Récepteur avec activité kinase - Chapitre 7

Récepteur avec activité kinase I -- Récepteur tyrosine Kinase 1. Voie des MAP Kinases Il y a 14 sous familles, par N terminale extracellulaire et C terminale intracellulaire. Domaine tyrosine kinase permet de phosphorylé les tyrosine. Plusieurs domaines permettant la liaison des ligands. Récept...

Récepteur avec activité kinase I -- Récepteur tyrosine Kinase 1. Voie des MAP Kinases Il y a 14 sous familles, par N terminale extracellulaire et C terminale intracellulaire. Domaine tyrosine kinase permet de phosphorylé les tyrosine. Plusieurs domaines permettant la liaison des ligands. Récepteur de l\'EGF : récepteur et liguant qui interviennent dans la différentiation cellulaire la multiplication cellulaire, la division cellulaire etc Récepteur INSR : récepteur de l\'insuline, Ce sont des récepteur directement formés en dimères. Ce sont des structure extrêmement stable, les deux chaînes polypeptidique sont associés l\'une à l\'autre via des pont disulfure qui les stabilisent. Dans les même famille que les récepteur de l\'insuline il y a l\'IGF1 formé par le foie. 2. Activation des récepteurs RTK Lorsque les ligands se fixent sur le récepteur (chaque récepteur fixe un ligand), lorsqu\'ils ont tous fixés un ligand ils se dimérisent. Ce qui fait que l\'on possède deux récepteurs et deux ligands. Pour activer les récepteurs il faut réaliser une phosphorylation : D\'abord trans-activation de l\'activité kinase, chaque domaine catalytique est phosphorylé par le récepteur voisin. A ce stade là le récepteur est seulement pré-activé. Ensuite autophosphorylation du récepteur sur des tyrosines qui phosphoryle la partie C terminale. La dimérisation du récepteur induit l'activation de l'activité tyrosine kinase du récepteur. 3. Activation des voies de signalisation Fixation des protéines médiatrices (M1, M2,...) sur les tyrosines phosphorylés. En général il y a 3 protéines qui se fixent. Puis cascade d\'activation des kinases. Entre M3 et Kinase 1 interactions protéines protéines pour changer la conformation de la Kinase 1 et l\'activé, Kinase 1 phosphoryle la kinase 2 et l\'active etc. Systématiquement pour ces récepteurs impliqués dans la multiplication et la différenciation des cellules régulation de l\'expression des gènes. De façon général les RCP sont plus retenus pour une action court terme plutôt qu\'une action à long terme. Alors que ces récepteurs à activités kinases ont une activité plutôt à long terme qu\'à court terme. 4. Récepteur de l\'EGF Ils impliquent la voies des MAP Kinases, ce sont des kinases impliqués dans les systèmes mitogènes. MAP kinase : - MKKK : MAP Kinase Kinase Kinases (MAP-3K) Phosphorylation - MKK: MAP Kinase Kinase ( MAP-2K) Phosphorylation - MK : MAP Kinase Activation des facteurs de transcription et expression des gènes → Multiplication et Différenciation cellulaire EGF interagit avec GERB2 et l\'active il va activer la petite protéine SOS qui va être hydrolysé par RAS et GDP hydrolysé par RAS en GTP. RAS interagit avec la protéine RAF, lorsqu\'elle n\'est pas en interaction elle n\'est pas active, lorsqu\'elle est active elle active K1. RAF phosphoryle la deuxième kinase qui lorsqu\'elle est active phosphoryla la troisième (ERK1/ERK2) avant d\'arriver au facteur de transcription et de les phosphoryler. Les différentes protéines médiatrices : - Grb2 - SOS - Protéine RAS ( famille des produite protéine G, c\'est la troisième protéine médiatrice activé par les facteur de l\'EGF). - Super famille des protéines GTPase plus de 15° membres chez l\'Homme - 6 sous famille Petites protéines G (petites GTPases) : - une grande famille (\~ 100 types) - protéines monomériques comme les Ras, Rab, Rho, Ran, Arf II- Récepteurs sans activité kinase 1. Les récepteurs aux cytokines Sont associées à des protéines kinases cytoplasmiques (souvent Tyr kinases, parfois Ser/Thr kinases) Dans cette famille il n\'y a pas de récepteur catalytique au niveau de la partie C terminale. La protéine JAK vient se fixer au niveau intracellulaire, les ligands se fixent ce qui rapprochent les récepteurs l\'un de l\'autre et ils se dimérisent. Les kinases réalisent de la transphosphorylation chaque kinase phosphoryle la protéine JAK de l\'autre récepteur. Pour qu\'un récepteur soit actif faut qu\'il soit de nouveau phosphorylé, on a de nouveau une autophosphorylation qui va se faire par l\'intermédiaire de la protéine JAK, c\'est ce qui va permettre de recruter les protéines médiatrices à domaine SH2 qui se fixe sur les phosphates. La protéine JAK va aller phosphoryler les protéines médiatrices qui se sont fixer sur les phosphates, les protéines médiatrices phosphorylés se détachent et vont agir au niveau du noyau. 2. Le récepteur de l\'IL-6 2. 1. L 'activation des facteurs STAT3 Protéines kinases JAK constitutivement associées aux récepteurs. Puis dimérisation du récepteur et activation des protéines JAK Trans-phosphorylation, enfin Auto-Phosphorylation du récepteur. 2. 2. Translocation des facteurs STAT3 Protéine médiatrice : Les facteurs de transcriptions Stat 3 sont recrutés au niveau du promoteur via leur domaine SH2. Les protéines Kinases JAK phosphorylent les facteurs Stat 3 sur un résidu tyrosine. Détachement de la protéine médiatrice phosphorylée, les protéines STAT 3 se dimérisent et trans loquent vers le noyau. 2. 3. Régulation transcriptionnelle par STAT3 Parmi les gènes cibles de Stat3 se trouvent de nombreux gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire III- Arrêt du signal transmis par les récepteurs avec ou sans activité kinase Désensibilisation homologue, puis internalisation par endocytose avec une phase de recyclage et une phase de dégradation. Le signal permettant la dégradation vers les lysosome est l\'ubiquitine. IV- Techniques d\'études des voies de signalisation des récepteurs membranaires On travaille sur des cellules non cancéreuses. En général entre 100 mille et 400 mille cellules par puits. On applique des ligand (agoniste avec ou sans antagoniste) : Différentes concentrations ( un puits avec du ligand et un puits sans ligand) : 10-12M à 10-5M Incubation pendant un temps fixe : par exemple 15 min. Il y a toujours un petit peu d\'activité enzymatique dans la cellule même si il n\'y a pas de stimulateur on parle de niveau basal. Lorsque l\'on fait varier les concentrations on ne fait pas varier le temps d\'incubation et inversement. Une fois que les stimulation sont faite on lyse les cellules à l\'aide de tampon (qui peuvent contenir du détergent par ex) On centrifuge le lysa et on conserve seulement le surnageant qui correspond au cytoplasme cellulaire. Enfin on réalise un dosage d\'AMPc et d\'IP3. On peut également rechercher la présence de protéines phosphorylées. Un puits de culture pour chaque concentration. On peut également travailler sur cellule vivante, on regarde dans une boite de pétrie avec un microscope c\'est ce que l\'on appel travailler en direct. On peut mesurer la quantité de calcium et la quantité d\'AMPc. 1. Mesure de la production du 2^nd^ messager : Courbe concentration/Réponse 1. 1. Dosage Elisa  On fait coller l\'anticorps au fond d\'un puis puis on ajoute le cytoplasme (surnageant) qui doit contenir de l\'AMPc ou de l\'IP3, ils doivent se fixer sur les anticorps AMPc et les anticorps IP3. Présence d\'un anticorps anticorps qui dégrade le substrat et déclenche une coloration.  Courbe concentration réponse sont des courbes spécifique en réponse à l\'augmentation de la quantité de ligand. C\'est ce que l\'on appel une courbe sigmoïde. La partie la plus basse entre A et B se nomme la zone de seuil, très faible réponse physiologique (faible augmentation). Augmentation du ligand rapide entre B et C se nomme la phase exponentielle. Quand on continue à augmenter la concentration, on a l\'apparition d\'un plateau cette phase après E se nomme le plateau de saturation. On considère qu\'au niveau du seuil il n\'y a pas d\'effet. Au niveau de la phase plateau on considère que c\'est l\'effet maximum, on l\'appel Emax. A 50% du maximum on obtient l\'EC50 qui est la concentration du ligand utilisée pour avoir 50% de la réponse maximum. L\'EC50 presque égal à la constante de dissociation (KD), il peut donner une idée de l\'affinité de la molécule. Si on doit utiliser plus de ligand ça veut dire que l\'affinité est moins bonne. 1. 2. Imagerie calcique Pour pouvoir mesurer le calcium on utilise des chélateur de calcium qui vont fixer le calcium. En plus de ça les molécule vont fluorescer quand elles vont fixer le calcium. La sonde Fluo4 traverse les membranes toutes seule, lorsqu\'elle est sous forme fluo4-AM elle peut rentrer et sortir des cellules comme elle veut. Dans les cellules présence d\'estherase qui vont couper le groupement AM, forme fluo4 devient liposoluble et reste dans les cellules. Elle n\'est pas fluorescente, pour qu\'elle le devienne elle doit fixer le calcium. Après 7h d\'incubation on stimule la vois, ce qui augmente le calcium dans la cellule qui va se fixer à fluo4. Pour que fluo 4 soit fluorescente il faut l'exciter à 488nm, puis elle émettra une longueur d\'onde fluorescente à 520 nm. 1. 2. 1.2.1 Microscope à fluorescence Observe les cellules et on peut mesurer la fluorescence grâce aux variations de couleur. On dépose le liquide à la surface des cellules, et quelques minutes après on observe la fluorescence. En général quand on utilise cette technologie c\'est pour savoir rapidement si les cellules répondent au cible, pour faire des statistique il faut un nombre de cellules beaucoup plus importante on ne peut pas utiliser le microscope/ 1.2.2 Lecteur de plaque On a une plaque dans laquelle on a plusieurs puits, on a 96 puits, donc on peut réaliser des statistiques. Chaque puits correspond à une condition et donc à une concentration. On obtient une cinétique de réponse, c\'est à dire que l\'on mesure dans le temps la signalisation liée au calcium. Pour passer de la courbe cinétique réponse à la concentration réponse, on prend les valeurs qui sont au niveau des piques. On met la concentration des ligand sur l\'axe des X et la concentration de calcium sur l\'axe des Y. 2. Partenaires protéiques phosphorylés ou non (Western Blot) Quand on stimule les cellule on prépare des lysat cellulaire, celui ci à été traité avec des détergents pour charger les protéines en charge négatives, on utilise généralement le SDS. Les protéines migrent en fonction de leur poids moléculaire. Deuxième étape on transfère les protéine sur la nitrocellulose. On réalise ensuite une saturation des membranes, puis on met le premier anticorps et on laisse incuber, on réalise des lavages puis on met un 2 anticorps qui va reconnaître le premier et qui est porteur de molécules fluorescente ou d\'enzymes qui réalisent des colorations. Si l\'anticorps reconnaît bien les protéines d'intérêts on devrait avoir la présences de bandes sur le Western Blot. Via l\'EGF activation de la voie de phosphorylation des MAP kinase. 3. Interaction protéine-protéine ou Co-Immunoprécipitation Un récepteur activé doit interagir avec une protéine alpha G. On incube le lysat avec un anticorps dirigé contre une protéine, et on incube l\'ensemble avec des bille magnétique qui sont porteuses des protéines collante qui vont se coller aux parties constantes des anticorps. Si la protéine est fixé sur le premier anticorps, soit c\'est une molécule seul soit c\'est une molécule qui est en interaction avec une autre molécule. On précipite la protéine qui s\'associe c\'est donc la seule que l\'on aura dans le culot. On récupère le culot, on le lave on change la force électrostatique et toute les protéines se séparent les unes des autres. Si on obtient une autre protéine dans le culot c\'est quelle était lié à la première protéine. On révèle la présence de cette nouvelle protéine à l\'aide d\'une révélation en western blot. On renouvelle cette expérience pour toute les nouvelles protéines trouvées dans le culot. 4. Mesure en présence d\'inhibiteur Inhibiteur H89 dirigé contre les protéines PKA. Si on inhibe une enzyme et qu\' on bloque une réponse physiologique ça veut dire que l\'enzyme était nécessaire à la réponse physiologique. Avec inhibiteur kinase : diminution de la phosphorylation. Avec inhibiteur de la MAPKK → diminution de la pERK1/2 Avec inhibiteur de JAK → Diminution de pSTAT3 V- Pharmacologie Ligand endogène = ligand présent naturellement dans l'organisme Exemple : l'insuline, la noradrénaline... Site de liaison du ligand naturel = site orthostérique Un site allostérique ne se met pas à l\'endroit où le ligand doit se fixer. Un agoniste : molécule chimique reproduisant l\'effet du ligand endogène, c\'est une molécule qui se fixe sur le site orthostérique. Certain agoniste ont une affinité plus/moins importante que le ligand endogène. Ils induisent automatiquement une réponse biologique. Pour avoir une courbe sigmoïde il faut transformer la courbe en Log. Un antagoniste compétitif : molécule inhibant l\'effet du ligand endogène uniquement lorsque l\'on co-incube l\'agoniste avec l\'antagoniste, c\'est une molécule qui se fixe sur le site orthostérique et enlève l\'agoniste, il n\'y a aucun effet biologique. Inhibition de la réponse. Un antagoniste tout seul n\'aura pas d\'effet sur les cellules.