Celbiologie Cursus - 4 PDF

1 5 Hoofdstuk 5 - Celmetabolisme en enzymen 5.1 Leerdoelen Leerdoelen Omschrijven wat anabool en katabool metabolisme betekent. *De chemische structuur van ATP (en ADP, AMP) herkennen en beschr...

1 5 Hoofdstuk 5 - Celmetabolisme en enzymen 5.1 Leerdoelen Leerdoelen Omschrijven wat anabool en katabool metabolisme betekent. *De chemische structuur van ATP (en ADP, AMP) herkennen en beschrijven uit welke onderdelen deze is opgebouwd. De ATP-cyclus verwoorden *Omschrijven wat een enzym, ES-complex, cofactor, apoenzym, holo-enzym, …is en het werkingsmechanisme van een enzym verklaren. Het sleutel-slot model omschrijven en het verschil duiden met het induced fit model 5.2 Metabolisme Onder metabolisme verstaat men alle (bio)chemische processen die zich afspelen binnen een organisme. Soms spreekt men ook van stofwisseling. De metabole activiteit is georganiseerd in pathways of metabole wegen, sterk vertakte ketens van opeenvolgende reacties. Sommige van deze ketens, de katabole pathways), zorgen er op gezette tijdstippen voor dat energie gegenereerd wordt, door complexe moleculen af te breken tot eenvoudige. Een belangrijk voorbeeld is de celrespiratie, waarbij de suiker glucose wordt afgebroken tot water en koolstofdioxide. Andere reactieketens, de anabole pathways, volgen de tegenovergestelde weg, en wenden energie aan om ingewikkelde moleculen te synthetiseren uit eenvoudige bouwstenen. De eiwitsynthese is hiervan een voorbeeld. Deze metabole weg vereist energie. 5.3 De ATP-cyclus Cellen verrichten drie types van arbeid: mechanische arbeid (bijvoorbeeld het bewegen van ciliën, het samentrekken bij spiercellen, het bewegen van chromosomen tijdens de reproductie); transport (pompen van stoffen door de membranen); en chemische arbeid (het aan de gang houden van reacties die niet spontaan verlopen, zoals de synthese van polymeren). In de meeste gevallen wordt de energie voor deze cellulaire arbeid geleverd door adenosinetrifosfaat (ATP). ATP bestaat uit adenine, ribose en drie fosfaatgroepen en is een nucleotide (zie verder Hoofdstuk 7). Wanneer één van de fosfaatgroepen van de molecule gebroken wordt, ontstaat adenosinedifosfaat (ADP) en een molecule anorganisch fosfaat (Pi). Er komt ook een aanzienlijke hoeveelheid  2 energie vrij. In een proefbuisje zou deze energie leiden tot opwarming, in de cel wordt het direct aangewend om niet-spontane reacties te laten doorgaan. De voorraad ATP wordt hernieuwd door het toevoegen van de fosfaatgroep aan ADP. De energie die daarvoor nodig is, wordt onttrokken aan de katabole pathways. figuur 43: Structuur van ATP en hydrolyse tot ADP, waarbij energie vrijkomt (Rasquin, 2014). De ATP-cyclus loopt aan een enorm tempo. Een werkende spiercel verbruikt bijvoorbeeld zijn ganse voorraad aan ATP in één minuut. Tien miljoen moleculen ATP worden per seconde verbruikt en geregenereerd. Mocht er geen regeneratie van ATP uit ADP bestaan, zouden mensen dagelijks hun gewicht in ATP verbruiken. 5.4 Enzymen Chemische reacties verlopen vaak erg traag. In de chemie van de cel wordt dit probleem opgelost door enzymen, eiwitten die de snelheid van reacties veranderen zonder zelf geconsumeerd te worden. Enzymen helpen substraat om te zetten in product. Hun naam wordt meestal gevormd door de stam van het substraat/product, aangevuld met de uitgang –ase. Sucrase, bijvoorbeeld, is een enzym dat sucrose (substraat) afbreekt tot glucose en fructose (producten). Maltase is een enzym dat maltose afbreekt tot glucose. Product en substraat zijn relatieve begrippen omdat vele enzymen in de twee richtingen werken. Enzymen zijn doorgaans erg substraatspecifiek; ze kunnen slechts één reactie aanzwengelen. Deze specificiteit komt tot stand door de unieke  3 vorm van elk enzym. Slechts een klein deel van de enzymmolecule is echt actief betrokken bij de binding van het substraat. Het gaat meestal om een holte, een groef in het oppervlak van het enzym (actieve plaatst). De rest van de molecule plooit zich na binding van de actieve site nog meer rond het substraat, en brengt de chemische groepen van de actieve kern in de ideale positie om hun werk te kunnen doen. Wanneer het en enzym met zijn substraat bindt, vormt het geheel een enzym-substraatcomplex (ES- complex). figuur 44: Schematische werking van een enzym (Tortora et al, 2007) “Het sleutel-slotmodel van Fischer (1894) gaat ervan uit dat er enkel een enzym-substraatcomples (ES) kan worden gevormd als het substraat precies past in het actieve centrum, zoals een sleutel in een slot. Met behulp van deze hypothese kan de absolute specificiteit worden verklaard. Hiermee wordt bedoeld dat een enzym slechts één substraat herkend. Enzymen vertonen echter een relatieve specificiceit, d.w.z. dat ze een aantal chemische nauw verwante stoffen herkennen. Koshland heeft deze relatieve specificiteit verklaard door aan te nemen dat het enzym door de bindingsinteractie met het substraat subtiele veranderingen in conformatie ondergaat. Hierdoor wordt een zodanige orientatie van de residuen van het actieve centrum verkregen dat de binding met het substraat optimaal is. Deze hypothese wordt de ‘induced fit ‘ hypothese genoemd. Ook schemisch nauw verwante substraten kunnen worden gebonden doordat ieder substraat een iets afwijken verandering in conformatie van het actieve centrum veroorzaakt” (Biemans et al, 2006).  4 figuur 45: Het Sleutel-slot model van Fischer (links) en het Induced fit model van Koshland (rechts) De efficiëntie van enzymen wordt sterk beïnvloed door omgevingsfactoren zoals temperatuur en pH. Voorbij de optimale temperatuur of pH vervormt de enzymmolecule al snel zodanig dat ze haar werk niet meer kan uitvoeren. Daarnaast hebben vele enzymen cofactoren nodig, dit zijn moleculen die het enzym helpen bij het afbreken van hun substraat. Het kan gaan om anorganische elementen (bijvoorbeeld zink, ijzer, koper, magnesium, mangaan) of om organische moleculen. In het laatste geval spreekt men van co-enzymen (bijvoorbeeld vele vitaminen en hun afgeleiden). Apo-enzymen zijn het eiwitgedeelte van een enzym en vormen samen met de cofactor of co-enzym, het holo-enzym. Het holo-enzym is het complete en werkzame enzym. figuur 46: Apo-enzym en cofactoren vormen het holo-enzym (Tortora et al, 2007) Andere stoffen staan bekend als inhibitoren van enzymen. Sommige inhibitoren lijken op de substraatmolecule en hechten zich vast op de actieve site van het enzym. Men spreekt dan van competitieve inhibitoren. Andere (niet-competitieve) inhibitoren binden op een  5 andere plaats op het enzym, maar veranderen de vorm van het enzym dusdanig dat haar werking verminderd wordt. figuur 47: De werking van inhibitoren (Tortora et al, 2007) Sommige giffen werken via inhibitie van enzymen. De pesticiden DDT en parathion zijn inhibitoren van sleutelenzymen van het zenuwstelsel. Vele antibiotica inhiberen de enzymen van bacteriën. Penicilline blokkeert de actieve site van een enzym dat bacteriën nodig hebben om hun celwand aan te maken. De enzymactiviteit is de hoeveelheid substraat die wordt omgezet (of de hoeveelheid product dat gevormd wordt) gemeten in functie van de tijd. De activiteit van enzymen zijn afhankelijk van o.a. temperatuur en pH maar ook door de aanwezigheid van verbindingen die het enzym kunnen remmen of activeren. Elk enzym heeft een pH of temperatuursoptimum. Een optimumtemperatuur is de temperatuur waarbij de activiteit van het enzym maximaal is. 5.4.1 Controle van de enzymactiviteit Wanneer alle biochemische pathways in de cel tegelijkertijd zouden actief zijn, zou dit resulteren in complete chaos. Stoffen die in één pathway gesynthetiseerd worden, zouden door andere pathways onmiddellijk weer afgebroken worden. De cel regelt echter nauwkeurig haar reactieketens, door te bepalen wanneer welke enzymen actief zijn. Dit kan gebeuren door de betrokken genen aan of af te schakelen (zie verder), of door de activiteit van de enzymen te regelen. Veelal opereren de moleculen die instaan voor de regulatie van de enzymactiviteit op dezelfde manier als niet-competitieve inhibitoren; ze nestelen zich op een specifiek plekje op het enzym (de allosterische site) en veranderen haar vorm. Vaak gaat het om het eindproduct van de door het enzymen bevorderde reactie, en wordt een reactie dus stopgezet als er  6 genoeg van dat eindproduct aangemaakt is (een vorm van feedbackregulatie). Ten slotte wordt het metabolisme ook gecontroleerd door de specifieke locatie van de enzymen. In eukaryote cellen zitten bijvoorbeeld alle enzymen nodig voor de respiratie bij elkaar in bepaalde compartimenten zoals bijvoorbeeld de mitochondria. Bij prokaryoten gebeurt dit ter hoogte van het plasmamembraan (Van Damme, 2008). Studietip Bekijk de PPt en ga regelmatig naar Bioplek voor meer basiskennis 5.5 Oefenvragen hoofdstuk 5- celmetabolisme en enzymen Uit welk voorloperproduct wordt ATP gevormd? In welke bindingen zit de energie in ATP opgeslagen? Wat is een co-factor? Wat is een apo-enzym en holo-enzym? Verklaar sleutel/slot model bij enzymwerking? Wat is het verschil tussen het sleutel/slot en het induced fit model? Het actief centrum van het enzym is de plaats waar het enzym met zijn substraat bindt en dit omzet tot een product O juist O fout Elk enzym herkent eender welk substraat O juist O fout Wat is het verschil tussen een competitieve en niet-competitieve inhibitor? Wat is het belang van allosterische regulatie voor een metabole pathway? 6 Hoofdstuk 6 - De eukaryote cel Leerdoelen 6.1 Leerdoelen Aangeven waar biomembranen voorkomen in de cel en het belang van de compartimentalisatie in een eukaryote cel uitleggen.  7 Beschrijven welke transportsystemen er bestaan voor intracellulair transport en voor transport in en uit de cel (zie ook hst 4). *De bouw en functie(s) van alle eukaryotische organellen (en hun onderdelen) en structuren (bv cytoskelet) beschrijven. Het semiautonome karakter en de gelijkenis tussen energie producerende organellen verklaren en hiervoor de endosymbionttheorie weergeven. Beschrijven welke eukaryote cellen een celwand hebben en welke niet. De chemische structuur noemen van de celwand van een specifiek organisme en het belang duiden van de aanwezigheid van een celwand. De verschillen en gelijkenissen schetsen tussen een prokaryote en eukaryote cel en voorbeelden van beide celtypes opnoemen. Onderstaande tekst werd met toestemming deels overgenomen van Raoul Van Damme (2008). 6.2 Bouw van de eukaryote cel Zoals we al weten, is de cel is de fundamentele eenheid van het leven. Alle organismen bestaan uit cellen. In de hiërarchie van de biologische organisatie is de cel de meest eenvoudige verzameling materie die kan ‘leven’. De meeste cellen zijn tussen 1 en 100 µm (1 µm = 10-6 m) groot; ze zijn nog juist zichtbaar door de lichtmicroscoop (vergroot tot 1000 maal). De subcellulaire structuren, of organellen, die we in dit hoofdstuk bespreken, meten doorgaans 1 tot 10 µm. Ze werden slechts zichtbaar na de ontwikkeling van de elektronenmicroscopen. Hieronder staat de algemene opbouw van een planten- en dierlijke cel weergegeven. centrale vacuole cytoskeleton peroxysoom mitochondrion ribosomen RER kern SER Golgi-apparaat chloroplast lysosoom plasmamembraan celwand figuur 48: Opbouw en vergelijking van een plantaardige cel (links) met een dierlijke cel (rechts).  8 6.2.1 Compartimentalisatie in de eukaryote cel en biomembranen “Eukaryote cellen hebben een groter volume dan de prokaryote cellen. Alhoewel het totale celoppervlak groter is dan bij prokaryoten is de het oppervlak per volume-eenheid kleiner. Veel biochemische processen spelen zich op het celmembraan en bij bacteriën is dit voldoende. Eukaryoten hebben behoefte aan een groter membraanoppervlak. Dit werd gecompenseerd door de ontwikkeling van een sterk vertakt intern systeem van membranen. Door het interne membraansysteem wordt elke eukaryote cel verdeeld in compartimenten: de organellen: kern, endoplasmatisch reticulum (ER), golgi-apparaat, mitochondriën, lysosomen, peroxisomen. In plantencellen treffen we nog plastiden (chloroplasten) aan en vacuolen. Ribosomen bezitten geen compartimentstructuur. Toch worden ze vaak tot de organellen gerekend. Let wel zowel pro- als eukaryoten bezitten ribosomen. Het restcompartiment dat overblijft wordt cytosol genoemd en omvat meer dan de helft van het volume van de cel. Door de compartimentalisatie kunnen verschillende biochemische processen tegelijkertijd doorgaan zonder elkaar negatief te beïnvloeden (zie ook als voorbeeld fagocytose met behulp van lysosomen). 6.2.2 De kern De kern bevat het overgrote deel van de genen die de eukaryotische cel sturen. Het is doorgaans het meest opvallende organel in de cel, met een gemiddelde doormeter van ca. 5 µm. De kern wordt gescheiden van het cytoplasma door een dubbele membraan, elk bestaande uit een bilayer van fosfolipiden plus bijhorende eiwitten. In het membraan zijn poriën voorzien, die het passeren van macromoleculen moeten toelaten. Elke porie wordt afgelijnd door ingewikkelde eiwitten die de doorgang van deze moleculen regelen. In de kern ligt het DNA, samen met een aantal eiwitten, georganiseerd in een diffuse structuur die men het chromatine noemt. Wanneer de cel gaat delen, condenseert het vezelige, verwarde chromatine tot dikke, afzonderlijke structuren (de chromosomen). Elke eukaryote cel heeft een karakteristiek aantal chromosomen. Bij mensen bedraagt dit aantal 46. Voortplantingscellen vormen een uitzondering; bij mensen bevatten eicellen en spermacellen bijvoorbeeld slechts 23 chromosomen. Bij cellen die niet op het punt staan om te delen, is de nucleolus (kernlichaampje) de meest opvallende structuur. Hier worden de componenten van de ribosomen gesynthetiseerd en geassembleerd. Deze componenten verlaten de kern via de poriën in de kernmembraan, waarna ze samensmelten tot ribosomen.  9 De kern regelt de eiwitsynthese in het cytoplasma via het boodschapperRNA (messenger-RNA, mRNA). Hoe de vertaling van de genetische informatie gebeurt, bekijken we later. figuur 49: Nucleus algemeen (links en detailopname van een porie in het dubbele kernmembraan (rechts) (Tortora et al, 2007) 6.2.3 De ribosomen De ribosomen zijn de eiwitassemblage-plaatsen van de cel. Ze zijn evolutionair zeer oud en komen voor bij prokaryoten (zie ook cursus microbiologie 1) en eukaryoten en hebben een zeer gelijkaardige structuur (zie figuur). Eukaryote cellen met een hoge eiwitproductie bezitten massa’s ribosomen. Een menselijke levercel bevat er bijvoorbeeld enkele miljoenen. Ribosomen komen vrij in het cytoplasma voor, of gebonden aan het endoplasmatisch reticulum (zie verder). Elk 80S ribosoom bestaat uit twee delen, een klein (40S) en een groot (60S). Beide onderdelen bestaan uit eiwitten en uit RNA-moleculen (het zogenaamde ribosomaal RNA of r-RNA). Een overzicht van de aantallen en soorten rRNA en rproteïnen wordt in onderstaande tabel gegeven en in de figuur. We komen later terug op de werking van de ribosomen. Bij eukaryoten worden de ribosomen geassembleerd in de kern. Tabel 6 vergelijking ribosoom van pro- en eukaryoot; S = Svedberg. Volledig ribosoom Prokaryoot (70S) Eukaryoot (80S) Kleine subeenheid 30S 40S  10 Aantal proteïnen 21 33 rRNA 16S (1540 basen) 18S (1900 basen) Grote subeenheid 50S 60S Aantal proteïnen 31 50 rRNA 23S (2900 basen) en 28S+ 5,8S (4800+160 5S (120 basen) basen) en 5S (120 basen) figuur 50: Ribosomen bij prokaryoten(boven) en bij eukaryoten (onder) met een kleine en grote subeenheid bestaande uit rRNA’s en r-proteïnen 6.2.4 Proteasomen Proteasomen breken eiwitten af en zijn holle cilindervormige organellen die verschillende eiwitsplitsende enzymen of proteasen bevatten. Deze proteasen verwijderen en recycleren beschadigde of gedenatureerde eiwitten in cellen die bv voor virussen zijn geïnfecteerd (Martini en Bartholomew, 2012). 6.2.5 Het endomembraansysteem  11 Eukaryote cellen zitten vol membranen. Die staan onderling in verbinding, direct of via de transfer van membraansegmenten onder de vorm van minuscule blaasjes of vesikels (zakjes omgeven door membraan). Toch bestaat er een duidelijke differentiatie in structuur en functie binnen de membranen. Het endomembraansysteem omvat het kernmembraan (zie hierboven), het endoplasmatisch reticulum, het Golgi-apparaat, de lysosomen, en verschillende soorten vacuolen. 6.2.5.1 Het endoplasmatisch reticulum Het endoplasmatisch reticulum (ER) bestaat uit een doolhof van membranen, die in verbinding staan met het kernmembraan. Men onderscheidt twee types die weliswaar in verbinding met elkaar staan : het ruw endoplasmatisch reticulum, zo genoemd omdat het bezaaid is met ribosomen en daardoor een gekorreld uiterlijk heeft, en het zacht endoplasmatisch reticulum, zonder ribosomen. figuur 51: Schematische voorstelling van het endomembraanstelsel (Tortora et al, 2007) Het ruw endoplasmatisch reticulum (ER) vervoert de eiwitten die geassembleerd worden op de ribosomen, en bedoeld zijn om door de cel uitgescheiden te worden. De polypeptideketens glijden door de poriën in de wand van het ER en komen terecht in de ruimte omgeven door het membraan (de cisternale ruimte of ER-lumen). Vaak wordt in de cisternale ruimte een koolhydraat aan de eiwitten toegevoegd, zodat een glycoproteïne gevormd wordt (post-translationele modificatie). Daarna omwikkelt het ER de uit te scheiden stoffen met een membraan,  12 zodat een blaasje (Eng.: vesicle) ontstaat. Deze blaasjes transporteren de glycoproteïnen door het cytoplasma richting celmembraan (=secretie). Naast haar functie in de secretie van producten, staat het ruw endoplasmatisch reticulum ook in voor de aanmaak van membranen. Deze kunnen aan het bestaande ER vastgehecht blijven, of naar andere delen van de cel bewegen onder de vorm van transportvesikels. Het glad endoplasmatisch reticulum kan verschillende functies hebben, naargelang het type cel. Zo kan het tussenkomen in de synthese van lipiden, het metabolisme van koolhydraten, en de detoxificatie van giftige stoffen. Levercellen zijn gespecialiseerd in het onschadelijk maken van giftige stoffen. Dit gebeurt meestal door het toevoegen van hydroxylgroepen aan de giftige moleculen, waardoor die meer oplosbaar worden en gemakkelijker uit het lichaam kunnen verwijderd worden. De opname van barbituraten, alcohol, en andere drugs veroorzaakt een proliferatie van glad ER in de levercellen. Dit leidt op langere termijn tot een hogere tolerantie t.o.v. de drugs, waardoor hogere dosissen nodig zijn om hetzelfde effect te veroorzaken. Bovendien kan de ontwikkeling van het ER ook de tolerantie t.o.v. andere (nuttige) drugs verhogen. 6.2.5.2 Het Golgi-apparaat Na het ER verlaten te hebben, bewegen vele vesikels richting Golgiapparaat. In het Golgi-apparaat worden de producten van het ER omgebouwd en opgeslagen, om later naar andere bestemmingen verscheept te worden. Het is dan ook niet verwonderlijk dat vooral de cellen van secretie-organen bijzonder veel Golgi-apparaten bezitten. Het Golgi-apparaat bestaat uit een serie afgeplatte zakken, een beetje zoals een stapel pitabroodjes (dyctiosomen). Aan één zijde van het organel (de cis-zijde) arriveren de blaasjes die werden afgesplitst door het ER. De vesikels fusioneren met de membranen van het Golgi-apparaat en ledigen hun inhoud in het lumen van het Golgi-apparaat. Aan de andere kant (de trans-zijde) ontstaan blaasjes met omgebouwde producten. Deze migreren naar het celmembraan, smelten samen met dit membraan en storten hun inhoud naar buiten. Dit is het proces dat exocytose (zie ook figuur) noemt. Dit is een vorm van blaasjestransport. Het Golgi-apparaat sorteert ook eiwitten naar de verschillende delen van de cel (apicale of basolaterale zijde). De weg van het aangemaakte eiwit in het RER tot aan het plasmamembraan (PM) wordt hieronder in de figuur getoond.  13 figuur 52: Golgi-apparaat (links) en de sorteerfunctie (rechts) (Tortora et al, 2007) figuur 53: exocytose: het versmelten van een vesikel met het PM zodat het zijn inhoud naar buiten stort figuur 54: weg dat een eiwit, gevormd in het RER volgt totdat het gesecreteerd wordt, namelijk van RER , Golgi naar PM Lysosomen  14 Lysosomen zijn membraanzakjes gevuld met hydrolytische enzymen zoals proteasen, sacharidasen, lipasen, nucleasen, respectievelijk bestemd voor de afbraak eiwitten, polysachariden, vetten, nucleïnezuren. Deze enzymen werken optimaal bij een lage pH (ongeveer 5), en de membranen van de lysosomen zorgen hiervoor door constant H+-ionen binnen te pompen. Tenminste een aantal lysosomen ontstaan aan de trans- zijde van de Golgi-apparaatjes. Ze worden aangemaakt als primaire lysosomen (zie figuur hieronder). figuur 55: vorming van de primaire lysosomen aan transzijde van het olgi-apparaat (Farabee, 2007) Lysosomen staan in voor de intracellulaire vertering. Dit gebeurt doordat het partikel of vloeistof door endocytose wordt opgenomen. Sommige eencellige, zoals amoeben, eten door kleinere organismen volledig te omstulpen. Dit proces heet fagocytose. De aldus gevormde voedselvacuole fusioneert met een lysosoom, en de verteringsenzymen beginnen aan hun werk. Dit fusieblaasje wordt een secundair lysosoom genoemd (zie figuur hierboven). Wat overblijft, is een restlichaampje met onverteerd materiaal, dat vaak terug uit de cel wordt verwijderd via exocytose (zie figuur hieronder)  15 figuur 56: fusie van een endocytotisch vesikel met een lysosoom. Na vertering of digestie ontstaat een restlichaampje dat via exocytose het afval uit de cel verwijdert (Farabee, 2007) Ook sommige menselijke cellen doen aan fagocytose, bijvoorbeeld om bacteriën en andere indringers te vernietigen. Een specifieke vorm van endocytose is pinocytose, waarbij vloeistof in de cel opgenomen wordt. Ten slotte is er ook een receptor gemedieerde endocytose (zie onderstaande figuur) figuur 57: de verschillende vormen van endocytose De enzymen van de lysosomen worden ook aangewend om eigen organisch materiaal te recycleren. Dit proces heet autofagie. Het lysosoom omstulpt dan een ander organel, of een deel van het cytoplasma (zie onderstaande figuur).  16 figuur 58 : Fagocytose (een vorm van endocytose) (links) en autofagie (rechts) 6.2.5.3 Peroxisomen Een peroxisoom/peroxysoom is een celorganel dat door een enkel membraan omgeven is. Christian de Duve ontdekte deze celorganellen in 1965. Levercellen bevatten vele peroxisomen. Deze organellen vermenigvuldigen zich door binaire deling. Peroxisomen bevatten oxidatieve enzymen en zijn o.a. betrokken bij de afbraak van lange vetzuurketens. Bij deze afbraak ontstaat waterstofperoxide (H2O2). Waterstofperoxide is een heel reactieve stof die de cel kan beschadigen. Peroxisomen bevatten echter ook enzymen, namelijk katalasen, om het peroxide om te zetten tot water en zuurstofgas (Albrechts, 2013). 6.2.5.4 Vacuolen Vacuolen en vesicles (vesikels) zijn beiden zakvormige structuren, omgeven door een membraan, maar vacuolen zijn groter dan vesicles. Ze kunnen verschillende functies verzorgen. Voedselvacuolen, gevormd door fagocytose werden hierboven al aangehaald. Vele protisten hebben contractiele vacuolen, die een teveel aan water de cel uitpompen. Volwassen plantencellen bezitten een grote centrale vacuole, die dient als stockageplaats voor organisch materiaal en voor anorganische ionen (vb. Na+ en Cl-), en als stortplaats voor gevaarlijke bijproducten van het metabolisme. De opvallend kleuren van bloemblaadjes ontstaan door de aanwezigheid van pigmenten in de onsmakelijke stoffen die de plant moet beschermen tegen dieren.  17 tonoplast vacuole figuur 59:Schematische voorstelling van een plantencel, met de centrale vacuole 6.2.6 Mitochondria Mitochondria (of mitochondriën) worden omgeven door twee membranen, elk bestaande uit een fosfolipiden bilayer met een unieke verzameling eiwitten. Het buitenste membraan is glad, maar het binnenste vertoont vingerachtige instulpingen (cristae), waardoor het zijn oppervlakte aanzienlijk vergroot. figuur 60: Schematische voorstelling van een (doorgesneden) mitochondrion (Tortora et al, 2007) In de mitochondriale matrix en op de binnenste mitochondriale membraan bevinden zich de eiwitten die instaan voor de respiratie, het katabole proces waarbij ATP gegenereerd wordt door energie te onttrekken aan suikers, vetten e.a. die ‘verbrand’ (=d.m.v. zuurstof afgebroken worden tot koolzuurgas en water) worden. In de matrix van de mitochondria neemt de Krebscyclus plaats en op de binnenste membraan gebeurt de oxidatieve fosforylering: het proces van elektronenoverdrachten en waarbij uiteindelijk ATP gegenereerd wordt. De binnenste membraan is sterk ingestulpt (cristae) waardoor het membraanoppervlak enorm vergroot. De mitochondria zijn dus de motoren of energiefabriekjes van de cel. Dit proces van oxidatieve fosforylering gebeurt in bacteriën op het plasmamembraan.  18 Mitochondria bezitten een merkwaardig grote autonomie binnen de cel en men noemt ze dan ook semiautonoom. Ze hebben zelf ribosomen en bezitten een circulaire DNA-dubbelstreng. Hun membraaneiwitten worden niet aangemaakt door het ER, maar door vrije ribosomen en door ribosomen in de mitochondria zelf. 6.2.7 Plastiden Plastiden zijn een groep organellen die enkel in planten aangetroffen worden. Amyloplasten zijn kleurloze plastiden die zetmeel stockeren in wortels en knollen. Chromoplasten zitten vol pigmenten, en geven fruit en vruchten hun oranje en gele kleuren. Chloroplasten bevatten het groene pigment chlorofyl, enzymen en andere moleculen die een rol spelen bij de fotosynthese, het proces waarbij planten zonne-energie aanwenden om suikers aan te maken uit water en CO2. Chloroplasten zijn omkapseld door een enveloppe bestaande uit twee nauw aansluitende membranen. Binnenin het organel zitten nog meer membranen, georganiseerd in platte zakken (thylakoïden). Vaak zijn deze thylakoiden opgestapeld als munten, aldus structuren vormend die men grana noemt. granum stroma dubbele membraan thylakoid lumen figuur 61: Schematische voorstelling van een doorsnede door een chloroplast Net zoals mitochondria bezitten ze eigen DNA en ribosomen en zijn ook semiautonoom. Over de chloroplasten wordt hetzelfde beweerd als over de mitochondria; het zouden endosymbionten zijn, ontstaan uit ééncellige algen. Vermoedelijk drongen de chloroplasten de eukaryote cel later binnen dan de mitochondria (namelijk na de splitsing van planten en dieren). Men spreekt daarom vaak over de theorie van seriële endosymbiose.  19 6.2.8 De endosymbionttheorie Volgens een theorie bedacht door de Rus Mereschkovsky en ontwikkeld door de Amerikaanse Margulis, waren de voorouders van de mitochondria aërobe heterotrofe prokaryoten, die op één of andere manier in een eukaryote cel verzeild geraakt zijn. Mogelijks werden ze opgenomen door fagocytose, maar niet verteerd. Of waren het oorspronkelijk parasieten. Hoe dan ook, de eukaryote cellen, die zelf anaeroob waren, ondervonden al snel voordeel van de gast, omdat die in staat was om zuurstof te gebruiken om energie te winnen uit koolhydraten. Mitochondria zouden dus een soort endosymbionten kunnen zijn, cellen die binnen andere cellen leven. Er bestaan inderdaad gelijkenissen tussen moderne prokaryoten en mitochondria. Mitochondriale enzymen, ribosomen en transportsystemen lijken meer op die van bacteriën dan op die van de rest van de eukaryote cellen. Mitochondria vermenigvuldigen zich door een proces van ontdubbeling dat sterk lijkt op wat waargenomen wordt bij bacteriën. Het cyclische DNA dat aangetroffen wordt in de mitochondria lijkt qua basensequentie sterk op het DNA van protisten. In 1970 zette Lynn Margulis voor het eerst in "The Origin of Eukaryotic Cells" haar argumenten op een rijtje: chloroplasten en mitochondria hebben hun eigen cirkelvormig DNA (zoals prokaryoten) en hun eigen ribosomen (waarvan de samenstelling goed overeenkomt met die van de prokaryoten) zij hebben een systeem waardoor ze op beperkte schaal eiwitten kunnen maken (zij bezitten o.a. t-RNA moleculen) mitochondria en chloroplasten vermenigvuldigen zich onafhankelijk van de cel waarin ze voorkomen mitochondria en chloroplasten zijn net als bacteriën gevoelig voor bepaalde antibiotica mitochondria en chloroplasten worden omgeven door een dubbele membraan. De buitenste membraan zou afkomstig zijn van een instulping van de membraan van de waardcel of gastheercel en de binnenste zou een overblijfsel zijn van de plasmamembraan van de endosymbiont. Zoals vaak het geval is in de wetenschappelijke wereld stuitte haar theorie in het begin op heel wat verzet. Het zou dan ook nog verschillende jaren duren vooraleer haar theorie algemeen aanvaard zou worden. In 1981 publiceerde zij "Symbiosis in Cell Evolution", een nieuwe versie van de thesis die zij in haar eerste boek had verdedigd. De uiteindelijke erkenning kwam er in 1983 toen zij verkozen werd als lid van The National Academy of Sciences.  20 figuur 62: chloroplasten (en ook mitochondria) ontstonden door endosymbiose 6.2.9 Het cytoskelet De organellen dobberen niet zomaar rond in het cytoplasma, maar zitten ingebed in een netwerk van vezels, het cytoskelet. Het cytoskelet zorgt voor structurele steun en voor de mobiliteit van cellen. Speciale onderdelen, de motormoleculen, veroorzaken de bewegingen van ciliën en flagellen; ze zorgen er ook voor dat spiercellen kunnen samentrekken. De organellen gebruiken het cytoskelet ook als een soort monorail om zich doorheen de cel te verplaatsen. Ciliën en flagellen zijn draadvormige structuren aan de buitenzijde van cellen, die instaan voor de beweging. Ze worden aangetroffen bij vele ééncelligen, maar ook bij zaadcellen van dieren, algen en sommige planten. De ciliën op de cellen van organen dienen om vloeistof over het weefsel te laten vloeien. De cellen die de luchtpijp van de mens aflijnen, bijvoorbeeld, verwijderen zo mucus met afvalpartikeltjes uit de longen. Flagellen en ciliën verschillen onderling in lengte, aantallen per cel en bewegingspatroon. Flagellen zijn 10 tot 200 µm lang, vertonen een golfvormige beweging, en komen gewoonlijk alleen of in kleine aantallen per cel voor. Ciliën zijn 2 tot 20 µm lang, bewegen als roeiriemen, en komen in grote aantallen per cel voor. Beide structuren zitten vol microtubuli, één type vezels dat onderdeel uitmaken van het cytoskelet. Het inwendig raamwerk van de cel wordt gevormd door eiwitten die draadvormige of fibrillaire filamenten en buisjes vormen. Dit zijn de microfilamenten, intermediaire filamenten en microtubuli. De samenstelling en functie staat in onderstaande tabel. Tabel 7 cytoskeletale filamenten cytoskeletonderdeel Bestanddeel Functie  21 microtubuli tubuline Beweging van chromosomen (spoelfiguur) Ciliën- en flagellenbeweging, transport en beweging van organellen microfilamenten actine Vorm behouden van de cel, maar ook flexibiliteit verzekeren (amoeboïde beweging) Intermediaire filamenten Keratine-achtige Celvorm handhaven, eiwitten fixatie van organellen figuur 63: doorsnede door een eukaryote flagel, met microtubuli. 6.2.10 De celwand Bij plantencellen wordt de cel bovendien nog eens omgeven door een celwand, bestaande uit cellulose en enkele andere polysachariden en eiwitten. Bij fungi bestaat de celwand uit chitine. De wand beschermt de cel, houdt haar in de juiste vorm, en voorkomt overmatige opname van water. 6.2.11 Vergelijking tussen de morfologie pro- en eukaryote cellen Een vergelijking tussen prokaryote en eukaryote cellen toont dat de cellen verschillen op het gebied van grootte, kernstructuur, organisatie van het cytoplasma, opbouw van ribosomen, samenstelling van het  22 cytoplasmamembraan en opbouw van de celwand, …. Een samenvatting wordt in onderstaande tabel gegeven. Tabel 8 vergelijking tussen pro- en eukaryote cel* Structuur of organel Prokaryoot Eukaryoot Grootte klein (1µM) groter (10-100µM) Kern Geen Kern met dubbel kernmembraan DNA Circulair eenvoudig genoom Chromosomen bestaande uit dna en eiwitten (histonen), chromatine dus Soms ook plasmiden Ribosomen 70s 80s Plasmamembraan Vloeibare mozaïekmodel met Vloeibare mozaïkmodel met hopanoïden sterolen Geen endo- en pinocytose Wel endo- en pinocytose (en exocytose) Interne membraansystemen Afwezig Endoplasmatisch reticulum (ruw en glad) Golgi apparaat Lysosomen en peroxysomen Celwand Peptydoglycaanlaag Dieren: geen celwand Planten: cellulose Fungi: chitine Organellen Geen Kern, mitochondria, chloroplasten (bij planten) Flagellen Ja, maar flagel andere Ja bv op structuur dan bij eukaryoten luchtwegenepitheelcellen en bij spermacellen. Tubuline is Pili belangrijkste eiwit van de Ja, aanhechting- en sekspili flagel Geen pili Groei en voorplanting Binaire fisie Groei en vegetatieve voortplanting door mitose Geslachtelijke voortplanting door meiose Oefeningen en opdrachten 6.3 Oefenvragen hoofdstuk 6: eukaryote cel Wat is het voordeel van compartimentalisatie? De kern De kern bevat: (duid het juiste aan) O Chromosomen O Eiwitten O DNA O Mitochondria  23 De kern is omsloten door een (duid het juiste aan) O Dubbele membraan O Enkelvoudige membraan Chromatine bestaat uit O DNA plus histonen O RNA plus histonen O DNA en koolhydraten O DNA en eiwitten Een nucleosoom is O Histoneiwitten waarrond een deel van de DNA-dubbelhelix is gewonden O De plaats van rRNA-synthese O Een onderdeel van een chromosoom O De kern Ribosomen Ribosomen zijn enkel opgebouwd uit eiwitten. O Juist O Fout Ribosomen bestaan uit 1 geheel O Juist O Fout Ribosomen van prokaryoten en eukaryoten zijn identiek O Juist O Fout Geef aan of de volgende stelling juist of onjuist is. Als een stelling onjuist is moet je uitleggen waarom. ‘Vrije ribosomen en membraangebonden ribosomen zijn structureel identiek.’ Wat is de nucleoli, wat gebeurt er hier? In welke celcompartiment worden de ribosomen hoofdzakelijk geassembleerd? Leg uit. Golgi-apparaat en lysosomen Noem enkele functies van het Golgi-apparaat Het Golgi-apparaat is gepolariseerd. Welke zijden onderscheid je in het Golgi- apparaat Wat bedoelt men met blaasjestransport? Wat is exocytose en endocytose?  24 Lysosomen bevatten waterstofperoxide O Juist O Fout Lysomen bevatten eiwitten. Verklaar O Juist O Fout Lysomen komen als primair, secundair lysosoom en restlichaampje voor. Leg uit aan de hand van een schema Autolyse en autofagie worden bewerkstelligd door O Peroxysomen O lysosomen Peroxysomen bevatten O Hydrolytische enzymen O Enzymen die de vorming van waterstofperoxide bevorderen O Katalasen: enzymen die waterstofperoxide afbreken Chloroplasten en mitochondriën Bijgevoegde fotografische afbeelding geeft de elektronenmicroscopische opname van een organel (P) van een cel. (vergroting 50.000x) Wat is de belangrijkste functie van dit organel? a Het transporteren van eiwitten b Het vormen van eiwitten uit aminozuren c Het vormen van ATP, met behulp van energie uit zonlicht d Het vormen van ATP, met behulp van energie uit organische stoffen Geef 3 overeenkomsten tussen chloroplasten en mitochondriën Waaraan ontlenen mitochondria en chloroplasten hun semi-autonoom karakter? Chloroplasten bevatten O Grana O Cholesterol O Chlorofiel O enzymen Leukoplasten bevatten ook pigmenten. O Juist O Fout, ze zijn ongekleurd en bevatten zetmeel. Vacuolen en celwanden Een tonoplast is ………………………..van een vacuole. Een plantencelwand bestaat hoofdzakelijk uit lipiden.  25 O Juist O Fout Cytoskelet Wat is het cytoskelet? Noem 3 cytoskeletonderdelen en vermeld waaruit ze zijn opgebouwd. Vermeld tevens hun voornaamste functie. Cytoskeletonderdeel Bestanddeel Functie Tubuline vinden we terug in ciliën O Juist O Fout Samenvattend Geef minstens 1 functie van de onderstaande organellen. Organel Functie Chloroplast Mitochondrion Microtubule Lysosoom Kern  26 Ruw endoplasmatische reticulum Golgi-apparaat *Een vergelijking van de celstructuur van een prokaryote en een eukaryote cel kunnen maken Noem de verschillen tussen een eukaryote en prokaryote cel Structuur/organel Prokaryoot Eukaryoot Beschrijf hoe en waar een secretorisch eiwit gesynthetiseerd wordt en getransporteerd wordt door de cel. (geen antwoord geformuleerd, dit wordt in de les behandeld) 7 Hoofdstuk 7 - Nucleïnezuren en hun functie: transcriptie, translatie en replicatie 7.1 Leerdoelen Leerdoelen Nucleïnezuren *De 3 onderdelen van een nucleotide herkennen, aanduiden en benoemen. Het verschil aangeven tussen een nucleotide en een nucleoside. *De algemene structuur van de DNA-dubbelhelix aangeven. *Het verschil tussen RNA en DNA samenvatten en beide structuren herkennen en beschrijven. Transcriptie en translatie  27 *Het centrale dogma beschrijven en de termen ‘replicatie, transcriptie en translatie’ correct gebruiken. *Genexpressie verklaren en hierbij het transcriptie en translatieproces verduidelijken *Het proces van transcriptie en translatie beschrijven. De belangrijkste componenten/enzymen betrokken bij deze processen verklaren. *Van een gegeven DNA-streng de complementaire streng en de mRNA-streng kunnen neerschrijven. Op correcte wijze de 5’- en 3’kanten aanduiden. * De codontabel gebruiken om de sequentie van een eiwit te bepalen, startend van een DNA- of mRNA streng. Replicatie *Het proces van de replicatie beschrijven en de belangrijkste enzymen aangeven. Een replicatievork tekenen en de belangrijkste enzymen en onderdelen, betrokken bij het replicatieproces benoemen 7.2 Nucleïnezuren Nucleïnezuren of kernzuren, zijn net als polysachariden en proteïnen, biopolymeren. De monomeren zijn nucleotiden en bestaan uit een organische base, een pentose en een fosfaatgroep. Er bestaan twee typen nucleïnezuren: DNA (desoxyribonucleic acid; Eng) en RNA (ribonucleic acid, Eng.). Deze moleculen staan in voor de informatieoverdracht tussen opeenvolgende generaties organismen. DNA zorgt voor haar eigen replicatie, voor de synthese van RNA, en via RNA, voor de eiwitsynthese (zie hoofdstuk metabolisme). DNA is het genetische materiaal dat organismen erven van hun ouder(s). Het bevat alle informatie nodig om de werking van de cel te verzekeren, maar neemt niet rechtstreeks deel aan de celactiviteit. De genen op het DNA kunnen vergeleken worden met de software van een computer, die weliswaar alle gegevens bevat, maar toch randapparatuur nodig heeft om taken te kunnen laten uitvoeren. In de cel worden de taken van de randapparatuur uitgevoerd door de eiwitten. RNA speelt een rol tussen DNA en eiwit. Elk gen op de DNA-keten stuurt de synthese van een type RNA dat boodschapper-RNA (mRNA, messenger RNA) wordt genoemd. Dit mRNA geeft de boodschap door aan de  28 onderdelen van de cel die instaan voor de synthese van polypeptiden (de ribosomen). 7.2.1 Nucleotiden, de monomeren van nucleïnezuren (Rasquin, 2014) Ook nucleïnezuren zijn polymeren en bestaan uit monomeren die men nucleotiden noemt. Elke nucleotide is zelf opgebouwd uit drie onderdelen: een organische (stikstofhoudende) base een pentose (een suiker bestaande uit vijf koolstofatomen=pentose) een fosfaatgroep (PO43-). De stikstofhoudende basen Figuur 64: een nucleotide is opgebouwd uit een pentose (5-ring), een base (A, T, C of G in DNA of A,U,Cen G in RNA) en een fosfaatgroep. Men onderscheidt twee groepen basen: pyrimidinen en purinen. Tot pyrimidinen behoren cytosine (C), thymine (T) en uracil (U). Purinemoleculen zijn groter, bestaan uit een zesvoudige ring gekoppeld aan een vijfvoudige ring. Adenine (A) en guanine (G) zijn purinen. A, G en C worden in beide typen nucleïnezuren (DNA en RNA) aangetroffen; T komt enkel voor in DNA en U enkel in RNA.  29 figuur 65: De purines bestaan uit twee ringen (een 6 en een 5 ring) van koolstof en stikstof (boven). De pyrimidinen (onder) bestaan uit één ring van zes koolstof en stikstof-atomen. (Rasquin, 2014) De pentose De pentose die vasthangt aan de base is ribose (rechts) in RNA en deoxyribose (links) in DNA. De C-atomen in de ribosering zijn genummerd van 1’ t.e.m. 5’. De accenten dienen hier om het verschil duidelijk te maken met de nummering in de purines of pyrimidines. In de bazen worden C- en N-atomen immers genummerd van 1 tot 6 of van 1 tot 9. Figuur 66: Er komen slechts twee pentosen voor in de nucleotiden: desoxyribose (links) en ribose (rechts). DNA is opgebouwd op basis van desoxyribonucleotiden, RNA is opgebouwd op basis van ribonucleotiden. De pentose en base samen noemt men een nucleoside. Toevoeging van de fosfaatgroep vervolledigt de nucleotide.  30 Figuur 67: : het verschil tussen een nucleoside en een nucleotide De fosfaatgroep (aangeduid door een P met cirkel er rond) is afgeleid van fos forzuur. Opgepast ‘P’ zonder cirkel errond is gewoon het element fosfor. De namen van de nucleosides en nucleotides (RNA) en hun deoxyvorm (DNA) worden hieronder getoond en in onderstaande tabel opgelijst Figuur 68: bouwstenen van DNA en RNA (Scholte en Marree, 2011) Tabel 9: overzicht van de naamgeving Organische base Nucleoside Nucleoside(nucleotide) (nucleotide) met met desoxyribose ribose Adenine (A) adenosine(fosfaat) desoxyadenosine(fosfaat) Uracil (U) uridine(fosfaat) desoxyuridine(fosfaat)*  31 Guanine (G) guanosine(fosfaat) desoxyguanosine(fosfaat) Thymine (T) thymidine(fosfaat)* desoxythymidine(fosfaat) Cytosine (C) cytidine(fosfaat) desoxycytidine(fosfaat) * In de nucleïnezuren worden de nucleotiden aaneengeregen via een covalente binding (hier een fosfodiësterbinding), ook weer door een condensatiereactie tussen de 3’ –OH-groep van het eerste nucleotiden en de 5’-fosfaatgroep van het volgende nucleotide. Een gen bestaat uit honderden tot duizenden nucleotiden, zodat het aantal mogelijke basensequenties schier ongelimiteerd is. De betekenis van een gen ligt gecodeerd in de specifieke sequentie van de vier DNA-basen. De sequentie 5’AGGTAACTT3’ zal bijvoorbeeld tot een ander eiwit leiden dan de sequentie 5’CGTTTTAC3’. figuur 69: De structuur van nucleotiden en van polynucleotiden of nucleïnezuren (Rasquin, 2014). DNA bestaat eigenlijk uit twee ketens polynucleotiden die zich om een denkbeeldige as slingeren in een structuur die men de dubbele helix noemt. De twee ruggengraten bestaande uit suiker(=pentose) - en fosfaatgroepen zitten aan de buitenkant van de helix, de stikstofbasen zitten gepaard aan de binnenzijde. De twee polynucleotidenketens (of strengen) worden bij elkaar gehouden via waterstofbruggen tussen de basen. De paring van de basen gebeurt niet willekeurig. Adenine paart steeds met thymine, guanine steeds met cytosine. De basenparen van de twee strengen zijn dus volledig complementair: een sequentie 5’AGGTCC3’ in de ene streng moet gespiegeld worden door een sequentie 3’TCCAGG5’ in de andere streng.  32 Figuur 70: Twee complementaire DNA strengen Deze complementariteit is essentieel voor de replicatie van DNA en verantwoordelijk voor de overerving. De bindingen in de DNA-helix worden hieronder nog eens getoond figuur 71: De dubbele helixstructuur van DNA de basenparing en de soorten bindingen worden aangetoond (Tortora et al, 2007) In de voorbereiding van de celdeling wijken de beide strengen uit elkaar en dienen  33 als sjabloon voor de aanmaak van nieuwe strengen. Deze (nagenoeg) identieke kopieën worden dan doorgegeven aan de dochtercellen (zie verder). De lineaire sequentie van de nucleotiden in DNA-moleculen kan gebruikt worden om de verwantschap tussen soorten na te gaan. Meer verwante soorten (d.w.z. soorten die recent uit een gemeenschappelijke voorouder zijn ontstaan) zouden een grotere overeenkomst in nucleotidensequentie moeten vertonen dan minder verwante soorten. Dezelfde redenering gaat op voor de aminozuursequentie in eiwitten (zie ook hoofdstuk classificatie). 7.3 De eiwitsynthese : de weg van gen tot eiwit Hier bespreken we kort hoe de genetische informatie, opgeslagen in het DNA, vertaald wordt door de cel. Dit is het proces van genexpressie. Reeds in het begin van deze eeuw suggereerde de Brit Archibald Garrod dat genen het uiterlijk van organismen zouden bepalen via enzymen. Later onderzoek wees inderdaad uit dat elk enzym in de cel geproduceerd wordt op commando van een gen. Dit leidde tot de formulering van de ‘one gene – one enzyme hypothese’. Deze hypothese werd daarna ietwat aangepast, omdat genen soms eiwitten laten aanmaken die géén enzymen zijn (vb. keratine, insuline). Men ging daarom spreken van de ‘one gene – one protein’ regel. Maar ook dat klopt niet helemaal: we hebben reeds gezien dat sommige eiwitten uit verschillende polypeptidenketens kan bestaan (vb. hemoglobine). Omdat elke polypeptidenketen in zo’n eiwit door een eigen gen wordt gedicteerd, was het correcter om van de one gene – one polypeptide hypothese te gewagen. Tegenwoordig weten dat ook deze stelling moet bijgestuurd worden omdat één eukaryotisch gen, verschillende polypeptiden kan aanmaken. Hoe ‘dicteert’ het DNA de aanmaak van een polypeptidenketen? De informatieoverdracht van gen naar eiwit lijkt sterk op de vertaling van een stuk tekst. De boodschap ligt in het DNA opgeslagen in een alfabet van vier nucleotiden (A,C,T,G) en moet omgezet worden in de taal van de eiwitten, die bestaat uit 20 mogelijke ‘letters’ (de aminozuren). De omzetting vergt twee stappen: de transcriptie en de translatie. 7.3.1 Transcriptie  34 Onder transcriptie verstaat men de synthese van enkelstrengs RNA naar het evenbeeld van een stukje DNA. Transcriptie start met de binding van RNA-polymerase ter hoogte van een specifieke regio op het DNA, namelijk de promotor. Het enzym doet het DNA ter hoogte van het bewuste gen uit elkaar wijken. RNA-nucleotiden zetten zich neer op de vrijgekomen plaatsen. Dit gebeurt complementair: op vrije guaninenucleotiden komen enkel cytosine-nucleotiden en vice-versa, op vrije thymine-nucleotiden komen adenine-nucleotiden en op adenine- nucleotiden komen uracil-nucleotiden. Een nieuwe streng groeit steeds aan van 5’ (fosfaatzijde van het nucleotide) naar 3’-richting (de 3’ OH-groep). Een hypothetische gen 3’ ACCAAACCGAGT 5’ wordt dus overgeschreven in een complementair stuk RNA, met sequentie 5’UGGUUUGGCUCA3’. Men noemt dit type RNA, messenger-RNA (mRNA), omdat het de genetische boodschap gaat overbrengen aan de eiwitsynthesemachinerie van de cel. Het enzym dat de aangroei of polymerisatie bewerkstelligt is RNApolymerase. RNA- polymerase figuur 72: Transcriptie van DNA naar m-RNA. De start van transcriptie, de binding dus van RNA-polymerase op de promotor is de initiatiestap; het synthetiseren van de mRNA-streng is de de elongatiestap en via een bepaald signaal, eindigt de transcriptie en deze stap wordt de terminatiestap genoemd. 7.3.2 Translatie Onder translatie verstaat men de eigenlijke synthese van een polypeptidenketen, onder directie van het mRNA. Hier gaat het om een echte vertaling, want de cel moet de sequentie of de opeenvolging van de basen van de mRNA-molecule omzetten in een aminozuursequentie. Dit gebeurt door de ribosomen. Hoe kunnen 4 verschillende nucleotiden coderen voor 20 verschillende aminozuren? Als elke nucleotide individueel zou coderen voor één aminozuur, zouden slechts 4 aminozuren kunnen gespecificeerd worden. Combinaties van twee nucleotiden voor één aminozuur volstaan ook niet: er bestaan immers maar 16 mogelijke combinaties (42) : AA, AC, AG, AU, CA, CC, CG, CU, GA, GC, GG, GU, UA, UC, UG en UU. Tripletten zijn de kleinste  35 eenheden van gelijke lengte die alle aminozuren kunnen coderen. Ze kunnen 64 (43) codewoorden vormen. Dit volstaat ruimschoots voor 20 aminozuren. In het begin van de jaren ‘60 werd de genetische code volledig gekraakt. Ze bestaat inderdaad uit tripletten nucleotiden, die elk een specifiek aminozuur coderen (tabel) Tabel 10: Codontabel of woordenboek van de genetische code. Deze tabel geeft de 64 (43) mogelijke codons met de bijbehorende aminozuren. De aminozuren zijn ook aangeduid met de drieletterige schrijfwijze (en de één letterige afkorting). De basentripletten met hun overeenkomstige aminozuren. Merk op dat verschillende tripletten dezelfde aminozuurbetekenis kunnen hebben (vb. UUU en UUC zijn synoniem); dat AUG kan coderen voor methionine, maar ook een startsignaal kan betekenen voor de synthese; en dat er drie stop-tripletten zijn, waar de translatie ophoudt. Het AUGcodon codeert voor methionine en dient tevens als startpunt; de eerste AUG in een mRNA is de plaats waar de translatie begint Omdat bij de vorming van proteïnen de volgorde van de aminozuren niet wordt bepaald door aflezen van het DNA, maar wel van RNA, wordt de genetische code gebruikelijk voorgesteld aan de hand van de ribonucleotiden. Vermits (zie ook verder) dit (m)RNA afgelezen wordt in de 5’3’ richting, worden de nucleotiden van de tripletten gegeven volgens de 5’3’ richting. Hieronder vind je enkele andere voorstellingen van codontabellen. Tabel 11 alternatieve voorstellingen van codontabellen  36 Om het hierboven aangehaalde voorbeeld te vervolledigen: de mRNA keten met sequentie 5’ UGGUUUGGCUCA 3’ zal vertaald worden in een polypeptidenketentje met volgende aminozuren: Trp – Phe – Gly – Ser. De translatie start met de binding van de kleine subunit van het ribosoom aan het 5’ van het mRNA. De kleine subeenheid gaat vanaf het 5’ uiteinde op zoek naar het eerste AUG-codon (=startcodon), waarmee het leesraam wordt vastgelegd. Dan verenigt de grote subeenheid zich met de kleine en wordt de vertaling verdergezet. Het/de initiatieproces/stap wordt gemedieerd door verschillende initiatiefactoren. De eigenlijke vertaler is een ander type RNA, het transport-RNA (tRNA). Het tRNA brengt de aminozuren uit het cytoplasma naar de ribosomen, waar het RNA ligt te wachten. Er zijn verschillende types tRNA, elk gespecialiseerd in het transporteren van één type aminozuur. Welk aminozuur een molecule t-RNA zal vervoeren, hangt af van drie nucleotiden aan het uiteinde van de molecule. Een anticodon is steeds de complementaire code. Hieronder is het startcodon dus 5’AUG3’ (op het mRNA) en het anticodon (op het tRNA) is ‘3’UAC5’. ‘Met’ is methionine, het aminozuur dat aan dit specifieke tRNA is gehecht.  37 figuur 73: Een tRNA molecule met een aminozuur (Met) bindt via zijn anticodon UAC op het mRNA dat zich op de kleine subeenheid van het ribosoom bevindt Terwijl een lint mRNA door een ribosoom wordt getrokken, brengen tRNAmoleculen aminozuren aan, die aaneengeregen worden tot een polypeptiden-keten. Het eerste basentriplet uit het voorbeeld (UGG) trekt een tRNA-molecule aan met anticodon ACC. Die heeft achteraan een basentriplet UGG, en brengt dus Trp aan. Het tweede basentriplet lokt een t- RNA met AAA-anticodon, en dus een Phe. Die wordt door de enzymen in het ribosoom vastgehaakt aan het Trp, en zo gaat de assemblage van het eiwit voort (elongatiestap). Uiteindelijk eindigt elk stuk mRNA met een UAA, UAG of UGA basentriplet (stopcodon), waarvoor geen tRNA en een aminozuren bestaan. Daardoor stopt het aflezen (terminatiestap). Eén ribosoom kan een polypeptide van gemiddelde lengte assembleren in minder dan één minuut. In de regel zal één lint mRNA echter door verschillende ribosomen tegelijkertijd afgelezen worden. Een rijtje ribosomen dat tegelijkertijd mRNA aan het vertalen is, noemt men polyribosomen of polysomen. figuur 74 polyribosoom Tijdens en na de synthese beginnen de polypeptidenketens zich spontaan te plooien tot de driedimensionale structuur of conformatie die vereist is voor  38 een goede werking als vb. enzym. Kleine veranderingen aan de aminozuren, koppelingen met suikers, vetten, fosfaatgroepen kunnen nog nodig zijn in eukaryoten. Soms moeten verschillende ketens ook gecombineerd worden om tenslotte een volledig functioneel eiwit te verkrijgen. Bij eukaryoten gebeurt transcriptie in kern en translatie in het cytoplasma. Aangezien prokaryoten geen kern hebben, start translatie zodra het 5’ vrije uiteinde van de mRNA-molecule loskomt van de antisense DNA-streng, ook al is de transcriptie nog niet beëindigd. Bij prokaryoten gebeurt de transcriptie en translatie tegelijkertijd, waar bij eukaryoten transcriptie en translatie gescheiden zijn in plaats en tijd. In onderstaande figuren wordt het proces weergegeven. figuur 75: de translatie met initiatie-, elongatie- en terminatiestap Studietip Kijk ook vooral naar ‘Bioplek’ waar je deze processen geanimeerd kan volgen. 7.3.3 Overzicht van transcriptie en translatie  39 figuur 76: overzicht van transcriptie en translatie (Rasquin, 2014) 7.4 DNA-replicatie 7.4.1 DNA-replicatie in eukaryoten Wanneer cellen delen, krijgen beide dochtercellen een foutloze kopie (op een paar mutaties na) van het DNA van de moedercel. De ontrafeling van de structuur van het DNA, legde meteen het mechanisme van het verdubbelen van het DNA (de replicatie) bloot. Deze replicatie grijpt plaats in de synthese- of S-fase van de celcyclus bij eukaryoten (zie celdeling).  40 De complementaire structuur van beide strengen ligt aan de basis van de replicatie. Beide strengen gaan uiteen, en ten opzichte van elke base hecht zich een complementaire base. Hier wordt de beschrijving gegeven van de replicatie bij eukaryoten. Deze van prokaryoten verloopt echter zeer gelijkaardig, maar is eenvoudiger, omdat er minder verschillende enzymen betrokken zijn. Replicatie begint met het uiteenwijken van beide strengen ter hoogte van welbepaalde sequenties (origin of replication, ori). Het DNA wordt er door een enzym DNA-helicase (en topo-isomerase) ontwonden. Hierdoor ontstaan replicatievorken. DNA-primase maakt een korte RNA-primer (= korte keten van ribonucleotiden die als startpunt voor de verder synthese van DNA dient) aan, een dertigtal RNA-nucleotiden die het mogelijk maakt dat DNA-polymerase desoxyribonucleotiden polymeriseert. Eenmaal de RNA-primer gebonden, kan DNApolymerase aan het 3’-uiteinde van de primer of groeiende nucleotideketen/streng, molecule voor molecule desoxyribonucleotiden (complementair aan de ‘template’-streng) binden. figuur 77: de DNA replicatievork. De synthese van nieuwe strengen is hier te zien. Deze vorm van replicatie wordt ook semi-conservatieve replicatie genoemd. Wanneer DNA-helicase beide DNA-strengen ontwindt, ontstaan twee enkelstrengige DNA-regio’s. Omdat de twee strengen antiparallel zijn en DNA-polymerase enkel nieuwe nucleotiden kan binden aan een vrij 3’ uiteinde (synthese 5’3’), kan slechts één van de strengen continu worden gevormd wanneer de replicatievork verschuift. De nieuwe DNA-streng die continu wordt gevormd, wordt de “leading strand” genoemd. De andere streng (3’-5’) van de replicatievork wordt discontinu afgeschreven en de “lagging strand” genoemd. Net zoals de leading strand bindt DNApolymerase, nucleotiden aan het 3’-einde van de primer (5’-3’) aan. Naarmate de replicatievork opschuift, wordt hierdoor een stuk DNA aan het 5’ einde van de primer (‘stroomopwaarts’) enkelstrengig. Omdat DNApolymerase geen nucleotiden kan binden aan het 5’ uiteinde van de primer, moet ter hoogte van de replicatievorm een nieuwe RNA-primer worden gevormd. DNA-polymerase bindt aan het 3’ uiteinde van deze primer nieuwe nucleotiden tot aan de eerstvolgende primer. Met andere woorden: één van de strengen van een replicatievork wordt continu afgeschreven (waardoor de leading strand ontstaat), de andere discontinu. De korte RNA/DNA-strengen van de lagging strand worden Okazaki-fragmenten genoemd. Een DNA-polymerase verwijdert de RNA- primers en vervangt ze door DNA-nucleotiden. DNA-ligase bindt vervolgens de enkelstrengige breuken die overblijven (hecht losse fragmenten aan elkaar).  41 De snelheid van replicatie bedraagt ca. 50 baseparen per seconde. Omdat er duizenden ‘origins of replication’ verspreid zijn over het DNA, kan het ganse DNA gerepliceerd worden in amper een uur. Verder valt op te merken dat DNA-polymerase over een “proofreading” mechanisme beschikt (het enzym controleert of het nieuw gebonden nucleotide complementair is aan dat op de moederstreng=sjabloon), waardoor gemiddeld genomen maar 1 fout nucleotide per 107 wordt ingebouwd (error rate). Zeker in eukaryoten bestaan verschillende DNA-polymerasen (α, δ, ε, …) en de ‘error rate’ verschilt van type tot type. figuur 78: de verschillende oorsprongen van replicatie (origin of replication) in een DNA dubbelstreng bij eukaryoten. De replicatie verloopt telkens bidirectioneel  42 figuur 79: de replicatievork schuift op wanneer DNA-polymerase zijn werk doet. De leading en lagging strand zijn duidelijk aangeduid. figuur 80: Detailbeeld van de RNA-primerverlenging door DNA-polymerase. De nieuwe gesynthetiseerde streng groeit aan van 5' naar 3'  43 figuur 81:het opschuiven van de replicatievork en de vorming van de Okazakifragmenten in de lagging strand. Het RNA-deel wordt later verwijderd en vervangen door DNA. Ligase zorgt er ten slotte voor dat de nicks (=gaatjes in 1 streng van de dubbelstreng waar twee nucleotide niet verbonden zijn via een fosfodiësterbinding) verdwijnen. 7.4.2 Replicatie in prokaryoten Zoals vermeld, verloopt de replicatie bij prokaryoten zeer analoog aan deze bij eukaryoten, maar is eenvoudiger. Er wordt slechts 1 replicatieblaasje of ‘bubble’ gevormd (en dus twee replicatievorken). Het aantal enzymen betrokken bij de replicatie is kleiner. In onderstaande figuur tonen we aan hoe het circulaire DNA van een bacterie ontdubbelt. Bij deze replicatie ontstaat een (=theta; Griekse hoofdletter T) -structuur.  44 figuur 82: Bidirectionele replicatie via de theta-structuur in prokaryoten 7.5 Oefenvragen hoofdstuk 7: nucleïnezuren en hun functie Oefeningen en opdrachten Structuren Bouwstenen van DNA en RNA zijn……... Geef de 3 onderdelen van de ‘DNA-bouwsteen’. Noem 2 belangrijke verschillen tussen RNA en DNA. A(denine) basenpaart steeds met T(hymine) en G(uanine), basenpaart steeds met C(ytosine). Welke en hoeveel bindingen treft men aan tussen deze basenparen?  45 Gegeven: 5’ ATTCCGTAAACGTG 3’ schrijf de complementaire streng op Replicatie, transcriptie en translatie Leg schematisch het centrale dogma uit. Vul in: Het overschrijven van DNA naar mRNA wordt …………….genoemd Het omzetten van mRNA naar eiwit wordt ……………………..genoemd Wanneer DNA zich verdubbelt noemt men dit ……………………………. Welke is het sleutelenzym dat betrokken is bij de overschrijving van DNA naar RNA? Een eiwit wordt aangemaakt in de kern van de eukaryote cel O Juist O Fout mRNA wordt aangemaakt in de kern van de eukaryote cel O Juist O Fout rRNA wordt aangemaakt in de kern van een eukaryote cel O Juist O Fout tRNA (zonder AZ) wordt aangemaakt in de kern van de eukaryote cel O Juist O Fout Som de componenten op die nodig zijn in het translatieproces Je hebt de volgende DNA-sequentie. Voor welke eiwit codeert deze DNAsequentie: 5’AUGAAGUUUGGCUAATTCCCTCTA3’ Wat is een start- en stopcodon? Waarvoor dienen ze? Welke van de volgende componenten is NIET diect betrokken bij translatie? O mRNA O DNA O tRNA O ribosomen  46 Welk bestanddeel wordt getransfereerd door tRNA? Wat bedoelt men met ‘gedegenereerde code’? Geef de 3 stadia in de translatie Replicatie Teken een replicatievork (vergeet niet de 5 en 3’ einden aan te duiden!) Wat is een RNA-primer? Wat is het verschil tussen leading en lagging strand? Wat zijn Okazakifragmenten? Waarom kunnen er geen 2 continue strengen gevormd worden? Wat bedoelt men met ‘proofreading’? Replicatie, transcriptie en translatie moet goed gekend zijn voor de cursus biologie. Oefen hiervoor op Bioplek. De antwoorden op deze vragen vind je terug op het elektronisch platform 8 Hoofdstuk 8 - Celdeling en de celcyclus bij de mens 8.1 Leerdoelen Leerdoelen De opbouw van een eukaryoot chromosoom beschrijven Het verschil duiden tussen haploïde en diploïde cellen en de notatie (2n, n) gebruiken. *De celcyclus beschrijven en de functie van elke fase verklaren.  47 *De essentiële gebeurtenissen in de mitotische deling schetsen en schematisch weergeven voor een aantal chromosomen. *De essentiële gebeurtenissen in de meiotische deling schetsen en schematisch weergeven voor een aantal chromosomen. *De functie van beide delingen verklaren. Onderstaande tekst, met toestemming overgenomen, gedeeltelijk overgenomen van Raoul Van Damme (2008). 8.2 Inleiding “Eén van de meest karakteristieke eigenschappen van levende wezens is dat ze zich voortplanten. De continuïteit van het leven is gebaseerd op het vermogen van cellen om zich te delen in genetisch equivalente dochtercellen. Het proces dat zich afspeelt vanaf haar ontstaan uit een ouderlijke cel tot haar eigen splitsing, noemt men de celcyclus. Bij ééncellige organismen, zoals Amoeba, komt celdeling neer op de vorming van een gans nieuw organisme. Bij meercelligen, inclusief de mens, zorgen miljoenen celdelingen ervoor dat een individu zich kan ontwikkelen uit één enkele cel, de bevruchte eicel. Zelfs bij volledig volgroeide individuen gaan de celdelingen door, om gedeelten van het organisme te vernieuwen, te herstellen of te vervangen. Menselijke rode bloedcellen hebben een gemiddelde levensduur van 120 dagen. Ze bevatten geen celkern en kunnen daardoor niet delen. Verouderde rode bloedcellen worden verwijderd en in de milt vernietigd door macrofagen. Om ze te vervangen worden in het beendermerg constant nieuwe rode bloedcellen aangemaakt, door deling van stamcellen (de erythroblasten). Een volwassen mens produceert dagelijks zo’n 200 miljoen rode bloedcellen, het equivalent van ca. 100 ml bloed. Een donatie van 500 ml kan op minder dan een week tijd gecompenseerd worden. Essentieel bij de celdeling is dat beide dochtercellen de genetische informatie uit de oudercel moet meekrijgen. Het ganse genoom (=het geheel aan erfelijke informatie vervat in het DNA) moet dus nauwkeurig gerepliceerd worden en zo verdeeld over de cel dat elke dochtercel een equivalent deel ontvangt. Dit wordt vereenvoudigd doordat het DNA  48 georganiseerd is in een aantal chromosomen bij eukaryoten (strengen DNA en bijhorende eiwitten). Het DNA of genoom van de mens omvat 3 miljard basenparen. Het bestaat uit coderende delen en niet-coderende delen. De coderende delen zijn genen en vertegenwoordigen tussen de 1-2% van het genoom. Genen bevatten de informatie om eiwitten te maken via transcriptie en translatie (zie vroeger). Niet coderende delen (ruim 98%) hebben structurele en regelfuncties. Vroeger was niet geweten of dit niet-coderend DNA wel een functie had en sprak men dan ook over ‘junk DNA’. Prokaryoten hebben slechts één circulaire DNA-streng en hun genoom is volledig coderend. De celdeling is een veel eenvoudig proces (zie microbiologie)”. 8.3 Chromosomen-vorm en opbouw 8.3.1 Chromatine, chromosomen en chromatiden. Als ruggensteun bij het begrijpen van dit en het volgende hoofdstuk worden hier een aantal vaktermen en feiten die met chromosomen en chromatiden samenhangen op een rijtje gezet: Chromosomen Chromosomen en chromatiden komen voor als staaf of draadvormige structuren in de celkern van eukaryote cellen. Prokaryoten hebben meestal slechts een enkele cirkelvormige chromosoom (we zullen er in deze cursus niet verder op ingaan). De naam chromosoom (uit het Grieks chroma = kleur en soma = lichaam) is oorspronkelijk afgeleid van het feit dat gedurende de celdeling chromosomen als kleurbare staafvormige lichamen waargenomen kunnen worden in een lichtmicroscoop. Chromatine Chromatine heeft een draadvormige structuur en is opgebouwd uit DNA, eiwitten (histonen en niet-histonen), alsook een kleine hoeveelheid RNA. Chromatine heeft twee stapelingenvormen: het euchromatine en het heterochromatine. Heterochromatine heeft een veel compactere structuur. Euchromatine daarentegen is minder dens. Wanneer chromosomen door een kleuringproces (Giemsakleuring) lichtmicroscopisch worden zichtbaar gemaakt of elektronenmicroscopisch worden bekeken, zal heterochromatine als donkere band zichtbaar zijn en euchromatine als een lichte band. Euchromatine bezit vooral actieve genen. Histonen worden gekenmerkt door een hoog gehalte aan basische (positief geladen) aminozuren (lysine en arginine). Ze beslaan 20 tot 30% van het histoneiwit. Histonen spelen een belangrijke rol in de structuur van het chromatine. Het chromatine is opbebouwd uit eenheden die men nucleosomen noemt. Ieder nucleosoom bestaat uit een complex van acht histonen (octameer). Om dit histoncomplex is het DNA gewonden in 1 3/4de windingen die 140 basenparen (bp) omvat. De nucleosomen zijn via ‘linker-DNA’ van 60 bp lang met elkaar verbonden. Het kralensnoer van  49 nucleosomen is gespiraliseerd tot een meer compacte solenoïdestructuur. De mate van condensatie in heterochromatine is sterker dan in euchromatine. De opbouw van het chromosoom wordt hieronder getoond (Alberts, 2015, Biemans et al., 2006) figuur 83: Chromatine en chromosomen (Lodish et al, 2006) Schematisch stellen we een chromosoom en chromatiden zoals hieronder (zie figuur) voor. Het chromosoom bestaat hier uit twee identieke chromatiden. De uiteinden van chromosomen noemt men telomeren, het ‘insnoeringspunt’ is het centromeer. Chromosomen hebben een korte arm(p-arm) en een lange (q-arm).  50 Figuur 84: schematische voorstelling van een chromosoom. Na de S-fase, bestaat het chromosoom uit 2 identieke chromatiden. Zusterchromatiden (met de uitgang tiden), zijn de twee identieke (= precies gelijk) delen (chromatiden), die door middel van replicatie uit een chromosoom ontstaan. (In de figuur hieronder zijn dus de zusterchromatiden A1 en A2, maar ook het setje B1 en B2, precies gelijk aan elkaar, terwijl homologen A's en B's kleine verschillen vertonen). Die twee delen blijven chromatiden heten zolang ze via het centromeer met elkaar verbonden zijn; dat is dus het geval gedurende de hele S-fase (replicatie van DNA, zie verder). Die bindingsplaats is gedurende de mitose of meiose zichtbaar in de vorm van een insnoering. Gedurende de anafase in mitose en anafase II in meiose (zie verder) worden de twee zusterchromatiden bij het centromeer uit elkaar getrokken. Volgens gangbare definities wordt elke losse chromatide na scheiding van de chromatiden gedurende celdeling als een apart chromosoom beschouwd. figuur 85: Zusterchomatiden zijn identieke chromatine-strengen die ontstaan na replicatie (Uitzondering hierop zijn zusterchromatiden die tijdens de meiotische deling, crossing-over ondergaan) Homologe chromosomen  51 Chromosomen komen bij de meeste organismen in paren voor, de zogenaamde homologe chromosomen (homoloog = overeenkomstig). In tegenstelling tot de zusterchromatiden bestaan de homologe chromosomen uit twee verschillende kopieën van hetzelfde chromosoom; homologe chromosomen dragen weliswaar dezelfde genen, maar de twee kopieën van elk allel (=variant van een gen) kunnen of gelijk aan elkaar zijn, of verschillend zijn. Haploïd en dipoïd De ploïdie geeft aan het aantal verschillende kopieën van elk chromosoom, aanwezig in een cel. De meeste planten en dieren zijn diploïd, aangegeven met 2n, wat betekent dat ze van elk chromosoom twee kopieën hebben in hun somatische of lichaamscellen, maar hun geslachtscellen zijn haploïd, aangegeven als n (een enkele kopie). Bacteriën en sommige planten en schimmels zijn haploïde organismen. In het plantenrijk komen ook triploide en tertrapoïde organismen voor. Het karyogram Wanneer een cel deelt, worden chromosomen zichtbaar onder de microscoop. Wanneer de eukaryote chromosomen gekleurd en (digitaal) uitgeknipt worden (tijdens de metafase van de deling, zie verder)) kan men ze rangschikken naar vorm en grootte. Hierdoor ontstaat het karyogram voor de mens. Hier zien we dat een vrouw twee X-chromosomen heeft en een man een X- en Y-chromosoom. X- en Y-chromosomen bepalen het geslacht en worden dan ook geslachtschromosomen genoemd. De overige 22 paar chromosomen zijn autosomen. Deze somatisch cel of lichaamscel is duidelijk diploid (2n). figuur 86: Karyogram van de mens. Bestaat uit 46 chromosomen (2n=46) waarvan 22 paar autosomen en 1 paar geslachts- of sekschromosomen (XX voor een vrouw en XY voor een man).  52 8.4 De celcyclus bestaat uit de interfase, de mitose en de cytokinese “Gedurende de tijd tussen de bevruchting en lichamelijke volwassenheid, neemt het aantal cellen bij de mens toe van één cel tot 75 triljoen cellen. Dit gebeurt via de celdeling. Als de ontwikkeling is voltooid blijft celdeling noodzakelijk om oude en beschadigde cellen te vervangen. Voor de celdeling moet het erfelijk materiaal nauwkeuring worden gedupliceerd en elke van beide dochtercellen met een volledige kopie van het erfelijk materiaal ontvangen” (Martini en Bartolomew, 2015). In voorbereiding van de eigenlijke celdeling, en na de duplicatie van het genoom (=DNA-replicatie), gaat het chromatine condenseren. Elke DNAstreng plooit zich vele malen, waardoor de chromosomen zo dik worden dat ze zichtbaar zijn door een lichtmicroscoop. Elk chromosoom bestaat na verdubbeling of DNA-replicatie in de S-fase (zie verder) uit twee (zuster)chromatiden (deze zijn zelf dus ook dubbelstrengige DNA-moleculen). De twee chromatiden zijn identieke kopijen van dezelfde DNA-molecule. Ze zitten aanvankelijk aan elkaar vast, maar zullen tijdens de mitotische celdeling uit elkaar getrokken worden, om uiteindelijk elk in een andere dochtercel te belanden. De deling van de kern (=mitose of kerndeling) wordt meestal onmiddellijk gevolgd door de deling van het cytoplasma (=cytokinese). Mitose en cytokinese geven aanleiding tot de miljarden somatische cellen (=lichaamscellen) waaruit ons lichaam bestaat. Gameten (=eicellen en zaadcellen) komen echter tot stand via een variant van de celdeling, namelijk via de meiose. Dit proces speelt zich enkel af in gespecialiseerde organen (de gonaden) en impliceert een halvering of reductie van het aantal chromosomen (zie verder). 8.4.1 De celcyclus Een celcyclus bestaat essentieel uit twee grote fasen: een korte mitotische fase (of M-fase), tijdens dewelke zowel de mitose als de cytokinese plaatsvinden; en een langere interfase, tijdens dewelke de cel groeit en haar chromosomen verdubbelt in voorbereiding van de celdeling. 8.4.1.1 De interfase “Verschillende cellen brengen een verschillende hoeveelheid tijd door in de interfase en ondergaan een verschillend aantal delingen. Stamcellen delen zich bijvoorbeeld herhaaldelijk en hebben een korte interfase. Volwassen skeletspiercellen en de meeste zenuwcellen ondergaan daarentegen nooit mitose of celdeling” (Martini en Bartolomew, 2015).  53 De interfase wordt vaak ingedeeld in een G1-fase (eerste -Gap1-fase), gevolgd door een S-fase of synthesefase en ten slotte een G2-fase. In elk van de drie onderdelen van de interfase groeit de cel door de productie van eiwitten en cytoplasmatische organellen, maar enkel in de S-fase wordt DNA gerepliceerd en worden de chromosomen verdubbeld (zie tabel en figuren). Tabel 12: de celcyclus Fase Lengte Gebeurtenis (uren) G0 De cel deelt niet meer (vb. hersencellen) G1 Variabel , meer Algemene werking van de cel dan 3 uur plus celgroei, duplicatie van organellen en eiwitsynthese Voorbereiding replicatie als er een signaal voor deling is S-fase 6 tot 10 uur DNA-replicatie en synthese van histonen G2 2 tot 5 uur Beetje eiwitsynthese, beslissing om over te gaan tot de celdeling Celdeling 1 tot 3 uur Condensatie chromosomen en Celdeling (mitose segregatie of opdeling ervan (= of meiose) karyokinese) Daaropvolgend gebeurt de cytokinese  54 figuur 87: De celcyclus : algemeen overzicht (naar Scholte en Marree, 2010); in de S-fase gebeurt de replicatie waardoor het chromosoom ontdubbelt en uit 2 zusterchromatiden bestaat (onder). 8.4.1.2 Mitose “Mitose is een proces waarbij de chromosomen, die nu bestaan uit twee zusterchromatiden, van de oorspronkelijk cel worden gescheiden en door een kernmembraan worden omgeven. Zo ontstaan twee identieke kernen met elke één set dochterchromosomen”. Daarna volgt de opdeling van het cytoplasma (= cytokinese) waardoor 2 afzonderlijk cellen ontstaan, identiek aan de oorspronkelijke cel” (Martini en Bartolomew, 2015). Het centrosoom of spoellichaampje (Latijn; centrum 'center' + Grieks; sōma 'lichaam') is een organel dat fungeert als een microtubule-organisatie centrum (MTOC) van dierlijke cellen, maar regelt ook de celcyclus en de celdeling in het bijzonder. Centrosomen zijn opgebouwd uit twee centriolen die loodrecht op elkaar staan, en die uit tubuline opgebouwd zijn. Nog tijdens de interfase verdubbelt het centrosoom zich. De twee centrosomen zullen tijdens de eerste fasen van de mitose uit elkaar bewegen en tussen beiden ontstaat het spoelfiguur. Deze spoelfiguur of kernspoel (Eng; mitotic spindle) wordt gevormd door evenwijdig lopende spoeldraden. De spoeldraad bestaat zelf ook uit microtubuli. De spoeldraden overspannen de cel van pool tot pool en fungeren als een soort ‘trekdraden’ waarlangs de chromosomen of chromatiden zich bewegen. Dierlijke cellen bezitten dus twee structuurtjes, de centriolen, maar deze lijken geen onmisbare rol te spelen bij de celdeling. Ze ontbreken bij planten, en wanneer ze bij dierlijke cellen experimenteel weggenomen worden, kan de celdeling toch perfect doorgaan. Hoewel de mitose een continu, dynamisch proces is, is het gebruikelijk het onder te verdelen in vier perioden: de profase (pro= voor), de metafase (meta = na) , de anafase (ana= apart), en de telofase (telos= einde).  55 Tijdens de profase condenseert het chromatine zich en worden de afzonderlijke chromosomen zichtbaar. Ze manifesteren zich als twee identieke zusterchromatiden, die aan elkaar vastzitten ter hoogte van het centromeer. De nucleoli verdwijnen. In het cytoplasma begint het spoellichaampje zich te vormen. Tijdens de prometafase verbrokkelt de kernmembraan. De microtubuli van het spoelfiguur kunnen nu doordringen in de kern en interageren met de chromosomen. Op beide chromatiden van elk chromosoom ontwikkelt zich t.h.v. het centromeer (een insnoering in het chromosoom) een structuur van eiwitten (het kinetochoor). Sommige microtubuli van de spoeldraden hechten zich hieraan vast. In de metafase bevinden de centrosomen zich aan tegenovergestelde polen van de cel. De chromosomen situeren zich in een denkbeeldig vlak (de metafaseplaat of equatorvlak) halverwege. De centromeren van alle chromosomen liggen netjes gealigneerd, met elke zusterchromatide aan een andere kant van de metafaseplaat en via de kinetochoor verbonden aan de tegenovergestelde polen van de cel. telomeer telomeer figuur 88: Kinetochoor De anafase start met het uiteenwijken van de gepaarde centromeren van elk chromosoom. Uiteindelijk komen de zusterchromatiden volledig los van elkaar, en kunnen ze beschouwd worden als volwaardige, onafhankelijke chromosomen. De zusterchromatiden bewegen zich in tegenovergestelde richting. Aan het einde van de anafase bevatten beide uiteinden van de cel een volledige set equivalente chromosomen. Tijdens de telofase ontstaan rond beide sets chromosomen kernmembranen. Ze worden opgebouwd uit stukken van het ouderlijke kernmembraan, aangevuld met andere cytoplasmatische membranen. De chromosomen verliezen hun geplooide structuur. Op het moment dat deze laatste fase van de mitose voltooid is, is de cytokinese gewoonlijk reeds een eind gevorderd (zie onderstaande figuur).  56 figuur 89: Schematische voorstelling van de mitotische deling (Scholte en Marree, 2010). De deling start in de G1-fase, passeert de S-fase waar de chromosomen ontdubbelen via DNAreplicatie. Tijdens de eigenlijke mitotische deling leggen alle chromosomen zich in het evenaarsvlak en worden de zusterchromatiden uit elkaar getrokken, en vormen zich twee identieke cellen. Studietip Zie ook Bioplek voor de animatie Zorg dat je deze voorstelling zelf kan maken voor een opgegeven aantal chromosomen: vb. 2n=8 8.4.1.3 De Cytokinese Bij dierlijke cellen start de cytokinese met het verschijnen van een groef, die eerst zichtbaar wordt aan de oppervlakte van de cel, ter hoogte van de metafaseplaat. Een ring van actine- en myosinemoleculen zorgt ervoor dat de ouderlijke cel volledig ingesnoerd wordt, en uiteindelijk aanleiding geeft tot twee dochtercellen. Bij plantencellen is er geen sprake van zo’n groef. Tijdens de telofase bewegen zich hier kleine blaasjes van het Golgi-apparaat naar het midden van de cel, waar ze samensmelten en een celplaat vormen. De blaasjes brengen materiaal aan voor een nieuw stuk celwand, dat zich langzaam vormt en uiteindelijk fusioneert met de ouderlijke celwand. De mitotische celcyclus bij de eukaryoten is waarschijnlijk geëvolueerd uit het relatief eenvoudige voortplantingsproces van prokaryoten. Bacteriën reproduceren zich door een eenvoudige binaire celdeling. 8.4.2 Regulatie van de celcyclus  57 De timing en de frequentie van de celdeling in de verschillende delen van meercellige organismen is van het grootste belang voor een normale groei, ontwikkeling en instandhouding. De frequentie waarmee cellen delen, is sterk afhankelijk van hun functie. Menselijke huidcellen, bijvoorbeeld, delen zeer regelmatig, terwijl levercellen slechts delen als het echt nodig is, zoals wanneer er schade moet hersteld worden. Sommige zeer gespecialiseerde menselijke cellen, zoals zenuwcellen en spiercellen, delen bij volwassen mensen helemaal niet meer. Deze differentiatie in de timing van de celcyclus is het gevolg van een regeling op moleculair niveau. Het doorgronden van dit regulatiesysteem is van het grootste belang, niet alleen om te begrijpen hoe normale celdelingen gebeuren, maar ook om in te zien hoe kankercellen de normale controle omzeilen. De achtereenvolgende stappen in de celcyclus worden gestuurd door een controlesysteem, bestaande uit een set cyclisch opererende moleculen. Het geheel wordt dikwijls vergeleken met het controlesysteem van een wasmachine; het celcyclus-controlesysteem loopt door aan een eigen tempo, maar is toch afhankelijk van een aantal externe en interne sleutelgebeurtenissen. Achtergrond en verdieping Zie hieronder De stappen van de celcyclus worden getimed door ritmische veranderingen in de activiteit van een bepaald soort enzymen (de cycline-afhankelijke proteïne-kinasen of CdK’s), die andere eiwitten kunnen activeren of deactiveren. Deze enzymen ontlenen hun naam aan het feit dat ze enkel werken wanneer ze gebonden zijn aan cycline, een eiwit waarvan de concentratie cyclisch varieert. De cel zal bijvoorbeeld pas overgaan van de G 2-fase naar de M-fase wanneer er voldoende MPF actief is. MPF (maturation promoting factor, of M-phase promoting factor) ontstaat door de binding van cycline op een CdK. De cycline-concentraties stijgen tijdens de G1, de S en de G2-fase en vallen drastisch terug tijdens de mitose. De CdK-concentratie verandert nauwelijks. MPF stimuleert allerlei andere enzymen, onder andere in de kernmembraan (de juiste werking is nog niet helemaal opgehelderd). In een late fase van de mitose breekt het zijn eigen cycline-gedeelte af. Het CdK wordt gerecycleerd. Voorbeeld van een interne gebeurtenis, is de koppeling van alle chromosomen aan het spoeldraden. Zolang dit niet gebeurd is, zal de anafase (het uiteenwijken van de zusterchromatiden) niet aangevat worden. Dit voorkomt dat de dochtercellen chromosomen zouden missen of op overschot hebben. De kinetochoren zenden, zolang ze niet gebonden zijn aan de microtubuli, signalen uit waardoor het anafase-promoting complex (APC) geïnactiveerd wordt. Eenmaal alle kinetochoren vastgehaakt zijn, houdt dit signaal op, en wordt het licht voor het APC op groen gezet. Ook vele externe chemische en fysische prikkels beïnvloeden de celdeling. Cellen zullen bijvoorbeeld niet delen wanneer onvoldoende voedingsstoffen aanwezig zijn. Om de deling van zoogdiercellen te initiëren zijn specifieke groeifactoren of groeihormonen noodzakelijk – dit zijn eiwitten die uitgescheiden worden door andere cellen.  58 Voorbeeld van zo’n groeifactor is PDGF (platelet-derived growth factor), een eiwit dat aangemaakt wordt door bloedplaatjes (een soort bloedcellen). PDGF stimuleert de deling van fibroblasten, bindweefselcellen die instaan voor de heling van wonden. De nood aan groeifactoren verklaart wellicht ook het verschijnsel van de densiteitafhankelijke inhibitie van celdeling. Cellen in artificiële culturen houden op met delen wanneer één laag cellen de voedingsbodem bedekt. Blijkbaar wordt de hoeveelheid groeifactoren en voedingsstoffen te klein wanneer een zekere populatiedensiteit bereikt wordt. Wanneer er een fout in de celcyclus optreedt, legt de cel de deling stil en pleegt eventueel ‘zelfmoord’. Dit gebeurt via een heel apart biochemisch mechanisme waarbij typische enzymen (caspases) worden ingeschakeld, die de cel helemaal verteren. Zulk geprogrammeerde celdood wordt apoptosis genoemd. figuur 90: Controle van de celcyclus (Scholte en Marree, 2010) Wanneer een cel toch ontsnapt aan alle controlemechanismen, ontstaat een kankercel. Ze delen buitensporig veel en dringen andere weefsels binnen In culturen vertonen kankercellen ook geen densiteitafhankelijke inhibitie. Mogelijk hebben ze geen groeifactoren nodig, of maken ze zelf aan. Kankercellen lijken ook ‘onsterfelijk’ : terwijl normale zoogdiercellen in celculturen slechts 20-50 maal delen en vervolgens verouderen en sterven, blijven kankercellen delen en leven. Eén beroemde lijn (de HeLa lijn, naar Henrietta Lacks, de draagster van de tumor waartoe de cellen oorspronkelijk behoorden) bestaat reeds sinds 1951. Het abnormale gedrag van de kankercellen kan catastrofaal zijn. De problemen beginnen wanneer één cel verandert in een kankercel (transformatie). Normaal herkent het immuunstelsel de getransformeerde cel als een indringer en vernietigt ze, maar wanneer de cel hieraan ontsnapt, kan ze zich ontwikkelen tot een tumor, een massa abnormale cellen in een overigens normaal weefsel. Blijft de tumor op de oorspronkelijke plaats, dan spreekt men van een goedaardige tumor, en deze kunnen via een chirurgische ingreep verwijderd worden. Kwaadaardige tumoren invaderen echter andere weefsels, waardoor één of meerdere organen niet meer normaal kunnen functioneren. Cellen van kwaadaardige tumoren wijken vaak niet alleen af vanwege hun abnormale proliferatiegedrag (vermenigvuldigingsgedrag, maar door het bezit van een ongewoon aantal chromosomen, en een ontregeld metabolisme. Ze functioneren niet meer normaal. Door afwijkende structuren op hun plasmamembraan verliezen ze ook het contact met naburige cellen, waardoor ze zich kunnen verspreiden. Ze kunnen doordringen in de bloedbanen en het lymfevatenstelsel, en zo aanleiding geven tot  59 nieuwe tumoren in diverse delen van het lichaam. Deze spreiding van kankercellen buiten de oorspronkelijke tumor noemt men metastasis. De behandeling met hoogenergetische straling en chemotherapie is erop gericht om actief delende cellen zov