CHIMICA ANALITICA.docx

CHIMICA ANALITICA ================= **CAMPIONAMENTO** ----------------- Il campionamento è il primo stadio delle operazioni preliminari (azioni che rendono il campione adatto alla misurazione). Questo processo può essere definito in diversi modi complementari tra loro: - Procedura pratica utili...

CHIMICA ANALITICA ================= **CAMPIONAMENTO** ----------------- Il campionamento è il primo stadio delle operazioni preliminari (azioni che rendono il campione adatto alla misurazione). Questo processo può essere definito in diversi modi complementari tra loro: - Procedura pratica utilizzata per selezionare una o più porzioni (aliquota) del materiale oggetto di studio - Linea di collegamento tra l'oggetto e gli altri passaggi della procedura analitica - Il modo in cui si ottiene la rappresentatività del risultato analitico rispetto ad una serie specifica di caratteristiche del materiale oggetto di studio, considerando sia le caratteristiche del materiale che le informazioni che si intende ricavare da esso L'obiettivo di questa fase è quello di ottenere un campione rappresentativo del materiale oggetto di indagine (analita), per far ciò bisogna andare a valutare diversi fattori: - Orizzonte spaziale (la grandezza da cui dobbiamo ricavare il campione) - Orizzonte temporale (l'arco di tempo in cui raccogliamo il campione) - Stabilità del campione nel tempo - Quantità del materiale disponibile Inoltre, ad influenzare la procedura, saranno le caratteristiche proprie e della procedura sperimentale che si vuole utilizzare per l'analisi. Per quanto riguarda la raccolta dell'campione, questa deve avvenire secondo alcuni criteri specifici, ovvero: - Criteri probabilistici= vengono utilizzati dei metodi statistici per stabilire delle regole da attuare durante il campionamento di parti specifiche del materiale oggetto di analisi, come ad esempio il campionamento di un terreno. Esistono 3 tipi di criteri probabilistici applicabili: 1. [RANDOM]= comporta la raccolta di un grande numero di campioni, questo perché viene condotto in modo tale che tutte le parti del lotto (materiale di cui si assume che tutte le parti appartengano alla stessa popolazione) abbiano la stessa probabilità di essere campionate 2. [SISTEMATICO NELLO SPAZIO O SISTEMATICO NEL TEMPO]= nel primo caso i campioni vengono raccolti secondo specifici schemi spaziali (metodo più applicato), nel secondo caso si vanno a scegliere diversi intervalli di tempo (a seconda della necessità) per attuare la raccolta. Il secondo metodo viene usato per campioni dinamici, ovvero tutti quei campioni la cui composizione cambia nel tempo 3. [MISTO]= si attua per sistemi molto complessi dove ce la necessità di approcci misti - Criteri non-probabilistici= vengono utilizzati nel momento in cui ci sono zero probabilità di poter prelevare parti specifiche di un campione, come ad esempio il campionamento di un corso d'acqua. Esistono due tipi di campionamento appartenenti a questa classe: 1. Intuitivo 2. Orientato **TIPI DI CAMPIONE** Un campione viene definito come: una porzione, quindi una parte ben definita, prelevata dal materiale oggetto di indagine in accordo con la procedura di campionamento utilizzata. Quest'ultimo può essere classificato in base alla dimensione, alla procedura con cui è stato prelevato e alla distanza, in termini di passaggi intermedi di riduzione di dimensione, del materiale oggetto di indagine. Mentre, il materiale, può essere definito tramite il termine statistico di popolazione, ovvero un insieme finito o infinito di parti che differiscono da parti di popolazioni diverse. **ERRORI DI CAMPIONAMENTO** In un'analisi, esaminare ogni singolo elemento, è quasi impossibile. Questo perché si hanno limitate risorse, il numero di individui dell'intera popolazione è estremamente elevato e, oltre a non essere fisicamente raggiungibile, potrebbe anche non essere del tutto noto. Per questo motivo un campionamento, per essere efficace, deve comprendere il raccoglimento di dati che possano rappresentare, a livello generale, l'intera popolazione. Le principali fonti di errori sono: - Basso numero di campioni - Scarsa rappresentatività dei punti di campionamento - Errata grandezza del campione globale **Errori sistematici** Sono dovuti a difetti della procedura di campionamento, ovvero: - Apparecchiature inappropriate - Conservazione del campione inadeguata - Aumento o diminuzione di massa dovuta ad interazioni con il contenitore di trasporto - Reattività con agenti atmosferici Possono avere un esito positivo o negativo ma soprattutto, essendo identificabili, sono anche eliminabili **Errori casuali** Generalmente sono dovuti alla procedura di campionamento, in particolar modo ad un'eventuale mancanza di omogeneità del materiale. Questi possono diminuire con l'aumentare della quantità di campione e con il numero dei campioni, inoltre, possono essere quantificati con la deviazione standard. **CAMPIONAMENTO E ANALISI DEGLI ALIMENTI** L'obiettivo di queste analisi è quello di verificare la conformità dell'alimento alla normativa vigente, in modo tale da prevenire rischi per la salute pubblica, quindi si vanno a prevenire: - Tossinfezioni - Intossicazioni - Presenza di tossine o sostanze tossiche - Presenza di patogeni Tuttavia, presentano alti due obiettivi, ovvero: - Proteggere gli interessi dei consumatori - Tutelare la commercializzazione dei prodotti I campioni da prendere in analisi, invece, sono delle porzioni rappresentative dei lotti di produzione da dove vengono prelevati prima di essere trasportati in un laboratorio analitico. Questi lotti sono frazioni omogenee di una produzione, in quantità definita, che provengono da una lavorazione effettuata nelle stesse condizioni operative senza interruzione e/o sospensioni. Alcune normative di settore prevedono che in alcuni casi le analisi sulle aliquote (frazioni rappresentative del campione) siano effettuate in presenza di un numero standard di Unità campionarie (unità elementari del campione) presenti al loro interno (una o più U.C. vanno a costituire un'aliquota). Ad esempio, in piccole confezioni o pezzature, il prelievo di un campione casuale di 20 confezioni o 2000g va ripartito con un criterio della casualità in 4 aliquote composte da 5 confezioni o 5 U.C da 100g l\'una. Inoltre, è sempre consigliabile utilizzare un numero relativamente alto di aliquote per effettuare diversi campionamenti e analisi. L\'unica eccezione è quando sia ha un campione unico non ripetibile, questo perché: - Potrebbe non essere abbastanza per prelevarne più di un'aliquota - Potrebbe avere una scadenza prossima - L'aliquota, o l'analisi, potrebbero avere delle caratteristiche (elevata deteriorabilità del campione o procedura notevolmente lunga) che, in caso di esito sfavorevole, non permetterebbero la ripetizione delle analisi su un campione ancora in condizioni di normale conservazione **ESEMPI DI CAMPIONAMENTO DEGLI ALIMENTI** **Latte** [Materiali per il campionamento]: - Utensili per il campionamento in acciaio inossidabile - Stantuffi e pale di miscelazione di adeguate dimensioni tali da garantire un mescolamento del prodotto senza provocare rancidità - Strumenti di raccolta di dimensioni adeguate tali da consentire il prelievo di un campione da qualsiasi punto del recipiente - Recipienti per i campioni di materiali adeguati (vetro, metallo o plastica) e dotati di coperchio Tutte le superfici degli strumenti per il prelievo e dei contenitori finali devono essere lisce, prive di fessure e senza spigoli. [Tecnica di campionamento:] 1. Mescolare adeguatamente il campione 2. Prelievo immediato a seguito della miscelazione quando il campione è ancora in movimento per avere un'omogeneità (se si prelevano più campioni quello per le analisi microbiologiche deve essere il primo) I recipienti con i campioni devono essere quasi completamente riempiti, verrà lasciato solo lo spazio necessario per poter attuare una miscelazione prima dell\'analisi. Invece, nel caso in cui si facciano dei prelievi da più recipienti, per ottenere un unico campione, bisognerà mescolarli in quantità proporzionali al contenuto dei singoli recipienti. **Cereali** Rappresentano dei campioni solidi costituiti da grandi lotti, per cui l'importanza della procedura di campionamento ista consistente riduzione delle quantità di 8-9 ordini di grandezza (da un lotto di centinaia di t -- si ha analisi di alcuni g o quantità inferiori) [Tipologie di campioni:] - CAMPIONE ELEMENTARE: campione proveniente da ogni singolo prelievo effettuato sullo stesso lotto - CAMPIONE GLOBALE: si ottiene dal mescolamento adeguato di più campioni elementari tale da renderlo omogeneo - CAMPIONE MEDIO DI PRELEVAMENTO: si ottiene con metodi adeguati dal campione globale e rappresenta il campione che viene inviato al laboratorio per le analisi chimiche/biologiche **Formaggi** È un campione solido di dimensioni medio-piccole che dev'essere conservato in contenitori fatti di materiali impermeabili all\'acqua e ai grassi. Questi contenitori devono inoltre essere muniti di tappi ricoperti di materiale non assorbente ed inodore, di forma cilindrica e con imboccatura larga [Materiali per il prelievo:] - Sonda da formaggi di dimensioni appropriate - Coltello a punta in acciaio inossidabile - Filo da taglio in acciaio inossidabile - Spatola in acciaio inossidabile **RIFERIMENTI NORMATIVI** A causa di effetti nocivi sulla salute umana e ambientale dovuti all'elevata esposizione a metalli pesanti, sono stati creati negli anni dei riferimenti normativi nei confronti dei limiti di sicurezza di emissione ed esposizione a queste sostanze. Per far ciò sono stati presi in considerazione tutti i possibili scenari di esposizione, incluso quello per l'ingestione di cibi ad alto contenuto di metalli pesanti. **ENTI INTERNAZIONALI DI RICERA SUI CONTAMINANTI ALIMENTARI** **EFSA (European Food Safety Authority)** Organo di consulenza specialistica per Commissione Europea, Parlamento Europeo e Stati membri dell\'UE per decisioni in materia di gestione del rischio, relativo alla sicurezza del cibo e dei mangimi (es sostanze regolamentate: fitofarmaci e additivi alimentari) **FAO (Food and Agricolture Organization)** [Agenzia specializzata ONU]: accrescere i livelli di nutrizione, aumentare la produttività agricola, migliorare la vita delle popolazioni rurali e contribuire alla crescita economica mondiale. [FAO e OMS]: prodotto documento congiunto sulla sicurezza dell'utilizzo degli additivi alimentari; **OMS (Organizzazione Mondiale della Sanità - WHO)** [Agenzia specializzata ONU per la salute]: raggiungimento da parte di tutte le popolazioni del livello più alto possibile di salute, definita nella medesima costituzione come condizione di completo benessere fisico, non soltanto come assenza di malattia o di mentale e sociale, e infermità. **CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI** ------------------------------ Per conservare il campione dobbiamo valutare diversi aspetti come: - Il contenitore da utilizzare - Il materiale del contenitore - La temperatura a cui conservarlo Tra i vari tipi di contenitore possiamo trovare: - Contenitori in plastica - Contenitori in vetro - Contenitori in parafilm Per il mantenimento del campione ad una determinata temperatura abbiamo: - Refrigeratori che mantengono la temperatura tra i -4 e gli 8°C - Refrigeratori che mantengono la temperatura a -20°C - Refrigeratori che mantengono la temperatura a -80°C - Refrigeratori che mantengono la temperatura a temperature inferiori ai -100°C **PREPARAZIONE DEL CAMPIONE** ----------------------------- La preparazione del campione rappresenta la seconda fase delle operazioni preliminari, nonché una delle parti fondamentali del processo analitico. Questa parte del metodo analitico, viene definita come quel procedimento che va a rendere il campione adatto alla tecnica prescelta (una delle più utilizzate è l'estrazione che viene scelta in base alla natura delle varie variabili). Per rendere il campione adatto ad un determinato processo si può intervenire su diversi parametri: - Solvente e pH - Concentrazione - Forma molecolare rilevabile - Assenza di interferenze In questa fase sarà necessario andare a rispondere a delle domande fondamentali per poter proseguire poi con le analisi, ovvero: - COSA?= Con questa domanda si va ad [individuare il target delle analisi]; quindi, se stiamo andando a trattare piccole molecole (polari, apolari, anfotere) o grandi molecole (proteine amido). Quindi cosa si va a cercare all'interno di un campione. - DOVE?= [dov'è contenuto] il nostro analita e [quale parte della matrice dobbiamo andare ad utilizzare] (Nel caso di sistemi complessi, come piante o tessuti animali, bisogna andare a selezionare bene la parte nella quale vi è la maggiore probabilità di trovare la presenza dei composti) - COME?= il [selezionamento della tecnica di estrazione più efficiente]. A questa domanda si possono dare diverse risposte che variano in base alla natura del campione e dell'analita, dalle analisi che l'operatore può effettuare e dagli strumenti. L\'estrazione dei composti è influenzata: - Dalla solubilità in combinazione con altri soluti - Dai vari composti della matrice vegetale - Dal solvente utilizzato per solubilizzare i principi attivi Le scelte strategiche quindi si possono fare in funzione di: - Natura del quesito analitico= in base alla richiesta possiamo attuare analisi qualitative e/o quantitative, analisi di tracce e analisi a multicomponente - Natura del campione= il campione può presentare un diverso stato (solido, liquido o gassoso), una diversa complessità (semplice o complesso), una diversa interazione analiti-matrice e una presunta concentrazione degli analiti differente - Natura dell'analita= questo fattore va ad influenzare le caratteristiche chimico-fisiche, la reattività e la rivelabilità dell'analita - Strumentazione analitica disponibile= non tutte le tipologie di estrazioni sono compatibili con tutte le strumentazioni, infatti, bisogna andare a valutare la sensibilità dello strumento da utilizzare **TIPOLOGIE DI ESTRAZIONE** Esistono due tipologie di estrazioni. [Estrazioni convenzionali]: - **Estrazione liquido-liquido (LLE)**= È una delle tecniche più utilizzate poiché è semplice sia a livello operazionale, sia a livello strumentale, infatti, basta un imbuto separatore e l'operazione (che generalmente richiede un paio di minuti) può̀ essere applicata sia a impurezze presenti in tracce sia ai costituenti principali. Quest'estrazione si basa sulla distribuzione del soluto tra due liquidi essenzialmente non miscibili di e sulle caratteristiche chimiche delle sostanze da separare. All'equilibrio, il soluto sarà distribuito tra il solvente e la soluzione in una proporzione fissa secondo un coefficiente di ripartizione o distribuzione K -\> Dunque, in questa tecnica, il componente in esame si trasferisce da una fase (la sua matrice) più diluita e meno affine, ad un'altra che è più affine. La capacità del secondo soluto di legarsi più facilmente con il soluto permetterà l'utilizzo una quantità inferiore del liquido, per questo motivo sarà più concentrato e l'estrazione finale sarà più semplice e veloce. Il soluto, oltre che separarsi con la sua matrice, si separerà anche delle sostanze interferenti. Mediante tale tecnica è possibile: - L'identificazione di una sostanza sulla base del coefficiente di ripartizione - L'arricchimento di un componente - Attuare una separazione (anche di due sostanze che hanno punti di ebollizione vicini, cosa non fattibile tramite la distillazione) - Lo studio di equilibri in soluzione - **Estrazione solido-liquido (dissoluzione)** = è un'estrazione da campione solido (finemente triturato) mediante un solvente liquido (la polarità, o apolarità, del solvente sarà uguale a quella dei componenti) che a seguito del processo verrà poi eliminato mediante filtrazione, decantazione o centrifugazione. Questa tecnica può avvenire anche attraverso l'utilizzo di solventi chimicamente attivi, ovvero, vengono utilizzate sostanze che vanno a reagire chimicamente con il compost da estrarre tramite l'aggiustamento dei parametri chimici come pH e forza ionica. - **Estrazione solido-liquido continua (Soxhelt)**= Nelle tecniche di estrazione la viscosità ( è l'attrito interno ed esprime la maggiore o minore facilità di scorrimento di uno strato rispetto a un altro adiacente, inoltre, viene utilizzata come indice di resistenza alle deformazioni) si oppone al passaggio del solvente verso gli strati più interni del campione solido, per questo motivo, l'obiettivo della tecnica soxhelt è quello di ridurre la viscosità del solvente, a parità di polarità. Questo può avvenire nel momento in cui si va ad aumentare la temperatura, rispettando però i limiti di ebollizione del sovente, di stabilità termica degli analiti e di stabilità termica del campione - **Estrazione in fase solida (SPE)**= le tecniche preparative di questa estrazione sono ormai ampiamente diffuse in campo alimentare a causa della crescente richiesta di metodi pratici e veloci, ma anche altamente selettivi. Nell'ambito alimentare troviamo tre principali aree di applicazione: - Analisi di additive (dolcificanti artificiali, coloranti, aromi, ecc.) - Analisi di sostanze nutritive (carboidrati, vitamine, colesterolo, acii, organici, lipidi, ecc.) - Analisi di residui (pesticidi, erbicidi, tossine) - [Polari (fase normale)=] sono tipicamente usate per interagire con composti polari disciolti in un solvente organico non polare (etilacetato, n-esano, ecc.). Infatti, l'omogenizzazione della matrice e la sua estrazione con solvente organico sono condizioni spesso ricorrenti, le quali già predispongono l'analita al meccanismo dell'estrazione polare. Tali fasi offrono la possibilità di ritenzioni selettive, quali, legami di tipo dipolo-dipolo (CN) o ponti idrogeno (Diol, ammino) ed anche una riproducibilità nella qualità di queste interazioni - [Apolari (fase inversa)=] queste fasi sono le più utilizzate, in particolar modo, la C18, è spesso la prima ad essere provata per cercare di sostituire la LLE con quella SPE. In molte applicazioni, la colonna SPE, è impiegata come filtro chimico che rimuove gli interferenti non polari, difatti, la stessa colonna, può essere utilizzata per estrarre composti polari da una matrice lipofila oppure vicercersa. Tuttavia, per composti eccesivamente lipofili, si possono riscontrare dei problemi nel rilascio degli analiti. - [Scambio ionico (ion exchange)=] in questo caso, le colonnine scambiatrici, si sono rivelate molto utili nella preparazione all'analisi di campioni come pesticidi, erbicidi, tossine, ecc., che solitamente contengono un gruppo funzionale ionizzabile. In particolare, lo scambio ionico, ha un'enorme potenzialità dato il suo meccanismo che conferisce un elevato stato di selettività e quindi ad un'elevata pulizia degli estratti. Si possono perciò estrarre con questo meccanismo sia composti basici ( fasi a scambio cationico) che composti acidi ( fasi a scambio anionico), sia da matrici acquose sia da solventi organici (come metanolo o diclorometano). Le fasi legate coprono un range di scambiatori ed anionici deboli e forti: - [Immunoaffinità (IA-SPE)=] si basa sulle interazioni che si formano tra una sostanza ed il relativo ligando, per questo motivo è importante conoscere le caratteristiche chimico fisiche della sostanza in esame, tuttavia, in determinate condizioni deve essere possibile il rilascio dei legami per far tornare in soluzione l'analita. Tale estrazione è utile nella separazione delle biomolecole, poiché si può andare a sfruttare il legame selettivo tra un enzima e il suo substrato, tra ormoni e recettori, o tra antigeni e anticorpi (in questo caso si usa il termine Immunoaffinità). In campo alimentare è molto utilizzata per l'estrazione di micotossine da alimenti. La fase stazionaria solida (di solito composta da cellulosa, gel di agarosio o di agarosio-acrilamide) deve quindi avere le seguenti caratteristiche: - contenere molti ligandi specifici per il composto - essere stabile - avere solo interazioni deboli con il composto (in modo da non comprometterne l\'eluibilità) - avere buone capacità di flusso Il pretrattamento dei prodotti da sottoporre a questa estrazione varia in base all'alimento da trattare: - [Latte=] generalmente si usa SPE in fase inversa o a scambio ionico. Il campione può essere diluito con acqua o con metanolo (max 1:2) e alcune procedure possono richiedere di far precipitare le proteine (trattamento acido con HCl H2SO4 o acido tricloroacetico). Dopo la precipitazione vi sarà la centrifugazione e in fine l'utilizzo del surnatante in SPE - [Vino, birra e bevande acquose=] queste possono essere processate senza pretrattamento, ad eccezione di una diluizone per portare l'etanolo a valori inferiori dell'8% e, se necessario, verranno rimossi i solidi in sospensione tramite filtrazione - [Succhi di frutta=] questi possono essere processate senza pretrattamento, ad eccezione di una centrifugazione per separare eventuali solidi e, se i succhi sono particolarmente viscosi, dovranno essere diluiti con acqua o tampone per aggiustare il pH. - [Carni e pesce=] vengono omogeneizzati con solvente acquoso o miscela idroalcolica e potrebbe essere necessaria una digestione acida della componente proteica ,inoltre , per lavorare in fase inversa, sarà necessaria una saponificazione dei lipidi. Il campione verrà poi centrifugato e il surnatante usato in SPE. Nel caso di estrazione con solventi apolari si può lavorare in fase normale - **Microestrazione in fase solida (SPME)**= Questa tecnica viene utilizzata nell'ambito delle estrazioni volatili, ovvero quelle analisi che a temperatura pressione ambiente si trovano in fase gassosa o in equilibrio tra fase gassosa e un'altra (soluzione, solida, dispersione). Queste analisi presentano una determinata frazione, chiamata spazio di testa, la quale indica la porzione di gas in equilibrio con una fase liquida o solida all'interno di un contenitore ermeticamente chiuso. Questo spazio è influenzato dalla temperatura alla quale è tenuto il campione e, al raggiungimento delle condizioni di equilibrio, quest'ultimo è soggetto ad una cinetica che varia, oltre che con la temperatura, anche con la composizione della matrice, la concentrazione dell'analita e il volume del contenitore porta campione. L'SPME per le estrazioni di analiti volatili può poi essere accoppiata sia ad un GC che ad un HPLC ed è un tipo di estrazione economica, rapida e che non necessita dell'utilizzo solventi (è solvent-free). Questa va a sfruttare il potere adsorbente di una fibra di silice fusa (serve da supporto) ricoperta da una fase stazionaria (polimero) appropriata, ed è utile per l'estrazione di composti organici da soluzioni acquose o solidi a livelli inferiori del ppb (in trace). La fibra si applica all'estremità di un capillare, il quale può scorrere all'interno dell'ago di una siringa, e il suo scorrimento viene gestito da un dispositivo. Invece, la fibra in silice fusa, dev'essere contenuta anch'essa all'interno di un ago, il quale serve a forare il setto del contenitore porta campione, e viene fatta muovere in quest'ultimo tramite un sistema di molle. Nella porzione terminale della fibra è contenuto il materiale assorbente. Per quanto riguarda invece l'isolamento dei volatili provenienti da una matrice mediante l'estrazione SPME , si possono utilizzare due tecniche: - [Spazio di testa statico]= il campione sarà chiuso in un contenitore grazie ad un setto a tenuta nel quale l'ago del sistema può entrare ed introdursi nello spazio di testa del campione, quindi, si andrà ad immergere nella fase di vapore sovrastante al campione. Così facendo si avrà la possibilità di studiare campioni solidi e soluzioni, inoltre, avremo un equilibrio di adsorbimento più veloce [Per] - [Immersione]: in questo caso la fibra è completamente immersa nella matrice liquida mentre i tempi di adsorbimento sono più lunghi e vi è la possibilità di utilizzare meno tipologie di campione - Scelta delle modalità di estrazione - Scelta della fase di rivestimento - Ottimizzazione dell'estrazione - Tempo - Agitazione= possono accelerare il trasferimento dell'analita alla fibra, tuttavia, agitazioni troppo elevate portano alla riduzione del livello di riducibilità - pH - Temperatura - Sali= il loro uso favorisce l'estrazione per alcune tecniche - Ottimizzazione del desorbimento= il desorbimento può essere termico(spessore della fibra, tempo nell'iniettore, tempo di iniezione) o con solvente (dinamico, per analiti poco trattenuti e fibre con spessore sottile, o statico, per fibre con spessore maggiore) [Estrazioni non convenzionali]: - **Estrazione accelerata con solvente (ASE)**= L'estrazione con solvente tradizionale, pur garantendo ottime prestazioni, presenta alcuni inconvenienti tra cui: - Tempi di trattamento lunghi - Utilizzo di elevate quantità di solvente - Scarsa adattabilità all'automazione - **Estrazione assistita da ultrasuoni (UAE)**= è un metodo di estrazione molto efficiente poiché permette di risparmiare soldi e tempo, andando però a generare estratti di alta qualità, i quali verranno poi utilizzati per alimenti, integratori e prodotti farmaceutici. Ciò avviene perché la sonicazione, utilizzata maggiormente per isolare i composti bioattivi dalle piante, avviene in tempi molto brevi e riesce a raggiungere un'estrazione completa portando a rendimenti molto alti - **Micro estrazione liquido-liquido dispersiva (dLLME)**= è una tecnica giovane che ha catturato l'attenzione del mondo della ricerca grazie agl'indiscutibili vantaggi che porta nonostante la sua semplicità. È un tipo di estrazione liquido-liquido su scala micrometrica che inizialmente fu pensata per la determinazione di idrocarburi e pesticidi in acqua ma che, ad oggi, è stata adattata a diverse applicazioni grazie a delle modifiche del suo protocollo, il quale è stato adattato con lo scopo di massimizzare l'efficacia della metodica e di enfatizzarne il carattere green, siccome, a differenza della LLE, le quantità di materiale sono inferiori. Questa metodica, inoltre, permette l'estrazione di più analiti che presentano caratteristiche di polarità simili, andando così ad unificare il recupero in un unico step. Il principio alla base della DLLME è abbastanza simile a quello della LLE, infatti, si fonda sulla formazione di un sistema ternario composto dal campione acquoso (in cui viene disciolto un sale) al quale viene addizionata una miscela di solventi organici (fase estraente). Per ottimizzare tale tecnica bisognerà monitorare: - La quantità di sale (meglio un sale inerte) - Il pH della soluzione (meglio usare un tampone) - La tipologia di disperdente (i.e. 2-pronolo, metanolo, acetonitrile, acetone) - La tipologia di fase estraente (cloroformio, diclorometano, esano) +-----------------------------------+-----------------------------------+ | **VANTAGGI** | **SVANTAGGI** | +===================================+===================================+ | L'estrazione avviene con pochi | Per matrici complesse, come | | microliti di solvente organico | sangue e tessuti, è richiesto un | | (50-100 microliti) | pretrattamento del campione per | | | allontanare le proteine e i resti | | | del tessuto che potrebbero andare | | | a rendere impossibile | | | un'estrazione efficiente. | +-----------------------------------+-----------------------------------+ | La quantità di campione richiesta | Richiede uno studio di | | ha un range molto ampio dai 100 | ottimizzazione dei vari parametri | | μL ai 5 mL, a seconda della | (scelta dei solventi, dei loro | | complessità del | volumi e del pH), che può | | | | | Campione | risultare molto dispendiosa in | | | termini di tempo | +-----------------------------------+-----------------------------------+ | Ha un alto fattore di | Riproducibilità | | arricchimento (fino a 50-100 | | | volte) | | +-----------------------------------+-----------------------------------+ | Tempi di estrazioni molto brevi | La tecnica è piuttosto recente e | | (5 massimo 20 minuti) | mancano ancora molte applicazioni | | | su alcune matrici e analiti | +-----------------------------------+-----------------------------------+ | Tecnica semplice che può essere | Utilizzo di solventi organici | | attuata con strumenti e solventi | altamente tossici e limitati | | comuni | | +-----------------------------------+-----------------------------------+ | Va ad aumentare la selettività | | | per gli analiti di interesse | | +-----------------------------------+-----------------------------------+ | Può essere accoppiata con altre | | | tecniche estrattive per avere una | | | pulizia del campione più | | | efficiente | | +-----------------------------------+-----------------------------------+ - [immiscibili con l\'acqua] per consentire la separazione di fase e la partizione dell\'analita - con una densità inferiore a quella dell\'acqua per poter galleggiare sulla superficie - [a bassa volatilità] (caratteristica che si limita al solvente organico) per evitare la perdita di solvente per evaporazione - [con un elevato coefficiente di ripartizione] per garantire una distribuzione preferenziale nella goccia organica. - [«dispersibili» a seguito dell'aggiunta di un disperdente organico] (questo passaggio forma una soluzione torbida che aumenta drasticamente la superficie di contatto tra il solvente organico e il campione acquoso) - [Con punti di fusione e di congelamento bassi] (nell\'intervallo 10-25 °C) per rendere fattibile la fase di congelamento - [Compatibili con i metodi analitici strumentali], poiché, in caso contrario, dovranno essere prima evaporati, il che può limitare la scelta (questa ulteriore fase di evaporazione richiede tempo e fatica, complicando le procedure di estrazione) - [economici e disponibili] per rendere la tecnica economicamente vantaggiosa - **Estrazione in fase solida miniaturizzata (µSPE)**= è una tecnica di estrazione che presenta le stesse caratteristiche della classica SPE ma in versione miniaturizzata, infatti, in questo tipo di estrazione si andrà a lavorare con volumi micrometrici (da 200 a 10 microliti) e senza l'utilizzo di dispositivi accessori dispendiosi. Questa metodica, inoltre, è compatibile con analisi che richiedono pochi volumi (pozzetti di kit Elisa). Questa procedura presenta diversi step così come la sua versione classica (attivazione, condizionamento, carico, lavaggio, ed eluizione), che permettono la fissazione e successiva eluizione delle molecole target. Ma, a differenza delle normali SPE, in questo caso il campione viene fatto passare più volte attraverso la cartuccia (fase stazionaria) permettendo di lavorare con volumi ridotti e di arricchire il campione **VANTAGGI** **SVANTAGGI** ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ -------------------------------------------------------------------------------------------------- Il campione è eluito completamente usando piccoli volumi di solvente La varietà delle fasi adsorbenti non è comparabile a quella della SPE classica La quantità di campione richiesta è 5-100 volte inferiore rispetto a quella necessaria per SPE L'efficacia dell' estrazione dipende molto dall'esperienza dell'operatore I tempi di estrazione inferiori a 5 minuti La tecnica è piuttosto recente e per alcune applicazioni mancano dei materiali adsorbenti adatti La tecnica è semplice e user-friendly, siccome può essere attuata tramite una semplice Gilson L\'effetto matrice è abbattuto notevolmente ed è comparabile ai risultati che si possono ottenere con una SPE classica - **Microestrazione tramite fase adsorbente (MEPS)**= questa tecnica costituisce una variante moderna, e potenziata, della tradizionale SPE, infatti, rispetto a quest'ultima, è più veloce (tempi di estrazione inferiori ai 5 minuti) e l'assorbente è integrato direttamente in una siringa che può essere interfacciata ad un sistema automatizzato. Nella MEPS, dunque, il materiale assorbente (1-4mg) è inserito direttamente nel cilindro della siringa (100-250 μL) oppure tra il cilindro e l'ago come una cartuccia, la quale, oltre a poter essere riutilizzata (5-10 volte), può essere impaccata o rivestita con lo scopo di garantire adeguate condizioni di estrazione, che variano a seconda degli analiti da determinare. Come adsorbente si possono impiegare una vasta gamma di materiali, alcuni anche già comuni nella SPE come, ad esempio, materiali a base di silice (C2, C8 e C18), scambiatori a cationi (SCX), copolimeri polistirene-divinilbenzene (PS-DVB) o altri polimeri. Il principale vantaggio di quest'estrazione è quello di impiegare piccoli volumi operativi (da 10 μL a 250 μL), ciò la rende più economica ed ecologica di altre tecniche, inoltre è anche più semplice ed user-friendly (soprattutto se collegata ad un autocampionatore). In questa metodica, dunque, il campione verrà completamente eluito mediante l'utilizzo di piccoli volumi di solvente, consentendo così un interfacciamento semplificato con le valvole di gas cromatografia o cromatografia liquida. La MEPS si può anche utilizzare per introdurre gli analiti in colonna GC. - **Estrazione tramite solventi eutettici**= avviene tramite l'utilizzo di solventi eutettici profondi (DES), chiamati anche miscele a bassa temperatura di transizione (LTTM), ovvero dei solventi composti da due o più componenti di cui almeno un donatore ed un accettore di legame idrogeno. Questi composti interagiranno tra di loro andandosi ad autoassociarsi con lo scopo di formare una misciela eutettica con una temperatura di fusione molto inferiore rispetto a quella dei suoi componenti, ad essere utilizzati sono i legami ad idrogeno poiché si presume che insieme ad essi possano svolgere un ruolo anche le forze di Van der Waals. **ESEMPIO DI APPLICAZIONE DELLE MICROESTRAZIONI (dLLME-μSPE)** La valutazione degli IsoP è piuttosto complessa, poiché hanno un intervallo di concentrazione molto basso (da picogrammi a nanogrammi). Vari studi hanno riportato delle correlazioni tra i livelli di IsoP e diverse patologie, tra cui diabete, aterosclerosi, cancro, malattie neurodegenerative (il cervello è particolarmente sensibile al danno ossidativo perché utilizza grandi quantità di ossigeno), processi infiammatori cronici e invecchiamento. Di conseguenza, gli IsoP sono stati indicati come prognostici cardiovascolari, per marcatori disturbi diabete, aterosclerosi, cancro e malattie neurologiche. L'estrazione di queste molecole inizia con la preparazione del campione: - Vengono raccolti dei campioni di urina da volontari in Falcon da 50 mL. - Un'aliquota da 1 mL viene trasferita in un'eppendorf da 2mL; - Vengono poi aggiunti 50 μL di β-Glucoronidasi - Il campione verrà poi messo in incubazione per 2h a 37°C; - Dopo l'incubazione vi sarà una centrifugazione a 10'000 rpm per 10 min e il successivo recupero del surnatante Dopo aver ottenuto il campione (il surnatante) si procederà in base al tipo di estrazione che si vuole attuare. **CAMPIONE SOLIDO** Se si vuole analizzare tutto il campione basterà attuare un processo di dissoluzione, in caso contrario, si procederà in due modi differenti. Nel caso in cui si debba analizzare la parte volatile del campione si potranno utilizzare tre tecniche divere, ovvero: - Spazio di testa - Desorbimento termico - Microestrazione in fase solida Se invece non si vorrà analizzare la parte volatile si procederà con l'utilizzo di altre 5 metodiche: - **Estrazione liquido-solido** - **Estrazione con Soxhelt** - **Estrazione con fluidi supercritici** - Estrazione liquida a microonde - Sonicazione Andando a considerare la natura della coppia analita-matrice bisognerà individuare il solvente capace di dissolvere l'analita ma non la matrice **CAMPIONE LIQUIDO** Se non si vuole analizzare l'intero campione basterà estrarre selettivamente i componenti di interesse, questo lo si può fare mediante tre tecniche diverse: - Estrazione liquido-liquido - Estrazione in fase solida - Cromatografia flash Dopo aver attuato una di queste metodiche, bisognerà andare a valutare se il campione è adatto, o meno, per l'analisi diretta (questo passaggio è il primo che viene attuato per l'analisi di un campione intero. Per non esse adatto quest'ultimo sarà o troppo concentrato o troppo diluito. Nel primo caso si andrà a diluire, nel secondo caso si possono utilizzare due metodiche: - Estrazione liquido-liquido - Estrazione in fase solida **POLIMERI A STAMPO MOLECOLARE** -------------------------------- Lo stampo molecolare è un processo di polimerizzazione in cui monomeri specifici, scelti in base ai loro gruppi funzionali, vengono fatti auto assemblare intorno ad una molecola stampo in presenza di crosslinker. Successivamente, la molecola stampo viene rimossa dal polimero prodotto, andando così a formare delle cavità complementari ad essa sia in forma, sia in funzionalizzazione, le quali andranno poi a legare composti omologhi o strutturalmente simili alla molecola stampo. I polimeri a stampo molecolare (MIP) sono polimeri che presentano una «memoria» della forma e dei gruppi funzionali, a partire da una molecola stampo. Questo materiale è progettato per riconoscere selettivamente la molecola di modello utilizzata nel processo di stampa, anche in presenza di composti con strutture e funzionalità simili a quelle del modello. Molecolarmente, il polimero impresso, agisce essenzialmente come un anticorpo. La miscela dei MIP è composta da: - Modello target dell'analita= possono essere farmaci, aminoacidi, polifenoli, pesticidi, aflatossine, ecc. - Monomero funzionale= utilizzati in eccesso rispetto al modello (1:4) - Crosslinker= dimetacrilato di glicole etilenico (egdma) - Solvente= toluene, cloroformio, diclorometano, Acetonitrile - Iniziatore radicale= l'AIBN La sintesi dei polimeri richiede tre fasi: 1. Formazione di un complesso (covalente o non covalente) tra monomero funzionale e molecola del modello= - Complesso Covalente: necessita della formazione del legame monomero-modello, quest'ultimo, è più stabile e ciò rende il processo di stampaggio più preciso. Tuttavia, la sintesi di tale complesso è spesso problematica e poco economica, inoltre, il numero di legami covalenti reversibili disponibili è limitato, ed è difficile andare a rimuovere il modello dal polimero. Una volta che avvenuto il legame covalente la polimerizzazione può avvenire tramite diversi metodi. - Complesso non Covalente: In questo caso non è necessaria la formazione del legame monomero-modello prima della polimerizzazione, per questo motivo è più facile rimuovere il modello dal polimero (il complesso presenta un legame piuttosto debole). Questo modello, tuttavia, risulta essere meno preciso e presenta la necessità di andare a valutare le condizioni di polimerizzazione, per facilitare la formazione di interazioni non covalenti nella miscela di reazione. Il legame delle sostanze bersaglio e il loro rilascio è veloce ma meno selettivo, infatti, la presenza di un eccesso di monomeri all'interno de modello porta alla formazione di siti di legame non specifici Esistono 3 metodi di polimerizzazione per i MIP: - Riscaldamento termico (24 ore) - Bagno ad ultrasuoni (2h) - Sonda ad ultrasuoni ( pochi min) **CARATTERIZZAZIONE MORFOLOGICA E CHIMICA** Morfologica: Avviene mediante= - Microscopia ottica (per verificare l\'integrità naturale del polimero) - Microscopia elettronica a scansione (per visualizzare i macropori dei polimeri) - Porosimetria di assorbimento di azoto (per determinare l\'area superficiale specifica, la distribuzione della dimensione dei pori del volume specifico dei pori, ecc.) - Porosimetria ad intrusione di mercurio (adatta per la caratterizzazione di pori di grandi dimensioni) Chimica: avviene mediante microanalisi elementari, FT-IR, NMR allo stato solido **POLIMERI NON A STAMPO (NIP's)** I NIP's vengono sintetizzati senza l'aggiunta di un modello target dell'analita, in modo tale da essere utilizzati come riferimento per il confronto tra le caratteristiche dei polimeri bersaglio a stampo molecolare. **VALUTAZIONE DELLE PRESTAZIONI DEI MIP** Può avviene mediante: - Esperimento vincolante= come, ad esempio, l'isoterma di adsorbimento dei MIP e NIP per l\'analita del modello, il quale sfrutta l'equazione [\$Q = \\left\\lbrack \\frac{(Ci - Ce)}{m} \\right\\rbrack\*V = \\frac{Q\*MIP}{Q\*NIP}\$]{.math.inline} - Test selettivi= come, ad esempio, l'adsorbimento vincolante dei NIP e dei MIP per il modello analita interferente. **VANTAGGI DEI MIP** Hanno un'elevata selettività e affinità per i target molecolari utilizzati nella procedura di imprinting, inoltre, rispetto ai sistemi biologici come proteine e acidi nucleici i MIP hanno: - Maggiore robustezza fisica - Una unga durata di conservazione - Un minor costo di sintesi - Un'inerzia verso acidi, basi, ioni metallici e solventi organici - Un'alta resistenza a temperature e pressioni elevate - Maggiore forza **APPLICAZIONI DEI MIP** I MIP sono materiali eccellenti che presentano un'elevata selettività e sono ampiamente utilizzati per: - La preparazione dei campioni con metodi di analisi biologica - Le Estrazioni in fase solida - La cromatografia - Il veicolo di farmaci - Le reazioni di catalisi - L'applicazione di sensori In particolar modo, l'SPE basata sul MIP è stata applicata a diversi integratori alimentari che presentano recuperi apprezzabili e effetto a bassa matrice (ME \