Cours 4 Génie Génétique 2024-2025 PDF

Génie Génétique 2024- 2025 Enseignant : Walid Sabri HAMADOU 1  Introduction générale Les outils de base du génie génétique Les Enzymes  enzymes de restriction Découverte des enzymes de restriction : Ces enzymes ont été identifiées à parti...

Génie Génétique 2024- 2025 Enseignant : Walid Sabri HAMADOU 1  Introduction générale Les outils de base du génie génétique Les Enzymes  enzymes de restriction Découverte des enzymes de restriction : Ces enzymes ont été identifiées à partir de 1973. Ces enzymes ont été initialement identifiées chez les bactéries. Elles constituent un système de défense naturel contre les virus bactériophages. Fonctionnalité Fonctionnalité : Elles reconnaissent des séquences spécifiques de 4 à 10 paires de bases (pb) et clivent l'ADN à ces sites. Fragmentation de l'ADN : Elles permettent de fragmenter l'ADN en segments plus petits ou de couper à des sites choisis. Types de coupures : Certaines enzymes réalisent des coupures franches, tandis que la majorité effectue des coupures dissymétriques, produisant des extrémités cohésives. enzymes de restriction Variété des enzymes : Plus de centaines d'enzymes de restriction ont été caractérisées, chacune reconnaissant différents sites de coupure. Cartographie de l'ADN : Ces enzymes sont utilisées pour établir une carte de restriction, déterminant l'ordre des sites de restriction sur une molécule d'ADN. Méthode de détection : Après digestion enzymatique, les fragments d'ADN sont séparés par électrophorèse, permettant d'identifier leurs tailles. Classification : Les enzymes de restriction sont des endonucléases, clivant les liaisons phosphodiester à l'intérieur de l'ADN, contrairement aux exonucléases qui agissent aux extrémités. enzymes de restriction Origine des enzymes de restriction. Les enzymes de restriction sont extraites de micro-organismes, le plus souvent des bactéries. Les bactéries peuvent être parasitées par des virus à ADN. Les bactéries fabriquent des enzymes de restriction qui sont capables de cliver les ADN étrangers. Pour éviter une autodestruction de leur propre ADN, elles se protègent contre leurs propres enzymes de restriction par une modification des sites de restriction correspondants. enzymes de restriction Nomenclature des enzymes de restriction. Composition du nom : Leur nom est composé de 3 ou 4 lettres. Première lettre : La première lettre (majuscule) représente le genre de la bactérie d'origine. Deuxième et troisième lettres : Les deux lettres suivantes (minuscules) indiquent l'espèce de la bactérie. Quatrième lettre : Une quatrième lettre (majuscule) peut désigner la souche bactérienne. Chiffre romain : Un chiffre romain à la fin indique l'ordre de caractérisation de l'enzyme. Eco RI provient d'Escherichia coli souche R, le I signifie que c'est la première enzyme qui a été découverte. Eco RI Extraite de Escherichia coli RYB site reconnu: G / AATTC Sma I Extraite de Serratia marcescens site reconnu: CCC / GGG Pst I Extraite de Providencia stuartii site reconnu: CTGCA / G Enzymes de Restriction Les classes d’enzymes de restriction. Endonucléases de restriction coupent au niveau d’une séquence particulière ou à proximité. Il existe trois grandes classes (type I, II et III) Seules les enzymes du type II sont utilisées en Génie Génétique: Précises Les enzymes de types I et III ne sont pas utilisés en Génie Génétique, elles ne sont pas précises et portent aussi une activité de méthylation et nécessite des cofacteurs supplémentaires (ATP) Enzymes de type II : Sites de reconnaissance souvent palindromiques. Sites de coupure identiques ou proches du site de reconnaissance. Enzymes de type I : Reconnaissent des séquences sans symétrie. Coupent à 1000 à 5000 paires de bases du site de reconnaissance. Enzymes de type III : Présentent un site de reconnaissance. Coupent environ 20 nucléotides après le site de reconnaissance.  Enzymes de Restriction Site de reconnaissance AluI EcoRI AscI Les enzymes de restriction reconnaissent 4, 6 ou 8 bases: La fréquence de reconnaissance sera d’autant plus faible que le nombre de bases reconnues est élevé Isoschizomères: enzymes qui reconnaissent et coupent la même séquence mais qui proviennent de deux bactéries différentes  Biologie Moléculaire Notion d’isoschizomères Isoschizomères: enzymes qui reconnaissent et coupent la même séquence mais qui proviennent de deux bactéries différentes Soit la séquence suivante: GGTACC, cette séquence est coupée par l’enzyme Kpn I et l’enzyme Acc65 I: Biologie Moléculaire Types de coupures realisées par les enzymes de restriction. Les enzymes de restriction génèrent deux types de coupures : Coupure à bouts francs : Se produit au milieu de la séquence palindromique. Coupure à bouts collants (ou adhésifs) : Se fait de part et d’autre du centre de symétrie. Eco RI reconnaît et coupe la séquence G/AATTC (Extrémités cohésives 5' sortantes) Pst I reconnaît et coupe la séquence CTGCA/G (Extrémités cohésives 3' sortantes) Sma I reconnaît et coupe la séquence CCC/GGG ce qui donne des extrémités franches  Biologie Moléculaire Types de coupures realisées par les enzymes de restriction. Ces enzymes identifient et coupent l’ADN aux sites de restriction, créant des fragments variables. Chaque enzyme de restriction agit différemment, permettant de découper à des positions spécifiques sur l’ADN, qu'il soit circulaire (bactéries, plasmides) ou linéaire. Cela offre des possibilités considérables pour la manipulation génétique. Biologie Moléculaire Inhibitions de coupure par des méthylases L'ADN bactérien contient des sites de restriction que les enzymes de restriction de la bactérie peuvent reconnaître. Pour éviter l'auto-destruction, les bactéries possèdent des enzymes de modification appelées méthylases.  Ces méthylases ajoutent des groupes méthyle à la cytosine (carbone 5) ou à l'adénine (azote 6) des sites de restriction, inactivant ainsi l'enzyme de restriction correspondante. La méthylation peut concerner une ou plusieurs bases au sein du site de restriction, et ces méthylases sont très spécifiques. Biologie Moléculaire Inhibitions de coupure par des méthylases On pourra utiliser ces méthylases in vitro pour inhiber la digestion d’un fragment. La bactérie produit des méthylases spécifiques qui inhibent la digestion par les enzymes de restriction. Dans le génome des eucaryotes, les méthylations se concentrent sur les cytosines des dinucléotides CG. Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les nucléases (DNases et RNases) : Les DNases: Origine : Extraite du pancréas de bovin. Type : Endonucléase, capable de couper l’ADN double brin et l’ADN simple brin. Mode d'action : Effectue des coupures aléatoires sans reconnaître de site spécifique, ce qui la distingue des enzymes de restriction. Produits : Génère des fragments de tailles variées (oligonucléotides) avec un groupement phosphate à l’extrémité 5'. Sensibilité : Nécessite des ions bivalents comme Mg² et Mn² pour son activité. Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les nucléases (DNases et RNases) : Les DNases: Leur fonction consiste à couper l’ADN au niveau d’un phosphate, libérant deux fragments un se terminant par un 3’OH et l’autre par un 5’ phosphate - Dnases Exonucléases - Dnases Endonucléases  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les nucléases (DNases et RNases) : Exemple de DNases : La nucléase S1 Cette enzyme extraite d’un champignon, n’attaque que l’ADN simple brin. Elle n’attaque pas en principe les ADN doubles brins et les hybrides ADN-ARN. L'enzyme est utilisée pour éliminer les extrémités monocaténaires saillantes de l'ADN double brin Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les nucléases (DNases et RNases) : Les DNases: -Exonucléases Digèrent l'ADN en retirant les nucléotides à partir d’une extrémité: -3’-5’ exonucléases: retire les nucléotides d'une manière séquentielle à partir de l'extrémité 3‘ (L’exonucléase III ) -5’-3’ exonucléases retire les nucléotides d'une manière séquentielle à partir de l'extrémité 5‘ (l’exonucléase de phage T7)  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les nucléases (DNases et RNases) : Les DNases : La DNase utilisée au laboratoire est extraite du pancréas de bovin. Il s’agit d’une endonucléase qui coupe l’ADN double brin (mais aussi l’ADN simple brin). Elle conduit à des coupures ou « nicks » tout à fait au hasard, sans reconnaissance d’un site spécifique (ce qui la distingue des enzymes de restriction). On obtient des fragments de tailles variées (ou oligonucléotides) qui possèdent en leur extrémité 5’ un groupement phosphate. Cette enzyme est sensible à des ions bivalents (Mg2+ et Mn2+). Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les nucléases (DNases et RNases) : Les DNases: -Endonucléases Certaines coupent l'ADN double brin, d'autre l'ADN simple brin, certaines reconnaissent et coupent au niveau de séquences caractéristiques. Exemple : DNase I: DNase I Endonucléase qui coupe l’ADN double brin Eliminer l’ADN d’une solution Faire des « brèches» sur l’ADN: cas de la technique de marquage par déplacement de coupure (nick translation)  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les nucléases (DNases et RNases) : Les RNases : les enzymes qui dégradent l'ARN Les RNases (ribonucléases) sont une famille d'enzymes qui catalysent la dégradation de l'acide ribonucléique (ARN). Elles jouent un rôle crucial dans de nombreux processus biologiques, notamment la régulation de l'expression génique, la maturation de l'ARN et la dégradation des ARN défectueux. Il existe plusieurs types de RNases, classés en fonction de leur spécificité de substrat et de leur mécanisme d'action : RNases endonucléases RNases exonucléases RNases spécifiques de séquence RNases non spécifiques (Dégradent l'ARN de manière aléatoire).  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les nucléases (DNases et RNases) : Les RNases : Rôles des RNases dans la cellule Les RNases sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires, notamment : Maturation de l'ARN: Les RNases jouent un rôle important dans la maturation de l'ARN pré-messager (pré-ARNm) en ARN messager (ARNm) mature. Elles éliminent les introns et ajoutent des modifications post-transcriptionnelles Régulation de l'expression génique: Les RNases peuvent dégrader les ARNm, ce qui permet de contrôler l'expression des gènes. Certaines RNases sont régulées par des facteurs de transcription ou par des microARNs (miARNs), ce qui leur permet de participer à des réseaux de régulation complexes.  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les nucléases (DNases et RNases) : Les RNases : Rôles des RNases dans la cellule Dégradation des ARN défectueux: Les RNases dégradent les ARN qui sont endommagés ou qui contiennent des erreurs. Cela contribue à maintenir l'intégrité de l'ARN dans la cellule. Défense contre les virus: Certaines RNases sont impliquées dans la défense de la cellule contre les infections virales. Elles peuvent dégrader l'ARN viral, empêchant la réplication du virus.  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les nucléases (DNases et RNases) : Les RNases : Rôles des RNases dans la cellule Quelques exemples de ribonucléases impliquées dans la défense antivirale : RNase L: Activée par l'interféron, elle dégrade de manière non spécifique l'ARN viral et cellulaire, induisant une réponse antivirale. Les protéines AWN (Antiviral Nuclease): Ces protéines ont une activité ribonucléasique spécifique pour certains virus.  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les nucléases (DNases et RNases) : Les RNases : Applications des RNases Les RNases ont de nombreuses applications en biologie moléculaire et en biotechnologie et en génie génétique : Purification de l'ARN: Les RNases peuvent être utilisées pour éliminer les ARN contaminants lors de la purification de l'ADN. Analyse de l'ARN: Les RNases peuvent être utilisées pour étudier la structure et la fonction des ARN. Thérapie génique: Certaines RNases peuvent être utilisées pour cibler et dégrader des ARNm spécifiques, ce qui pourrait être utile pour le traitement de certaines maladies.  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les nucléases (DNases et RNases) : Les RNases : Exemple d’RNases -RNAseA : coupe après (en 3') les résidus pyrimidiques (C, U) en donnant un 3' phosphate sur l'ARN simple brin. -RNaseT1 : coupe en 3' de la guanosine donnant une guanosine 3' phosphate. -RNAseH : digère l'ARN dans un complexe ARN-ADN. Sert pour éliminer l’ARN après avoir fabriqué un premier brin de cDNA à l’aide de la reverse transcriptase. -Dicer : Une enzyme qui transforme l'ARN double brin en fragments d'ARN plus petits appelés petits ARN interférents (siARN) et microARN (miARN). Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction les polymérases : Propriétés générales Les enzymes recopiant aussi bien une chaîne d’ADN ou d’ARN ont les propriétés générales suivantes: - Elles synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’à 3’. - Cette synthèse s’effectue de manière complémentaire et antiparallèle. - Elles nécessitent la présence de nucléosides triphosphates (NTPs) (constituant des ARN) ou de désoxynucléosides triphosphates (dNTPs) (constituant des ADN).  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les enzymes recopiant un ADN en ADN Ces enzymes sont des ADN polymérases ADN dépendantes. Elles ne sont pas capables de synthétiser le brin nouveau d’ADN sans la présence d’une amorce d’acide nucléique. Toutes les ADN polymérases possèdent les caractéristiques suivantes: - Elles ont besoin d’une amorce avec une extrémité 3’-OH libre. - La chaîne nouvelle d’ADN est synthétisée dans le sens 5’à 3’. - La chaîne nouvelle est complémentaire de la chaîne matrice d’ADN et antiparallèle.  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction ADN polymérase I d'E. coli L'ADN polymérase I d'E. coli a été la première ADN polymérase découverte. Elle possède plusieurs activités enzymatiques : Activité polymérase 5'→3' : Elle ajoute des nucléotides à l'extrémité 3' d'un brin d'ADN en utilisant un brin matrice. Activité exonucléase 3'→5' : Elle permet de corriger les erreurs d'appariement de bases en éliminant les nucléotides incorrects à l'extrémité 3' du brin néoformé. Activité exonucléase 5'→3' : Elle permet d'éliminer les amorces d'ARN et les fragments d'ADN endommagés.  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction ADN polymérase T4 L'ADN polymérase T4 est une enzyme virale, produite par le bactériophage T4. Elle possède une activité polymérase 5'→3' très processive, ce qui signifie qu'elle peut ajouter de nombreux nucléotides sans se dissocier de l'ADN. Elle possède également une activité exonucléase 3'→5'. L'ADN polymérase T4 Utilisations en biologie moléculaire: En raison de sa haute processivité et de sa fidélité, l'ADN polymérase T4 est largement utilisée en biologie moléculaire pour des applications telles que le remplissage d'extrémités cohésives, le marquage d'ADN et la synthèse d'ADN complémentaire (ADNc).  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction ADN polymérase T4 L'ADN polymérase T4  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction ADN polymérase T7 L'ADN polymérase T7 est une autre enzyme virale, produite par le bactériophage T7. Elle possède une activité polymérase 5'→3' très rapide et une très haute fidélité. Elle est dépourvue d'activité exonucléase 3'→5'. L'ADN polymérase T7 Utilisations en biologie moléculaire: L'ADN polymérase T7 est utilisée dans des applications nécessitant une synthèse d'ADN rapide et précise, telles que la PCR (Polymerase Chain Reaction) et le séquençage de l'ADN.  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Caractéristique ADN polymérase I d'E. coli ADN polymérase T4 ADN polymérase T7 Origine Bactérie E. coli Bactériophage T4 Bactériophage T7 Activité Oui, très rapide et Oui Oui, très processive polymérase 5'→3' fidèle Activité Oui Oui Non exonucléase 3'→5' Activité Oui Non Non exonucléase 5'→3' Remplissage Réplication, d'extrémités, Utilisations PCR, séquençage réparation marquage d'ADN, synthèse d'ADNc  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les ADN polymérases thermostables La Taq ADN polymérase est une enzyme isolée de la bactérie thermophile Thermus aquaticus. Cette bactérie vit dans des sources chaudes, ce qui lui confère une résistance à des températures élevées. De ce fait, la Taq ADN polymérase est thermostable, ce qui signifie qu'elle peut fonctionner à des températures élevées sans être dénaturée. Activités 5'-3' polymérase et 5'-3' exonucléase, Comme elle est dépourvue d'activité 3'-5' exonucléase, le taux d'erreurs est d'environ 10-5 par base dupliquée et l’activité terminal transférase est efficace (Tdt); capable d'allonger l'extrémité 3' d'un brin d'ADN sans l'aide d'un modèle  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les ADN polymérases thermostables La Pfu et la Pwo DNA polymérase: proviennent de Pyrococcus furiosus et de Pyrococcus woesei, bactéries découvertes dans des sources géothermiques Activité 5'-3' polymérase et 3'-5' exonucléase mais pas d'activité 5'-3' exonucléase.  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les ADN polymérases thermostables La Vent ADN polymérase: provient de Thermococcus littoralis, activités 5’-3’ polymérase et 3’-5’ exonucléase retirée pour permettre une meilleure amplification La KOD1 DNA polymérase : isolée de l'archaebactérie Thermococcus kodakarensis. Elle a les activités 5'-3' polymérase et 3'-5' exonucléase. Thermococcus littoralis est un microorganisme appartenant au domaine des Archaea. Il est classé comme un extremophile thermophile, ce qui signifie qu'il est capable de survivre et de se développer dans des environnements extrêmes, notamment à des températures très élevées.  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les ADN polymérases ARN dépendantes: Reverse transcriptase La transcriptase inverse est une enzyme produite par certains virus, notamment les rétrovirus (virus à ARN). Elle permet de fabriquer à partir d’un ARN messager (mARN) un ADNc (ou séquence d’ADN complémentaire d’un mARN). Elle possède les propriétés suivantes:  C’est une ADN polymérase qui synthétise le nouveau fragment dans le sens 5’à3’.  Elle est ARN-dépendante.  Elle est dépourvue d’activité exonucléasique 3’à5’, donc de fonction d’édition. Elle peut donc insérer des bases par erreur.  Elle a une activité RNAse.  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les ADN polymérases ARN dépendantes: Reverse transcriptase  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les ADN polymérases ARN dépendantes: Reverse transcriptase On peut utiliser trois sortes d’amorce :  soit un oligo dT (ARN eucaryote) dans ce cas on obtient une population d’ADNc.  soit une amorce au hasard, on obtient alors une population d’ADNc dont l’extrémité 5’ est variable  soit une amorce spécifique, on obtient alors un ADNc correspondant à un seul gène Amorce spécifique  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les ADN polymérases ARN dépendantes: Reverse transcriptase  Exemple amorce spécifique, (on obtient alors un ADNc correspondant à un seul gène) COVID-19 (SARS-CoV-2) - diagnostic direct –RT- PCR  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les ARN polymérase ADN dépendantes o L'ARN polymérase est une enzyme essentielle à la transcription, le processus de synthèse de l'ARN à partir d'un brin d'ADN matrice. Elle joue un rôle crucial dans l'expression des gènes, car l'ARN est le messager qui transporte l'information génétique du noyau vers les ribosomes, où les protéines sont synthétisées. o L’ARN polymérase reconnaît un promoteur et synthétise un ARN complémentaire au brin en aval de ce promoteur o La synthèse s'effectue dans le sens 5'-3' en présence de ribonucléotides triphosphates et de et d’ions Mg2+ o Elles sont dénuées d’activité d’édition.  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les ARN polymérase ADN dépendantes Types d'ARN polymérases Il existe trois principaux types d'ARN polymérases chez les eucaryotes : ARN polymérase I: Synthétise les ARN ribosomales (ARNr), qui sont des composants essentiels des ribosomes. ARN polymérase II: Synthétise les ARN messagers (ARNm), qui codent pour les protéines. ARN polymérase III: Synthétise les ARN de transfert (ARNt), les ARN 5S et d'autres petits ARN. Remarque : Chez les procaryotes, il n'y a qu'un seul type d'ARN polymérase qui est responsable de la synthèse de tous les types d'ARN.  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les ligases Les ligases sont capables de lier par une liaison ester un fragment avec un groupement phosphate en 5’ et un groupement OH en 3’ et ceci en présence d’ATP. Elles peuvent effectuer des ligatures sur des fragments d’ADN Il existe ADN et ARN ligases. Elle ligue de l’ADN double brin. Utilisation : ligation d'extrémités cohésives ou d'extrémités franches de fragments de restriction Si les deux extrémités sont déphosphorylées, la ligation ne peut avoir lieu, par contre si une seule est déphosphorylée, la ligation a lieu sur un des deux brins, l'autre reste avec une brèche.  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les ligases Exemple de ligases  ADN ligase d’E. coli: Ligue des extrémités cohésives d’ADN double brin  L’ADN ligase de phage T4: liguer des extrémités franches ou cohésive d’ADN double brin  T4 ARN ligase : Catalyse la jonction entre un 5' phosphate d'un ARN ou d'un ADN simple brin avec un 3' OH  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les phosphatases et kinases Les phosphatases Se sont des enzymes enlevant des groupes phosphates Les phosphatases alcalines sont actives à pH alcalin (pH entre 9 et 10). Elles permettent d’enlever le groupement phosphate situé en 5’ d’une chaîne d’ADN. Elles sont extraites de bactéries ou d’origine animale (intestins). Thermolabile, elle peut être inactivée par incubation à 65°C pendant une heure Elles sont utilisées pour préparer de l’ADN recombinant par exemple pour déphosphoryler les vecteurs avant de liguer un insert pour éviter sa recircularisation..  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les phosphatases et kinases Les phosphatases  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les phosphatases et kinases Les Kinase Les kinases permettent de fixer un groupement phosphate en présence d’ATP. Dans cette molécule d’ATP, le phosphate fixé est celui situé en position gamma (position la plus externe) de la molécule d’ATP. Le groupement phosphate est fixé à l’extrémité 5’ d’un ADN préalablement déphosphorylé. Ces kinases sont extraites de bactéries. Utilisation : marquage de l'extrémité 5' de l'ADN, marquage des oligonucléotides  Biologie Moléculaire Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction Les phosphatases et kinases Les Kinase Génie Génétique 2024- 2025 Enseignant : Walid Sabri HAMADOU 48