Capítulo 18: Base estructural de la información celular - Becker PDF

Base estructural de la información celular: 18 DNA, cromosomas y el núcleo E n lo que hemos tratado hasta el momento sobre la es- (Figura 18.1a), la información almacenada en las molécu...

Base estructural de la información celular: 18 DNA, cromosomas y el núcleo E n lo que hemos tratado hasta el momento sobre la es- (Figura 18.1a), la información almacenada en las molécu- tructura y la función celular, ha existido siempre, de for- las de DNA de una célula se somete al proceso de la repli- ma implícita, un sentido del orden, del control y de lo pre- cación, generando dos copias de DNA que se distribuyen a visible. Hemos llegado a esperar que los orgánulos y otras las células hijas cuando la célula se divide. Los tres capítu- estructuras celulares tengan una apariencia y función pre- los iniciales de esta sección, están enfocados hacia las es- visibles, que las rutas metabólicas se realicen de manera tructuras y acontecimientos asociados con este aspecto del ordenada en lugares intracelulares específicos y que el con- flujo de la información. Este capítulo cubre la organización junto de las actividades celulares se realice de una forma estructural del DNA y los cromosomas en los que se empa- extraordinariamente cuidadosa, controlada, eficaz y here- queta; también trata sobre el núcleo, que es el orgánulo que dable. aloja a los cromosomas de las células eucariotas. El Capítu- Tales expectativas expresan nuestra confianza en que las lo 19 trata sobre la replicación del DNA y la división celu- células posean un conjunto de «instrucciones» que especi- lar, mientras que el Capítulo 20 considera los aconteci- fiquen su estructura, dicten sus funciones y regulen sus ac- mientos celulares y moleculares asociados con el flujo de la tividades, y que estas instrucciones se puedan transmitir información entre generaciones de organismos con repro- fielmente a las células hijas. Hace más de cien años, el mon- ducción sexual (incluyendo los trabajos de Mendel y su je agustino Gregor Mendel desarrolló reglas que trataban base cromosómica). sobre los patrones de herencia que observó en plantas de La Figura 18.1b resume cómo la información que resi- guisantes, aunque él tenía pocas nociones de las bases celu- de en el DNA se utiliza dentro de la célula. Las instruccio- lares o moleculares de estas reglas. Estos estudios conduje- nes almacenadas en el DNA se utilizan en un proceso de dos ron a Mendel a concluir que la información hereditaria se etapas denominadas transcripción y traducción. Durante la transmitía en forma de unidades diferenciadas que en la ac- transcripción, el RNA se sintetiza en una reacción enzimá- tualidad llamamos genes. Actualmente, sabemos también tica que copia información a partir del DNA. Durante la tra- que los genes consisten en secuencias de ADN que codifi- ducción, la secuencia de bases de las moléculas de RNA can productos funcionales que normalmente son cadenas mensajero resultante se utiliza para determinar la secuen- proteicas, pero que en algunos casos pueden ser moléculas cia de aminoácidos de las proteínas. Además, la información de RNA que no codifican proteínas. que inicialmente se almacenaba en secuencias de bases de La Figura 18.1 presenta un avance de cómo el DNA lle- DNA se utiliza finalmente para codificar la síntesis de mo- va a cabo su papel de instructor celular y cómo al mismo léculas de proteína específicas. Son las proteínas particula- tiempo proporciona el marco para describir cómo se orga- res sintetizadas por una célula las que finalmente determi- niza este grupo de capítulos sobre el flujo de información. nan la mayoría de las características estructurales de ésta, así La figura destaca el hecho de que la información que lleva como las funciones que realiza. La transcripción y la tra- el DNA fluye entre generaciones de células y dentro de cada ducción, que juntas constituyen la expresión de la infor- célula individual. Durante el primero de estos dos procesos mación genética, son los temas de los Capítulos 21 a 23. Base estructural de la información celular: DNA, cromosomas y el núcleo 557  Núcleos Figura 18.1 El flujo de información en las células. El diagrama caracteriza las células Citoplasma eucariotas, aunque la replicación del DNA, la DNA división celular, la transcripción y la traducción son procesos que también suceden en las células Núcleos procariotas. (a) La información genética Replicación del codificada en las moléculas de DNA se DNA (síntesis Citoplasma transmite a las sucesivas generaciones celulares de DNA) DNA por la replicación del DNA y por la división Transcripción celular (en las células eucariotas por medio de la (síntesis de RNA) mitosis). El DNA primero se duplica y después se divide equitativamente entre las dos células hijas. De esta forma se asegura que cada célula División RNA mensajero hija tenga la misma información genética que la celular célula de la que procede. (b) En cada célula, la (mitosis) información genética codificada en el DNA se Traducción (síntesis expresa mediante el proceso de la transcripción de proteínas) (síntesis de RNA) y la traducción (síntesis de Proteína proteína). La transcripción implica el uso de segmentos específicos del DNA como moldes para la síntesis de RNA mensajero y otras moléculas de RNA. La traducción es el proceso por el cual los aminoácidos se ensamblan en (a) Flujo de información genética entre (b) Flujo de información genética en el interior generaciones celulares de una célula: expresión de la información una secuencia dictada por la secuencia de genética nucleótidos del RNA mensajero. Abrimos este capítulo describiendo el descubrimiento tir de una fuente más agradable, el esperma de salmón. El del DNA, la molécula cuyo papel informativo, subyace en el esperma de pescado puede parecer una fuente de material centro de este grupo de seis capítulos. poco usual, hasta que caigamos en la cuenta de que el nú- cleo supone más del 90% de la masa de una célula esper- mática típica y de que, además, el DNA supone la mayoría Naturaleza química del material de la masa de las células espermáticas. Por esta razón, Mies- genético cher inicialmente creyó, que el DNA estaba implicado en la transmisión de la información hereditaria. Sin embargo, Cuando Mendel postuló por primera vez la existencia de los pronto rechazó esta idea, debido a que sus técnicas primi- genes, no conocía la identidad de la molécula que les per- tivas de medida sugirieron de forma incorrecta que los mitía almacenar y transmitir la información heredada. Pero óvulos contenían mucho más DNA que los espermatozoi- unos años más tarde, esta molécula fue descubierta, sin des. Dedujo que el espermatozoide y el óvulo debían con- querer, por Johann Friedrich Miescher, un médico suizo. En tribuir aproximadamente con cantidades iguales a la in- 1869, cuando Miescher estudiaba células en división, in- formación hereditaria que se transmite a la descendencia, formó sobre el descubrimiento de una sustancia que ahora y por esto, le pareció que el DNA no podría transmitir la conocemos como DNA, justo unos años antes de que el información hereditaria. Aunque Miescher se equivocó con biólogo celular Walter Flemming observase por primera respecto al papel del DNA, a principios de 1880 un botá- vez los cromosomas al microscopio. nico llamado Eduard Zacharias informó de que la extrac- ción del DNA de las células causaba la desaparición de la tinción de los cromosomas. Puesto que las evidencias em- El descubrimiento del DNA por Miescher condujo a pezaban a sugerir el papel de los cromosomas en la trans- propuestas contradictorias sobre la naturaleza química misión de la información hereditaria, Zacharias y otros in- de los genes vestigadores infirieron que el DNA era el material genético. Miescher estaba interesado en estudiar la química del nú- Esta visión prevaleció hasta principios de 1900, cuando cleo, ya que la mayoría de los científicos suponía que era unos experimentos de tinción interpretados incorrecta- donde se situaba el material genético celular. En sus expe- mente condujeron a la conclusión falsa de que la cantidad rimentos iniciales, Miescher aisló núcleos de glóbulos blan- de DNA cambiaba dramáticamente en el interior celular. cos de la sangre obtenidos a partir de pus procedente de Puesto que se esperaba que las células mantuvieran una vendas quirúrgicas. Una vez extraídos los núcleos con ál- cantidad constante de la sustancia que guarda sus instruc- cali, descubrió una sustancia inusual, a la que denominó ciones hereditarias, estas observaciones erróneas conduje- «nucleína» y de la que ahora sabemos que es, en gran me- ron a rechazar la idea de que el DNA transmitía la infor- dida, DNA. Miescher continuó estudiando el DNA a par- mación genética. 558 Capítulo 18 Base estructural de la información celular: DNA, cromosomas y el núcleo  El resultado es que entre 1910 y 1940, la mayoría de los información genética se almacena y se transmite. Los ante- científicos pensaban que los genes estaban formados por cedentes los proporcionó en 1928 el médico británico Fre- proteínas, más que por DNA. Los bloques químicos que derick Griffith, que estaba estudiando una cepa patógena de construyen tanto las proteínas como los ácidos nucleicos se una bacteria, llamada «neumococo» que causa una neu- identificaron a principios de la década de 1900, percibién- monía fatal en animales. Griffith descubrió que esta bacte- dose a las proteínas como estructuras más complejas y por ria (llamada Streptococus pneumoniae) existe en dos formas tanto más probables para almacenar la información gené- denominadas cepa S y cepa R. Cuando crece en un medio de tica. Se defendía que las proteínas estaban construidas por agar sólido, la cepa S produce colonias lisas y brillantes de- 20 aminoácidos diferentes que se podían ensamblar en un bido al moco, cubierta polisacárida que secreta cada célula, enorme número de combinaciones, generando, de ese mientras que la cepa R carece de la capacidad para fabricar modo, la diversidad de la secuencia y la complejidad espe- la cubierta mucosa y por tanto produce colonias que mues- rada en una molécula que almacena y transmite la infor- tran un límite rugoso. mación genética. Por el contrario, el DNA se percibía de Cuando se inyecta en ratones, la cepa S bacteriana (pero forma general como un polímero que consistía en la mis- no la cepa R) desencadena una neumonía fatal. La capaci- ma secuencia de cuatro bases (es decir, el tetranucleótido dad para causar la enfermedad está directamente relacio- —ATCG—) repetido una y otra vez, faltándole además, la nada con la presencia del polisacárido en la cubierta de la variabilidad esperada en una molécula genética. De este cepa S, que protege a la bacteria del ataque del sistema in- simple polímero se esperaba que sirviera meramente como mune del ratón. Uno de los descubrimientos más intrigan- un soporte estructural para los genes, que estaban, en cam- tes de Griffith fue el que la neumonía también se podía in- bio, formados por proteínas. Esta visión prevaleció hasta ducir inyectando a los animales una mezcla de bacterias que dos líneas de evidencia resolvieron el asunto a favor del vivas de la cepa R con bacterias muertas de la cepa S (Figu- DNA como material genético, como describiremos a con- ra 18.2). Este descubrimiento fue sorprendente porque ni tinuación. los organismos vivos de la cepa R ni los organismos muer- tos de la cepa S causaban neumonía si se inyectaban solos. Cuando Griffith realizó la autopsia de los animales a los que Avery demostró que el DNA es el material genético había inyectado la mezcla de cepa R viva con cepa S muer- de las bacterias ta estaban repletos de bacterias vivas de la cepa S. Puesto que Una gran sorpresa esperaba a los biólogos que estaban es- a los animales no se les había inyectado ninguna bacteria tudiando las moléculas proteicas para determinar cómo la viva de la cepa S, concluyó que las bacterias de la cepa R no El ratón muere El ratón se mantiene sano El ratón se mantiene sano El ratón muere (a) Bacterias vivas S (lisas) (b) Bacterias vivas R (c) Bacterias S muertas por (d) Bacterias R vivas (rugosas) calentamiento mezcladas con bacterias S por Figura 18.2 El experimento de Griffith sobre la transformación genética del neumococo. Las colonias calentamiento S (lisas) de la bacteria neumococo (Streptococus pneumoniae) son patógenas en ratones. Las colonias R (rugosas) no. (a) La inyección de bacterias S vivas en un ratón produce el desarrollo de neumonía y la muerte. (b) La inyección de bacterias R vivas mantiene al ratón sano. (c) Las bacterias S muertas por calentamiento no tienen ningún efecto cuando se inyectan solas. (d) Cuando se inyecta una mezcla de bacterias de la cepa R vivas y bacterias de la cepa S muertas por calentamiento, el resultado es neumonía y muerte. (e) El descubrimiento de que la cepa S de bacterias patógenas vivas (e) Bacterias S vías en la se recobraba a partir de la sangre del ratón del apartado d, le sugirió a Griffith que algún factor sangre de un ratón muerto químico procedente de las células S muertas por calentamiento, era capaz de causar un cambio heredable (transformación) de las bacterias R no patógenas en bacterias S patógenas. El factor químico se identificó posteriormente como el DNA. Naturaleza química del material genético 559 patógenas, se habían convertido de alguna forma en bacte- producción de virus. ¿Cuál es la naturaleza química del ma- rias de la cepa S, patógenas, debido probablemente, a algu- terial inyectado? En 1952, Alfred Hershey y Martha Chase na sustancia presente en las bacterias de la cepa S (muertas diseñaron un experimento para dirimir esta cuestión. Sólo por calentamiento) con las que se habían inyectado las de existen dos posibilidades ya que el virus T2 está formado so- la cepa R. Él denominó a este fenómeno transformación lamente por dos clases de moléculas: DNA y proteínas. Para genética y se refirió a la sustancia activa (aunque todavía distinguir entre estas dos alternativas, Hershey y Chase se desconocida) de las bacterias de la cepa S como «el princi- aprovecharon del hecho de que las proteínas del virus T2, pio transformante». como la mayoría de las proteínas, contienen azufre (en los Los descubrimientos de Griffith dispusieron el escena- aminoácidos metionina y cisteína) pero no fósforo, mien- rio de 14 años de trabajo de Oswald Avery y de sus colegas tras que el DNA viral contiene fósforo (en su esqueleto azú- en el Instituto Rockefeller de Nueva York. Estos investiga- car fosfato) pero no azufre. Hershey y Chase prepararon dores continuaron con los trabajos sobre la transforma- además dos lotes de partículas del fago T2 (a los que se de- ción bacteriana hasta su conclusión más lógica, pregun- nominan fagos intactos) con distintos tipos de marcaje ra- tándose qué componente de la cepa S muerta por dioactivo. En uno de los lotes se marcaron las proteínas del calentamiento era el responsable de la actividad transfor- fago con 35S; en el otro lote el DNA del fago se marcaba con mante. Fraccionaron extractos de la cepa S bacteriana exen- el isótopo 32P. tos de células y descubrieron que sólo la fracción de los áci- Usando de esta forma los isótopos radiactivos, Hershey dos nucleicos era capaz de causar la transformación. y Chase localizaron el destino tanto de las proteínas como Además, la actividad se eliminaba de manera específica por del DNA, durante el proceso de infección (Figura 18.3a). tratamiento con desoxirribonucleasa, una enzima que de- Empezaron el experimento mezclando el fago radiactivo grada el DNA. Ésta y otras evidencias les convencieron de con células bacterianas intactas, permitiendo así que las que la sustancia transformante del neumococo era el DNA, partículas del fago se adhiriesen a la superficie de las célu- una conclusión publicada por Avery, Colin MacLeod y las bacterianas e inyectasen su material genético a las célu- Maclyn McCarty en 1944. las. En este punto Hersey y Chase descubrieron que las cu- Ésta es la primera afirmación rigurosamente documen- biertas proteicas vacías (o «fantasmas» de fagos) se podían tada, al respecto de que el DNA pudiera portar información retirar de forma efectiva de la superficie de las bacterias, agi- genética. Pero, a pesar del rigor de los experimentos, la asig- tando la suspensión con una batidora convencional y recu- nación del papel genético al DNA no obtuvo una aceptación perando las células bacterianas por centrifugación. Midie- inmediata. El escepticismo se debía en parte a la convicción ron, entonces, la radiactividad en el líquido sobrenadante y persistente y extendida ampliamente de que al DNA le fal- en el precipitado de bacterias del fondo del tubo. taba la complejidad necesaria como para desempeñar tal Los datos revelaron que la mayoría del 32P (65%) que- papel. Además, muchos científicos se cuestionaban si la in- daba en las células bacterianas, mientras que la mayoría del 35 formación genética en las bacterias estaría relacionada con S (80%) se liberaba al medio circundante (Figura 18.3b). la herencia en otros organismos. Sin embargo, la mayoría de Puesto que el 32P marcaba el DNA viral y el 35S marcaba las las dudas que quedaban se acallaron ocho años después proteínas virales, Hersey y Chase concluyeron que era el cuando se demostró que el DNA era también el material ge- DNA del fago T2, y no las proteínas, lo que había sido in- nético de un virus, el bacteriófago T2. yectado a las células bacterianas, y por tanto, debería fun- cionar como material genético. Estas conclusiones fueron respaldadas por la siguiente observación: cuando las bacte- Hershey y Chase demostraron que el DNA es el material rias radiactivas infectadas se resuspendían en un medio lí- genético de los virus quido fresco y se incubaban durante más tiempo, el 32P se Los bacteriófagos, o fagos para abreviar, son virus que in- transfería a alguna de las partículas de los fagos de la des- fectan a bacterias. Han sido objeto de estudio científico des- cendencia, pero el 35S, no. de 1930 y muchos de nuestros primeros conocimientos de Como resultado de los experimentos que hemos descri- genética molecular proceden de experimentos que implican to, a principios de la década de 1950, la mayoría de los bió- a estos virus. El Anexo 18A describe la anatomía y el ciclo logos aceptaban la idea de que los genes estaban formados de replicación de algunos fagos y destaca sus ventajas para por DNA, pero no por proteína. Desafortunadamente, el vi- estudios genéticos. sionario Oswald Avery, máximo responsable de dar un giro Uno de los fagos, que infectan a la bacteria Escherichia a la visión existente sobre la función de DNA, nunca reci- coli, estudiados más a fondo es el bacteriófago T12. Duran- bió su bien merecido reconocimiento. El Comité del Premio te la infección, este virus se une a la superficie de la célula Nobel debatió sobre el trabajo de Avery, pero decidió que no bacteriana, y le inyecta su material. Poco después, la célula había hecho suficiente. Quizás la naturaleza modesta y sin bacteriana empieza a producir miles de nuevas copias del pretensiones de Avery fue la causante de esta falta de reco- virus. Este escenario sugiere que el material inyectado en la nocimiento. Después de la muerte de Avery en 1955, el bio- célula bacteriana porta la información genética que guía la químico Erwin Chargaff escribió en su tributo: «Era un 560 Capítulo 18 Base estructural de la información celular: DNA, cromosomas y el núcleo  Proteína Cubierta libre Fago marcada de proteínas (fantasmas) con 35S Bacteria La mayor parte DNA de la radiactividad está en el líquido 1 Mezcla de bacterias con 2 Agitación en un agitador para 3 Centrifugación: medida de la 4 Medida de la fagos marcados separar los fagos del exterior de radiactividad en el precipitado radiactividad radiactivamente; los la célula bacteriana de su y en el líquido en la descendencia fagos infectan a las contenido de los fagos células bacterianas Proteína marcada con 32P La mayoría de la radioactividad está en el precipitado Partículas del fago (pellet) radiactivas (a) El experimento de Hershey-Chase Total de isótopos retirados (%) 100 80 80% 35 S extracelular La homogenización elimina el 80% 60 de las células marcadas con 35S 32 40 P extracelular 35% La mayoría del 32P (65%) 20 se mantiene en las células intactas 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tiempo de agitación en el homogenizador (min) (b) Datos experimentales del apartado a, paso 3 Figura 18.3 Experimento de Hershey-Chase: el DNA como material genético del fago T2. (a) 1 Se utilizan fagos T2 marcados bien con 35S (para marcar proteínas) bien con 32P (para marcar DNA) para infectar bacterias. Los fagos se adsorben a la superficie celular e inyectan su DNA. 2 La agitación de las células infectadas en un agitador elimina la mayoría de 35S de las células, mientras que la mayoría de 32P se mantiene. 3 La centrifugación hace que las células formen un precipitado; cualquier partícula libre del fago, incluyendo los fantasmas que quedan en el líquido sobrenadante. 4 Cuando las células de todos los precipitados se incuban, el DNA del fago dirige en ellas la síntesis y finalmente la liberación de nuevas partículas del fago. Algunos de estos fagos contienen 32P en su DNA (ya que el antiguo DNA marcado del fago, se ha empaquetado en alguna de las nuevas partículas), pero ninguna contiene 35S en las proteínas de su cubierta. (b) El gráfico muestra el grado en que se retiran tanto el 35S como el 32P de las células intactas en el paso 3, en función del tiempo de agitación. Unos pocos minutos de agitación son suficientes como para retirar la mayoría (80%) del 35S, mientras que en ese mismo tiempo se mantiene la mayoría (65%) del 32P de las células. Naturaleza química del material genético 561 Anexo 18A En detalle Fagos: sistema modelo para estudiar genes Desde su inicio a mediados del siglo XIX, la genética empleó una un núcleo de la cola hueco rodeado por una vaina contráctil de amplia variedad de organismos como material de la cola y que termina en una placa basal hexagonal a la que se experimentación. Inicialmente, centró su atención sobre unen seis fibras de la cola. animales y plantas, como los guisantes de Mendel y las moscas La Figura 18A.2 representa los principales acontecimientos de la fruta popularizadas por investigadores posteriores. Sin en el ciclo de replicación del fago T4. Los esquemas no son a embargo, alrededor de 1940, comenzaron a probarse bacterias y escala; la bacteria es proporcionalmente más grande, como virus, proporcionando a los biólogos sistemas experimentales indica la micrografía electrónica. El proceso empieza con la que revolucionaron literalmente la ciencia de la genética adsorción de una partícula de fago a la pared de una célula llevándola al nivel molecular. bacteriana. Cuando el fago colisiona con la célula, se aplasta de Los bacteriófagos han sido especialmente importantes. Los modo que su placa basal se ancla a un receptor proteico bacteriófagos o fagos para acortar, son virus que infectan a específico de la pared (Figura 18A.2a, 1 ). Lo siguiente es que células bacterianas. Es fácil obtener grandes cantidades de la vaina de la cola, se contrae dirigiendo a la cola central hueca a partículas de fagos en un corto periodo de tiempo, lo que través de la pared bacteriana. La porción central de la cola facilita enormemente el muestreo de mutantes —fagos con forma una aguja a través de la que el DNA del bacteriófago se variaciones heredables— que de esta forma hacen posible que inyecta en la bacteria ( 2 ). Una vez que este DNA ha alcanzado los genetistas identifiquen genes en particular. Algunos de los la célula bacteriana, la información genética del fago se fagos estudiados en mayor profundidad son el bacteriófago T2, transcribe y se traduce ( 3 ). Esto da lugar a unas pocas el T4 y el T6 (los denominados T-pares) que infectan a la proteínas clave que alteran la maquinaria metabólica de la bacteria E. coli. Los tres fagos T-pares tienen estructuras célula huésped en beneficio del fago, que consiste normalmente similares, que son bastante elaboradas. El fago T4 se muestra en en su rápida multiplicación. Puesto que el fago consiste la Figura 18A.1. La cabeza del fago es una cápsula proteica que simplemente en una molécula de DNA rodeado por una tiene forma de icosaedro hueco (un objeto de 20 caras) relleno cubierta proteica (su cápsida), la mayoría de la actividad de DNA. La cabeza se une a una cola proteica, que consiste en metabólica de la célula infectada está canalizada hacia la replicación del DNA del fago y hacia la síntesis de las proteínas de la cápsida. El DNA del fago y las proteínas de la cápsida se autoensamblan en cientos de nuevas partículas del fago ( 4 ). En aproximadamente media hora, la célula infectada se lisa (se abren grietas), liberando al medio las nuevas partículas del fago. ( 5 ). Ahora cada nuevo fago infecta otra célula bacteriana, haciendo posible la obtención de enormes poblaciones del fago —tantas como 1011 partículas del fago por mililitro de cultivo de bacterias infectadas—. Para determinar el número de partículas de fago en una 65 nm muestra, un volumen medido se mezcla con bacterias creciendo en medio líquido para permitir la adsorción de los fagos a la bacteria. La mezcla se extiende en un medio nutritivo sólido (que contiene agar) en una placa de Petri. En la incubación, la Cabeza bacteria se multiplica para producir un «césped» de células sobre la superficie del medio nutritivo. Así, en cualquier lugar que una partícula vírica haya infectado una célula bacteriana, DNA 225 nm una mancha clara aparecerá en el césped debido a que las Núcleo de la cola células bacterianas han muerto por la población del fago en multiplicación. Estas manchas claras se denominan placas. El Vaina de la cola número de placas que aparecen en el césped bacteriano representan el número de partículas de fago en la mezcla original de bacterias-fagos, siempre que el número inicial de Cola fagos sea lo suficientemente pequeño como para asegurar que cada uno va a dar lugar a una placa separada. La Figura 18A.3 muestra las placas formadas por el bacteriófago T4 en el césped Placa basal de células de E. coli. Fibras de la cola El curso de los acontecimientos mostrados en la Figura 18A.2a se denomina crecimiento lítico y es característico de un Figura 18A.1 Estructura del fago T4. La imagen identifica los fago virulento. El crecimiento lítico tiene como resultado la lisis componentes estructurales principales de este fago, no todos son de la célula huésped y la producción de una progenie de muchas visibles en la micrografía (MET). partículas de fago. En comparación, un fago temperado puede o 562 Capítulo 18 Base estructural de la información celular: DNA, cromosomas y el núcleo Pared de la célula DNA Figura 18A.2 El ciclo lítico de vida de un fago bacteriana T-par. (a) El ciclo de replicación de un fago T-par, empieza cuando una partícula del fago 1 se adsorbe en la superficie de una célula bacteriana e 2 inyecta su DNA en la célula. 3 El DNA del fago se replica en la célula huésped y codifica la producción de las proteínas del fago. 4 Estos componentes se ensamblan en nuevas partículas de fago. 5 Normalmente, la célula huésped se lisa, 1 Adsorción de la liberando las partículas de fago de la partícula de fago descendencia que pueden infectar a más en la célula bacterias. Este proceso de replicación es huésped típico del crecimiento lítico de muchos 1 ␮m fagos. (b) Micrografía electrónica de una bacteria con partículas de fago pegadas a su (b) Bacteria con partículas de fago unidas superficie (MET). 2 Inyección de DNA 3 Replicación del DNA del fago y síntesis de las proteínas del fago Figura 18A.3 Placas de fago en un césped de bacterias. Se han formado placas de fago sobre un césped de E. coli infectadas con el fago T4. Cada placa procede de la reproducción de una única 4 Ensamblaje de l partícula de fago de la mezcla original. los componentes del fago bien producir crecimiento lítico, como hace un fago virulento, o integrar su DNA en el cromosoma bacteriano sin causar ningún daño inmediato a la célula huésped. Un ejemplo de fago temperado especialmente bien estudiado, es el bacteriófago ␭ (lambda), que junto con los fagos T-pares, infecta a las células 5 Liberación de de E. coli. En el estado integrado o estado lisogénico, el DNA de nuevas partículas un fago temperado se denomina profago. El profago se replica del fago con lisis junto con el DNA bacteriano, a menudo a través de muchas celular generaciones de células huésped (Figura 18A.4). Durante este tiempo, los genes del fago, aunque potencialmente letales, para el huésped, están inactivos o reprimidos. Sin embargo, bajo (a) Replicación del fago ciertas condiciones, el DNA del profago se escinde del cromosoma bacteriano y entra otra vez en el ciclo lítico, produciendo progenie de partículas de fago y lisando la célula huésped. Naturaleza química del material genético 563 Anexo 18A Una razón por la que los fagos son tan atractivos para los 1 El fago se une a la genetistas es porque el pequeño tamaño de sus genomas (que célula huésped Fago puede ser de DNA o de RNA) hace relativamente fácil de e inyecta el DNA temperato identificar y estudiar sus genes. El genoma del bacteriófago
, es Cromosoma bacteriano una molécula de DNA sencilla que contiene menos de 60 genes, DNA (DNA) comparado con los varios miles de genes de una bacteria como del fago E. coli. Otros fagos son todavía más pequeños; en algunos casos, contienen menos de una docena de genes. Debido a sus Célula bacteriana genomas sencillos, su rápida multiplicación y el enorme 2 El DNA del fago se número de progenie que se puede producir en un pequeño integra dentro del volumen de medio de cultivo, los bacteriófagos están entre los cromosoma bacteriano, «organismos» mejor conocidos. Además, también tienen otros convirtiéndose en beneficios prácticos. Puesto que los fagos son capaces de profago destruir bacterias, algunas empresas de biotecnología están Profago investigando en el desarrollo de fagos modificados que podrían ser útiles para tratar infecciones bacterianas en humanos, especialmente en aquellos casos en los que las bacterias se han hecho resistentes a los antibióticos. 3 La bacteria se produce con normalidad Figura 18A.4 Estado lisogénico de un profago dentro de un cromosoma bacteriano. El DNA inyectado por un fago temperado se puede integrar en el DNA de un cromosoma bacteriano. El DNA del fago integrado, denominado profago, se replica junto con el DNA bacteriano cada vez que la bacteria se reproduce. hombre tranquilo; habría honrado más al mundo, si el todos cromatográficos para separar y cuantificar las canti- mundo le hubiera honrado más a él». dades relativas de las cuatro bases en el DNA —adenina (A), ¿Por qué los trabajos de Hershey-Chase recibieron una guanina (G), citosina (C) y timina (T)—. De estos análisis acogida más cálida que los trabajos previos de Avery sobre surgieron varios descubrimientos importantes. Primero de- la transformación de las bacterias, aunque los dos condu- mostró que el DNA aislado a partir de diferentes tipos ce- jeron a las mismas conclusiones? La principal razón parece lulares de especies dadas, tenían el mismo porcentaje de haber sido simplemente el paso del tiempo y el cúmulo de cada una de las cuatro bases (Tabla 18.1), y que este por- evidencias circunstanciales adicionales después de la publi- centaje no varía con el individuo, el tejido, la edad y el es- cación de Avery de 1944. Quizás la evidencia más impor- tado nutricional o el medioambiente. Esto es exactamente tante fue que el DNA tiene una estructura lo suficiente- lo que podría esperarse de la sustancia química que alma- mente variable como para ser el material genético. Esta cena información genética, ya que de las células de una es- evidencia procedía de estudios sobre la composición de ba- pecie dada se espera que tengan una información genética ses del DNA, como veremos después. similar. Sin embargo, Chargaff descubrió que la composi- ción de bases del DNA, varía entre especies. Esto se obser- va, examinando la última columna de la Tabla 18.1, que Las reglas de Chargaff revelan que A ⴝ T y que C ⴝ G muestra las cantidades relativas de las bases A y T con res- A pesar de la reacción de indiferencia con la que inicial- pecto a las cantidades relativas de G y C en los DNAs de va- mente se recibió el trabajo de Avery, éste ejerció una in- rios organismos. La comparación de estos datos le reveló a fluencia trascendental en otros científicos. Entre ellos esta- Chargaff que las preparaciones de DNA de especies rela- ba Erwin Chargaff, que estaba interesado en la composición cionadas estrechamente tienen una composición de bases de bases del DNA. Entre 1944 y 1952, Chargaff utilizaba mé- similar, mientras que aquéllas de especies diferentes tienden 564 Capítulo 18 Base estructural de la información celular: DNA, cromosomas y el núcleo  Tabla 18.1 Composición de bases del DNA de varios orígenes Número de cada tipo de nucleótido* Proporción de nucleótidos** Origen del DNA A T G C A/T G/C (A ⴙ T)/(G ⴙ C) Timo bovino 28,4 28,4 21,1 22,1 1,00 0,95 1,31 Hígado bovino 28,1 28,4 22,5 21,0 0,99 1,07 1,30 Riñón bovino 28,3 28,2 22,6 20,9 1,00 1,08 1,30 Cerebro bovino 28,0 28,1 22,3 21,6 1,00 1,03 1,28 Hígado humano 30,3 30,3 19,5 19,9 1,00 0,98 1,53 Langosta 29,3 29,3 20,5 20,7 1,00 1,00 1,41 Erizo de mar 32,8 32,1 17,7 17,3 1,02 1,02 1,85 Germen de trigo 27,3 27,1 22,7 22,8 1,01 1,00 1,19 Cangrejo marino 47,3 47,3 2,7 2,7 1,00 1,00 7,50 Aspergillus (moho) 25,0 24,9 25,1 25,0 1,00 1,00 1,00 Saccharomyces cerevisiae (levadura) 31,3 32,9 18,7 17,1 0,95 1,09 1,79 Clostridium (bacteria) 36,9 36,3 14,0 12,8 1,02 1,09 2,73 * Los valores de estas cuatro columnas son el número aproximado de cada tipo de nucleótido encontrado por cada 100 nucleótidos de DNA. ** Las proporciones de A/T y de G/C no son todas exactamente 1,00 debido al error experimental. a exhibir composiciones de bases bastante distintas. Una vez Watson y Crick descubrieron que el DNA es una doble hélice más, esto es lo que se esperaría de una molécula que alma- En 1952, James Watson y Francis Crick formaban parte del cena información genética. pequeño grupo de científicos que estaban convencidos de Sin embargo, la observación más sorprendente de Char- que el DNA era el material genético y de que el conoci- gaff fue su descubrimiento de que para todas las muestras miento de su estructura tridimensional les proporcionaría de DNA examinadas, el número de adeninas era igual al nú- pistas valiosas sobre cómo funcionaba. Trabajando en la mero de timinas (A ⫽ T), y el número de guaninas igual al Universidad de Cambridge, en Inglaterra, se aproximaron número de citosinas (G ⫽ C): esto significaba que el nú- al rompecabezas construyendo modelos en alambre de es- mero de purinas era igual al número de pirimidinas (A ⫹ tructuras posibles. Durante años, se pensaba que el DNA era G ⫽ C ⫹ T). El significado de estas equivalencias, conoci- un polímero largo con un esqueleto de azúcares repetidos das como las reglas de Chargaff, era un enigma y así se (desoxiribosas) y unidades de fosfato y una base nitroge- mantuvo hasta que en 1953 Watson y Crick establecieron el nada unida a cada azúcar. Para construir su modelo Watson modelo de la doble hélice de DNA. y Crick se basaron en que a pH fisiológico las bases A, G, C y T existen en unas formas particulares que permiten la formación de puentes de hidrógeno específicos entre pare- La estructura del DNA jas. Sin embargo, la evidencia experimental más importan- te, vino del patrón de difracción de rayos X del DNA obte- A medida que la comunidad científica aceptaba gradual- nido por Rosalind Franklin, que estaba trabajando en el mente las conclusiones de que el DNA almacenaba la in- King’s College de Londres. La imagen de Franklin indicaba formación genética, comienza a surgir un nuevo grupo de que el DNA era una estructura helicoidal, y basándose en la preguntas relacionadas con la manera en la que el DNA información proporcionada por esta imagen, Watson y realiza su función genética. Uno de los primeros temas que Crick propusieron finalmente un modelo de DNA que con- surge es la cuestión sobre cómo se replica el DNA de una sistía en dos hebras entrelazadas, una doble hélice. forma tan precisa que las copias duplicadas de la informa- En la doble hélice de Watson y Crick, ilustrada en la Fi- ción genética se pueden pasar de una célula a otra durante gura 18.4, los esqueletos de azúcar fosfato de las dos hebras la división celular, y de los padres a la descendencia. Con- están en el exterior de la hélice, y las bases miran hacia el in- testar a esta pregunta requiere el conocimiento de la es- terior, hacia el centro de la hélice, formando los escalones tructura tridimensional del DNA, que fue proporcionada en de una escalera circular a la que se parece la estructura. La 1953 cuando Watson y Crick formularon su modelo de la hélice es dextrógira, esto significa que la hélice se curva «ha- doble hélice del DNA. Hemos descrito la estructura de la cia arriba» y hacia la derecha (fíjese en que esto es cierto, in- doble hélice en el Capítulo 3 y su descubrimiento en el Ane- cluso si se pone el diagrama al revés). Contiene diez pares xo 3A, pero volvemos a ello ahora, para revisarlo y ver al- de nucleótidos por vuelta y avanza 0,34 nm por cada par de gunos detalles en profundidad. nucleótidos. Consecuentemente cada vuelta completa de la La estructura del DNA 565  2 nm Extremo 5′ Extremo 3′ O H 5′ CH3 O P O P O CH2 H N N H O H O S O– 3′ T A N N N P S H N O– S C G N O P S H O H2C O P O S P Adenina Timina O G C S P S C G S Surco P P Surco O H H 3C menor S mayor N H P O P O CH2 H O H N P Dirección 5′ a 3′ Dirección 5′ a 3′ O T A S S O– N N H N N O– P S N O G C O H2C O P O S P H P S Timina Adenina O S C G P S S T A P O P H 3,4 S H nm P O P O CH2 H H O N H S O N C G O– N P S N N H N O– S N O P T A H 2C O P O S O H N 0,34 nm S G C P Citosina O S H P Guanina S T A S P P O S H H P P O P O CH2 H N O H N O H C G S S P O– N N H N N O– S 3′ S G C N O N H O H2C O P O P O H Citosina 5′ O Pirimidina Extremo 3′ Guanina Extremo 5′ Purina (a) Doble hélice (b) Orientación antiparalela de las hebras Figura 18.4 La doble hélice de DNA. (a) Esta imagen esquemática muestra las cadenas de azúcar fosfato del esqueleto de DNA, los pares de bases complementarias, el surco mayor y menor y otras dimensiones importantes. A ⫽ Adenina, G ⫽ Guanina, T ⫽ Timina, P ⫽ Fosfato y S ⫽ Azúcar (deoxiribosa). (b) Una de las hebras de la molécula de DNA está orientada en dirección 5⬘ : 3⬘ mientras que su hebra complementaria está orientada en la dirección opuesta 5⬘ : 3⬘. Este diagrama también muestra los puentes de hidrógeno que conectan los pares de bases AT y GC. hélice añade 3,4 nm a la longitud de la molécula. El diáme- determina la secuencia de bases de la cadena opuesta; ade- tro de la hélice es de 2 nm. Esta distancia es demasiado pe- más, se dice que las dos cadenas de la doble hélice de DNA queña para dos purinas y demasiado grande para dos piri- son complementarias. Ese modelo explica por qué Chargaff midinas, pero se ajusta bien para una purina y una había observado que las moléculas de DNA contienen can- pirimidina, de acuerdo con las reglas de Chargaff. En otras tidades iguales de las bases A y T que de las bases G y C. palabras, se necesita el par purina-pirimidina por conside- La implicación más profunda del modelo de Watson y raciones estéricas. Las dos hebras se sostienen por puentes Crick es que sugiere un mecanismo por el que las células re- de hidrógeno entre las bases de hebras opuestas. Además, los plican su información genética: simplemente, las dos hebras puentes de hidrógeno que mantienen juntas las dos hebras de la doble hélice de DNA se separan antes de la división, de la doble hélice sólo ajustan cuando se forman entre la base de manera que cada hebra funciona como un molde que di- adenina (A) en una de las cadenas y timina (T) en la otra, o rige la síntesis de una nueva hebra de DNA, usando las re- entre la base guanina (G) en una cadena y citosina (C) en la glas del emparejamiento de bases. En otras palabras, la base otra. Esto significa que la secuencia de bases en una cadena A en la hebra molde definiría la inserción de la base T en la 566 Capítulo 18 Base estructural de la información celular: DNA, cromosomas y el núcleo hebra de nueva formación, la base G especifica la inserción de la base C, la base T concreta la inserción de la base A, y la base C implicaría la inserción de la base G. En el siguien- te capítulo, trataremos las evidencias experimentales para el mecanismo propuesto y describiremos las bases molecula- res de la replicación del DNA en detalle. En la Figura 18.4 se ilustran varias de las características más importantes de la doble hélice de DNA. Por ejemplo, la Surco mayor forma en la que giran las dos hebras crea un surco mayor y un surco menor. Estos surcos desempeñan un papel impor- tante en las interacciones del DNA con varias de moléculas. Surco Otra característica importante es la orientación antiparale- menor la de las dos hebras de DNA, que se ilustra en la Figura Surco menor 18.4b. Este diagrama muestra que, a medida que nos des- plazamos a lo largo de una de las hebras en una dirección dada, los nucleótidos sucesivos están unidos por enlaces fos- fodiéster que unen el carbono 5⬘ de un nucleótido al car- bono 3⬘ del siguiente nucleótido; de una cadena de este tipo se dice que tiene una orientación 5⬘ : 3⬘. Pero si se mueve a lo largo de la otra hebra en la misma dirección, el orden de los enlaces exhibe una orientación 3⬘ : 5⬘. En otras pa- labras, los enlaces fosfodiéster de las dos hebras se orientan en direcciones opuestas. Las diferentes orientaciones de las (a) DNA B (b) DNA Z dos hebras son una característica que tiene implicaciones Figura 18.5 Formas alternativas de DNA. (a) En la forma B del importantes tanto para la replicación como para la trans- DNA, el esqueleto de azúcar fosfato forma una doble hélice cripción del DNA como veremos en los Capítulos 19 y 21. suavemente dextrógira. (b) En el DNA Z, el esqueleto forma una La hélice dextrógira de Watson y Crick es una versión hélice en zigzag, levógira. Se utiliza el color para destacar el idealizada de lo que se denomina B-DNA (Figura 18.5a). esqueleto del DNA. Pero las dobles hélices de B-DNA que se forman de mane- ra natural son moléculas flexibles que a menudo se desvían de este ideal, con formas y dimensiones exactas que depen- El DNA puede transformarse en formas relajadas den de la secuencia local de nucleótidos. Además, aunque y superenrolladas el B-DNA es indudablemente la forma principal del DNA en las células, también pueden existir otras formas, quizás En muchas situaciones el DNA de doble hélice puede girar dispuestas en pequeños segmentos intercalados en molé- sobre sí mismo para formar DNA superenrollado. Aunque culas mayoritariamente de B-DNA. De estas formas alter- ahora se sabe que es una propiedad del DNA extendida am- nativas, las más importantes son A-DNA y Z-DNA. La for- pliamente, el superenrollamiento se identificó por primera ma A-DNA tiene una configuración en hélice dextrógira vez en el DNA de ciertos virus pequeños que contenían que es más corta y más gruesa que la forma B-DNA. La for- moléculas de DNA circular que se disponen en bucles ce- ma A-DNA se puede crear de manera artificial deshidra- rrados. Las moléculas de DNA circular también se han en- tando el B-DNA, pero se desconoce que exista en condicio- contrado en bacterias, mitocondrias y cloroplastos. Aunque nes celulares normales. Como muestra la Figura 18.5b la el superenrollamiento no está restringido al DNA circular, forma Z del DNA es una doble hélice levógira. Su nombre es mucho más fácil de estudiar en estas moléculas. deriva del patrón en zig-zag que sigue su esqueleto de azú- Una molécula de DNA puede ir hacia atrás o hacia de- car fosfato, y es más larga y delgada que la forma B del lante entre el estado de superenrollamiento y el estado de DNA. La forma Z del DNA surge con mayor facilidad en no superenrollamiento, o estado relajado. Para entender aquellas regiones del DNA que contienen o bien purinas al- esta idea básica, podría desarrollar el siguiente ejercicio. ternando con pirimidinas o bien citosinas metiladas (si- Empiece con un trozo de cuerda que consista en dos hebras tuación que se produce en el DNA cromosómico; véase Ca- que giren juntas formando una hélice dextrógira; éste es el pítulo 23). equivalente a una molécula de DNA lineal relajada. Unir los Aunque la significación biológica de la forma Z del DNA extremos de la cuerda no cambia nada; la cuerda ahora es no se conoce con exactitud, algunas evidencias sugieren circular pero todavía está en el estado relajado. Pero si an- que pequeños tramos del DNA pasan de manera transito- tes de sellar los extremos, se le da a la cuerda una vuelta ex- ria a la configuración Z como parte del proceso mediante tra en la dirección en la cual las hebras están entrelazadas, el cual se activa la expresión de ciertos genes. la cuerda entra en un superenrollamiento positivo. En cam- La estructura del DNA 567 bio, si antes de sellar los extremos, a la cuerda se le da una cluyendo el de bacterias, virus y orgánulos eucariotas están vuelta extra en la dirección opuesta, la cuerda entra en un de manera invariable superenrrolladas negativamente. (La superenrollamiento negativo. De manera similar, una mo- Figura 18.6b muestra una molécula de DNA circular de un lécula de DNA relajada se puede convertir en una molécu- fago relajada y una molécula similar con superenrolla- la de DNA con un superenrollamiento positivo girándola miento negativo.) en la misma dirección en la que está enrollada y en una mo- El superenrollamiento se produce también en molécu- lécula de DNA con un superenrollamiento negativo girán- las de DNA lineal, cuando las regiones de la molécula están dola en la dirección opuesta (Figura 18.6a). Las moléculas ancladas a alguna estructura celular de manera que no pue- de DNA circular que se encuentran en la naturaleza, in- da rotar libremente. En un momento dado, porciones sig- nificativas del DNA lineal del núcleo de las células eucario- tas pueden estar superenrolladas, y cuando el DNA se empaqueta en los cromosomas en el momento de la divi- sión celular, el superenrollamiento masivo ayuda a hacer al DNA más compacto. El superenrollamiento influye tanto en la organización espacial como en el estado de energía del DNA y afecta a la capacidad de una molécula de DNA para interactuar con otras moléculas. El superenrollamiento positivo implica un enrollamiento muy apretado de la doble hélice y por tanto se reducen las oportunidades para interaccionar. Por el con- trario, el superenrollamiento negativo está asociado con el Superenrollamiento DNA relajado Superenrollamiento desenrollamiento de la doble hélice, que aumenta el acceso negativo positivo (a) de sus hebras a las proteínas implicadas en la replicación o en la transcripción del DNA. La interconversión entre la forma relajada y la forma superenrollada del DNA está catalizada por enzimas deno- minadas topoisomerasas, que se clasifican en tipo I o en tipo II. Ambos tipos catalizan la relajación del DNA superenro- llado, pero las enzimas de tipo I lo hacen introduciendo cortes transitorios en una sola hebra del DNA mientras que las enzimas de tipo II introducen rupturas transitorias en la doble hebra de DNA. En la Figura 18.7 se ilustra la forma en la que estos cortes temporales afectan al superenrolla- miento del DNA. Las topoisomerasas de tipo I inducen la relajación cortando una hebra de la doble hélice, permi- tiéndole al DNA rotar y a la hebra no cortada pasar a través del agujero antes de que la hebra rota se vuelva a sellar. Por el contrario, las topoisomerasas de tipo II inducen la rela- jación cortando las dos hebras de DNA y pasando un seg- mento de la doble hélice no cortada a través de la ruptura antes de que sea sellada. A diferencia de la reacción de la en- zima tipo I, la acción de las topoisomerasas de tipo II re- quiere energía derivada de la hidrólisis de ATP. Las topoisomerasas de tipo I y de tipo II se utilizan para eliminar superenrollamientos del DNA. Además, los pro- cariotas tienen una topoisomerasa de tipo II denominada DNA girasa que puede inducir tanto la relajación como el (b) superenrollamiento del DNA. Como aprenderemos en el Figura 18.6 Conversión de DNA relajado y superenrollado. Capítulo 19, la DNA girasa es una de las enzimas implica- (a) Diagrama de una molécula de DNA circular relajado y su das en la replicación del DNA. Puede relajar el superenro- conversión hacia formas superenrolladas por el giro en la misma llamiento positivo que resulta del desenrollamiento parcial dirección en la que la doble hélice está enrollada de una doble hélice, o puede introducir activamente vuel- (superenrollamiento positivo). (b) Micrografías electrónicas de moléculas de DNA circular de un bacteriófago denominado PM2, tas negativas que promuevan la separación de las hebras, fa- con una molécula relajada a la izquierda, y una molécula con cilitando además el acceso a otras proteínas implicadas en superenrollamiento negativo a la derecha (METs). la replicación del DNA. La DNA girasa requiere ATP para 568 Capítulo 18 Base estructural de la información celular: DNA, cromosomas y el núcleo  Topoisomerasa I Corte en una sola hebra Se suelda el corte El DNA rota y la hebra intacta pasa a través del orificio Topoisomerasa I DNA Topoisomerasa II Topoisomerasa II La doble hélice intacta pasa a través del orificio que posteriormente se sella ATP DNA Corte en la doble hebra Figura 18.7 Reacciones catalizadas por la topoisomerasa I y II. (Arriba) La topoisomerasa I elimina los superenrollamientos porque rompe de manera transitoria una hebra de la doble hélice de DNA y pasa la hebra no cortada a través de la ruptura. (Abajo) La topoisomerasa II elimina superenrollamientos porque corta de manera transitoria las dos hebras de la doble hélice de DNA y pasa una región no cortada de la doble hélice de DNA a través del orificio. La DNA girasa es una topoisomerasa II que utiliza este mecanismo para eliminar superenrollamientos positivos y para introducir superenrollamientos negativos. generar el superenrollamiento, pero no para relajar una rizar debido a que el DNA de doble cadena y el DNA de ca- molécula ya superenrollada. dena sencilla difieren en sus propiedades de absorción de luz. Todo el DNA absorbe la luz ultravioleta, con un máxi- mo de absorción de alrededor de 260 nm. Cuando la tem- Las dos hebras de una doble hélice de DNA se pueden peratura de una solución de DNA se aumenta lentamente, separar por desnaturalización y volver a unirse por la absorbancia a 260 nm se mantiene constante hasta que la renaturalización doble hélice comienza a fundirse en sus hebras componen- Debido a que las dos hebras de la doble hélice de DNA se tes. A medida que las hebras se separan, la absorbancia de mantienen unidas por enlaces no covalentes relativamente la solución aumenta rápidamente debido a la elevada ab- débiles, las dos hebras pueden separarse con facilidad bajo sorción intrínseca del DNA de cadena sencilla (Figura 18.8). condiciones adecuadas. Como veremos en los próximos ca- Se denomina temperatura de fusión del DNA (Tm) la pítulos, la separación de las hebras es parte integral tanto de temperatura a la cual se alcanza la mitad del cambio de ab- la replicación del DNA como de la síntesis de RNA. La se- sorbancia. El valor de la temperatura de fusión refleja la paración de las hebras también se puede inducir de mane- fuerza con la que se mantiene unida la doble hélice de DNA. ra experimental teniendo como resultado la desnaturali- Por ejemplo, la pareja de bases GC, que se mantienen uni- zación del DNA; el proceso inverso, que restablece una das por tres puentes de hidrógeno, son más resistentes a la doble hélice a partir de hebras separadas de DNA, se deno- separación que la pareja de bases AT, que sólo tienen dos mina renaturalización del DNA. puentes de hidrógeno (véase Figura 18.4b). Además, la tem- Una forma de desnaturalizar DNA en el laboratorio es peratura de fusión aumenta en proporción directa al nú- aumentando la temperatura. Si esto se hace lentamente, el mero relativo de pares de bases GC en el DNA (Figura 18.9). DNA retiene su estado de doble hebra, o nativo, hasta que Asimismo, las moléculas de DNA en las que las dos hebras se alcanza una temperatura crítica, en ese punto la doble he- están emparejadas correctamente en cada posición se fun- bra se desnaturaliza rápidamente, o se «funde», en sus he- dirán a temperaturas más elevadas que el DNA en el que las bras componentes. El proceso de fusión es fácil de monito- dos hebras no sean perfectamente complementarias. La estructura del DNA 569  Cadenas de DNA Enfriar hasta 20°C Absorbancia relativa a 260 nm desnaturalizadas Acto de nucleación 1,4 (cierre en cremallera) Absorbancia relativa a 260 nm 1.4 1.3 DNA renatu- DNA Tm ralizado 1,2 1.2 nativo 1.1 1.0 40 50 60 70 80 90 100 0 30 60 1,0 Temperatura (°C) Tiempo (minutos) Tm Figura 18.10 Desnaturalización y renaturalización del DNA. Si una 70 80 90 100 solución de DNA nativo (de doble cadena) se calienta lentamente Temperatura (°C) bajo condiciones controladas cuidadosamente, el DNA «se funde» en un estrecho rango de temperaturas, con un aumento de la Figura 18.8 Perfil de desnaturalización térmica del DNA. A medida absorbancia a 260 nm. Cuando se deja enfriar la solución, las que la temperatura de una solución de DNA de doble cadena hebras de DNA separadas se reasocian siguiendo una cinética que (nativo) se aumenta, se alcanza un punto en el cual la energía del depende de la concentración inicial. Las cadenas complementarias calor causa que el DNA se desnaturalice rápidamente. La colisionan aleatoriamemente en el acto de nucleación que es conversión en cadenas sencillas va acompañada de un aumento seguido por un rápido «cierre en cremallera» de las parejas de característico de la absorbancia de la luz a 260 nm. La temperatura nucleótidos adyacentes. La reasociación requiere cantidades a la cual se produce el punto medio de este aumento se denomina variables de tiempo que dependen de la concentración de DNA en temperatura de fusión Tm. Para la muestra representada, el valor de la solución y de la longitud de las cadenas de DNA. Tm es de aproximadamente 87ºC El DNA desnaturalizado se puede renaturalizar dis- tos para identificar ácidos nucleicos, basada en la capacidad minuyendo la temperatura para permitir el restableci- de las cadenas sencillas de unirse, o hibridar, con secuencias miento de los puentes de hidrógeno entre las dos hebras (Fi- de bases complementarias. La hibridación de los ácidos nu- gura 18.10). La capacidad de renaturalizar los ácidos cleicos se puede aplicar a interacciones entre DNA-DNA, nucleicos tiene una gran variedad de aplicaciones científi- DNA-RNA e incluso RNA-RNA. Por ejemplo, en la hibrida- cas. Lo que es más importante, forma la base de la hibrida- ción DNA-DNA, el DNA que se examina se desnaturaliza y ción de los ácidos nucleicos, una familia de procedimien- se incuba con un fragmento radiactivo de DNA de cadena sencilla, denominado sonda, cuya secuencia es comple- mentaria a la secuencia de bases que se trata de detectar. Contenido en guanina + citosina del DNA (%) Las secuencias de ácido nucleico no necesitan ser per- 100 fectamente complementarias para poder hibridar. Cam- M. phlei biando la temperatura, la concentración de sales y el pH uti- 80 lizado durante la hibridación se permite que tenga lugar el Serratia emparejamiento entre secuencias que presentan numerosas 60 E. coli bases mal emparejadas. En estas condiciones, es posible de- Neumococo tectar secuencias de DNA relacionadas entre sí pero no Timo de 40 ternera idénticas. Este abordaje es útil para identificar familias de Levadura genes relacionados en un tipo de organismo dado y entre di- Esperma de salmón ferentes tipos de organismos. 20 Bacteriófago T4 0 60 70 80 90 100 La organización del DNA Tm (°C) en genomas Figura 18.9 La temperatura de fusión depende de la composición de Hasta ahora, hemos considerado varias propiedades del bases del DNA. La temperatura de fusión del DNA aumenta linealmente con su contenido de G ⫹ C, como se ilustra por la DNA, tanto físicas como químicas. Pero, como biólogos ce- relación entre Tm y el contenido de G ⫹ C para muestras de DNA lulares, esta