C1 - CM3 - Dr. Adaime - Cytometrie En Flux & Diagnostique - PDF

Joe Azar & Maroun Beyrouth 21/1/2025 C1 – Hématologie – CM3 Dr. Andre Adaime CYTOME...

Joe Azar & Maroun Beyrouth 21/1/2025 C1 – Hématologie – CM3 Dr. Andre Adaime CYTOMETRIE EN FLUX ET DIAGNOSTIC EN HEMATOLOGIE Joe Azar Bold = Lu, Remarques à la fin du cours a propos de ce qui est demandé I – La cytométrie en flux : - A connaitre le principe en gros, FSC, SSC Technique d'analyse cellulaire à haut débit : On va mettre les cellules, surtout les GB du patient avec un mélange d’AC qui vont reconnaitre les Ag présents à la surface des cellules. Par exemple : Patient atteint de HIV : On dose surtout les CD4, CD8, et plus ou moins CD20. (CD20 est plutôt pour les lymphomes, puisqu’il existe beaucoup de traitements anti-CD20, mais à noter que les patients CD20 négatifs ne peuvent pas profiter de ces traitements) Anticorps monoclonaux contre les structures cellulaires, couplés à des fluorochromes. Etudier les antigènes présents à la surface ou dans le cytoplasme des cellules, pour: - Identification des cellules immatures : Selon les marqueurs, nous pourrons savoir si mes cellules sont matures ou immatures. - Discrimination entre les cellules morphologiquement semblables : Lorsque mes cellules se ressemblent énormément, ceci me permet de déterminer à quelle lignée elles appartiennent. 1 On appelle cette technique cytométrie en flux, car elle repose sur le passage des cellules dans un flux liquide. Pour commencer, je prépare une suspension cellulaire en mélangeant les cellules avec des anticorps (AC) spécifiques, dans des conditions particulières d'incubation, de lavage et de préparation. À la fin de ce processus, j'obtiens une suspension que le cytomètre va aspirer. Les cellules sont ensuite entraînées dans un flux de liquide (ou diluant), où on va avoir ce qu’on appelle un centrage ou alignement hydrodynamique des cellules. Une fois alignées, ces cellules vont passer à la file, l’une derrière l’autre, devant un faisceau laser de différentes couleurs ou longueurs d'onde. Une fois que le faisceau laser frappe les cellules qui défilent successivement, le processus est rapide. En effet, on peut analyser jusqu’à 100 000 cellules en seulement deux minutes. Ce n’est pas un temps énorme. Donc, quand je passe mes cellules devant le faisceau laser, on va avoir une réflexion et une diffraction de la lumière. On aura ainsi le « forward scatter » et le « side scatter ». Forward scatter : Renseigne sur le nombre et la taille des cellules Side scatter : Renseigne sur la complexité et le type/granularité de la cellule. 2 Par exemple : les monocytes sont de grande taille et ne sont pas granuleuse, contrairement aux éosinophiles (ressemble à un sac à billes, on a de grosses granulations orangées dans le cytoplasme). Le logiciel recueille les informations sur la taille, la complexité, et les anticorps associés à chaque cellule. Par exemple, le détecteur 3 analyse la fluorescence émise par le fluorochrome que j’ai utilisé. Toutes ces données sont ensuite traitées et présentées sous forme de graphiques, facilitant l’interprétation des résultats. Détecteur 1 = Forward scatter Détecteur 2 = Side scatter (lumiere diffusée) Informations cellulaires obtenues La taille relative / FSC : forward scatter La granularité relative/ SSC : side scatter L’intensité de la fluorescence émise : FI Classiquement, on utilisait 2 à 3 fluorochromes par tube pour les analyses. Actuellement, et entre autres à l’HDF, nous sommes en train d’introduire la cytométrie en flux à 8 couleurs. Cette avancée permet de détecter simultanément 8 antigènes à la surface des cellules, en plus d’évaluer leur taille et leur granularité. Cela simplifie considérablement les analyses tout en augmentant la fiabilité des diagnostics. FSC et SSC utilisés aussi dans les compteurs cellulaires / Numération Formule Sanguine FSC et SSC sont aussi utilisés dans les compteurs cellulaires, dans la FNS, surtout pour les nouveaux automates. En effet on a la diffraction, l’impédance (la cellule passe entre 2 électrodes et selon les signaux électriques, on va compter les cellules GR, GB, plaquettes et on va les différencier ), et aussi un conteur laser, qui en se basant sur le FSC et SSC va nous 3 permettre de mieux identifier les neutrophiles, éosinophiles, basophiles, lymphocytes mais surtout aussi tous ce qui est blastocytes et cellules atypiques ou immatures. Question sur le slide précédent : Question 1 : Comment est-ce qu’on va trier les cellules à la fin de la cytométrie ? On peut profiter de ce système pour faire le tri cellulaire : Je mets des anticorps qui vont reconnaître les antigènes présents à la surface des cellules. Les anticorps sont liés à des billes magnétiques, et c’est le champ magnétique qui va m’aider à effectuer le tri. Par exemple : si je veux trier les plasmocytes, leur marqueur typique est le CD138. Je peux donc coupler le CD138 à des billes magnétiques, et automatiquement, le champ magnétique va dévier toutes les cellules marquées par le CD138 d’un côté, et les autres de l’autre côté. Question 2 : Comment va-t-on connaître le nombre de cellules ? On peut effectuer un dosage ou un comptage pour le déterminer. En principe, on peut calibrer ce que l’on a mis dans le tube. On obtiendra ensuite des pourcentages, comme pour la formule numération sanguine (FNS). Exemple : un patient a 10k GB, avec un ratio normal de neutrophiles/lymphocytes de 70/30. Donc, ce patient aura 7k neutrophiles. C’est le même principe ici : si je sais combien de cellules j’ai mis et que 20 % des cellules sont CD138 positives, en multipliant par le chiffre de base, je peux calculer le nombre de cellules. En partant du même principe : Si mon patient a 14 % de neutrophiles et qu’il a 10k GB, il aura 1400 neutrophiles, ce qui indique une neutropénie (car 4000, qui sont 60% PNN, 30% Lympho, Hb = 8, plaquetes = 70 000. Il faut voir ce qui se passe dans la moelle. À la ponc on de la moelle, je trouve une moelle infiltrée par des lymphoblastes ou des myéloblastes. Pour le pourcentage de blastes : pour tout ce qui est aigu, >5 % de blastes en périphérie et >20 % blastes dans la moelle, qui est la référence. Pour le follow-up de ce pa ent, il va subir une ponc on sternale tous les 6 mois, pour confirmer la rémission, voir s’il y a une rechute … B] Différencia on lymphoïde normale I - Lignée lymphoide B : On a des hématogones ou des cellules souches dans la moelle osseuse. Cete classifica on tend un peu à s’effacer pour être remplacée par tout ce qui est ‘classifica on moléculaire’. Mais classiquement c’était la LAL1, LAL2, LAL3 … Donc on dira face à ces marqueurs : c’est une LAL B par exemple (leucémie aiguë lymphoblas que B) CD34+, TDT+ CD45- → B immature. CD38 tout seul n’est pas très u le mais avec le CD138 il devient très u le pour iden fier les plasmocytes. 17 Ici on est dans le sang et les ganglions. On a toujours le CD19 et le CD20. On a le CD10, CD38 et d’autres marqueurs (kappa et lambda mish ma7tou n) qui vont me permetre de classer les cellules dans le sang périphérique et dans les ganglions et voir si on a une proliféra on de lymphocytes normaux ou anormaux. - Si j’ai des lymphocytes normaux mul variés B, T, NK → c’est parfait ; tant mieux pour le pa ent - Cependant si j’ai des lymphocytes B monoclonaux → je m’oriente vers un lymphome 18 II - Lignée lymphoide T : Dans le thymus et dans la moelle les cellules sont CD3c+, CD7+, TDT+, CD2+, CD5+, CD1a+ parfois, et CD4-, CD8-. Ces marqueurs vont me permetre de dire qu’il s’agit de lymphocytes T CD3c → « c » pour cytoplasmique → donc à l’intérieur de la cellule. La leucémie aigue lymphoblas que T existe mais elle est moins fréquente que la B. Si on trouve des lymphocytes T matures donc CD4+ et des CD8+, on se penche plutôt sur un état réac onnel suite à une infec on par exemple. (pas leucémie ou lymphome à moins qu’on ne trouve d’autres marqueurs avec, surtout des marqueurs de clonalité) CD3s → « s » pour surface → lymphocytes T matures en périphérie Les CD45RA et CD45RO sont u lisés dans les panels d’immunodéficience pour différen er les lymphocytes T naïfs des lymphocytes T mémoires et ac vés. CD25+ → Lymphocyte T ac vé 19 C] Score de Matutes On suspecte une LLC lorsqu’on a un pa ent qui a en valeur absolue >4000-5000 (dépendamment des références) lymphocytes/mm3 Les tubes sont envoyés au labo et on fait alors la cytométrie en flux. Estella Matutes a établi un score pour pouvoir différencier la LLC des lymphomes parce qu’il existe parfois des formes qui sont vraiment ambiguës. Il a lu tout le tableau Le diagnos c de la LLC repose sur le calcul du score de Matutes ou de Moreau : Un score élevé (4/5 ou 5/5) correspond à une LLC, les autres syndromes lymphoproliféra fs (lymphome) ayant un score inférieur ou égal à 3/5. 20 Pourquoi on u lise ceci, et pas seulement le microscope ? (pas de cytologie et de lames à l’examen) Exemple ci-dessous ↓ 1) Tous les lymphomes non hodgkiniens de bas grade peuvent me donner des cellules comme ça : 2) Cete cellule : peut être retrouvée dans la PLL (leucémie pro-lymphocytaire), LLC, MCL (mantle cell lymphoma) et SZML (Splenic Zone Marginal Lymphoma) Donc la morphologie est évocatrice mais n’est pas suffisante pour le diagnos c à elle seule. Exemple : il y avait un pa ent, que Dr Nasr avait diagnos qué de leucémie aiguë d’après son exper se. Au microscope, il y avait un léger surplus de proERB non évocateur. Il y avait surement un problème, mais on n’arrivait pas à prouver que c’est une leucémie aigüe. On a fait la cytométrie, et on n’arrivait toujours pas à classer en leucémie aigüe. On pouvait seulement dire qu’il s’agissait de syndrome myélodysplasique = un état de dysfonc onnement de la moelle qui parfois peut être pré leucémique. On a enfin trouvé qu’il s’agissait d’une muta on de la nucléophosmine NPM1 → on classe le pa ent et on le traite comme leucémie aiguë myéloïde quelque soit le nombre de blastes. La géné que est en train de remplacer toute cete classifica on microscopique… 21 Cete diapo est l’inverse de l’autre : Dans la diapo précédente on disait : qu’un type cellulaire peut être retrouvé dans plusieurs pathologies Dans la diapo ci-dessous : on nous montre qu’une pathologie peut avoir plusieurs types cellulaires. 1 2 3 LPL : lymphome lymphoplasmocytaire 1- lympho-plasmocyte 2- plasmocyte 3- mastocyte HCL : hairy cell leukemia = leucémie à tricholeucocytes → on a l’impression qu’il y a des poils sur le cytoplasme. ZML : Zone Marginal Lymphoma FCL : Follicle Center Lymphoma MCL : Mantle Cell Lymphoma Comment s’assurer que ces cellules de différents aspects forment une popula on monoclonale → on va détecter les Ag grâce à la cytométrie qui nous permet de classer selon la nature et selon la maturité. 22  Comment va-t-on faire le diagnos c d’une personne qui a trop de lymphocytes : ex 30 000 GB dont 80% de lymphocytes → on fait la cytométrie en flux On a trouvé (1ère colonne) → phénotype compa ble avec LLC B Si on suspecte une HCL : la première chose qu’on fait est qu’on demande le CD103 qui n’est posi f que dans HCL et HCL-V. Donc je vais évidemment faire le panel, mais le premier type que je vais metre dans le cytomètre est le CD103 Donc le diagnos c se fait en couplant le microscope avec la cytométrie au bout d’environ 2 heures. Exemples de ques ons d’examen : : - Quels sont les marqueurs pour les cellules immatures ? CD45 faible et CD34+ - Quels sont les marqueurs pour les lymphocytes B ? CD19+ et CD20+ - Quels sont les marqueurs pour les lymphocytes T ? CD < 10 (quick p) 23 Commentaires du Dr. sur le tableau ci-dessus : Ce qui est toujours constant : CD2+ CD3+ (+/-) CD5+, CD7+ … En fonc on de la présence ou de l’absence de ces an gènes à la surface, on va sor r un diagnos c. 24 C’est un tableau seulement à tre indica f : Classifica on FAB (1982) : French-American-Bri sh, qui se basait surtout sur le microscope. On a LAM0 (différen a on minimale) → LAM7 (leucémie mégacaryoblas que). LAM 6 = érythroleucémie. Classifica on OMS (2016 et révisée l’année dernière) : elle est plus compliquée et traite le côté moléculaire aussi. 25 Au microscope : LAM 0 LAM 2 LAM11 LAM Figure a) : LAL2 = leucémie aiguë lymphoblas que 2 ou LAL commune actuellement. Marqueurs : CD19+, CD20+, (CD34+ et TDT+) indiquent l’immaturité Figure c) : LAM2 Figure d) : LAM1 La différence entre LAM1 et LAM2 est le pourcentage, et un peu les Ag en cytométrie Figure b) : LAM0 : qu’est ce qui va me permetre de la différen er d’une LAL ? ce n’est pas le microscope mais les Ag de surface. Marqueurs : CD34+, CD117+, CD13+, CD33+, bref les marqueurs myéloïdes. MPO- aussi dans la LAM0 26 Là aussi, c’est en fonc on des Ag de surface que l’on va classer les cellules. Ce tableau répond à la moi é des ques ons. Ce serait bien de le retenir pour l’examen ou pour la vie courante. 27 On ne va pas trop s’atarder sur la classifica on d’EGIL. En fonc on des Ag qui sont à la surface, on va classer en TI, TII, TIII, ou TIV et BI, BII, BIII et BIV pour les LAL-B ---- 28  Immunophénotypage des LAM LAM 0 LAM 1 LAM 2 LAM 3 LAM 4 LAM 5 LAM 6 LAM 7 MPO - + +/- + + +/- +/- - CD 2 +/- +/- +/- Eo - - - CD 11c - + CD 13 + + + + + - +/- + CD 14 - - - - +/- + - - CD 15 +/- +/- - +/- + CD 33 + + +/- + + + +/- + CD 34 + + + - + +/- +/- + CD 36 - - - - + + + + CD 61 - - - - - - - + CD 65 - + + + + + + + CD 71 +++ +/- CD 117 + + + + +/- +/- + +/- HLA DR + + + - + + +/- + Commentaires sur le tableau ci-dessus : MPO- pour LAM0 et LAM7 CD34+ un peu partout sauf dans la LAM3 car la LAM3 est classée comme leucémie aiguë promyélocytaire. Les blastes qui y sont retrouvés ressemblent fortement aux promyélocytes. Les promyélocytes ayant gagné en maturité, n’expriment donc plus le CD34 (cf. tableau sur la lignée granuleuse) 29 Les diapos restantes sont des exemples de panels d’an corps : Si je cherche une LLC, on va coupler dans une quinzaine de tubes les marqueurs différents. Pour voir si j’ai des lymphocytes qui sont LLC ou lymphome : CD19/CD79b CD79b est retrouvé dans les lymphomes. Marqueurs de clonalité : Kappa ou Lambda, l’un ou l’autre pour voir si j’ai une proliféra on monoclonale et je dois con nuer pour chercher quelle est la pathologie. Si c’est distribué entre les deux, ce n’est pas tellement (…) 30 Ces marqueurs nous permetent de classer nos cellules, voir si ce sont des lymphocytes B ou pas … Si elles sont B- avec CD38+, CD138+ avec une clonalité → je suis en face d’un myélome Si elles sont B+, je peux être en face d’une LPL, pas myélome Suite à une ques on : FITC et PE (en haut) sont les fluorochromes qui peuvent changer d’un tube à l’autre, d’un cytomètre à l’autre, dont nous ne sommes pas responsables Par exemple pour la LAM qu’est ce qu’on a dans les tubes ? CD14, CD33 / CD15, CD33 / CD16, CD33 / CD16, CD33 CD66, CD33 / CD34, CD33 / CD33, CD117 Pourquoi est-ce qu’on a tellement de CD33 ? → Parce que le CD33 est un marqueur des cellules myéloïdes et est exprimé pra quement sur tous les sous-types. Le CD33 est un marqueur de nature CD14, CD15 vont me dire si c’est un monocyte ou pas CD34, CD117 → mature ou pas 31