] [E] = [Et] - [ES] k1 ([Et] - [ES]) [S] = k-1 [ES] + k2 [ES] [Et]. [S] k −1 + k 2 [ES] = k2 + k-1 On pose : Km = [S] + k1 k1 [Et]. [S] [ES] = [S] + Km Rappel : Vitesse de formation du produit : V0 = k2 ES  [Et]. [S] d’où : Vo = k2 [S] + Km  Equation de Michaelis-Menten (4) Or Vmax est atteinte lorsque toutes les molécules d’enzymes sont saturées en substrat → [ES]max = [Et] Vmax = k2 [ES] max = k2 [Et] k2 [Et]. [S] Vmax / 2 Vo = [S] + Km Vmax. [S] Km Vo = [S] + Km Equation de Michaelis  Transformation de Lineweaver-Burk (doubles inverses) Vmax S  V0 = S  + K m 1 S  + K m pente = V0 Vmax S  1 = Km + S V0 Vmax S  Vmax S  1 Km 1 1 = + V0 Vmax S  Vmax  Transformation de Eadie-Hofstee 1 Km 1 = + V0 Vmax S  Vmax Vmax Vmax Vmax K m Vmax = + V0 Vmax S  Vmax Slope pente - = Km V Vmax K m 0 = +1 V0 S  Vmax Km K mV0 Vmax = + V0 S  V0 V0 V0 = − K m + Vmax S  [S]  Paramètres cinétiques 1) Dans la situation où k2