Cours AMQ4 (1) PDF

Partie 1: Techniques spectroscopiques ▪ Introduction à la spectroscopie ▪ Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible) ▪ Spectrométrie infrarouge (IR) ▪ Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie) ▪ Spectrométrie de fluorescence des rayons X (FX)...

Partie 1: Techniques spectroscopiques ▪ Introduction à la spectroscopie ▪ Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible) ▪ Spectrométrie infrarouge (IR) ▪ Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie) ▪ Spectrométrie de fluorescence des rayons X (FX) ▪ Diffraction des rayons X (DRX) ▪ Spectrométrie d'Absorption Atomique (AA) ▪ Spectrométrie d’émission atomique à plasma à couplage inductif (ICP)  I- Principes de Base et Théorie  Le domaine spectral La spectrométrie de fluorescence moléculaire étudie l’émission de lumière par des molécules, en solution après excitation par des photons appartenant au domaine du visible ou du proche ultraviolet. Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Terminologie 1. Luminescence : La luminescence est une émission de rayonnements électromagnétiques visible ou proche ultraviolet. Selon la source de l’énergie excitatrice, on distingue plusieurs phénomènes de luminescences : Phénomène de luminescence Source de l’énergie excitatrice Chimiluminescence Réaction chimique Bioluminescence Réaction enzymatique Thermoluminescence Chaleur Electroluminescence Courant électrique Photoluminescence Absorption de photons Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Terminologie 2. Photoluminescence : La photoluminescence est un phénomène de luminescence due à l’absorption de photons. Selon la durée de la luminescence, on distingue : a. La phosphorescence ; de longue durée (plusieurs minutes voir plusieurs heures). b. La fluorescence ; de courte durée (quelques nanosecondes). Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Terminologie 3. La spectrométrie de fluorescence ou Fluorimétrie : La fluorimétrie regroupe deux techniques analytiques : Analyte Domaine énergétique Spectrométrie de fluorescence moléculaire Molécule Visible et proche UV Spectrométrie de fluorescence atomique Atome Rayons X ou spectrométrie de fluorescence X Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Origine de la photoluminescence Fluorescence : transitions électroniques n → π* ou π → π* entre deux états énergétiques de même multiplicité. Absorption des molécules organiques dans le domaine UV-Visible Phosphorescence : transitions électroniques n → π* ou π → π* entre deux états énergétiques de multiplicités différentes. Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Origine de la photoluminescence 1- Règle de multiplicité: - Nombres quantiques électroniques Chaque électron est caractérisé par les nombres quantiques : - Nombre quantique principal (n) - Nombre quantique azimutal ou secondaire (l) - Le nombre quantique magnétique (ml) - Nombre quantique de spin (ms ) (ms = ± ½) - La multiplicité La multiplicité M définit deux états électroniques : SINGULET ou TRIPLET M = 2S + 1 Avec S = Somme de « ms » des électrons d’une orbitale moléculaire Etat SINGULET : M = 1 Etat TRIPLET : M = 3 Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Origine de la photoluminescence 1- Règle de multiplicité: On distingue ainsi les états électroniques suivants : a. Etat électronique fondamental SINGULET : Les électrons appariés sont de spins opposés ou antiparallèles (↑↓) M = 2 [(+ ½ ) + ( - ½ )] + 1 => M = 1 b. Etat électronique excité SINGULET : Les électrons non appariés sont de spins opposés ou antiparallèles (↑↓) M = 2 [(+ ½ ) + ( - ½ )] + 1 => M = 1 c. Etat électronique excité TRIPLET : Les électrons non appariés sont de spins parallèles (↑↑) M = 2 [(+ ½ ) + ( + ½ )] + 1 => M = 3 Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Origine de la photoluminescence 2- Diagramme de Jablonski : S0 : Etat électronique fondamental SINGULET S1 : Premier état électronique excité SINGULET S2 : Deuxième état électronique excité SINGULET T1 : Premier état électronique excité TRIPLET T2 : Deuxième état électronique excité TRIPLET Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Origine de la photoluminescence 2- Diagramme de Jablonski : Excitation : 1 Absorption d’un quantum d’énergie fournie par une source lumineuse externe permettant le passage d’électrons de l’état fondamental à un état excité. S0 : Etat électronique fondamental SINGULET S1 : Premier état électronique excité SINGULET S2 : Deuxième état électronique excité SINGULET T1 : Premier état électronique excité TRIPLET T2 : Deuxième état électronique excité TRIPLET Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Origine de la photoluminescence 2- Diagramme de Jablonski : Désactivation: a. Désactivation non radiative : Dissipation de l’énergie sous forme de chaleur. - Relaxation vibrationnelle : 2 Transfert de l’énergie au niveau vibrationnel le plus bas du même niveau énergétique excité. - Conversion interne : 3 Transfert de l’énergie du niveau vibrationnel le plus bas d’un état excité à un état électronique inférieur. - Conversion externe : Transfert de l’énergie au solvant ou à la matrice. S0 : Etat électronique fondamental SINGULET - Conversion inter-système : 4 S1 : Premier état électronique excité SINGULET S2 : Deuxième état électronique excité SINGULET Changement de multiplicité nécessitant un retournement de spin et T1 : Premier état électronique excité TRIPLET évolution d’un état excité SINGULET S1 à un état excité TRIPLET T1 T2 : Deuxième état électronique excité TRIPLET d’énergie voisine et de durée de vie plus longue. Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Origine de la photoluminescence 2- Diagramme de Jablonski : Désactivation: b. Désactivation radiative : Retour à l’état fondamental avec émission de radiations. - Désactivation directe : 5 Transition entre l’état excité SINGULET S1 et l’état fondamental SINGULET S0. - L’énergie restituée est plus faible que l’énergie absorbée. - L'état excité a une durée de vie de 10-9 et 10-7 sec. Il s’agit de la FLUORESCENCE - Désactivation après changement de multiplicité : 6 Passage d’un état excité TRIPLET T1 à l’état fondamental SINGULET S0. - Désactivation par émission de lumière de longueur d’onde plus grande que S0 : Etat électronique fondamental SINGULET celle de la lumière initialement absorbée ou celle émise par fluorescence. S1 : Premier état électronique excité SINGULET S2 : Deuxième état électronique excité SINGULET - L'état excité a une durée de vie de l’ordre du microsecondes à plusieurs T1 : Premier état électronique excité TRIPLET secondes ou même plus. T2 : Deuxième état électronique excité TRIPLET Il s’agit de la PHOSPHORESCENCE Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Spectrométrie de fluorescence moléculaire 1. Aspects qualitatifs: a. Principe: La spectrométrie de fluorescence moléculaire utilise la mesure de l’intensité de lumière fluorescente émise (If) par la substance à examiner par rapport à celle émise par un étalon déterminé. La fluorescence est mesurée à un angle de 90° par rapport au trajet optique du rayonnement incident (I0) afin de différencier la lumière fluorescente de la lumière transmise (It). Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Spectrométrie de fluorescence moléculaire 1. Aspects qualitatifs: b. Spectres d’absorption et de fluorescence: Dans un milieu transparent (la lumière peut passer à travers un tel milieu avec une perte minimale d'intensité), le spectre de fluorescence est une image inversée (effet miroir) du spectre d’absorption. Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Spectrométrie de fluorescence moléculaire 1. Aspects qualitatifs: b. Spectres d’absorption et de fluorescence: Un milieu est transparent en fluorimétrie dans les cas suivants : - Absence d'Absorbants: Le milieu ne contient pas de composés qui absorbent la lumière aux longueurs d'onde d'excitation ou d'émission. C'est souvent le cas des solvants purs. - Faible diffusion: Le milieu ne diffuse pas la lumière de manière significative. La diffusion de la lumière (scattering) peut provenir de particules en suspension ou d'inhomogénéités dans le milieu. Un milieu bien filtré ou homogène minimise la dispersion. - Faible Auto-fluorescence: Le milieu ne présente pas d'auto-fluorescence (fluorescence intrinsèque) aux longueurs d'onde d'excitation ou d'émission utilisées. - Absence de Quenchers: Le milieu ne contient pas de molécules qui peuvent éteindre (quencher) la fluorescence de la molécule d'intérêt, soit par transfert d'énergie, soit par des interactions chimiques. - Stabilité Chimique: Le milieu ne réagit pas chimiquement avec la molécule fluorescente d'intérêt, ce qui pourrait soit quencher la fluorescence, soit conduire à la formation de produits fluorescents indésirables Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Spectrométrie de fluorescence moléculaire 2. Aspects quantitatifs : a. Rendement quantique de fluorescence «ɸf » : Le rendement quantique de fluorescence détermine l’efficacité d’une molécule à fluorescer. ɸf = 0 => Absence de fluorescence 0 < ɸf < 1 ɸf = 1 => Fluorescence maximale If : Intensité de fluorescence Ia : Intensité absorbée Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Spectrométrie de fluorescence moléculaire 2. Aspects quantitatifs : b. Intensité de fluorescence « If » : If = ɸf. Ia = ɸf (I0 – It) If = Intensité de fluorescence Ia = Intensité du rayonnement absorbé I0 = Intensité du rayonnement incident It = Intensité du rayonnement transmis A = Absorbance (A = log I0/It = ε.l.c) (relation entre l'absorbance et la transmittance, valable pour de faibles absorbances) Si la solution est diluée, le terme A est très petit et le terme 10−A est donc proche de 1 − 2,3 A If = ɸf. I0. (2,3.A) On ne mesure qu’une partie de la fluorescence à 90° => Introduction d’un facteur k If = k. ɸf. I0. (2,3.A) If = k. ɸf. I0. (2,3.ε.l.C) If = K’ C Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Spectrométrie de fluorescence moléculaire 2. Aspects quantitatifs : b. Intensité de fluorescence « If » : - Le facteur K’ regroupe les paramètres propres au composé If = K’ C et à l’appareillage. En pratique, ces paramètres sont fixes. - La linéarité de la fonction If = f(C) n’est vérifiée que pour les solutions très diluées (< 10-4M). L’intensité de fluorescence If dépend de :  L’intensité I0 de la source  L’appareillage If  La longueur d’onde d’excitation  La concentration de la solution fluorescente  L’environnement, la nature du solvant, la température et le pH. C Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Spectrométrie de fluorescence moléculaire 3. Les espèces fluorescentes (fluorophores): Ceux sont généralement des composés organiques aromatiques qui répondent aux critères suivants:  Absorption dans le visible ou le proche ultraviolet  Coefficient d’extinction molaire εmax important  Fort rendement quantique (0.8 - 0.9)  Très courte durée de vie de fluorescence (≈ ns)  Grand décalage de STOKES phénolphtaléine fluorescéine Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Spectrométrie de fluorescence moléculaire 4. Facteurs influençant la fluorescence: a. Effet de la structure moléculaire: La fluorescence est privilégiée par les molécules:  Cycliques  Rigides  Possédant des liaisons π La fluorescence est augmentée par la présence de groupements électrodonneurs (OH, NH2, R …) et est diminuée par la présence de groupements électroattracteurs (NO2, COOH, X …) Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Spectrométrie de fluorescence moléculaire 4. Facteurs influençant la fluorescence: b. Effet de la polarité du solvant: Une augmentation de la polarité, diminue If et augmente λémission. Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Spectrométrie de fluorescence moléculaire 4. Facteurs influençant la fluorescence: c. Effet du pH: Exemple d’acide faible HA de concentration initiale C0 : [H3O+] [A-] HA + H2O ↔ H3O+ + A- Ka = [AH]  Cas où la forme acide est fluorescente C0. [H3O+] pH ↑ => [H3O+] ↓ => If ↓ If = K C = K Ka + [H3O+] pH ↓ => [H3O+] ↑ => If ↑  Cas où la forme basique est fluorescente Ka. C0 pH ↑ => [H3O+] ↓ => If ↑ If = K C = K Ka + [H3O+] pH ↓ => [H3O+] ↑ => If ↓ Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  I- Principes de Base et Théorie  Spectrométrie de fluorescence moléculaire 5. Transformation chimique (Dérivatisation de fluorescence ) : La dérivatisation de fluorescence est une technique utilisée pour augmenter la sensibilité de détection de certaines molécules, en particulier dans la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Le principe est de convertir des molécules non fluorescentes ou faiblement fluorescentes en dérivés hautement fluorescents. Cette approche est particulièrement utile pour l'analyse quantitative de mélanges complexes, tels que des échantillons biologiques. Réactifs courants pour la dérivatisation de fluorescence : 1,2-phénylènediamine pour la détection d'aldéhydes et cétones. Chlorure de dansyle pour la détection d'amines et de phénols. O-phthalaldéhyde (OPA) pour la détection d'amino-acides. Hydroxyméthyl-9 anthracène (9HMA) pour la détection d'acides carboxyliques. Applications : La dérivatisation de fluorescence est largement utilisée dans l'analyse de composés biologiquement actifs, tels que les acides aminés, les peptides, les amines biogènes, les lipides et d'autres molécules d'intérêt médical et environnemental. Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  II- Instrumentation  Spectrofluorimètres Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  II- Instrumentation  Spectrofluorimètres 1- Source de lumière: Les spectrofluorimètres (qui mesurent la fluorescence plutôt que l'absorption) utilisent des lampes à arc, comme les lampes à arc xénon, car elles fournissent une lumière intense sur une large gamme de longueurs d'onde. Dans une lampe à arc xénon haute pression, le courant électrique passe à travers une atmosphère de xénon sous haute pression, générant un arc lumineux. Le xénon, un gaz noble, devient luminescent lorsqu'il est excité électriquement. La lampe à arc xénon produit un spectre lumineux continu sur une large gamme de longueurs d'onde (qui couvre une plage spectrale de 200 à 800 nm), ce qui en fait une source idéale pour diverses applications spectroscopiques. La haute intensité de la lampe permet une excitation efficace des molécules, produisant des signaux de fluorescence plus forts. Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  II- Instrumentation  Spectrofluorimètres 1- Source de lumière: Avantages: Simplification de l'instrumentation: N'ayant besoin que d'une seule lampe pour couvrir la plage UV-VIS, cela peut simplifier la conception de l'instrument. Changement moins fréquent: Puisqu'il y a une seule lampe, il y a moins de besoins de remplacement. Inconvénients: Coût: Les lampes à arc xénon peuvent être plus coûteuses que les autres types. Chaleur: Elles peuvent générer plus de chaleur, nécessitant parfois un refroidissement supplémentaire. Précautions : Les lampes à arc xénon haute pression opèrent sous des pressions élevées et peuvent exploser si elles sont endommagées. Il est donc essentiel de les manipuler avec soin et de s'assurer que les équipements dans lesquels elles sont installées sont bien entretenus. Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  II- Instrumentation  Spectrofluorimètres 2- Détecteur: Un photomultiplicateur (PM) est un type de détecteur de lumière qui est capable de détecter des niveaux de lumière très faibles et de les convertir en un signal électrique. Il est très sensible et peut détecter des photons sur une large gamme de longueurs d'onde, de l'ultraviolet au proche infrarouge.. Photocathode (cathode photosensible) : Lorsqu'un photon de lumière frappe la cathode photosensible d'un photomultiplicateur, il libère un électron par l'effet photoélectrique. Dynodes : Après avoir été émis par la cathode, l'électron est accéléré vers une série de dynodes grâce à une différence de potentiel. Chaque fois qu'un électron frappe une dynode, plusieurs autres électrons sont éjectés à cause de l'énergie cinétique de l'électron incident. Ces électrons supplémentaires sont ensuite accélérés vers la dynode suivante, où encore plus d'électrons sont produits. Ce processus est répété sur plusieurs dynodes, créant ainsi une multiplication en cascade des électrons. Anode : Finalement, les électrons atteignent l'anode, où ils sont collectés et produisent un courant. Grâce à la multiplication en cascade des électrons à travers les dynodes, même un seul photon incident peut générer un courant mesurable à l'anode. Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  II- Instrumentation  Spectrofluorimètres 2- Détecteur: Caractéristiques des dynodes : Le terme "dynode" provient du grec "dynamis", qui signifie "force" ou "puissance". Le nom reflète le rôle de la dynode dans le photomultiplicateur: elle amplifie le signal en multipliant le nombre d'électrons. Matériau : Les dynodes sont souvent fabriquées à partir de matériaux spécialement choisis pour leur capacité à émettre plusieurs électrons lorsqu'ils sont frappés par un électron à haute énergie. Configuration : Dans un photomultiplicateur, plusieurs dynodes (parfois jusqu'à une dizaine ou plus) peuvent être disposées en série pour maximiser l'amplification du signal. Gain : Le gain d'un photomultiplicateur est le rapport entre le nombre d'électrons collectés à l'anode (la dernière étape) et le nombre d'électrons initialement produits à la cathode. La présence de dynodes multiples permet d'obtenir un gain très élevé. Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)  III- Applications Biochimie et biologie moléculaire : - Suivi des interactions protéine-protéine ou protéine-ADN. - Études de conformation et de dynamique des protéines et des acides nucléiques. Pharmacologie et médecine : - Mesure de concentrations de médicaments dans des échantillons biologiques. - Imagerie médicale et diagnostic à l'aide d'agents fluorescents. Chimie environnementale : - Analyse de traces de composés organiques dans l'eau, le sol et l'air. - Surveillance des polluants environnementaux. Industrie agroalimentaire : - Évaluation de la qualité et de la maturité des produits alimentaires. - Détection de contaminants ou d'additifs. Ces applications sont le reflet de la grande sensibilité et de la sélectivité de cette technique pour détecter et quantifier des molécules spécifiques dans un large éventail de domaines. Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)