Chimica Farmaceutica e laboratorio di Molecular Modeling PDF

Chimica Farmaceutica e laboratorio di Molecular Modeling Contents Chimica Farmaceutica e laboratorio di Molecular Modeling............................................................ 1 Introduzione............................................................................................................................. 2 Condividere le strutture chimiche.............................................................................................. 4 Drug Discovery......................................................................................................................... 5 Drug discovery e sicurezza dei farmaci.................................................................................... 7 Nomi dei farmaci...................................................................................................................... 9 Fasi d’azione di un farmaco..................................................................................................... 10 Fase Farmaceutica – Vie di Somministrazione....................................................................... 11 Ripasso di alcuni concetti di chimica.................................................................................... 13 Fase farmacocinetica – assorbimento................................................................................... 18 Fase Farmacocinetica: distribuzione.................................................................................... 20 Fase Farmacocinetica - metabolismo................................................................................... 21 Fase farmacocinetica - escrezione....................................................................................... 29 Parametri della Farmacocinetica.......................................................................................... 31 Target dei Farmaci - Farmacodinamica..................................................................................... 35 Proteine.............................................................................................................................. 35 Oligonucleotidi.................................................................................................................... 44 Altri target........................................................................................................................... 44 Fase farmaceutica – legami e stereochimica......................................................................... 45 La scoperta dell’hit................................................................................................................. 57 Hit to lead.............................................................................................................................. 62 Drug Optimization............................................................................................................... 67 1 Introduzione “La chimica farmaceutica riguarda la scoperta, lo sviluppo, l’identiﬁcazione e l’interpretazione del meccanismo d’azione di composti biologicamente attivi. Enfasi è posta sui farmaci, ma gli interessi della chimica farmaceutica non sono limitati ai farmaci, ma includono i composti bioattivi in generale. La chimica farmaceutica riguarda anche lo studio, l’identiﬁcazione e la sintesi dei metaboliti dei farmaci.” -deﬁnizione IUPAC. È quindi una scienza interdisciplinare che serve a sviluppare, creare e migliorare sostanze che curano o, quando non possono, alleviano le malattie. “...negli ultimi anni la chimica sembra aver perso terreno di fronte a nuove tecnologie quali, ad esempio, la biologia molecolare. A mio avviso un chimico resterà sempre parte integrante di un team multidisciplinare perché solo il chimico possiede la capacità di leggere le strutture molecolari e quindi prevederne i comportamenti biologici…” – Prof. Dieter Seebach Farmaco: qualsiasi sostanza, inorganica o organica, naturale o sintetica, capace di produrre in un organismo vivente modiﬁcazioni funzionali, utili o dannose, mediante un’azione chimica, ﬁsico-chimica o ﬁsica. L’utilità e l’e etto della molecola dipendono sia dalla sostanza stessa – dalla sua azione – sia dalla dose, ad esempio la tossina botulinica a dosi minime è utilizzata nella medicina estetica, mentre a dosi superiori è molto pericolosa. Esempi: - morﬁna, utilizzata per analgesia a bassa dose, ad alta dose dà blocco respiratorio - curaro, miorilassante a bassa dose, letale ad alta dose - cianuro, veleno letale - veleno di serpente, veleno letale - LSD, droga allucinogena - penicillina, antibiotico - zucchero, responsabile del sapore dolce Tutte le sostanze elencate sopra rientrano nella deﬁnizione di farmaco. In farmacia, quindi, non c’è una di erenza netta tra droga e medicina: entrambe rientrano nella categoria di farmaci, la di erenza è più legislativa che molecolare. In inglese, ad esempio, non esiste una di erenza a livello linguistico e sono chiamati entrambi “drug”. Allo stesso tempo, rientrano nella deﬁnizione anche le “everyday drugs” o molecole con cui entriamo in contatto tutti i giorni, senza considerarle come tali: ca eina, nicotina, alcol e il cibo stesso oppure molecole come le tossine e i veleni. Anche aspetti che normalmente vengono attribuiti solo alle droghe sono in realtà caratteristiche di tutti i farmaci: tolleranza, dipendenza e tossicità possono essere sviluppate verso tutte le sostanze che entrano in contatto con l’organismo. Indice terapeutico: dose tossica/dose beneﬁca. È una misura degli e etti beneﬁci del farmaco a bassa dose e degli e etti negativi dello stesso ad alta dose: compara la dose necessaria per produrre e etti dannosi nel 50% dei pazienti con la dose necessaria a produrre il massimo e etto terapeutico nell’altro 50%. Più è alto, più grande è il margine di sicurezza tra le dosi beneﬁche e quelle tossiche, per esempio: i valori per la cannabis e l’alcol sono rispettivamente 1000 e 10, cosa che indicherebbe la cannabis come più sicura dell’alcol. Tuttavia, questo indice non tiene conto della tossicità: se la cannabis viene assunta in modo cronico può dare tossicità con e etti che includono attacchi di panico, allucinazioni e paranoia. Se l’indice terapeutico è alto, quindi, è possibile assumere un’alta dose di una sostanza prima che questa diventi tossica per l’organismo. Come si deﬁnisce la tossicità? È la capacità di una sostanza chimica o di un preparato farmaceutico di provocare, a determinate dosi o concentrazioni, disturbi o danni a carico di organismi viventi (animali o vegetali), ai quali siano stati somministrati o con cui siano venuti a contatto. Tale azione lesiva si conﬁgura in turbe o arresti funzionali, espressione di lesioni biochimiche ed eventualmente strutturali. Può essere di tre tipologie: 1. acuta, cioè a breve termine 2. cronica, cioè a lungo termine 3. selettiva, propria di farmaci alcune tipologie di cellule e non altre, come la penicillina che distrugge le cellule batteriche, ma che non ha alcun e etto su quelle umane. Le medicine nell’organismo possono mostrare tossicità selettiva contro cellule non self o contro cellule anormali, senza creare danni a quelle normali. 2 Farmaci che hanno cambiato la medicina e la società: Si può progettare un farmaco? Progettare qualcosa signiﬁca che qualunque componente dell’oggetto può essere sostituito con qualcosa di pensato appositamente: si può andare a creare ogni componente conoscendone l’esatta destinazione e funzione. Un po’ come quando si progetta una macchina: si può smontare e rimontare, conoscendo ogni pezzo e riuscendo a creare dei sostituti e icaci. Tuttavia, non si conosce l’esatto funzionamento di tutto i corpo umano e di tutti gli elementi che lo costituiscono, quindi non si può progettare un farmaco: vengono disegnate delle molecole con diverso potenziale e le si accompagna negli step successivi, migliorandole. La parte La parte di disegno iniziale è razionale, si parte da una base che tiene in conto il target, ma in seguito ci saranno varie tecniche e procedimenti volti a migliorare i disegni e le molecole. In totale questo processo di ricerca e ottimizzazione richiede circa 14 anni di sviluppo, non è lineare come mostrato nell’immagine, ma coinvolge una serie di test, saggi e prove che porteranno man mano a eliminare moltissime molecole nel corso degli anni, ﬁno ad arrivare al farmaco e ettivo. Di conseguenza, il prezzo ﬁnale di un farmaco è accordato con l’ente regolatore del farmaco e serve a coprire i costi dell’investimento fatto durante lo sviluppo. Esiste anche il mercato dei generici, cioè di quei farmaci che vengono prodotti una volta scaduto il brevetto di un’altra azienda e che sono più convenienti da produrre perché non bisogna coprire tutta la parte di ricerca e sviluppo. Allo stesso tempo però, non hanno il monopolio del mercato e so riranno di concorrenza da parte di altri generici e da parte del farmaco della ditta originale. Gli enti regolatori che approvano la messa in commercio dei farmaci per l’Italia sono l’AIFA e l’EMA, l’ente europeo a cui bisogna fare riferimento. Questi enti rallentano la messa in commercio dei farmaci: ogni anno vengono fatti più controlli e introdotti più protocolli, che permettono una maggiore sicurezza e a idabilità delle terapie. Cosa interessa alle aziende farmaceutiche? 3 - Blockbusters: molecole che generano >1'000'000'000 di dollari di fatturato annuo, sono farmaci che permettono alle aziende di sostenersi in termini di fatturato e di guadagnare. - Brevetti: durano 20 anni, ma i composti utilizzati nel drug design non vengono brevettati subito: bisogna essere sicuri che funzionino; quindi, si brevetta appena prima dei trial clinici. Esempio: Pﬁzer ha venduto Lipitor per 9,6 miliardi all’anno ﬁno al 2011, quando è scaduto il brevetto. Per non perdere miliardi da un anno all’altro, cosa si può fare? - Si licenziano dipendenti - l’azienda viene acquisita da un’altra azienda - si sostituisce l’introito con un altro blockbuster  una delle strategia migliori per sviluppare farmaci è partire da una molecola esistente/sviluppata. Abbiamo una molecola con delle potenzialità che va modiﬁcata per avere un e etto e uno sca old al di fuori dal brevetto. Normalmente non si è certi che nel brevetto si sia scelta la molecola migliore in assoluto per quel determinato target: uno stesso sca old con sostituenti diversi può avere comunque un e etto. MA le molecole non vengono lasciate fuori dai brevetti apposta  quando si fa un brevetto non si acquisisce protezione contro le aziende senza scopo di lucro, ad esempio quindi, in università si possono utilizzare e modiﬁcare strutture coperte da brevetto. Al momento, i farmaci stanno diventando sempre più soﬁsticati e personalizzati  servono sempre più tempo e soldi investiti nello sviluppo. Quindi, anche se con lo sviluppo di nuove tecnologie ci si aspetterebbe di vedere un numero sempre più alto di farmaci prodotti e approvati ogni anno, non è così. (comunicare la scienza: vedere appunti cartacei) Condividere le strutture chimiche Gli articoli spesso non ci permettono di trovare le strutture chimiche, ma solo il nome della molecola: esistono dei database speciﬁci che permettono di immagazzinare le strutture. CAS = chemical abstract service, sono codici assegnati alle molecole, sapere quanti ne sono stati assegnati dà un’indicazione del numero di molecole scoperte dall’uomo. Ad oggi i numeri assegnati sono 219 milioni e comprendono molecole organiche e inorganiche, ma non i peptidi: non tutte sono accessibili, perché per ottenere un numero cas basta che siano state isolate, non serve che siano state utilizzate o che siano biodisponibili. Ipoteticamente con soli cinque elementi si possono creare >10^60 molecole che pesano meno di 500 kD  lo spazio chimico è immenso e i database non ne possono contenere che una piccola parte. Database di molecole: archivio di dati strutturato in modo da razionalizzare la gestione e l’aggiornamento delle informazioni, oltre che utilizzato per svolgere ricerche complesse. Possono essere scaricabili o consultabili online. Li possiamo suddividere in quattro tipologie, in bese alle caratteristiche delle molecole presenti al loro interno: 1. Database di molecole con attività: 4 a. PubChem, simile a Pubmed ma per le strutture chimiche b. ChEMBL, raccoglie dati chimici, bioattivi e genomici su molecole con proprietà simili ai farmaci. I dati non sono inseriti automaticamente, ma normalizzati per dare un giusto parametro per confrontare. 2. Database di molecole in commercio: a. ZINC (Zinc Is Not Commercial), contiene 884 milioni di molecole, più del cas. Questo perché i venditori di molecole dicono di averne anche se mai sintetizzate, perché teoricamente si potrebbe fare  sono molecole che non avranno numero cas, perché mai prodotte ﬁsicamente o isolate. Non è commerciale nel senso che non si compra nulla, ma ha la capacità di raggruppare tutto quello che è messo in vendita dalle aziende. b. MolPort: è un venditore, dà informazioni sulla disponibilità e sulla provenienza delle molecole, ci sono Stati da cui è meglio non comprare sia per motivi doganali sia perché si rischia di ﬁnire in mezzo a processi o indagini. c. ChemSpider, della Royal Society of Chemistry, è un database di strutture chimiche ad accesso aperto. Non è solo un database basato su terabyte di dati di chimica, ma funge anche da comunità di crowdsourcing per i chimici che hanno contribuito con i loro dati, abilità e conoscenze per il miglioramento e la cura del database. 3. Database di farmaci: a. DrugBank: raccoglie tutti i farmaci approvati o in fase III di sperimentazione clinica con le loro formulazioni, brevetti e struttura. b. DrugCentral: database ricercabile di farmaci con proprietà annotata raccolte dalla letteratura insieme ad alcune proprietà calcolate c. PharmGKB: risorsa di conoscenza di farmacogenomica che comprende informazioni cliniche quali linee guida cliniche ed etichette di farmaci, relazioni gene-farmaco-malattia e relazioni genotipo- fenotipo. PharmGKB raccoglie, cura e di onde le conoscenze sull’impatto della variazione genetica umana sulle risposte ai farmaci attraverso le seguenti attività. d. FDA Online Label Repository, è di un ente regolatore e di conseguenza è in deﬁnitiva la fonte più a idabile e a idabile di informazioni relative alla droga online. Questo sito web contiene un database ricercabile di farmaci approvati con collegamenti a dati primari. La FDA ha anche alcuni strumenti online per fare ricerche approfondite. e. Withdrawn 2.0: database curato di farmaci che sono stati ritirati per vari motivi. Include informazioni come e etti collaterali, tossicità e obiettivi. Il database è una preziosa fonte educativa per sapere cosa fare attenzione quando si progettano nuovi farmaci e perché. È meno importante nella fase di drug discovery, ma viene utilizzato in fase avanzata di sviluppo. 4. Database di molecole in base all’origine, utili più per ispirazione che per utilizzo e ettivo della molecola allo stato naturale. a. Dictionary of natural products b. MarinLit Drug Discovery Sono necessarie alcune componenti: qualcuno che paga il conto, la libertà di giudizio, il trasferimento di conoscenze, l’utilizzo corretto della bibliograﬁa. “Dio ha creato tutte le malattie, ma ha anche creato un agente o un farmaco per ogni malattia. In natura si può trovare ogni cosa, perché la natura è la farmacia universale” Paracelso–1500 Si possono utilizzare quindi farmaci estratti dalle erbe: hanno come vantaggio l’avere una fonte di materiali virtualmente illimitata e una chemodiversità altissima. Come contro sono di icili da ottenere come composti chimici puri, i farmaci venivano deﬁniti utilizzando l'osservazione empirica della presenza o assenza di sintomi nei pazienti, 5 piuttosto che la comprensione della malattia. Allo stesso tempo, era assenta la grande maggioranza delle conoscenze fondamentali richieste per comprendere anche i principi di base della progressione della malattia. Slides: Mahuang  utilizzata dal 3000 a.C, si sono scoperti i principi attivi nel 1897. Curcumina: altamente polare, ha problemi di assorbimento – si è cercato per molti anni di utilizzarla come base per qualche farmaco. Papaver somniferum: molecole con struttura simile hanno funzione simile, ad eccezione di alcuni outliers. Il vero drug discovery inizia nel 1800  Le scienze farmaceutiche sono scienze empiriche, guidate dalla medicina tradizionale. Si usano tinture, infusioni, estratti acquosi o alcolici di piante, la cui e icacia era stata scoperta un po’ per caso. Si è scoperto anche che non tutti i farmaci arrivano ad attaccare il target dopo essere stati assunti: il metabolismo li può modiﬁcare e rendere inattive (o attive se questa cosa viene usata a favore del farmaco). James Lind e lo scorbuto: ha e ettuato il primo trial clinico conosciuto, prendeva i mariani a coppie e somministrava a ognuna diete diverse (acqua di mare, sidro, arance e limone, oppure placebo). In realtà, anche se aveva dimostrato che chi mangiava arance e limoni non aveva più sintomi non si è implementato nulla. Farmaci inorganici: i primi principi attivi isolati sono stati i Sali – ferro e zinco solfato. 1815-1820: i primi principi attivi vengono isolati dalle piante. Non c’era ancora regolamentazione, tutto era gestito dall’azienda di produzione direttamente. E i prodotti venivano assaggiati direttamente dall’uomo. 1938: viene fondato il primo ente regolatore, FFDAC, diventerà FDA. A cosa serve avere un ente regolatore? - Caso della talidomide: una volta che si sono capiti i pericoli della talidomide sulle donne incinta, l’FDA ha bloccato la sua approvazione negli Stati Uniti, salvando migliaia di bambini da deformazioni gravissime. La talidomide racemizza in vivo, uno degli enantiomeri è teratogeno e porta alla nascita di bambini focomelici se assunto da donne incinta come antinausea. - Caso della malaria: malattia che ha fatto parte della storia umana sin dai sumeri, era ancora pericolosissima tra la ﬁne dell’ottocento e la metà del novecento. Il 6 novembre del 1880 è stato scoperto l’agente che la causava, il plasmodio malaria. Venne poi identiﬁcato il ruolo della mosca anofele nel circolo parassitario. Si è quindi scoperto che la chinina, primo farmaco antimalarico scoperto e utilizzata per secoli in Sud America come estratto della corteccia di Cinchona portata in Europa dai Gesuiti e isolata nel 1820, era e icace nella cura alla malaria. 1672 Robert Talbor’s remedy: Infuso di polvere di cincona powder in vino bianco. Nel 1944 è stata creata una sintesi per produrla chimicamente. In realtà, il prodotto naturale era ﬁn troppo complesso e di icile da gestire e sintetizzare: a volte basta creare un farmaco sempliﬁcato rispetto all’originale, mantenendo i punti fondamentali per le interazioni che ne danno l’e etto. Nle caso della chinina, si è sempliﬁcata a clorochina e distribuita dallo stato italiano a tutti i cittadini. Nel giro di pochi anni la malaria è stata eradicata. 6 Il drug discovery, ad oggi, consiste in approcci che considerano genomica, proteomica, computer aided drug design, chimica combinatoriale, high-throughput screening. Inoltre, si utilizzano anche altri “aiuti”, provenienti da altri settori: modelli animali, cristallograﬁa ai raggi X, modellazione molecolare, biotecnologie. Si sa anche che l’interazione delle cellule con le molecole chimiche crea un e etto biologico, che i chemorecettori dei microorganismi patogeni e virali o delle cellule tumorali sono diversi da quelli dell’ospite (paziente) e che le di erenze possono essere utilizzate per produrre un beneﬁt a livello terapeutico (teoria del magic bullet). Sono stati anche trovati i primi esempi di correlazione tra la struttura e l’attività delle molecole e i primi esempi di resistenza ai farmaci. Drug discovery e sicurezza dei farmaci Si fanno prima dei test preclinici (sugli animali) e, solo una volta superati questi, si può passare alla sperimentazione sull’uomo. Etici o no non possono essere completamente rimossi, ma grazie alle nuove tecnologie possono essere ridotti. Test preclinici: tutti i test svolti prima di arrivare all’uomo, quindi fatti su animali che vadano bene per la patologia e il farmaco in esame (devono avere caratteristiche simili all’uomo, in modo da imitare il comportamento del possibile farmaco nel suo destinatario e ettivo). Comprendono: - Studi di e icacia - Studi di tossicità, acuta e cronica - Studi di metabolismo – degradazione del farmaco nell’organismo - Studi di formulazione e stabilità DOPO questa fase si può richiedere un brevetto, sono più importanti questi studi del brevetto, perché danno delle informazioni e ettive su basarsi per proseguire la ricerca. La richiesta di commercializzazione andrà sottoposta alle agenzie del farmaco (AIFA – Italia, EMA – Europa, FDA – USA) e già le sperimentazioni precliniche devono essere supervisionate da comitati etici per le sperimentazioni sugli animali: la regolamentazione è molto rigida sia per quanto riguarda i numeri che le condizioni degli animali stessi, oltre a regolamentare la produzione del farmaco e i trattamenti sperimentali. Enti regolatori: Trial sull’uomo: - FASE I – volontari sani (20-80). Serve a: o Capire se il farmaco è tollerato o se dà tossicità: identiﬁcarlo in un paziente malato è più di icile. Spesso oltre alla malattia sono presenti altre problematiche. o Ottenere dati di farmacocinetica: il farmaco arriva al target? Che percorso fa? Quanto viene degradato prima di arrivare? Come arriva? o Preparare uno schema di dosaggio per la fase II: ogni quanto va somministrato? Quanto ne va somministrato ogni volta? o Ideare la tipologia di formulazione: come lo si vuole somministratore? Come la forma farmaceutica inﬂuenza la farmacocinetica? 7 o MA: se si sa a priori che il farmaco in via di sviluppo avrà una tossicità elevata ma tollerabile rispetto a quelli che saranno i beneﬁci sulla patologia, allora non si somministra a persone sane, ma a pazienti. È stata saltata questa fase anche nei trial per il vaccino del covid: si avevano tanti pazienti, alcuni anche poco gravi. o Dura 1-2 anni - FASE II: pazienti (100-200). Serve a: o Deﬁnire e icacia (funziona?) e tollerabilità anche nei pazienti: che e etti collaterali ci sono (se ci sono)? Sono tollerabili/accettabili? o Suddivisione in due fasi, una con pochi pazienti (IIa) e una che ne coinvolge un numero superiore (IIb). Nella IIb si lavora con due gruppi, in doppio cieco: i gruppi sono randomizzati ma omogenei, uno otterrà il farmaco e l’altro serve da controllo con il placebo oppure con il farmaco migliore in circolazione per quella malattia. Trattandosi di uno studio a doppio cieco, anche il medico che somministra le terapie sperimentali non è al corrente di cosa sta somministrando o di che gruppo fanno parte i suoi pazienti, stessa cosa i pazienti, che non sanno cosa stanno ricevendo. Gli unici al corrente dei gruppi e delle terapie sono coloro che gestiscono lo studio. Gli studi possono anche essere fatti a singolo cieco, dove solo il soggetto sottoposto alla sperimentazione non è al corrente di cosa sta ricevendo, oppure possono essere a triplo cieco: anche altre ﬁgure coinvolte nello studio (es. radiologi, valutatori, statistici, ecc.) non conoscono quale trattamento hanno ricevuto i pazienti. Anche l’analisi dei referti può essere poco obiettiva, in questo modo si cerca di dare un maggiore grado di oggettività. Se chi e ettua l’analisi non sa cosa aspettarsi, è più probabile che controlli tutto senza bias. o Dura 1-2 anni. Fun Fact: il placebo esiste anche nei farmaci ad uso veterinario, l’animale non è in grado di capire che cosa gli viene somministrato, ma lo capisce leggendo il comportamento dell’uomo. Placebo: e etto dimostrato nel 1955, è una sensazione di miglioramento data dalla suggestione di star ricevendo una terapia e dall’aspettarsi dei miglioramenti. Nocebo: e etto contrario al placebo, anche se non viene somministrato alcun principio attivo, se si è convinti che il farmaco farà stare male, allora si starà male. - FASE III: gran numero di pazienti (1000-3000). Serve a: o Osservare se ci sono interazioni con altri farmaci o Osservare se ci sono e etti collaterali rari  più pazienti e quindi più probabilità che, se ci sono, si vedano o Deﬁnizione ﬁnale del rapporto dose-e etto o Dura 3-4 anni o Si può dividere in due altre fasi: IIIa e IIIb. IIIa ﬁnisce con la registrazione del farmaco, la seconda con l’approvazione. In generale, quindi, la fase III ﬁnisce con la messa in commercio del farmaco. - FASE IV: il farmaco messo sul mercato e accessibile a tutti viene costantemente monitorato sia per quanto riguarda l’e icacia che la sicurezza. Tutti possono fare segnalazioni sui siti degli enti regolatori, anche se molto spesso sono fatte dai medici. Le segnalazioni portano a fare delle analisi: la problematica è isolata solo a quel paziente? Ci sono altri che hanno riscontrato gli stessi e etti? C’è correlazione? Ci sono altre cose che possono aver inﬂuenzato lo sviluppo della problematica? I farmaci segnalati possono essere ritirati dal mercato (ex. Rofecoxib: ritirato dal commercio nel 2004, dopo 5 anni, dalla Merck per l’alta incidenza di attacchi cardiaci), oppure possono essere eliminati per alcuni gruppi 8 o utilizzati solo in determinati contesti, magari strettamente monitorati (situazioni di emergenza, pazienti ospedalizzati). Quali sono le cause che portano alla cessazione dello sviluppo di un farmaco? 1. E icacia: non colpisce bene il target 2. Sicurezza: gli e etti collaterali sono troppo gravi 3. Strategia: l’azienda farmaceutica decide di concentrarsi su altro (sparisce in fase III) Terminologia farmaceutica Classiﬁcazione ATC: anatomica, terapeutica e chimica, è un codice alfanumerico di massimo sette caratteri. NON è un codice univoco: uno stesso farmaco può agire su distretti diversi o con terapia diversa. Di solito hanno un codice solo quando hanno un utilizzo preponderante, ma ci saranno più codici quando gli utilizzi sono equivalenti. Terminologia legata ai medicinali: quelli che chiamiamo comunemente farmaci sono in realtà principi attivi (API) con vari eccipienti. Il principio attivo è la componente che determina l’azione curativa. la sua somministrazione avviene tramite forme farmaceutiche Fabbricate tramite eccipienti, che favoriscono la preparazione o l'accettabilità del prodotto da parte del paziente, ma che non devono dare e etto farmaceutico  gli eccipienti sono inerti. Tuttavia: - Funzionano da vettori per il principio attivo. - Contribuiscono alla presentazione (aspetto, ma soprattutto gusto) e alla stabilità del prodotto perché coesistono insieme - favoriscono l'allestimento e il prodotto ﬁnale e quindi Contribuiscono anche alla sua forma ﬁsica. Le molecole che hanno di icoltà ad arrivare al target dovranno essere accompagnate da eccipienti che lo possano aiutare. Non esiste necessariamente una sola forma farmaceutica. Ci sono delle formulazioni che permettono al principio attivo di svolgere il suo lavoro più velocemente e sono classiﬁcate in base a: - Forma ﬁsica. - Via di somministrazione. - Modalità di rilascio. Tutte queste forme hanno e etti sulla farmacocinetica e sulla dose aiutandolo accettabilità. E modiﬁcandone, appunto, la quantità: se ho qualcosa che rilascia più lentamente il principio attivo, questo agirà nel tempo, diminuendo la necessità di somministrazione. Nomi dei farmaci Destino di molte tipologie: IUPAC, nome del proprietario, INN. Quest'ultimo è il nome internazionale non proprietario. È quindi il nome generico assegnato dall' OMS ed è appunto quello che si trova sui farmaci generici e che è consigliato usare in generale. È il metodo valido in modo internazionale: se andassi all'estero potrei non trovare la tachipirina, ma se chiedo del paracetamolo mi daranno l'equivalente del paese. L'iter di formazione della domanda inizia dopo la fase uno di sperimentazione clinica. Perché nel nome c'è anche un'indicazione sull'utilizzo del farmaco. Punto 9 L'azienda, proporre il nome tendo di farsi riconoscere e di erenziarsi. Il comitato tecnico lo prende in carico, ma non è vincolante. L'azienda farmaceutica deve però fornire il CAS number e la struttura. Perché è necessario un nome comune? - per avere un linguaggio comune tra tutti i partecipanti, quindi chimici, farmacisti di farmacologi, industre, medici, pazienti. - Per trasferire l'informazione trovata. Quindi per farmacovigilanza, per le autorità regolatorie, per avere un’accessibilità soprattutto su Internet, per i giornali scientiﬁci. - per ridurre i rischi sanitari. - Per scollegare la protezione del nome del proprietario dal brevetto e dal diritto ad utilizzare un certo tipo di farmaco. - Aiuta alla competizione quando c'è più di un produttore, per esempio quando bisogna produrre i farmaci generici. Dal 1953 L'OMS ha prodotto più di diecimila INN, ma in realtà solo una porzione di questi farmaci è in commercio (20- 25%). Nella maggior parte delle Nazioni, un farmaco non può entrare in commercio se non ha un INN e di solito dà sia il sommario del prodotto che delle sue caratteristiche. Se non può essere modiﬁcato a seconda della regione, ma deve rimanere identiﬁcabile, ad esempio l'antibiotico amoxicillin è conosciuto come amoxicillina in nazioni che parlano spagnolo o italiano e amoxicilline in nazioni che parlano francese. L’INN di solito cerca di dare un nome che permette di studiare e memorizzare il farmaco, ma in realtà il suo obiettivo principale è avere una prescrizione che sia sicura e e ettiva. Contiene sempre Una parte di fantasia che lo di erenzia da tutti gli altri farmaci. Come viene dato il nome? - Su issi, di solito indicano lo scopo terapeutico. Ad esempio. -mab indica un antibiotico e -vir indica un antivirale. - Inﬁssi di solito indicano da dove deriva o il target. Ad esempio -tu- indica che sono farmaci antitumorali, -ci- che sono farmaci per il cuore. - Preﬁssi, di solito di fantasia, prendono il nome pronunciabile o univoco. Fasi d’azione di un farmaco 1. Fasi farmaceutica con somministrazione, disgregazione e dissoluzione. 2. Fase farmacocinetica – ADME(T), con assorbimento (Come arriva in circolo?), distribuzione (Come viene veicolato? Dove è portato dal circolo?), metabolismo (Come viene degradato? quando è distribuito in zone diverse dal target come prevengono l'accumulo?) e escrezione (Come l'organismo espelle il farmaco?). 10 Le ultime due fasi fanno parte della fase di eliminazione. In più, il metabolismo è quell'insieme di reazioni che rendono il farmaco più facile da eliminare, modiﬁcandolo. 3. Fase farmacodinamica, inizia quando il farmaco raggiunge il target. Ed è contestuale all'eliminazione dell'addome e deve tenere conto dell'e etto biologico. Fase Farmaceutica – Vie di Somministrazione Ci sono tre vie principali, a loro volta suddivise in sottocategorie: - Via enterale – apparato gastroenterico: o Orale o Sublinguale o Rettale - Via parenterale – vie che non sono l’apparato gastroenterico: o Endovenosa o Intramuscolare o Sottocutanea - Altre vie: o Inalatoria o Cutanea Niente nella via enterale avviene in tre zone principali: lo stomaco, l'intestino tenue e il colon. La zona di assorbimento, infatti, cambia a seconda delle caratteristiche del farmaco: i farmaci acido resistenti passano allo stomaco e vengono assorbiti solo in seguito. Se tuttavia, l'assorbimento non avviene in nessuno di queste vie il farmaco verrà eliminato. Nello stomaco, quindi, verranno assorbiti gli acidi deboli e i farmaci non ionizzati con alcune basi deboli. Nell'intestino tenue, invece, c'è un'ampia superﬁcie di assorbimento, circa 150 m², ed è la sede principale di assorbimento gastrointestinale dei farmaci. L'assorbimento qui avviene per di usione semplice e per trasporto attivo. Il colon, invece, è importante per tutti quei farmaci che richiedono un metabolismo ulteriore da parte della ﬂora batterica. I farmaci vanno presi prima o dopo i pasti? Dipende dalla formulazione del farmaco stesso. In alcuni casi sarà necessario prenderli prima dei pasti perché elementi della dieta possano modiﬁcare il modo dell'organismo di interagire con il farmaco, ad esempio vengono occupati di enzimi necessari per la degradazione e quindi verrà assorbita una quantità eccessiva, dando tossicità. In alcuni casi sarà necessario prenderli dopo i pasti, perché magari sono farmaci che possono creare acidità ed è quindi meglio avere lo stomaco pieno. Di base la somministrazione lontana dai pasti comporta un assorbimento più rapido e completo. Via orale – via per Os: il farmaco può essere assorbito in tutte e tre le zone che sono divise perché hanno pH e caratteristiche diverse. I vantaggi di questa via sono la facilità, perché si può prendere una compressa o una bustina e quindi il paziente può assumerle indipendentemente. Inoltre, è una via poco costosa perché non c'è bisogno di utilizzare device o che ci sia la presenza di un operatore. È un metodo ben accettato dal paziente perché tendenzialmente non si ha paura di farmaci che vengono assunti per OS. Altri vantaggi risiedono nella possibilità di intervenire in caso di errore, nel senso che è possibile fare una lavanda gastrica. Prima che venga assorbito completamente il farmaco e poi è anche utile nelle terapie protratte. Ci sono però alcuni problemi, nel senso che non è adatta a farmaci sensibili all'acidità, perché appunto verrebbero distrutti subito dallo stomaco; tuttavia, si possono formulare medicinali con eccipienti protettivi sia contro l'acidità 11 che contro gli enzimi del tasso del tratto gastrointestinale. È anche possibile che il cibo interagisca, come abbiamo visto prima, con il cibo, sia perché viene complessato insieme, sia perché viene sequestrato o vengono sequestrati gli enzimi necessari per il suo assorbimento e la sua gestione. L'assorbimento poi cambia da persona a persona e infatti cambia in base all'età, al sesso e alle condizioni generali del paziente. C'è un e etto poi dovuto al primo passaggio epatico, cioè la dose somministrata non è quella che arriva al punto di assorbimento, proprio perché prima di essere distribuita nei tessuti necessari deve passare dal fegato e nel fegato verrà parzialmente metabolizzato, degradata. La via per OSS in più non può essere utilizzata con pazienti non cooperanti o in situazioni di emergenza ed è quindi allo stesso tempo non indicata se si vuole un e etto immediato. Anche se l'e etto non immediato può sembrare uno svantaggio, risulta una cosa positiva nel momento in cui dobbiamo intervenire in caso di errore, proprio perché è quello che ci permette di eliminare il farmaco dell'organismo prima che questo faccia e etto. Forme farmaceutiche: Come si sceglie la formulazione? In base alle caratteristiche del paziente e a quelle del farmaco. La compressa può essere spezzata: si utilizza in terapie in cui la variabilità è accettata Come abbiamo detto prima, ci sono anche delle dei fattori che possono modiﬁcare l'assorbimento: interferenza con il cibo, diarrea e vomito, altri farmaci sia in fase di assorbimento sia in tutte le altre fasi in cui permangono nell'organismo. Ci sono poi stati di malassorbimento tipici degli anziani, che infatti assorbiranno peggio dei giovani. E poi qualunque modiﬁca dell'intestino o dello stomaco fa cambiare le dimensioni e quindi anche la superﬁcie di assorbimento. Un ultimo fattore è la stenosi pilorica. Via Sublinguale: assorbimento diretto che evita il ﬁltro epatico entrando subito in circolo senza essere aggredito prima dagli enzimi epatici. È possibile e ettuare un'auto somministrazione al bisogno, inoltre, l'e etto è rapido Anche se è possibile interrompere l'e etto sputando la compressa. Gli svantaggi di questo approccio sono le possibilità di irritazioni alla mucosa, la mancata adattabilità a un uso regolare e frequente e poi la necessità di dover evitare la deglutizione per poterla far assorbire  spesso non è gradita ai pazienti. Le forme farmaceutiche più utilizzate sono le losanghe e le compresse. Via rettale: utile perché utilizzabili nel caso di vomito di pazienti incosciente e di bambini piccoli. Allo stesso tempo, non passando dallo stomaco, è possibile somministrare farmaci che ne sarebbero irritanti, si utilizza anche per farmaci ad azione locale e non solo ad azione sistemica. In generale permette di evitare, almeno parzialmente, il ﬁltro epatico. È complicata da utilizzare perché bisogna tenere in conto che il materiale fecale può interferire con l'assorbimento e che quindi la farmacocinetica è poco prevedibile. Inoltre, è possibile che si crei un'irritazione locale ed è poi una formula poco gradita dai pazienti. Come forme farmaceutiche si utilizzano supposte e pomate. Via Parenterale: utilizzo di aghi per iniettare il farmaco, si suddivide in: 12 - Endovenosa: entrano direttamente in circolo, quindi hanno un'azione rapida, utile soprattutto nelle situazioni di emergenza e per ottenere un'elevata concentrazione di farmaco nel sangue. Inoltre, il dosaggio è molto preciso, proprio perché tutto quello che viene iniettato arriva direttamente nei siti d'azione e allo stesso tempo si possono somministrare volumi notevoli. È anche possibile somministrare sostanze che sarebbero irritanti per le mucose, ma visto che appunto non le devono attraversare, non creano irritazione. È utilizzabile nei pazienti incoscienti. Tra gli svantaggi e in realtà è molto grave la possibilità di un errore nel dosaggio, nel senso che c'è un maggior rischio di e etti avversi, come le ﬂebiti, le embolie, le shock anaﬁlattici e le infezioni, allo stesso tempo è complicato evitare gli e etti avversi provocati, nel senso che non si può rimuovere facilmente l'e etto di questo tipo di medicinale. Spesso, inoltre, non è gradita. - Intramuscolare: L'assorbimento rimane molto rapido, anche se non viene mandato direttamente in circolo. Anche in questo caso può essere utilizzata su pazienti incoscienti ed è più sicura rispetto alla via endovenosa. Questo perché non c’è pericolo dato dalle bolle d'aria e perché si può rimediare agli errori. Utilizzabile con preparati deposito perché viene lasciata nel muscolo e lentamente il muscolo metterà in circolo il farmaco e quindi non tutto in una volta. È svantaggiosa perché provoca dolore nella sede di iniezione e perché non possono essere utilizzati farmaci necrotizzanti proprio perché manderebbero in necrosi il muscolo. - Via sottocutanea: anche in questo caso l'azione rapida, si possono utilizzare preparative di deposito e allo stesso tempo è il tipo di iniezione per cui è possibile fare un'auto somministrazione. Tuttavia, non si possono utilizzare sostanze irritanti. E nei pazienti con scarsa su icienza circolatoria periferica l'assorbimento non è ottimale. Allo stesso tempo, iniezioni ripetute possono provocare l'ipertroﬁa, con conseguente scarso assorbimento. Altre vie: la via inalatoria può essere utilizzata per terapie sistemiche (gli alveoli sono molto irrorati) sia per il polmone stesso. Grazie alla grande vascolarizzazione degli alveoli, l'assorbimento è molto rapido. È anche utile perché proprio partendo dai polmoni, non deve passare direttamente dal fegato e quindi evita almeno per un certo tempo, il ﬁltro epatico. Allo stesso tempo può essere autosomministrato ed è adatta anche per altre somministrazioni, come ad esempio quelle dei gas come gli anestetici. Essendo formato da gas avremo un minor controllo del dosaggio, una necessità di apparecchiature e di device particolari e poi una possibile irritazione alle mucose con cui entri in contatto. Anche la via cutanea permette un'azione sia locale che sistemica, grazie ai cerotti transdermici. Ma se ci sono ferite o lesioni cutanee può avere e etto anche in circolo, quando in realtà la formulazione non dovrebbe poterlo fare se non disegnata speciﬁcamente per questo scopo. Forma particolare di somministrazione per via cutanea è la ionoforesi: cioè l’impiego di corrente elettrica continua che favorisce l’assorbimento del farmaco. Le forme farmaceutiche principali sono: + cerotti transdermici: cerotti con incorporati farmaci che vengono rilasciati lentamente. Possono avere e etto topico perché ha depositati sulla cute, ma sono anche utili appunto per il rilascio ritardato. Il derma viene utilizzato come percorso per far arrivare il farmaco al sangue. Ripasso di alcuni concetti di chimica I gruppi funzionali conferiscono proprietà e comportamenti speciﬁci che permettono alle molecole dei farmaci di esercitare i loro e etti farmacodinamici e farmacocinetici desiderati  servono alla molecola per interagire con il loro speciﬁco target con un meccanismo adatto, ma allo stesso tempo inﬂuenzano anche le caratteristiche generali della molecola. Sono coinvolti in aspetti di: - solubilità complessiva in acqua (sangue/stomaco) / lipidi (membrane): quello che è solubile in una sostanza non sarà solubile nell’altra. 13 - via di somministrazione + forma farmaceutica: ci sono formulazioni più adatte a gestire alcuni gruppi funzionali. - capacità di interagire con speciﬁci bersagli biologici: i gruppi funzionali determinano l’idrofobicità o l’idroﬁlicità della molecola. Modiﬁcandoli, si modiﬁcano anche le caratteristiche generali della sostanza e le sue capacità, come: - meccanismo d'azione- via di metabolismo ed eliminazione - durata d'azione - idoneità per una speciﬁca situazione terapeutica - tendenza a causare e etti collaterali o interazioni farmacologiche I gruppi possono essere caratterizzati a livello chimico e funzionale in base alla posizione: a seconda dei sostituenti cambiano le proprietà di uno stesso gruppo e le sue cariche parziali. Funzionalmente li dividiamo in: a) idroﬁli: le molecole si sciolgono in ambiente acquoso perché fanno legame idrogeno o si ionizzano b) lipoﬁli: non sono ionizzabili e non sono in grado di dare legame idrogeno c) ci sono gruppi che cambiano le loro caratteristiche a seconda degli atomi che le circondano i gruppi idroﬁli possono essere sia acidi (sinistra) che basi (destra): I gruppi funzionali lipoﬁli, invece, sono nell’immagine a destra: QUINDI: I gruppi funzionali acidi sono quelli che possono donare (o perdere) un protone (H+). Da un punto di vista molto sempliﬁcato, un acido può essere rappresentato come segue: HA   H+ + A- Ci sono due caratteristiche chiave di un gruppo funzionale acido: la presenza di un atomo di idrogeno che può dissociarsi dal gruppo (H+) e la capacità degli atomi rimanenti di delocalizzare la carica negativa risultante tramite risonanza. Come promemoria, la delocalizzazione per risonanza si riferisce alla capacità del gruppo funzionale di distribuire la carica in modo che possa essere condivisa tra due o più atomi. I valori di pKa di questi gruppi funzionali vengono utilizzati per confrontarne l'acidità relativa. Il fatto più importante da ricordare è che più basso è il valore di pKa, più forte è l'acido. Ad esempio, un gruppo funzionale acido con un pKa di 2,4 è più acido di uno con un pKa di 3,4. Esempi di farmaci con gruppi acidi – vedi quaderno o slides (slide 36 pacco 5). Solfonammidi: le solfonammidi sono gruppi acidi in quanto la carica negativa iniziale può essere condivisa da due atomi di ossigeno adiacenti. Entrambi gli atomi di ossigeno sono legati a un unico atomo di zolfo. 14 Gruppi ossidrilici alifatici: non sono acidi in ambienti ﬁsiologici. La ragione di ciò è l'assenza di una stabilizzazione per risonanza della carica risultante. pKa = Al contrario degli acidi, i gruppi funzionali basici sono quelli che possono accettare (o acquisire) un protone. In una visione molto sempliﬁcata, una base può essere rappresentata nel seguente modo: B: + H+  B:H+. Similmente ai gruppi funzionali acidi, i valori di pKa vengono utilizzati per misurare la basicità relativa dei gruppi funzionali. In questo caso si va a considerare la seguente reazione inversa: B:H+ B: + H+. Al contrario dei gruppi acidi, un valore di pKa più alto indica una base più forte. Ad esempio, un gruppo funzionale basico con un pKa di 9,8 è più basico di uno con un pKa di 6,7. Non tutti gli azoti sono basici: la caratteristica strutturale chiave di un gruppo funzionale basico è la presenza di un atomo con una coppia solitaria di elettroni (ad esempio, un atomo di azoto) che può legarsi e accettare un protone. Ma in alcuni casi gli azoti non hanno lo spazio per accettare un protone: I gruppi funzionali possono perciò essere acidi o basici o anfoteri (entrambe le caratteristiche), sali di ammonio quaternario carico o neutro (non ionizzabile). Le molecole, di conseguenza, saranno acide o basiche, ma non solo: ci possono essere più gruppi con una caratteristica o un’altra in ogni molecola. Prevarrà il carattere di quello che è più forte.  Esercitazione 5 La solubilità dei farmaci è inﬂuenzata dalla struttura del principio attivo e dalla ionizzazione del farmaco. Sono fattori che aumentano la solubilità i gruppi polari, come gli ossidrili, le ammine, gli amidi, gli esteri e i carbonili. Sono invece fattori che diminuiscono la solubilità, i gruppi apolari come gli anelli aromatici e le catene alifatiche. Fa si deﬁnisce assorbimento di un farmaco, il suo passaggio dal sito di somministrazione al torrente circolatorio è da tenere in considerazione sempre, tranne quando il farmaco è somministrato e somministrato per via endovenosa. Le strutture dell'organismo che un farmaco deve attraversare per soddisfare questo passaggio sono di tre tipi, la prima sono le membrane cellulari, pressoché impermeabile all'acqua e alle sostanze idrosolubili, ma permeabili alle 15 sostanze liposolubili. La seconda struttura sono i citosol plasmatici con caratteristiche di permeabilità opposte a quelle delle membrane. Inﬁne, ci sono i liquidi acquosi e le sostanze amorfe o strutturate presente negli spazi intracellulari. I meccanismi per attraversare queste barriere sono diversi, la prima può essere la di usione attraverso gli spazi intercellulari. In base alla modalità di attraversamento del bilayer fosfolipidico, si distinguono due categorie generali di trasporto, la prima e la di usione semplice, la seconda e il trasporto mediato. In base alla richiesta energetica del trasporto, si distinguono due caratteristiche generali di trasporto: - Trasporti passivi: fenomeni di trasporto in cui la cellula non fornisce energia alle molecole che permeano, in quanto le molecole si muovono secondo il loro gradiente di concentrazione. I trasporti passivi sono spontanei e equilibranti, in quanto le molecole tendono a distribuirsi uniformemente nei due ambienti separati dalla membrana. Può avvenire attraverso tre modalità, a seconda delle caratteristiche molecolari della sostanza da trasportare: o Di usione semplice, attraverso lo spessore delle membrane: la sostanza passa direttamente. Le molecole attraversano le membrane biologiche di ondendo tra le molecole costitutive della membrana stessa. Ne sono esempi alcuni gas come l'ossigeno, l'anidride carbonica, oppure molecole liposolubili come le vitamine liposolubili A, E, D, K e gli ormoni steroidei. Si comportano nello stesso modo anche piccole molecole idrosolubili prive di carica, con peso molecolare inferiore a 100 o 120 dalton. MA: le molecole lipoﬁle non lo devono essere troppo, altrimenti rimangono bloccate all’interno della membrana. Molti farmaci sono acidi o basi deboli e sono in parte ionizzati nel mezzo acquoso: la frazione ionizzata è responsabile della solubilizzazione, solo la frazione non ionizzata è in grado di attraversare la membrana cellulare.  la concentrazione a livello ematico è sempre in difetto rispetto al punto da cui sta entrando il farmaco, perché questo è sempre in movimento una volta che entra in circolo. La di usione semplice è così sempliﬁcata – funziona allo stesso modo quando il farmaco deve essere smaltito: la concentrazione nel sangue è sempre minore rispetto alle altre zone e il farmaco che deve essere smaltito può rientrare in circolo e essere metabolizzato. Trasporto per coppia ionica: È un caso particolare di di usione ed è caratterizzata da sostanze altamente igienizzate e con carica permanente che legano un controllore di carica opposta formando un complesso neutro che attraversa la membrana. La di usione in generale si veriﬁca quando tra due regioni di una soluzione esiste una di erenza di concentrazione, in tal caso si ha un ﬂusso di particelle dalle regioni a concentrazione maggiore verso quelle a concentrazione minore ﬁnché le particelle non siano distribuite in modo omogeneo tutto lo spazio disponibile. La di usione e il processo ﬁsico attraverso il quale molecole in soluzione o sospensione dotata di moto casuale termico o moto browniano si disperdono da regioni da concentrazione più elevata a regioni a concentrazioni più basse  La di usione è un processo causato dall'agitazione termica della materia. Se immaginiamo di porre una soluzione di saccarosio nella metà di un recipiente, separata con un setto dall'altra metà piena d'acqua, appena viene rimosso il setto, il processo di usivo immediatamente ha inizio. Concentrazione nell'ambiente uno continua a diminuire esponenzialmente e parallelamente quella nell'ambiente due continua ad aumentare con un andamento esponenziale ﬁno al raggiungimento dell'uniformità di concentrazione. Se la di usione dipende dalla temperatura, allora uno stato febbrile può far variare l’assorbimento di una sostanza. Legge di Fick: 16 Coe iciente di di usione: dipende dalle caratteristiche chimico-ﬁsiche della sostanza che di onde ed inoltre dalla viscosità del mezzo in cui avviene la di usione. Tiene conto sia dell’energia cinetica delle molecole, sia degli attriti che incontrano muovendosi. il coe iciente di di usione è proporzionale alla temperatura (e quindi all’energia cinetica posseduta dalle molecole) e inversamente proporzionale all’attrito, il quale dipende sia dalle caratteristiche del mezzo (η) sia dalle dimensioni della molecola (r). Esiste anche una seconda legge di Fick: stabilisce che il tempo necessario a inché la concentrazione del soluto raggiunga una certa percentuale della concentrazione iniziale (es. 75%) ad una certa distanza dalla sorgente di di usione cresce con il quadrato della distanza. Ne consegue che il trasporto di materia per di usione è e iciente e rapido (dell’ordine dei millisecondi) su distanze molto piccole (dell’ordine dei µm) mentre esso diventa lentissimo su scale macroscopiche. o Di usione attraverso canali acquosi. Costituiti da proteine integrali di membrana che organizzata in subunità attraverso una parte a parte la membrana, determinando pori proteici attraverso di essa. o Trasporto facilitato. Secondo cui la molecola da trasportare si combina con una proteina carrier che ne facilita il passaggio attraverso la membrana. - Trasporti attivi, fenomeno di trasporto in cui l'organismo spende energia metabolica per far avvenire il passaggio, in quanto la sostanza si muove contro gradiente di concentrazione. I trasporti attivi sono disequilibranti perché le particelle vengono accumulate da un lato e non sono spontanei in quanto richiede energia dall'esterno. Regole del 5 per molecole Drug-Like: le regole in realtà sono 4, date da Lipinski. In generale indicano che, se le molecole hanno ¾ delle caratteristiche, allora avranno una buona probabilità di essere assorbite per OS. MA non sono una regola assoluta: ci sono molecole che possono non rispettare la maggior parte, se non tutte le caratteristiche e essere comunque assorbibili, sono solo indicazioni, ma bisogna poi valutare caso per caso. Non bisogna basare il drug design e il drug discovery solo su parametri: è meglio utilizzarli per prioritizzare le molecole, non per scartarle a priori. Un farmaco che non rispetta i criteri avrà più di icoltà nell’assorbimento, ma ciò non vuol dire che non sarà mai assorbita o che non si possano trovare vie di somministrazione diverse da quella per os. Lipinski notò che le molecole che arrivavano alla fase ﬁnale dei trial avevano tutte caratteristiche simili: la maggior parte dei farmaci per uso orale (90%) rispettano almeno tre di queste caratteristiche. Le ultime tre caratteristiche permettono alla molecola di avere cariche parziali e di non essere completamente lipoﬁla: buono perché attraversa bene le membrane, ancora meglio perchè non rimangono intrappolate al loro interno. 17 Fase farmacocinetica – assorbimento Il logD dipenderà dal logP in base all’ambiente in cui ci si trova (acido o basico). Il logP è una caratteristica intrinseca delle molecole. Se la molecola NON è ionizzabile, allora logP = logD perché signiﬁca che non è inﬂuenzata dal pH. Sono farmaci neutri. Importanza della pKa: più il valore è piccolo più l’acido è forte. A pH = pKa il 50% dell’acido è indissociato e il 50% è dissociato. Se pH < pKa l’ambiente è acido, la forma sarà protonata perché ci sono tanti H+. Se, viceversa, pH > pKa, allora l’ambiente sarà basico, il farmaco sarà deprotonato perchè ci saranno pochi H+. Ricorda: se stiamo parlando di una base, la forma neutra è quella deprotonata, se stiamo parlando di un acido la forma neutra è quella protonata. pKah = pKa dell’acido coniugato. Più è alto il valore, più debole è l’acido e forte la base. A pH = pKaH il 50% della base non è protonata e il 50% è protonata. 18 QUINDI: il trasporto passivo non richiede energia metabolica, perché i soluti si muovono lungo un gradiente di potenziale elettrochimico. È mediato da proteine canale o carrier: le molecole idroﬁle e gli ioni non possono permeare attraverso il doppio strato fosfolipidico, ma adottano meccanismi di trasporto facilitato. Il trasporto attivo contro gradiente è un trasporto doppio, perché una molecola è contro gradiente e l'altra no, oppure perché la cellula vuole eliminare il farmaco dall'interno perché inteso come negativo. Il trasportatore avrà jun meccanismo ﬂip-ﬂop. Il trasporto facilitato avviene secondo gradiente di concentrazione. Trasportatori GLUT: sono una famiglia di proteine di membrana che consentono la di usione facilitata dal glucosio. Sono formati da 12 segmenti di Alfa, elica e idrofobici disposti in cerchio a formare un tunnel. 7 isoforme, ognuna speciﬁca per cinetica, distribuzione tissutale e funzione. In generale i carrier o trasportatori sono proteine e quindi hanno le caratteristiche tipiche delle proteine, la speciﬁcità, la saturazione, la competizione. Se un farmaco ha speciﬁcità per un trasportatore come quello del glucosio o di qualche altra molecola, se sono nell'organismo contemporaneamente, devo pensare che l'assorbimento avvenga più lentamente rispetto a quando non ho altra molecola in circolo. Speciﬁcità: ogni trasporto mediato è a idato ad un sistema che opera solo per una particolare sostanza o per un gruppo di sostanze simili. Saturazione: l’intensità del ﬂusso non aumenta in modo proporzionale al gradiente di concentrazione della sostanza trasportata (come nel caso della di usione semplice secondo la legge di Fick), ma al crescere del gradiente tende asintoticamente ad un limite massimo. Competizione: quando due sostanze simili utilizzano lo stesso sistema di trasporto, il trasporto dell’una tende a inibire il trasporto dell’altra. Il trasporto attivo richiede energia metabolica sotto forma di atp. I saluti vengono trasportati contro gradiente di potenziale elettrochimico e si tratta di un processo disequilibri ante che crea e mantiene la di erenza di concentrazione tra ambienti separati da una membrana. Ce ne sono due tipologie: - Primario: Sistemi di trasporto che traggono l'energia necessaria per trasportare le particelle contro il gradiente direttamente dalla scissione dell'Atp in Adp. No. La proteina trasportatrice e quindi allo stesso tempo anche una T PIASI, ossia un enzima che catalizza l'idrolisi di ATP. In queste proteine l'idrolisi di ATP è accoppiata a cambiamenti con formazione della molecola tali da consentire il trasporto contro gradiente del substrato. Esempi: pompe di tipo P: costituite da 2 peptidi, α e β; passano in uno stato fosforilato (subunità α) durante il ciclo di trasporto. Le pompe delle classi F e V non hanno intermedi fosforilati, costituite da numerose subunità, non hanno alcuna relazione con quelle delle pompe della classe P. Le proteine ABC hanno 4 domini: 2 transmembrana (T) e 2 citosolici leganti ATP (A) che accoppiano l'idrolisi di ATP al trasporto del soluto. In certe ABC, i domini sono presenti come subunità separate mentre in altre risultano fusi in un singolo polipeptide. ABC-ATPasi (acronico di ATP Binding Cassette) sono proteine ancestrali, ritrovate in tutti i phyla. Sono composte da due subunità transmembranali (denominate T), ciascuna formata generalmente da 6 α- eliche e da due subunità ABC (denominate A). Si ritiene che il meccanismo di funzionamento di tali ATPasi sia riconducibile ad un meccanismo di tipo ﬂip-ﬂop. Glicoproteina P: multidrug transporters contribuiscono alla resistenza farmacologica (Multi Drug Resistance) delle cellule tumorali, in quanto sono in grado di espellere dalla cellula farmaci antitumorali. PDB id 3g61 I ricercatori stanno lavorando duramente per trovare modi per bloccare la glicoproteina P nelle cellule tumorali, per renderle suscettibili al trattamento. Un possibile approccio è usare anticorpi. - Secondari: trasporto di una o più molecole contro gradiente di concentrazione accoppiato al trasporto di una seconda sostanza che si muove secondo gradiente di concentrazione. Come tutti i trasporti mediati anche il trasporto attivo secondario segue una cinetica di saturazione. I più comuni sistemi di trasporto attivo secondario sono guidati dal gradiente di concentrazione del Na+, che è praticamente ubiquitario. Esempi: cotrasporto Na+-amminoacidi (consente alla cellula di accumulare amminoacidi) antiporto Na+-Ca2+ (contribuisce al mantenimento dell’omeostasi intracellulare del Ca2+) Cotrasporto Na+-glucosio nella membrana apicale dell’epitelio di intestino tenue e del tubulo contorto prossimale  l’energia potenziale accumulata nel gradiente di concentrazione del sodio viene usata per spostare il glucosio contro il suo gradiente di concentrazione. Le proteine che operano 19 questo trasporto appartengono alla famiglia SGLT (Sodium-dependent Glucose Transporters). Esse trasferiscono all’interno della cellula delle molecola di glucosio accoppiata a due ioni Na+ che si muovono nello stesso verso. Esiste anche una tipologia di trasporto mediata da vescicole: l’endocitosi è il processo attraverso il quale la membrana si invagina a formare una cavità nella quale sono presenti macromolecole o aggregati sovramolecolari. Successivamente la membrana si chiude formando una vescicola, la quale alla ﬁne si distacca dalla membrana stessa. Fase Farmacocinetica: distribuzione Dopo essere stato assorbito, il farmaco è in circolo e viaggia all’interno del sistema circolatorio. Le caratteristiche del farmaco inﬂuenzano la permanenza nel sangue o i tentativi di uscita dal circolo. La distribuzione è inﬂuenzata anche dalla permeabilità dei capillari: condiziona il percorso delle sostanze non liposolubili, che è maggiore nei distretti provvisti di capillari fenestrati (fegato, milza, midollo osseo) piuttosto che in quelle zone dotate di una circolazione altamente impermeabile (barriera ematoencefalica). Anche il ﬂusso ematico ai diversi organi: se il target è un organo poco irrorato, sarà più di icile per il farmaco arrivare a destinazione. Il farmaco può anche legarsi alle proteine plasmatiche: alcune sostanze molto liposolubili non riescono a stare a contatto con l'ambiente acquoso del plasma; pertanto, si legano a particolari "tasche" idrofobiche di alcune proteine plasmatiche, come l'albumina, dalle quali fuoriescono solo molto lentamente. Una volta raggiunto il target, la di usione del farmaco deve fare ancora i conti con l’entità di perfusione sanguigna del tessuto e della natura più o meno lipidica dello stesso. Nell’elenco è indicata la perfusione dei diversi tessuti. Nell’immagine a sinistra: sezione di un vaso sanguigno. Ci sono due frecce per la sede d’azione perché, una volta esaurito il suo compito il farmaco esce e ritorna nel circolo, le interazioni non sono covalenti. È però possibile che il farmaco escano i punti sbagliati e che si formino dei depositi tessutali  Fa la quantità nella sede del sito d'azione sarà minore. Se il farmaco avrà e etti collaterali anche diminuendolo li vediamo lo stesso perché del deposito continua ad uscire quello che si era accumulato. La quantità di farmaco che deposita dipende anche dalla quantità di tessuto adiposo. L'iscrizione avviene nel fegato, che ripulisce il sangue e che rende gli scarti più facilmente eliminabili. Il problema a livello farmaceutico è che c'è un rischio di modiﬁcare l'e icacia e le caratteristiche del farmaco se passa prima dal fegato. C'è il rischio, infatti, di avere biotrasformazione: biotrasformazione: la generazione di nuove molecole che entrano in circolo dtte metaboliti. I metaboliti possono subire lo stesso destino del farmaco e quindi avere un'attività biologica sul target o non sul target oppure creare e etti collaterali. Tuttavia, è possibile superare questo problema somministrando dei farmaci inattivi: la biotrasformazione mi permette di attivarli, è utile soprattutto nei farmaci assunti per os perché passano subito dal fegato. Viene creata una molecola chiamata prodrug. Proteine plasmatiche: biotrasformazione: si può calcolare la percentuale di farmaco legato, cioè farmaco che non è biodisponibile, non è metabolizzabile e non è escretibile e che quindi non avrà e etto. Biotrasformazione: ci sono due grandi famiglie di proteine plasmatiche, la prima è quella dell'albumina e la seconda è quella dell'alfa uno 20 glicoproteina. L'albumina lega farmaci acidi perché è basica e infatti espone aminoacidi basici. L'alfa, un agricolo proteina Lega Farmaci Basici perché espone aminoacidi acidi. Ci sono anche delle situazioni rare dove si possono creare legami covalenti e dove il farmaco non verrà più rilasciato. Non è detto che questa condizione sia una cosa negativa: Warfarin è un farmaco che al 99,5% sta legato alle proteine plasmatiche, ma funziona molto bene. Non si può usare la percentuale come criterio fondamentale, è come se il farmaco fosse stato depositato. Quindi, viene aumentata la vita all'interno dell'organismo e se all'inizio bisogna dare una dose maggiore detta fattore di carico, nella continuazione della terapia si può anche usare una dose minore, ci sarà comunque un e etto, perché quello che è sequestrato continua a essere rilasciato nell'organismo. Esistono anche trans cortine che legano Corti con steroidi, tiroxina e vitamina B 12 e lipoproteine che legano steroidi di vitamina A, vitamina D, ciclosporina, chinidina e alcuni pesticidi. Nell’immagine: percentuale legata alle proteine plasmatiche di un determinato farmaco. Accumulo di farmaci: I farmaci altamente liposolubili abbandonano l'organo bersaglio ad elevate irrorazione per ridistribuirsi a tessuti meno irrorati ma maggiore capacità ritentiva. Questo fenomeno si chiama redistribuzione. I siti di accumulo principali sono la cheratina, il fegato, il rene, l'adipe e il tessuto osseo. La composizione dei tessuti e inoltre variabile, man mano che si invecchia, il quantitativo di farmaci che può trovarsi nei tessuti di proposito. Aumenta e quindi si vedrà un e etto diverso dello stesso farmaco. Con l'età, infatti, diminuisce la quantità di acqua e aumenta la quantità di grasso. I fenomeni di accumulo si veriﬁcano: - Per l’elevata a inità del farmaco ad un tessuto, ad esempio al tessuto lipidico quando il farmaco è molto lipoﬁlo (anestetici generali) o il farmaco è abbastanza lipoﬁlo ma somministrato cronicamente (benzodiazepine). - Perché il farmaco si lega ai costituenti di un tessuto. Ci sono siti in cui questo non può avvenire, ad esempio nella barriera ematoencefalica, che è una barriera complessa fatta apposta per l'altra passare le molecole. Questo rende più di icile per una sostanza arrivare al cervello. Ma anche impedisce a una sostanza tossica che è riuscita ad entrare per sbaglio di riuscire ad essere eliminata. È molto forte anche la barriera emato placentare, infatti alcuni farmaci non possono essere assunti in gravidanza proprio perché c'è un ricircolo di sangue con il feto. Fase Farmacocinetica - metabolismo Il metabolismo in generale è composto da due fasi: catabolismo e anabolismo. Il catabolismo è quel processo che gli viene energia degradando carboidrati, acidi grassi e aminoacidi e che porta alla formazione di prodotti di riﬁuto come l'anidride carbonica, l'acqua e le scorie azotate. L'anabolismo invece assorbe energia per svolgere le reazioni di sintesi e condensazione all'interno delle cellule. Il metabolismo alimentare è diverso dal metabolismo farmaceutico: un farmaco; infatti, è una struttura estranea all'organismo che viene modiﬁcata tramite vie di salvaguardia se le molecole sono di piccole dimensioni  operazione di biotrasformazione. Se le dimensioni sono maggiori, viene utilizzato il sistema immunitario. 21 La biotrasformazione descrive il metabolismo del farmaco ad opera di speciﬁci enzimi, detti appunto enzimi metabolici. Questi enzimi sono presenti soprattutto nel fegato, ma anche in altre parti del corpo come l'intestino, i reni, i polmoni, la cute, il plasma e il sistema nervoso centrale. Hanno come scopo principale trasformare i farmaci in molecole maggiormente solubili e quindi più facili da eliminare attraverso le urine. Si cerca quindi di limitare la lipoﬁlia aumentando l'idroﬁlicità. Le reazioni metaboliche possono essere di fase uno o di fase due: - Fase I: Fa sono reazioni non sintetiche e quindi viene modiﬁcato un gruppo funzionale del nostro farmaco tramite idrolisi o ossidazione. È la tipologia di reazione principalmente sfruttata dai profarmaci. Le reazioni di Ossido-Riduzione avvengono principalmente in reticolo endoplasmatico liscio degli epatociti ad opera di enzimi particolari detti citocromi. - Fase II: sono reazioni di coniugazione o sintetiche, quindi vengono aggiunti i gruppi funzionali idroﬁli, rendendo la molecola più a ine ai liquidi acquosi. Le principali reazioni di fase due sono la glucuroconiugazione, cioè la coniugazione con acido glucuronico, l'acetilazione, la coniugazione con aminoacidi come glicina, taurina e glutammina, la coniugazione con solfato o solfoconiugazione e la metilazione. I numeri non indicano che devono essere svolte in ordine, né che devono essere presenti entrambe perché un farmaco sia metabolizzato. Reazioni di fase I Consistono nell'introduzione di gruppi funzionali che forniscono i siti per la coniugazione con unità fortemente polari, caratterizzate poi dall'unità di fase due. Si tratta per la maggior parte di reazioni di ossidazione catalizzata da diverse classi di enzimi. Il risultato dell'ossidazione varia a seconda delle caratteristiche chimiche del substrato e dell'enzima che interviene nella reazione. Oltre le reazioni di ossidazione, sono considerate nella fase uno anche le reazioni di idrolisi e di riduzione catalizzate dalle idrolasi e dalle reduttasi. Enzimi coinvolti: - Microsomi: citocromo P450, per epossidazione, sulfossidazione, dealchilazione, desulforazione e deidrogenazione. - Frazione solubile del citoplasma:  Alcol deidrogenasi  Aldeide deidrogenasi  MAO  Xantino ossidasi Nell’ossidazione: i composti aromatici che portano un gruppo alchilico possono andare incontro a una dealchilazione; in corrispondenza di un doppio legame di molecole aromatiche o alifatiche si può avere la formazione di un anello epossidico, per addizione dell’ossigeno, come nel caso del benzene e degli IPA; in corrispondenza di eteroatomi si possono avere una N- ossidazione o una S-ossidazione, una dealchilazione o anche la sostituzione dell’eteroatomo con l’ossigeno, come nel caso delle ammine aromatiche o dei tiocomposti. Citocromi Si trovano nel reticolo endoplasmatico. Sono delle monossigenasi che contengono il gruppo Eme e che hanno il come cofattore il NADPH. 12 famiglie di enzimi sono espresse nell'uomo. Esistono almeno 57 geni e 58 pseudogeni diversi, che sono raggruppati sulla base della similarità della sequenza aminoacidica in una gran numero di famiglie e sottofamiglie. 22 I citocromi P sono denominati utilizzando una radice comune CYP È un numero identiﬁcativo della famiglia che corrisponde ad una sequenza uguale per il 40% e ad uno sottofamiglia che corrisponde a una sequenza uguale per il 55%. Negli esseri umani ci sono 12 citocromi che sono considerati importanti per il metabolismo degli xenobiotici. E in particolare le famiglie. 1A,1B, 2A, 2B, 2E non sono coinvolte nel metabolismo dei farmaci, ma catalizzano la reazione di molte sostanze contenute negli alimenti di origine ambientale, tra cui tossine e molecole precancerose. L’evoluzione del numero di questi enzimi riﬂette l'esposizione ad un numero sempre maggiore di xenobiotici potenzialmente tossici: tossici: gli organismi che hanno di più hanno un vantaggio evolutivo proprio perché è in grado di eliminare più sostanze tossiche. Inoltre, i citocromi non sono univoci. Un citocromo non metabolizza un solo farmaco e allo stesso tempo un farmaco può essere metabolizzato da più citocromi diversi con una reazione simile o con reazioni diverse. Ci sono anche citocromi che tendono a farla da padrone quando metabolizzano i farmaci. L'isoforma CYP3A4 è quella responsabile del metabolismo del 60% dei farmaci tossici: è inibita ad alcune sostanze come il succo di polpo elmo e subisce tutti i meccanismi di regolazione tipici delle proteine, come ad esempio la competizione tra i metaboliti, ad esempio o metabolizza il succo di pompelmo oppure il farmaco  meno farmaco metabolizzato signiﬁca più farmaco in circolo. La sua funzionalità viene inoltre inibita da antibiotici come l'eritromicina e la claritromicina, oppure da antifungini, da antidepressivi e da inibitori delle proteasi. Abbiamo già parlato dei bioﬂavonoidi presenti nel succo di pompelmo, ma viene bloccato anche dalla curcumina e dal tè verde. Gli inibitori enzimatici agiscono diminuendo la trasformazione metabolica degli xenobiotici e inibiscono solo un enzima o un enzima oppure isoenzimi strettamente correlati. I meccanismi di inibizione del citocromo P450 sono divisi in tre categorie: Inibizione reversibile – è il meccanismo più comunemente responsabile delle Essa è il risultato di una competizione per il sito attivo del CYP, mentre le inibizioni irreversibili o quasi irreversibili sono conseguenti alla formazione di metaboliti reattivi o con a inità particolarmente elevata per l’enzima. Si veriﬁca un’inibizione reversibile quando un agente lipoﬁlo si lega al sito attivo del CYP. Il legame può avvenire con la regione idrofobica che lega il substrato o con il ferro eme nella posizione libera del sesto ligando. Molti degli inibitori reversibili del CYP sono farmaci contenenti gruppi azotati, specialmente imidazoli, piridine e chinoline. La potenza di un inibitore risulta sia dalla sua lipoﬁlicità, che dalla forza del legame tra la coppia di elettroni liberi dell’azoto e il ferro dell’eme. L’inibizione si instaura immediatamente, in seguito alla prima somministrazione dell’inibitore. L’inibizione scompare quando l’inibitore viene eliminato dall’organismo Inibizione quasi irreversibile o da intermedi metabolici - L'enzima non viene modiﬁcato, ma non è attivo. Succede quando ci sono sostanze che una volta metabolizzate diventano reattive, ma non nei confronti dell'enzima ma ad esempio nei confronti dell'ENEL. Lo complessino e l'enzima rimane senza. Non è irreversibile perché presenza di altre enzima può dipende dal suo gruppo prostetico ma in assenza non può funzionare. Questi complessi si chiamano complessi con intermedi metabolici o metabolic intermediate complex. Tra i farmaci che la causano ci sono gli antidepressivi, gli antistaminici, gli antibiotici macrolidi e i composti idrazinici. 23 il citocromo P3A4 può essere inibito in maniera quasi irreversibile dai macrolidi. I metaboliti nitroso alcani derivano dall'ossidazione metabolica del gruppo - N(CH3)2 dell’antibiotico, con formazione di – N=O. I nitroso-alcani formano complessi stabili con il ferro eme del CYP3A4, inattivando in maniera quasi irreversibile l’enzima. Inibizione irreversibile: c’è meno enzima perché viene degradato. I farmaci, contenenti certi gruppi funzionali, possono essere ossidati dal citocromo P450 ad intermedi reattivi che si legano covalentemente all'enzima prima del loro distacco dal sito attivo, causandone l'inattivazione irreversibile. I substrati che provocano questo tipo di inibizione sono dati inattivatori suicidi. Esempio: metabolismo ossidativo dell’etinilestradiolo. Lo stato attivato dell’ossigeno coordinato nel citocromo P450 interagisce con il sostituente acetilenico per produrre un intermedio radicalico. Il ferro dell’eme viene perso ed il sistema porﬁrinico è modiﬁcato. X: rappresenta la porzione steroidea della molecola. FMO – Monoossigenasi Flavina Adenina dinucleotide dipendenti. Sono un'altra importante famiglia di enzimi del metabolismo ossidativo. Sono simili ai citocromi, ma cambiano il cofattore e la localizzazione; infatti, il gruppo prostetico è il FAD che viene ridotto dal NADPH. Il FAD incorpora prima l'ossigeno molecolare per poi trasferirlo ai substrati, che sono in genere i nucleoﬁli più deboli rispetto ai substrati dei citocromi. La forma uno è presente nel fegato, nel rene e nell'intestino, la forma due è presente principalmente nel rene e la forma tre è presente soprattutto nel fegato. All'interno delle cellule si trovano sulla membrana mitocondriale e vanno spesso a inattivare i neurotrasmettitori. Ci sono poi meno isoforme rispetto ai citocromi, perché vanno a modiﬁcare e gestire gli elementi indigeni, che sono limitati rispetto a quelli con cui si può entrare in contatto fuori dall'organismo. Una tipica reazione catalizzata dalle FMO è la deamminazione ossidativa, ma le FMO possono anche catalizzare reazioni di N-ossidazione e S- ossidazione, a seconda dei substrati, che includono molte ammine terziarie e secondarie, le idrazine, i tiocomposti organici e diversi composti inorganici solforati e nitrogenati MAO – monoamminoossidasi. Le monoamminoossidasi sono rappresentate da due ﬂavoproteine, MAO-A e MAO-B, che si trovano localizzate all’esterno della membrana mitocondriale, con espressione praticamente ubiquitaria. Nel SNC la loro funzione primaria consiste nell’inattivare i neurotrasmettitori monoamminici, come la serotonina e la dopammina, attraverso una reazione di deamminazione ossidativa. La loro azione sui substrati endogeni è quindi fondamentale per la trasmissione del segnale a livello neuronale. La loro attività ossidativa sulle ammine esogene è però particolarmente dannosa, in quanto genera aldeidi, ammoniaca e idroperossidi, che possono ra. giungere livelli tossici. COX – cicloossigenasi. Le cicloossigenasi, dette anche prostaglandina-sintetasi, sono rappresentate da due isoenzimi, COX-1, che è espresso costitutivamente in diversi tessuti anche extraepatici, e COX-2, la cui espressione viene signiﬁcativamente aumentata in risposta ai processi inﬁammatori. Nelle reazioni di ossidazione catalizzate dalle COX possono fungere da substrato composti fenilici e diverse ammine aromatiche che, passando attraverso intermedi perossidici o radicalici, altamente reattivi, possono innescare la perossidazione lipidica o legarsi alle macromolecole cellulari. Sono le molecole che possono dare tossicità da paracetamolo. Reazioni di idrolisi Non sono importanti a livello di numero, ma sono importanti nella creazione di prodrug. Ci sono diversi enzimi: esterasi, epossido idrolasi e peptidasi (aminopeptidasi, carbossipeptidasi). 24 Le reazioni di idrolisi hanno un importante ruolo nella creazione di gruppi funzionali nelle molecole esogene, che è tipica della fase I. Tra le idrolasi occupano una posizione di rilievo le epossido idrolasi (EH) Tra le altre idrolasi, le esterasiammidasi, le solfatasi e le glicosidasi meritano attenzione per il loro intervento nel metabolismo degli xenobiotici. mEH: legata alle membrane del reticolo endoplasmatico. Le epossido idrolasi (EH) sEH: solubile, si trova in notevoli quantità nei perossisomi, dove svolge un ruolo protettivo rispetto al danno ossidativo degli idroperossidi generati dalla degradazione degli acidi grassi a catena lunga. I due isoenzimi sono presenti principalmente nel fegato, ma anche in altri organi, e condividono la struttura tridimensionale e il meccanismo d’azione, anche se hanno un basso livello di omologia della sequenza amminoacidica (< 15). Le reazioni mediate dalle EH convertono gli epossidi aromatici e alifatici nei corrispondenti diidrodioli, che hanno un carattere meno elettroﬁlo, ma l’intervento delle EH può anche contribuire ad accrescere la mutagenicità di alcuni composti. Le esterasiammidasi sono enzimi che svolgono sia la funzione esterasica che ammidasica, idrolizzano cioè gli esteri carbossilici e le ammidi. I più importanti substrati delle esterasiA, dette anche arilesterasi, sono gli insetticidi organofosforici. Alcuni di questi composti non vengono trasformati dall’esterasi B detta anche acerilcolinesterasi, mane inibiscono l’azione nella terminazione della neurotrasmissione colinergica, con rilevanti e etti neurotossici. Rottura del legame estereo, la parte persa viene eliminata, l’altra si attiva come farmaco. Le solfatasi e le glicosidasi possono scindere prodotti coniugati solfati o glucuronati (reazioni di fase II), riattivandone il potenziale genotossico  è più raro ma può accadere – se le molecole di fase II permane può essere rimodiﬁcata. Deidrogenasi: iI metabolismo di diversi composti che portano gruppi alcolici e aldeidici può essere mediato dalle alcol deidrogenasi e dalle aldeide deidrogenasi. Questi enzimi entrano nel metabolismo dell’etanolo, uno dei composti esogeni di più largo uso, che viene prima deidrogenato ad acetaldeide dall’alcol deidrogenasi e poi, per intervento dell’aldeide deidrogenasi, ad acido acetico. Reduttasi: sotto il nome generico di reduttasi vanno alcuni enzimi caratteristici dei batteri ospiti del tratto intestinale che catalizzano diverse reazioni di riduzione la loro azione su nitrocomposti aromatici può anche dar luogo alla formazione di idrossilammine aromatiche, che rappresentano i precursori di esteri altamente genotossici. Una reduttasi endogena, la NADPH-chi-none ossidoreduttasi o DT-diaforasi (NQ01), svolge un ruolo importante nella detossiﬁcazione dei chinoni, prevenendo la formazione dei radicali semichinonici. [vedi sulle slides esempi]  ossidazione della piridina, quando le molecole hanno cariche, è più di icile che vengano assorbite; quindi, quando arrivano alle urine stanno molto bene lì e non verranno più riassorbite. Per quanto poi uno voglia tentare di modulare il metabolismo, è fondamentale che l'escrezione ci sia, altrimenti il farmaco e rimarrebbe in circolo senza uscire e senza esaurire mai il suo e etto. Anche gli addotti con le proteine, per quanto utili, possono diventare dannosi, infatti ogni volta che viene eliminato un farmaco o un metabolita, viene eliminata anche una proteina e alla lunga questa perdita può risultare problematica. Metabolismo di fase II Se la fase I creava molecole potenzialmente attive, le reazioni di fase II comportano l’aggiunta di gruppi importanti, quindi è improbabile che la molecola sia attiva. Vengono coniugati gruppi reattivi, già presenti nel farmaco o ottenuti in seguito a reazioni di fase I, con piccole molecole endogene  gli enzimi coinvolti sono localizzati principalmente nel citosol. Cosa succede? Creazione di legame covalente con molecole endogene per produrre una molecola polare (ad eccezione della metilazione e dell’acetilazione). Sono: - Glucuronazione 25 - Solfatazione - Acetilazione - Metilazione - Coniugazione con glutatione - Coniugazione con aminoacidi Glucuronazione (è la più frequente): crea molecole altamente idroﬁli, si forma un legame covalente tra lo xenobiotico e l’atomo di carbonio 1 della molecola di acido glucuronico. I glucuronidi formatisi nel fegato possono essere escreti con la bile oppure passare nel sangue ed essere escreti dai reni. Il modo di escrezione è determinato dalle dimensioni molecolari del glucuronide: - i glucuronidi più grandi sono eliminati per via biliare - quelli più piccoli per via renale Le molecole sono in generale più pesanti, quindi avranno più di icoltà nell’attraversare le membrane. Avviene sia su COOH che su OH. Solfatasi: aggiunta di gruppo solfato ridotto, ma anche di carica  maggiore polarità. Le sulfotrasferasi (SULT) sono una famiglia di enzimi che utilizzano il 3-fosfoadenosina S-fosfosolfato (PAPS) come donatore di un gruppo solfato. Solfatasi Le forme principali sono enzimi citosolici, che condividono molte proprietà ﬁsico-chimiche ed hanno una speciﬁcità di substrato largamente sovrapposta. I maggiori livelli di espressione sono stati trovati nel fegato, ma le diverse isoforme hanno un’espressione diversa in molti altri tessuti, che è quindi regolata in modo indipendente. Acetilazione: aggiunta di un gruppo acetato, che non è idroﬁlo ma che modiﬁca lo stesso la lipoﬁlicità, rendendo meno assorbibili le sostanze e evitare che vadano in circolo. Principale meccanismo di trasformazione degli xenobiotici contenenti una amina aromatica (R-NH2) o una idrazina (R-NH-NH2). L’acetilazione dell’azoto è catalizzata dalle N-acetiltransferasi presenti a livello citosolico, principalmente nell’epatocita. Gli enzimi sono le AcetilCoAtrasferasi (NAT), nell’uomo sono presenti 2 enzimi CITOSOLICI: NAT1 e NAT2 (che hanno un’omologia di sequenza superiore al 75%). NAT1 è presente in molti tessuti, NAT2 è espressa prevalentemente nel fegato e nelle cellule epiteliali dell’intestino. 26 Metilazione: ha un e etto limitato, si utilizza principalmente per bloccare l’eteroatomo in modo da evitare ulteriori reazioni di coniugazione. Si crea un metabolita che non verrà eliminato velocemente: in alcune situazioni si può modiﬁcare l’orientamento dell’organismo da una via di eliminazione ad un’altra. Riguarda soprattutto i composti endogeni su eteroatomi ricchi di elettroni (O, N, S) e gli xenobiotici metilati sono fenoli, catecoli, amine aromatiche o alifatiche. GST – glutatione S trasferasi: le glutatione-S-trasferasi (GST) formano una famiglia che comprende quattro classi di enzimi citosolici, presenti in molti tessuti, tra i quali il fegato, il rene, lo stomaco, l’encefalo. I diversi enzimi sono strettamente correlati dal punto di vista ﬁlogenetico, con omologie che arrivano ﬁno al 95%, per i membri della stessa classe. La funzione è di coniugare con il glutatione (GSH) un ampio spettro di sostanze elettroﬁle, generando prodotti che vengono facilmente rilasciati dalle cellule per trasporto attivo ed escreti, dopo essere stari convertiti ad acidi mercapturici  proteggono l’organo in cui si trovano. Glutatione – GSH, è un tripeptide formato da acido glutammico, glicina, cisteina con il gruppo SH libero. Coniugazione con aminoacidi: sono coinvolti glicina, serina, glutammina, taurina, prolina. Esistono due vie di coniugazione con aminoacidi: 1) il composto è attivato con il CoA e poi coniugato 2) avviene direttamente la coniugazione carbossile dell’aminoacido e lo xenobiotico. Esempi: biotrasformazione del benzo(a)pirene, tossicità del paracetamolo, ruolo della coniugazione acido solforica nella produzione di metaboliti cancerogeni. Cosa inﬂuenza il metabolismo? Ci sono elementi genetici, ambientali e interazioni con altri elementi. Un polimorﬁsmo metabolico può causare, ad esempio nel caso della succinilcolina, conseguenze come un abnorme prolungamento dell'azione. Induzione enzimatica: Meccanismo per cui alcune sostanze, tra cui farmaci e l'alcol, simulano gli stessi enzimi che sono incaricati di trasformarli, in questo modo il farmaco o l'alcol stimolerà la sua stessa distruzione. Se infatti si è esposti per tanto tempo a uno stesso farmaco o una stessa sostanza, verranno prodotti più enzimi in modo tale da eliminarlo meglio. First pass e ect: biotrasformazione ~ 50% prima di entrare nel circolo sistemico. Modiﬁcano il metabolismo anche i fattori elencati nell’immagine a destra. 27 Le conseguenze del metabolismo cambiano in base all’e etto che questo ha sul farmaco: - inattivazione: o metabolita incapace di agire sul farmaco o metabolita incapace di raggiungere la sede d’azione o metabolita eliminato più rapidamente - attivazione: o metabolita dotato di attività, a di erenza del farmaco progenitore inattivo – profarmaco o mutageni e carcinogeni attivati della microﬂora intestinale Metaboliti Un metabolita è una qualunque struttura che otteniamo dopo l'azione degli enzimi del metabolismo. Possono avere diversi stati funzionali a seconda di come erano in partenza e di come sono stati modiﬁcati: - Farmaco attivo  Metabolita inattivo, è il caso più frequente. Un esempio è la sertralina: può avere tre metaboliti, tutti inattivi, che si creano tramite due razioni di fase uno e una di fase due. Dall'immagine si capisce che, se entrambe le strutture ottenute con reazioni di fase uno hanno perso il metile e il metabolita risulta quindi inattivato, allora questa porzio

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