Chapitre 2 Cours Bio Mol S5 12 PDF

ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER Cours de Biologie Moléculaire Partie I Cycle : License Filière : Biotechnologies Options : Biotechnologie Animale et Végétale...

ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER Cours de Biologie Moléculaire Partie I Cycle : License Filière : Biotechnologies Options : Biotechnologie Animale et Végétale Pr. Zeineb ZIAN Année universitaire : 2024-2025  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER Chapitre II : La Réplication de L’ADN I. La Réplication de L’ADN La vie de la cellule se déroule entre deux mitoses. Chez les Mammifères, cette période dure en moyenne 30 heures bien qu’il y ait des cellules dont la vie soit très courte ou au contraire très longue. Durant ces trente heures la cellule traverse quatre phases : La phase G1 où le génome étant diploïde, chaque gène est représenté en deux exemplaires. La chromatine est accessible aux RNA-polymérases qui transcrivent les gènes en messagers, qui seront à leur tour traduits. Vers la moitié du cycle commence la réplication de l’ADN : les ADN-polymérases vont mettre environ 8 heures (phase S) pour recopier en double l’ADN de chaque chromosome. Durant cette phase la transcription est inhibée. Puis la cellule entre en phase G2 où chaque gène est représenté en quatre exemplaires. La chromatine est à nouveau accessible aux ARN-polymérases qui recommencent à transcrire. Enfin survient la mitose, qui donne naissance à deux cellules filles. Chacune recevra une des copies identiques de l’ADN de chaque chromosome et chaque gène y sera représenté en deux exemplaires. La réplication de l’ADN est un mécanisme très important qui permet la duplication du patrimoine génétique pour obtenir 2 exemplaires, chacun transmis à une des deux cellules filles lors de la division cellulaire. La réplication a donc lieu avant la division cellulaire. Ce mécanisme doit être le plus fidèle possible, pour que le patrimoine génétique qui va être transmis aux cellules filles soit le plus parfaitement identique à celui de la cellule mère. En effet, la survie à court terme de la cellule et de l’organisme dépend de la prévention de la modification de son ADN, puisque les modifications peuvent conduire à des évènements extrêmement délétères (mutations, associées à certaines pathologies comme le cancer). Cependant, à long terme, il peut y avoir des mutations qui entraineront l’évolution de l’espèce.  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER La réplication de l’ADN est un mécanisme cellulaire semi conservatif : sur la double hélice d’ADN de la cellule fille, un des deux brins provient du brin parental et l’autre est synthétisé lors de la réplication par polymérisation (brin fils). Chaque brin parental est lu dans le sens 3’>5’ et sert de matrice à la synthèse d’un brin complémentaire et antiparallèle, appelé brin fils ou brin néosynthétisé, synthétisé dans le sens 5’>3’. Pour cela les deux brins parentaux doivent se séparer. Une rupture des liaisons hydrogène est donc nécessaire. I. Réplication Chez Les Procaryotes (E. Coli) Éléments nécessaires : -L’ADN parental (aussi appelé ADN matrice) où chacun des deux brins sert de matrice pour synthétiser le brin antiparallèle subit une dénaturation (séparation des deux brins) pour passer à un état simple brin et le rendre accessible aux enzymes de la polymérisation. -Les dNTP (dATP, dCTP, dTTP et dGTP) rentrent dans la réaction sous forme triphosphate, et sont intégrés dans le brin sous forme monophosphate : le relargage du pyrophosphate apporte l’énergie nécessaire à la réplication. -Les ions Mg2+ stabilisent les dNTP en les protégeant d’une hydrolyse enzymatique et sont également importants pour l’ADN polymérase. -Les enzymes suivantes :  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER - Les hélicases - Les topoisomérases - Les ADN polymérase - Les primases § Les hélicases : Elles permettent aux deux brins de l’ADN parental de se séparer en supprimant les liaisons hydrogène entre les bases qui se font face. Le déplacement le long de l’ADN parental nécessite une énergie (hydrolyse des molécules d’ATP en ADP et Pi). Après elles, des protéines se positionnent : les protéines SSB, qui se lient à des simples brins, pour éviter la renaturation spontanée de l’ADN. § Les topoisomérases : Les topoisomérases modifient l’état d’enroulement (+ ou -) de la molécule d’ADN. Il existe deux types de topoisomérases : - Les topoisomérases I n’agissent que sur un seul brin de l’ADN et ne nécessitent donc pas d’ATP. - Les topoisomérases II agissent sur les deux brins de l’ADN, et nécessitent de l’ATP pour maintenir les deux fragments d’ADN. Chez les procaryotes, la gyrase bactérienne est une topoisomérase II. Rappel : Une séquence d’ADN peut avoir différents états d’enroulement, par ajout de surenroulements :  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER - Négatif : soulagements des contraintes (baisse du nombre d’enlacements). Très intéressant pour la réplication et la transcription, car meilleure accessibilité de l’ADN pour les enzymes. - Positif : augmentation du nombre d’enlacements. Les topoisomérases modifient l’état d’enroulement (+ ou -) de la molécule d’ADN. Tous les ADN double brins circulaires peuvent êtres surenroulés en présence de Topoisomérases => l’ADN va être torsade sur lui-même. Les topoisomérases agissent derrière l’action de l’hélicase, qui induit des surenroulements positifs (en avançant) qui vont super vriller la double hélice d’ADN. La gyrase va supprimer ces surenroulements positifs et introduire des surenroulements négatifs. Cette action est simultanée aux hélicases et permet une bonne accessibilité aux enzymes de la réplication à la molécule d’ADN. Les topoisomérases agissent suivant trois étapes : 1) Coupure transitoire de l’ADN 2) Libre rotation de l’ADN 3) Ressoudure de l’ADN (= ligation), toujours par la topoisomérase.  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER § Les ADN polymérases : Elles permettent la synthèse du brin fils par polymérisation en utilisant un brin de l’ADN parental comme matrice. L’activité ADN-polymérasique est la synthèse de l’ADN dans le sens 5’>3’ dans la chaine du brin en cours de synthèse. Cette activité nécessite une initiation (démarrage par une amorce de nucléotides). Pour la réplication, l’amorce est un ARN synthétisée par polymérisation par une primase (ARN polymérase). L’ADN-polymérase se positionne sur l’extrémité 3’OH pour polymériser de l’ADN dans le sens 5’>3’ après incorporation successive de nucléotides. La synthèse se fait de manière complémentaire et antiparallèle à l’ADN parental. Lors de la formation de la liaison phosphodiester, il y’a libération de deux pyrophosphates qui s’hydrolysent en deux phosphates inorganiques. La survie de la cellule à court terme dépend de la fidélité de la réplication. Cette haute-fidélité nécessite plusieurs mécanismes de vérification des nucléotides : - Avant addition covalente du nucléotide : Le dNTP entrant est celui qui possède la meilleure affinité et un état énergétique optimal. A ce moment il y a une transconformation de la polymérase ; elle change de conformation pour vérifier la bonne géométrie de la paire de base. - Après addition covalente du nucléotide : Une activité exonucléasique (= fonction d’édition) de la polymérase pour corriger des erreurs d’appariement en 3’>5’ par clivage entre deux nucléotides adjacents en bout de chaine. L’ADN polymérase a une activité exonucléasique dans le sens 3’>5’. C’est une fonction primordiale dans la réplication, qui est possédée par toutes les ADN polymérases dans le sens 3’>5’. C’est un mécanisme qui concourt à l’augmentation de la fidélité de la réplication. L’enzyme se modifie pour retirer la mauvaise liaison, l’emmène au niveau de son site catalytique P (site de polymérisation), et la détruit. Chez E. Coli, on retrouve trois ADN polymérases : les ADN polymérases I II, III. L’ADN polymérase III ne fonctionne pas seule mais est associée à un complexe multimérique appelé holoenzyme. Holoenzyme ADN pol III est l’enzyme majeure, qui réalise la synthèse de l’ADN (des brins fils).  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER La 2ème enzyme qui intervient dans la réplication chez la bactérie est l’ADN pol I, qui possède en plus une activité exonucléasique 5’>3’ permettant la dégradation des amorces d’ARN. L’ADN pol III a une activité ADN polymérasique dans le sens 5’>3’ et une activité de correction exonucléasique dans le sens 3’>5’. L’ADN pol I a trois activités : deux identiques à l’ADN pol III et une activité exonucléasique dans le sens 5’>3’. Les primases : Les primases sont des ARN polymérases ADN-dépendante : elles synthétisent les amorces d’ARN et sont dites ADN-dépendantes car elles se servent de l’ADN comme matrice. L’amorce d’ARN se fait dans le sens 5’>3’ du sens de la chaine en cours de synthèse. Les primases sont capables de synthétiser de courtes séquences d’ARN (de 4 à 12 ribonucléotides) qui sont ensuite utilisées comme amorces par l’ADN polymérase réplicative. Chez E. Coli, la primase et l’hélicase forment un seul complexe appelé le primosome. 1. Mécanisme de Réplication 1.1.Initiation de la réplication Chez E. Coli, il n’y a qu’un seul chromosome, et environ 4,6.106 paires de bases. Il existe une seule origine de réplication (appelée oriC : environ 245 pb), contenant des séquences répétées riches en A et T. C’est ici que se fixent les protéines d’amorçage, qui initient la réplication par  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER l’ouverture locale de la double hélice d’ADN. Localement on va avoir le passage à la forme simple brin, c’est l’œil de réplication. A partir de là se propage la réplication. C’est une propagation bidirectionnelle. On a deux fourches de réplications : une à droite et l’autre à gauche du point d’initiation. Les deux fourches progressent jusqu'à avoir deux molécules d’ADN double brin. On obtient donc un chromosome pour chaque cellule filles (donc deux au total), le plus fidèle possible au chromosome bactérien de la cellule mère. Chacune des deux cellules filles possède un chromosome à deux brins, qui correspondent à un brin synthétisé et à un brin parental. 1.2.Réplication des 2 brins d’DN parentaux La synthèse des brins fils se fait par l’ADN polymérase III. L’activité enzymatique se fait toujours dans le sens 5’>3’. Le sens de propagation de la réplication doit s’effectuer dans le sens d’ouverture de la boucle d’ADN, c'est-à-dire dans le sens 5’> 3’. La réplication est donc discontinue sur un des deux brins. On distingue un brin dit avancé et un brin dit retardé : - Pour le brin avancé ou continu, la synthèse de l’ADN se fait dans le sens d’ouverture de la molécule d’ADN, donc dans le sens de propagation de la fourche de réplication. - Pour le brin retardé ou discontinu, la synthèse d’ADN se fait dans le sens contraire de l’ouverture la molécule d’ADN. L’ADN polymérase n’exerce son activité polymérasique seulement dans le sens 5’>3’ de la chaine en cours de synthèse, or sur ce brin d’ADN, le sens de propagation de la  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER fourche de réplication est 3’>5’. La synthèse de ce brin est donc discontinue. Elle va s’effectuer de manière rétrograde, à partir de multiples fragments d’ARN. On obtient donc de multiples fragments d’ADN (fragments de 1000 à 2000 nt), appelés fragments d’Okazaki. Comment s’effectue la synthèse simultanée des deux brins ? Il existe un modèle démontré chez la bactérie et qui semble aussi être démontré pour les cellules eucaryotes.  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER Chez la bactérie : mise en jeu de deux molécules d’ADN polymérase III qui travaille en même temps au niveau de la fourche de réplication : une qui synthétise de manière continue le brin avancé et l’autre qui synthétise de manière discontinue le brin retardé. Le brin d’ADN parental, qui sert de matrice au brin d’ADN retardé, forme une boucle pour repositionner l’amorce de façon à ce que l‘allongement du fragment d’Okazaki par l’ADN polymérase se fasse dans le sens 5’>3’ mais aussi dans le sens de propagation de la fourche de réplication. La processivité de l’enzyme est donc la capacité de polymériser sur une longue distance. L’ADN polymérase III est naturellement peu processive : elle a tendance à synthétiser spontanément de l’ADN sur une courte distance et à se dissocier aussi spontanément de l’ADN parental. Cela est en adéquation avec la synthèse du brin discontinu : synthèse d’un fragment, puis détachement et synthèse d’un autre fragment. Mais sur le brin continu, l’ADN polymérase III doit synthétiser sur une longue distance. L’ADN pol III est donc maintenue au brin d’ADN parental par un collier coulissant (clamp). Pour E. Coli, c’est la sous-unité β du complexe holoenzyme qui joue le rôle de clamp. Cela permet à l’ADN pol III de rester associer au brin parental. La vitesse de réplication procaryote est de 500 et 1000 nt/s, ce qui permet à la réplication du chromosome bactérien de se faire en 40min. 1.3.Finition des brins d’ADN « fils » :  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER Pour finir, il faut : - Éliminer l’amorce ARN - Remplacer les amorces d’ARN par de l’ADN - Transformer le brin discontinu en un brin continu Pour avoir un fragment d’ADN continu, l’ADN pol I se positionne au niveau 3’OH d’un fragment d’Okazaki et comble la lacune qui le sépare de l’amorce d’ARN suivante. Dès qu’elle va rencontrer l’amorce d’ARN, de par son activité exonucléasique 5’>3’, elle hydrolyse cette amorce d’ARN et continue, de par son activité ADN-polymérasique, à synthétiser de l’ADN à partir du fragment d’Okazaki précédent. Elle remplace ainsi l’amorce d’ARN en ADN. La dernière étape consiste à relier ces fragments d’ADN grâce à une enzyme, appelée ADN ligase, qui permet la création d’une liaison phosphodiester entre 2 nucléotides adjacents. On obtient alors un fragment continu. Quand la synthèse d’ADN est terminée, les 2 fourches de réplication vont se rencontrer (car l’ADN est circulaire. Il y’a alors séparation des 2 doubles hélices par la gyrase. II. Réplication chez les Eucaryotes La réplication chez les eucaryotes est en grande majorité semblable à celle de la bactérie E. Coli mais il y a quelques spécificités. 1. Spécificités du génome eucaryote :  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER Ø Localisation : il se trouve dans le noyau cellulaire, alors que la bactérie ne possède pas de noyau. Ø Taille : le génome eucaryote est plus grand que le génome procaryote. Ø Organisation : le génome eucaryote est organisé sous forme de chromosomes formés de molécules d’ADN linéaire et double brin. Ø Structure : structure en nucléosomes pour faciliter la condensation de l’ADN afin que le génome puisse rentrer dans le noyau cellulaire. La vitesse de réplication chez les eucaryotes est plus faible (50 nt/s). Dix fois plus faible que celle de la bactérie. Nous avons donc un génome beaucoup plus grand, qui se réplique à une vitesse plus faible et qui est associé à des structures. Cependant nous avons quand même une réplication active. Comment s’effectue la réplication chez les eucaryotes ? Chez les eucaryotes, il y a plusieurs origines de réplication, de 20 000 à 100 000 origines de réplication par cellule. Ces origines de réplication ne sont pas toutes activées en même temps, mais par petits groupes de 20 à 80 OR. Ces groupes constituent une unité de réplication. Ces unités de réplication sont activées de manière asynchrone. Selon la localisation, la réplication s’effectue plus ou moins tardivement : les unités de réplication dans l’euchromatine sont activées précocement alors que les unités de réplication dans l’hétérochromatine sont activées plus tardivement. Sur un chromosome, on retrouve donc plusieurs milliers d’OR, à partir desquelles il y a les deux fourches de réplication. A partir de chaque point de réplication, quand il y a activation, il va donc y avoir un œil de réplication qui va se former, avec les deux fourches qui vont progresser dans des sens opposés (bidirectionnel). Ces portions de chromosome répliquées s’appellent les réplicons. Sur un même chromosome, il y a différents yeux de réplication qui s’agrandissent, et qui progressent jusqu’à ce que la fourche rencontre une autre fourche qui progresse en sens inverse ou atteigne l’extrémité du chromosome.  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER 2. Les enzymes et protéines eucaryotes Ø Les hélicases : pour séparer les brins parentaux. Ø Les protéines RPA : (les équivalents des protéines SSB chez la bactérie) pour maintenir les 2 brins séparés. Ø Les topoisomérases : pour éliminer les surenroulements positifs et introduire des négatifs. Ø La primase : (ARN-polymérase ADN-dépendante) pour synthétiser les amorces d’ARN. Ø L’ADN polymérase eucaryote : il y en a 5 : α, β, ϒ, δ, ε. q ADN POL δ: C’est une ADN polymérase ADN-dépendante. C’est l’enzyme principale de la réplication des deux brins fils : - Elle réalise la réplication totale du brin direct en 5’→3’ (initiation et élongation) - Elle réalise la majorité de la réplication du brin indirect (élongation) - Elle a une activité polymérasique en 5’→3’ et une fonction d’édition en 3’→5’. - Sa processivité est régulée par un anneau ou clamp, qui est une protéine particulière nommée la PCNA (Proliferating Cellular Nuclear Antigen). - Elle intervient aussi sur la finition des brins d’ADN. q ADN POL α: - Elle intervient uniquement sur le brin indirect pour initier la réplication.  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER - Elle est associée à la primase : elle prend le relai direct au niveau des fragments d’Okazaki eucaryote (100-200 nt), sur le brin indirect. q ADN POL ϒ: Elle est impliquée dans la réplication de l’ADN mitochondrial. q ADN POL β, ADN POL ε: Elles sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Comment s’effectue la finition du brin indirect ? Une enzyme de la classe des RNases (H-1 et FEN-1) élimine les amorces d’ARN. Le comblement est réalisé par l’ADN POL δ, puis l’ADN ligase ligue les morceaux entre eux pour former un seul brin. L’ADN POL α réalise le début de la synthèse du brin indirect, en initiant la polymérisation, puis elle est remplacée par l’ADN POL δ, qui continue la synthèse dans le sens 5’→3’ du brin en cours de synthèse. On retrouve sur le brin indirect des fragments d’Okazaki (100 à 200 nt) comme pour le chromosome bactérien. Pour la finition du brin indirect, l’ADN POL δ allonge le fragment en synthétisant de l’ADN, et remplit la lacune jusqu’à rencontrer le 1er nucléotide du fragment suivant. Notion de boucles : il y un repliement structurel de l’ADN du brin fils, de façon à ce que l’allongement se fasse dans le sens 5’-3’ mais aussi dans le sens la fourche de réplication.  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER 3. Particularités eucaryotes 3.1.Première particularité eucaryote : La présence de nucléosomes Les nucléosomes sont des structures composées de protéines basiques (les histones). L’ADN est enroulé autour de ces histones, et enroulé sur lui-même, dans un état de condensation. La présence des nucléosomes ne semble pas affecter les fourches de réplication. Les génomes des cellules filles doivent être identiques au génome de la cellule mère, ce qui concerne également les nucléosomes. Les nucléosomes parentaux restent associés, puis une répartition équivalente se fait entre les deux brins (brin parental et brin fils) de la molécule d’ADN. Pendant la phase S du cycle cellulaire, de nouveaux nucléosomes sont synthétisés pour compléter les nucléosomes parentaux dans les cellules filles. Chaque brin possède alors 50% de nucléosomes parentaux et 50% de nucléosomes néo-synthétisés. La présence de ces nucléosomes est à l’origine du fait que la réplication chez les eucaryotes est beaucoup plus lente que chez les procaryotes. 3.2.Deuxième particularité eucaryote : les télomères à l’extrémité des chromosomes Les télomères sont des séquences d’ADN situées aux extrémités des chromosomes. On y retrouve une séquence répétée en tandem (chez l’homme : TTA GGG). La réplication du brin parental débute grâce à la primase qui synthétise pour amorce la séquence CCC UAA (séquence complémentaire et antiparallèle de la séquence répétée TTA GGG). En fin de réplication, cette séquence va être éliminée par les RNases par hydrolyse. Ce n’est pas un fragment d’Okazaki, donc une fois dégénérée, elle n’est pas remplacée par de l’ADN par polymérisation. En fin de réplication, on a donc le brin 3’ plus long que le brin 5’ (puisque l’on a une lacune au niveau du brin fils). Lorsque les cellules filles se divisent, les deux brins deviennent les brins parentaux. Le brin 5’ qui est alors répliqué a perdu 10 nt, qui correspondent à l’amorce d’ADN dans la génération précédente. Donc sans aucun phénomène compensatoire, il y aurait une perte de nucléotides (10 nt) à chaque cycle de réplication, et donc une perte d’information génétique. Il existe cependant un phénomène compensatoire, réalisé par la télomérase.  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER La télomérase est une ribonucléoprotéine (constituée de protéines et d’ARN). La fonction enzymatique portée par cette enzyme est une fonction ADN polymérase dans le sens 5’→3’. C’est une enzyme ARN dépendante, qui utilise comme séquence matrice une séquence d’ARN. Elle va utiliser comme matrice son ARN interne (endogène). Le mécanisme qui vise à synthétiser de l’ADN à partir d’une molécule d’ARN est appelé rétrotranscription. La télomérase est donc retro- transcriptase. Mécanisme d’action de la télomérase : Tout d’abord, la télomérase se positionne à l’extrémité 3’ et s’hybride via sa séquence d’ARN à la séquence complémentaire sur le télomère. Elle synthétise ensuite la séquence répétée de l’ADN de manière complémentaire et antiparallèle à sa séquence d’ARN. La télomérase effectue ensuite une translocation, et synthétise une nouvelle fois la même séquence. Une fois que la télomérase a rallongé les séquences télomériques, la réplication de ces séquences est réalisée par l’ADN polymérase α et la primase. La longueur des télomères dépend de l’équilibre entre le raccourcissement dû à la réplication et le niveau d’activité de la télomérase.  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER Après l’action de la télomérase, l’extrémité 3’ des chromosomes simple brin plus longue que l’extrémité 5’. Cette extrémité plus longue s’enroule vers l’arrière pour réaliser une boucle T (repliement), grâce à des protéines spécialisées. Cette structure constitue un système de protection des chromosomes, et participe donc à l’intégrité des chromosomes. Elle protège les chromosomes de l’action de certaines enzymes. 3.3.Troisième particularité eucaryote : Méthylations Chez les cellules eucaryotes, seule la cytosine peut être méthylée. Ces cytosines font généralement parties des îlots CG. Elles seront méthylées sur le brin fils seulement si le brin parental est méthylé. Les méthylations jouent aussi un rôle dans la régulation de l’expression de certains gènes. Certains gènes sont régulés par un mécanisme épigénétique de méthylation. L’hypométhylation entraine le déverrouillage du gène, alors que l’hyperméthylation entraine le verrouillage du gène. Exemple : Le gène de l’insuline est présent dans toutes les cellules, or l’insuline est seulement sécrétée par les cellules pancréatiques, les ilots de de Langerhans. Donc l’information n’est exprimée que dans les cellules pancréatiques, où il y a donc hypométhylation. Dans toutes les autres cellules, il y a hyperméthylation.  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER La duplication est donc un évènement crucial où peuvent se produire des erreurs, il y a donc des mécanismes de contrôle, pour limiter ces erreurs. Ces mécanismes peuvent être complétés par des mécanismes de réparation de l’ADN. Lorsque ces mécanismes sont fonctionnels, il y a un taux de mutations de génome extrêmement bas (un seul nucléotide modifié pour 109 nucléotides à chaque cycle de réplication). II. La réparation de l'ADN 1. Introduction On sait que la survie à court terme d’une cellule dépend de la stabilité génétique. Au niveau cellulaire, la cellule a donc à sa disposition des systèmes de prévention de l’altération de l’ADN. Sur 1 000 modifications, seule une ne sera pas réparée, et entrainera alors une mutation permanente. Il existe plusieurs mécanismes de réparations, chacun associé à un type de réparation particulier. Les différents mécanismes de réparation d’ADN 2. Correction des erreurs d’appariement lors de la réplication 2.1.Correction immédiate : fonction d’édition de l’ADN polymérase Elle corrige les mésappariements et diminue le taux d’erreurs de 2 log (105 à 107).  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER 2.2.Réparation par excision (BER ou NER) C’est un mécanisme de réparation simple brin. On peut distinguer deux types de mécanismes (NER ou BER) en fonction de l’excision de la partie altérée. Ce mécanisme agit sur les lésions présentes sur un seul brin. C’est un mécanisme multi-étapes : 1- Reconnaissance de la lésion 2- Excision de la partie altérée : soit sur une base (BER) soit sur plusieurs nucléotides (NER). 3- Réparation par réplication pour combler la lacune (ADN pol et ligase). 2.2.1. Réparation par excision de base (BER) La réparation par excision de bases (BER), aussi appelé mécanisme de correction courte, est un système de réparation capable de réparer par exemple les désaminations, les dépurinations ou les dépyrimidations spontanées. Cette réparation aboutit à la réparation d’un site AP (dans le cas des désaminations spontanées, il y aura au préalable création du site AP). Ce mécanisme met en jeu une ADN-glycosylase (cette protéine existe en plusieurs types). Cette ADN-glycosylase va reconnaître et exciser spécifiquement une base modifiée, par clivage de la liaison N-Glycosidique (entre la base et le désoxyribose). Lorsque ces ADN-glycosylases agissent, elles aboutissent à la formation d’un site AP. L’ADN-glycosylase qui rentre en jeu est celle qui est spécifique de la base qui est endommagée (ex : Uracile ADN-glycosylase). Il faut ensuite réparer le site AP. Cette réparation est faite avec deux autres enzymes. Tout d’abord l’AP-endonucléase qui a pour rôle de couper le squelette désoxyribose phosphate contenant le site AP, et donc d’enlever le sucre. Il y a donc clivage de la liaison phosphodiester, et retrait du site AP. Le trou sur la chaine d’ADN est alors complété par l’ADN polymérase qui se positionne en 3’OH pour ajouter par polymérisation le nucléotide complémentaire. La dernière liaison phosphodiester est faite par l’ADN ligase (pour figure voir annexe). 2.2.2. Réparation par excision de plusieurs nucléotides (NER) Ce deuxième mécanisme est basé sur le même principe, mais il correspond à des lésions plus volumineuses, où il faut exciser plusieurs nucléotides. Ce mécanisme s’adresse donc à des lésions ou des modifications structurales importantes (ex : dimères de thymines ou pyrimidines) (pour figure voir annexe). a. Chez E. Coli :  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER La réparation est assurée par un complexe multienzymatique : l’exonucléase ABC. Les constituants de ce complexe sont des protéines codées par uvrA, uvrB et uvrC. Ce complexe se positionne sur la lésion et reconnait la modification. Après s’être fixé, il induit une distorsion de la double hélice. L’ADN hélicase permet de séparer les deux brins et de les dissocier, ce qui permet à l’exonucléase de cliver un fragment de 13 nt, contenant les lésions. L’ADN pol I se fixe sur l’extrémité 3’OH libre pour synthétiser l’ADN complémentaire et anti parallèle. La dernière liaison phosphodiester est réalisée par l’ADN ligase. b. Chez l’Homme : Ce sont les protéines ERCC1 et les protéines XP (A, B, C, …) (xeroderma pigmentosum) qui réalisent la NER dans les cellules. La protéine XPC reconnait la lésion. Certaines XP possèdent l’activité hélicase (XPB et XPD). L’excision est réalisée par XPF, ERCC1 et XPG. La synthèse d’ADN se fait par l’ADN pol δ et l’ADN pol ε et la dernière liaison phosphodiester est réalisée par l’ADN ligase. o Maladie Xeroderma pigmentosum (enfant de la lune) : Les sujets sensibles à la lumière UV sont souvent porteurs de modifications des gènes XP, c'est-à- dire qu’ils ont un système de réparation altéré, ce qui aboutit à une incapacité de réparer les paires de thymines (pour figure voir annexe). 2.3.Système de réparation guidée par les CH3 : système MMR Le système MMR est un système de réparation permettant la correction d’un mésappariement oublié par la fonction d’édition. Grâce à ce système, on aboutit à un taux d’erreur de 1 pour 109 bases. Lorsque le système détecte un mésappariement, il détecte aussi le brin qui doit être corrigé. Pour pouvoir savoir quel est le brin avec le mésappariement, il se base sur le temps où il n’y a pas encore eu méthylation du brin fils. Le nucléotide du mésappariement du brin non méthylé est celui qui doit être corrigé. Ce système existe aussi bien chez les cellules eucaryotes et que chez les cellules procaryotes. - Chez les procaryotes, le système de réparation repère la méthylation des adénines des séquences GATC et fait intervenir les enzymes MUT. - Chez les eucaryotes, le système repère la méthylation des cytosines des séquences CG et fait intervenir les enzymes hMSH, hMLH, hPMS.  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER a. Chez E. Coli Le système enzymatique de réparation est multi-protéique. Il est capable de reconnaitre un mésappariement et une séquence GATC située dans l’environnement du mésappariement (jusqu’à 1000 pb), afin de vérifier le brin méthylé. Ce complexe multienzymatique est codé par les gènes MUT et constitué des enzymes MUT. Il peut se positionner sur le mésappariement et détecter le brin méthylé. Il a une activité endonucléasique (il peut cliver les liaisons phosphodiester à l’intérieur d’une chaine). Ce complexe excise le fragment d’ADN simple brin qui contient le mésappariement (donc sur le brin non méthylé). Cela entraine la formation d’une lacune qui doit être comblée. L’ADN pol III se positionne alors en 3’OH en synthétise l’ADN complémentaire et antiparallèle. La dernière liaison phosphodiester est effectuée par l’ADN ligase. Ce système doit agir dans le laps de temps où la méthylation du brin fils n’est pas encore effectuée. Une fois ce laps de temps écoulé, les ADN méthylase rentrent en jeu et méthylent en miroir le brin fils. Le complexe ne peut alors plus reconnaitre le brin fils. b. Chez l’homme Le complexe multienzymatique a les mêmes fonctions, mais il est basé sur les méthylations des cytosines des séquences répétées GC. Les enzymes qui interviennent ne sont pas les enzymes MUT mais les enzymes hMSH, hMLH et hPMS (h pour humain). 2.4.Réparation par recombinaison homologue C’est un système de réparation constitutif, basé sur la recombinaison homologue, qui intervient quand les systèmes précédents n’ont pas pu réparer les lésions, soit car ils étaient défectueux, soit parce qu’ils étaient débordés. Ce mécanisme agit surtout contre les dommages induits par les radiations ionisantes ou les agents oxydants. Il agit contre les lésions majeures de l’ADN, lorsque le système NER est débordé ou défectueux. S’il n’y a pas de réparation avant réplication, une lacune (ou brèche post-réplicative) est laissée par l’ADN polymérase, lorsqu’elle rencontre une lésion. Cette lacune va être réparée par recombinaison homologue (pour figure voir annexe). a. Mécanisme chez les procaryotes :  ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TANGER Lors de la réplication, une lacune est laissée sur le brin fils en face du dimère. Cette lacune est remplie par la séquence du brin parental opposé identique à ce brin fils, qui est prélevée par la protéine REC A. Cela va fournir la séquence correcte et créer une deuxième lacune sur le brin parental opposé. Puis le dimère est excisé par des enzymes d’excision. Les deux lacunes (à la place du dimère de thymines et sur le brin parental opposé) sont ensuite corrigées grâce à l’ADN polymérase qui synthétise la séquence complémentaire et antiparallèle de chaque brin parental. La bactérie possède près de 1 millier de protéines REC A, qui sont normalement présentes en quantité suffisante pour effectuer les recombinaisons. Le pool des protéines REC A présentes dans la cellule est contrôlé par un inhibiteur LEX A qui est le répresseur de REC A. Cet inhibiteur bloque la synthèse de protéines REC A et régule donc le nombre de protéines présentes dans la cellule. b. Chez l’Homme : Le système est équivalent mais il fait intervenir chez l’Homme la protéine RAD 51 (homologue eucaryote de REC A), associée aux protéines BRCA1 et BRCA2. 2.5.Réparation par jonction d'extrémités non homologues Lorsqu'une cellule subit des dommages à son ADN, comme une cassure des deux brins d'ADN, cette situation est critique car elle peut conduire à des mutations, des translocations chromosomiques ou même à la mort cellulaire. Ce mécanisme intervient comme une méthode de réparation rapide et efficace pour combler ces ruptures en l’absence d’un modèle d'ADN identique (homologue). Il répare les cassures double-brin lorsque la recombinaison homologue n'est pas possible (par exemple, lors de la phase G1 du cycle cellulaire, avant la réplication). Des protéines spécialisées, comme Ku70/80, se lient aux extrémités de la cassure. Les extrémités brisées sont alignées et jointes, souvent sans recourir à une séquence homologue, ce qui peut entraîner une perte de nucléotides. À la fin, l'ADN ligase IV rejoint les extrémités réparées. Ce mécanisme peut entraîner des erreurs (indels) et est plus susceptible d'introduire des mutations.