Mutagenesi & Meccanismi Riparazione DNA PDF

Mutagenesi & Meccanismi Riparazione DNA A volte la DNA polimerasi può inserire il nucleotide sbagliato, oppure ci possono essere danni al DNA che portano a sequenze scorrette. Questi portano a: MUTAZIONI = errori di replicazione o danno al DNA che introducono variazi...

Mutagenesi & Meccanismi Riparazione DNA A volte la DNA polimerasi può inserire il nucleotide sbagliato, oppure ci possono essere danni al DNA che portano a sequenze scorrette. Questi portano a: MUTAZIONI = errori di replicazione o danno al DNA che introducono variazioni nella sequenza dei nucleotidi. Possono derivare da: errori replicativi, danni ambientali, trasposizioni. MUTAZIONI PUNTIFORMI = viene cambiato un solo nucleotide. Una purina con una purina o una pirimidina con una pirimidina —> Transizioni Una purina con una pirimidina o viceversa —>Trasversoni Grazie ai meccanismi di riparo del DNA si impedisce un tasso elevato di mutazioni. Quando le mutazioni sono nella linea somatica, la somma di più mutazioni, sono spesso collegate al cancro. Altri tipi di danno al DNA possono portare a morte cellulare, apoptosi. Se fossero invece mutazioni nella linea germinale verrebbero trasmesse alla progenie. La cellula al danno subito può dunque morire, arrestare il ciclo cellulare, ecc. E. COLI -PROCARIOTI La polimerasi III un errore ogni 10^4-10^5 nucleotidi. Ciò nonostante nel momento in cui inserisce un nucleotide scorretto, è in grado di valutare questo appaiamento scorretto ed effettuare un’attività di proofreading 3’-5’ grazie al dominio correzione di bozza.. Alcuni errori di appaiamento di basi sfuggono all’attività esonucleasica. Fissata la mutazione la cellula non può più riconoscere l’errore, e potrebbero esserci degli effetti negativi. Ci deve essere un sistema che appena fatta la replicazione va a ricercare distorsioni della doppia elica che suggeriscano che vi è un errore Il sistema che corregge i MISMATCH è dato da MutS. Questa proteina si comporta come una pinza che si muove e va a vedere se vi sono distorsioni dell’elica. Dove le trova, si ferma, piega il DNA a 90°e non riesce più a scorrere. Vi è una variazione conformazionale e viene legato ATP a domini proteici di MutS, che fa variare nuovamente conformazione e ristende il DNA, cosa necessaria per poter procedere con la correzione dell’errore all’interno della sequenza. Non è Mut S in sè a correggere ma altri complessi come MutH, che vanno a tagliare il DNA di nuova sintesi (taglio NICK).  MutL fa da adattatore tra MutS e MutH. Vengono richiamate poi delle esonucleasi per rimuovere tutta la porzione sbagliata e la DNA polimerasi aggiunge i nucleotidi corretti, così le ligasi riuniscono i due filamenti. Il DNA di nuova sintesi da correggere viene riconosciuto grazie alla metilazione, in particolare grazie alla sequenza GATC, che si può trovare ogni circa 256bp. Man mano che viene replicato il parentale ha già al metilazione, mentre quello di nuova sintesi no. Quindi il DNA per un piccolo frangente risulta emimetilato. MutH si lega proprio in questa situazione di emimetilazione, prima dell’azione delle Dam-metilasi. Viene così rotto un singolo filamento. Dunque MutS cerca facendo da pinza attorno al DNA che passa al suo interno, quando incontra un appaiamento scorretto che porta a una distorsione dell’elica si ferma, ruota il DNA e riceve ATP. Cambia conformazione distendendosi, si recluta MutL, il quale lega MutH. Viene così attivato quest’ultimo che consente un taglio a singolo filamento, con richiamo di fattori di taglio al DNA. Interviene poi una ligasi, con un sito attivo con lisina in grado di legare un donatore di AMP per richiudere il legame fosfodiesterico. Ricorda come funziona la DNA ligasi. EUCARIOTI Le cellule eucariotiche non hanno un omologo di MutH per riconoscere il filamento, in quanto non usano l’emimetilazione per il filamento di nuova sintesi come riconoscimento. Un’ipotesi del funzionamento di riparazione dei mismatch si basa sul fatto che ci sia un filamento discontinuo, che permetta il riconoscimento del DNA di nuova sintesi. Si pensa che la PCNA (la sliding clamp) possa reclutare un sistema MSH, che sarebbe omologo di MutS. Nel caso ci sia un mismatch il punto di distorsione è riconosciuto da MSM, che recluta MLH, in grado di generare un NICK e sostituire la regione scorretta. DANNI AL DNA Possono portare a basi modificate che portano ad errori di appaiamento e conseguenti mutazioni Rotture del DNA o dimeri tra basi che impediscono la replicazione del DNA o la trascrizione. DANNI ALLE BASI DEAMINAZIONE = è un evento di idrolisi che può coinvolgere citosine o adenine con perdita del gruppo amminico ad opera di una molecola di acqua. - Nel primo caso ciò causa una mutazione da citosina a uracile, ovvero la base azotata presente nel RNA. Questo porta a un appaiamento scorretto, e quando verrà duplicato questo danno nelle generazioni successive si appaierà un’adenina invece che una guanina come in precedenza. Quando l’uracile viene poi corretto si ha una transizione da citosina a timina, base complementare dell’adenina a cui si era legato l’uracile. - Se invece succede all’adenina, il prodotto ha un gruppo chetonico al posto dell’amminico e si forma una base detta ipoxantina, questa può legarsi a quasi tutti i nucleotidi e risulterebbe la struttura molto danneggiata. Può anche riguardare la 5-metil citosina, che quando è deaminata si trasforma in timina, di conseguenza si ha un appaiamento scorretto di basi anche in questo caso. La deaminazione delle basi può dunque portare a varie modificazioni. L’appaiamento e la duplicazione possono continuare ma con una modificazione della sequenza.  DEPURINAZIONE = viene persa tutta la base azotata, si rompe il legame glicosidico, dunque non può avvenire nessun tipo di appaiamento perchè manca completamente la base. Rimane solamente lo zucchero, portando a una perdita di una coppia di nucleotidi durante la replicazione. Ci sono dunque due tipi di idrolisi, deaminazione e depurinazione, e avvengono proprio perché il DNA si trova in un sistema ricco di acqua. AGENTI ALCHILANTI = causano il trasferimento di un gruppo metilico, ad esempio sull’ossigeno della guanina O6m coinvolto nella formazione del legame a idrogeno on la citosina. Anche in questo caso avremmo delle transizioni e degli accoppiamenti scorretti, in questo caso la guanina potrebbe infatti formare solo due legai a idrogeno e dunque appaiarsi con una timina. A causa degli agenti alchilanti la metilazione della guanina può essere incontrollata. TEST DI AMES Per definire se un agente è mutageno o no. Bisogna utilizzare organismi che effettuano numerose replicazioni del DNA in poco tempo, dunque solitamente batteri, per avere così una più alta probabilità che l’agente mutageno inserisca mutazioni nel genoma. Si utilizza una provetta contenente grande quantità di Salmonella con mutazione del gene per il metabolismo dell’istidina, ovvero che in assenza di questa non sono in grado di crescere. Si piastrano numerosi individui e si aggiunge il mutageno che si pensa di avere, in questo caso MMU. Si troveranno cloni di cellule in cui è avvenuta la reazione per il metabolismo di istidina, grazie all’agente mutageno, che ha ripristinato la capacità di crescere in terreno non arricchito effettuando una seconda mutazione sul gene.  DANNO OSSIDATIVO Nell’ambiente si formano molto facilmente radicali liberi. Questi derivano dall’ossigeno e hanno un elettrone in più. Possono essere dovuti a vari fattori. Questi posssono dare ossidazione. Può ad esempio accadere sulla Guanina, che può continuare ad appaiarsi normalmente con la citosina, nonostante questo gruppo chetonico che si forma sul C8. Quando però è introdotta questa variazione è possibile che la 8-ossiguanina, possa formare due legami a idrogeno con l’adenina. In questo modo si ha una trasversione con una T al posto della C. DIMERI DI PIRIMIDINE La luce ultravioletta può far si che due timine si leghino tra loro covalentemente tra C5 e C6 di basi adiacenti, a causa di un ripiegamento del DNA provocato dalla luce UV, formando un anello di ciclobutano, da noi definito dimero di timina, portando a una distorsione dell’elica con conseguente inibizione della replicazione. CONSEGUENZE DEI DANNI Ossidazione Dimeri di T Alchilazione Rotture e NICK Basi modificate ↓ ↓ Portano a una distorsione con Transizioni e trasversoni = conseguenze nella avvicinamento dei nucleotidi, le progenie cellulare con alterazioni proteiche conseguenze bloccano la trascrizione e la replicazione e si può arrivare a morte per apoptosi. RIPARAZIONE DEL DNA Riparazione diretta = rimozione del danno con enzimi specifici Escissione di Basi = enzimi eliminano basi sbagliate Escissione di nucleotidi = rimozione della regione danneggiata e sintesi di un nuovo filamento Non-homologous end-joining / Homologus recombination = riparazione di doppi filamenti spezzati Tutti questi metodi si basano sul fatto che essendoci un doppio filamento, c’è sempre una copia che possa fare da stampo. RIPARAZIONE DIRETTA Esempio = nei dimeri di timina, esiste un particolare enzima, la DNA fotoliasi, in grado di riconoscere il danno e andarlo a correggere, in un processo di fotoriattivazione. Questo sistema non è però presente nell’uomo, che quindi non può correggere questi danni con la fotoliasi, ma si ha nei marsupiali. Esempio = nel caso della metilazione, esistono dei particolari enzimi metiltransferasi con uno zolfo tiolico SH, in aminoacidi presenti nel sito catalitico quali cisteina, in grado di acquisire il metile della base modificata. È un sistema di riparo molto raro. ESCISSIONE DI BASI Esiste un sistema che volta la base verso l’esterno, verso il sito esterno dell’enzima, base flipping, avviene dunque il taglio e si rimuove la base scorretta. Questo è fatto grazie a enzimi specifici detti glicosilasi, in cui il C1 dello zucchero ha un legame glicosidico con la base azotata. Esempio = Studi strutturali della DNA glicosilasi che rimuove la 8-ossiguanina (oxo-G, altamente mutagena) indicano che si muove lungo il DNA ispezionando ogni coppia G-C nel duplex. Quando l’enzima incontra una coppia di basi oxoG-C, l’enzima si inserisce sulla molecola di DNA e provoca la rotazione del nucleotide di 180 ̊ fuori dall’elica di DNA e verso l’enzima. Se la base ispezionata è una oxo-G (oG), viene alloggiata nel sito attivo dell’enzima e tagliata dallo zucchero a cui è associata. Se la base è invece una normale guanina, la cui struttura differisce da oxo-G solo per due atomi, non può adattarsi al sito attivo, caratterizzato da strutture ad alpha-elica, e ritorna nella sua posizione nell’elica. Esempio = Esiste anche per l’uracile che si ottiene per deaminazione della citosina. Nel DNA umano esistono 11 tipi di glicosilasi che agiscono sui danni alle basi. Si calcola che ogni giorno per ogni cellula che replica, ci sono 20000 lesioni che vengono corrette dalle glicosilasi. È quindi un sistema molto attivo. Una volta tolta la base, le endonucleasi si occupano di eliminare completamente lo zucchero a cui è rimossa la base, in modo poi da poter riempire lo spazio lasciato. Esempio = per la citosina-ipoxantina la DNA glicosilasi riconosce la base non corretta, la flippa e la taglia, lo scheletro fosfodiesterico è ancor intatto ma presenta un nucleotide senza la propria base. Questo nucleotide viene riconosciuto dalle endonucleasi AP che tagliano solo in nucleotide danneggiato, oppure interviene la polimerasi β che è la polimerasi per la correzione del DNA, in caso di nucleogenesi. ESCISSIONE DI NUCLEOTIDI I sistemi di riparazione per escissione nucleotidica (nucleotide excision repair: NER) agiscono attraverso un meccanismo di taglio e riparazione che rimuove grosse lesioni attorno tutta la regione in cui si è danneggiata la doppia elica, come dimeri di pirimidina o nucleotidi ai quali si sono attaccati dei gruppi chimici. È indipendente dalla duplicazione del DNA, in quanto dovuta ad esempio a raggi UV, e dunque anche quando non si distingue il filamento neo-sintetizzato. Gli studi hanno scoperto che vengono attivate proteine quando le cellule sono esposte a raggi UV portando a modificazioni con dimeri di timidina, per questo i sistemi per riparare sono detti Uvr. PROCARIOTI: UvrA scorre, trova l’errore, si lega e recluta UvrB il quale richiama ATP, in grado di fornire l’energia per tagliare il filamento sbagliato. Il DNA si ripiega e viene reclutata UvrC, ovvero una endonucleasi che taglia il singolo filamento. Viene rimosso il filamento sbagliato. È richiamata la DNApol I e si riempie il buco assieme alla ligasi. È ricopiato il filamento dal complementare, utilizzato quindi come stampo, tanto vi è lasciato un -OH’ libero. Nei batteri sono rimossi 12-13 nucleotidi più o meno. EUCARIOTI Negli eucarioti il sistema è molto simile e si chiama XPC , che corrisponde a UvrA dunque riconosce il danno. UvrB corrisponde invece a TFIIH, in particolare alle sue parti XPA e XPD. Questo è un fattore di trascrizione utile per aprire la doppia elica durante la trascrizione e durante il riparo. UvrC è invece sostituita da XPF e XPG. Vengono rimossi circa 30 nucleotidi. Sono detti XP per la patologia Xeroderma Pigmentoso, spesso coinvolta in questi tipi di errori nella correlazione di questo tipo. Porta a un grande aumento dell’incidenza di tumori della pelle a causa di esposizione al sole, in quanto hanno per l’appunto mutazioni sulle proteine che correggono normalmente gli errori dovuti ai dimeri formati dai raggi UV. Avviene sia durante condizioni normali sia durante la trascrizione, proprio eprchè coinvolge il fattore di trascrizione TFIIH. Durante la trascrizione quando si ha un danno di questo tipo, la RNA polimerasi si blocca, questo potrebbe portare all’impossibilità di trascrivere i gene e tradurre dunque una proteina importante, risultando così in un danno molto grave. Dato che si blocca la RNA polimerasi, esiste un sistema che recluta tutte le proteine perché si attivano per la riparazione del danno, vengono richiamate proprio grazie alla distorsione dell’elica dovuta al punto di stallo. SINTESI DNA TRANSLESIONE Negli eucarioti se c’è il dimero di timina, la DNA polimerasi δ/ε può bloccarsi. Questo stallo della replicazione fa implodere a forca replicativa e la cellula può morire per apoptosi. Se la polimerasi δ si ferma a causa del dimero, essa richiama dei sistemi che permettono di risolvere il blocco, in parte il DNA si è replicato ma non completamente e quindi il ciclo cellulare non si può concludere. Esiste un sistema per superare lo stallo che prevede la sostituzione delle polimerasi. Quando si arriva in stallo PCNA si modifica da una ubiquitina, 70aa, che si lega alle lisine delle proteine, normalmente dopo l’aggiunta di tante ubiquitine la proteina viene mandata alla degradazione nel proteasoma. Quando si aggiunge solo una ubiquitina è un’etichetta che cambia la struttura della proteina, la PCNA non riesce più a tenere legata la polimerasi δ che quindi perde attività. La PCNA ha maggior attività per la polimerasi ε, che non è fedele: non sa copiare in modo molto preciso, riesce ad inserire nucleotidi necessari per passare attraverso la lesione ma subito dopo il suo legame con la PCNA risulta molto instabile perché viene ubiquitinata e mandata alla degradazione e ritorna la polimerasi δ. DANNNI AL DNA Rotture a singolo o doppio filamento —> radiazioni ionizzanti, agenti chimici (es. Bleomicina) Filamenti legati covalentemente tra loro —> i due filamenti possono legarsi tra loro—>agenti alchilanti (es. Mitomicina C) Le cellule possono riparare il DNA in risposta a questi danni molto gravi, che portano a morte cellulare, o traslocazioni, e in generale eventi che geneticamente portano ad aneuploidie. Nella replicazione ad esempio si può rompere il singolo filamento e la molecola dunque viene interrotta. Vengono riparati in fase S o altri momenti in base al tipo di rottura del ciclo cellulare. ROTTURE SINGOLO FILAMENTO Sono rilevate soprattutto dall’Enzima PARP, poly adp ribose polimerase, che aggiunge polimerizzando ADP- ribosio in catene, etichettando la zona, un po’ come l’ubiquitina, per richiamare così i sistemi di riparo come ad esempio BER. A volte la rottura può portare comunque al collasso della forca replicativa e portare quindi ad apoptosi. È dunque sia collegato a riparazione che alla morte cellulare quando i danni sono troppo gravi. PARP richiama XRCC1, che funziona da proteina adattatrice, che porta con sè e lega DNA polß e PCNA per farla funzionare, la ligasi 3 e a volte chinasi dipendenti da DNA. XRCC sono proteine rilevate con raggi X, dette X crossing complementing. Non hanno comuni attività biochimiche, il nome deriva dalla scoperta che vengono usati per il riparo del DNA. Legano il DNA con domini ad alpha-elica, vanno al sito spezzato e sono dotate dei domini proteici che portano tutti gli enzimi necessari al riparo del danno. Dunque: PARP si lega rilevando il danno e formando le catene di ADP-ribosio. L’etichetta dice che si deve reclutare XRCC1 e utilizzare gli enzimi per richiudere il danno. PARP a volte lo si incontra in caso di danni troppo ingenti che richiamano sistemi che vanno a spezzare ulteriormente il DNA portando alla morte cellulare. ROTTURA DOPPIO FILAMENTO La rottura del doppio filamento può portar ad apoptosi o a danni al DNA. Possono essere dovute a inibitori di topoisomerasi, radiazioni ionizzanti, agenti cross linking. Ci sono due modi per riparare, ovvero la riparazione omologa o non omologa. NON HOMOLOGUS END JOINING È la giunzione delle estremità non omologhe per cercare di salvare il filamento. Quando si risalda in questo modo ci possono essere tagli al DNA e dunque errori. Quando il DNA a doppio filamento è spezzato, vi sono molecole che rilevano la rottura a come Ku70/80, proteine filamentose che si avvolgono attorno al DNA danneggiato formando un anello. Queste sono elicasi, che andranno ad aprire il DNA. Richiamano una kinasi che va a fosforilare altre proteine ed è dipendente dal DNA, ovvero DNA-PKcs, in particolare è fosforilata la proteina Artemide con attività eso-endonucleasica, che taglia il DNA fino a quando non incontra una regione di omologia in cui si accoppiano i nucleotidi. Vengono reclutate XRCC4 che porta ligasi e Cernunno-XLF. Come funzioni quest’ultimo è ancora poco chiaro, mutazioni in questo gene però causano immunodeficienza, ciò fa capire che ci siano difetti nelle immunoglobuline Col fatto che Artemide taglia, si possono avere aggiunta o rimozione sbagliata di nucleotidi, e si possono avere delle inserzioni e delezioni IN-DEL. Portano alla variabilità degli anticorpi in alcuni casi. In base al taglio si possono avere i filamenti: - Piatti —> Bunt end - A forcina —> Hairpin end = nella ricombinazione dei loci delle immunoglobuline i due filamenti del DNA si chiudono l’uno sull’altro formando delle forcine Ad ogni modo viene richiamata KU80/70, ligasi, chinasi, ecc.. Vengono richiamate chinasi che attivano istoni H2A.X, che funzionano da stazioni SOS per i sistemi di riparo. Si ha una ricombinazione detta somatica che può provocare dunque grande variabilità anche nella produzione di anticorpi.  RICOMBINAZIONE OMOLOGA DEL DNA Ricombinazione —> è il meccanismo che permette di generare nuove combinazioni di geni in un genoma. La ricombinazione omologa permette lo scambio di gruppi di geni tra cromosomi omologhi e quindi serve a generare variabilità. Avviene casualmente tra due regioni omologhe, ci sono dei punti caldi detti hotspot in cui avviene con maggiore probabilità. Dipende dalla frequenza di ricombinazione data dalla distanza tra due lo Regioni di omologia —>Sono delle sequenze quasi identiche, un locus che controlla una caratteristica che per una piccola variazione può dare fenotipo diverso, Perchè possa avvenire la ricombinazione, bisogna: di almeno 100bp rompere il dna avere invasione del filamento giunzione di Holliday migrazione del chiasma risoluzione per taglio o dissoluzione. È una correzione fedele. Il filamento perde parte dell’estremità, e il filamento protrudente 3’ invade l’altro filamento, si forma DNA eteroduplex. Si forma il chiasma e la giunzione di Hollliday, ci sono proteine che fungono da motore e ruotano il DNA portandolo in forma aperta per poterlo tagliare. Il taglio può avvenire in due piani dando o meno crossing over. 1. Rottura del DNA 2. Allineamento di due molecole di DNA omologhe (alleli) 3. Perdita di alcuni nucleotidi formando un’estremità protrudente 3’ 4. Invasione del filamento 3’ sul filamento omologo formando DNA eteroduplex 5. Formazione delle giunzioni Holliday 6. Migrazione del chiasma 7. Risoluzione della giunzione di Holliday 8. Taglio dei due filamenti 9. Converganza/collasso  Possono avvenire due tipi di tagli: 1. Prodotto del crossing over. Le due doppie eliche originali ora sono unite in modo che molecole di DNA parentale diverse sono ora riunite in una molecola ibrida 2. Prodotti patch. La ricombinazione non porta al riassortimento dei geni (prodotti a toppa o prodotti del non incrocio). Dato che vi è perdita di materiale, le nucleasi dovranno poi ricostruire. La polimerasi aggancia in -OH’ e forma del DNA da nuova sintesi, usando non il DNA stampo ma il DNA omologo. PROCARIOTI ESCHERICHIA COLI La ricombinazione inizia grazie al complesso RecBCD, un complesso di tre proteine, che processa le molecole di DNA rotte per generare filamenti singoli. Riconoscono il punto di rottura e lo devono aprire ulteriormente. RecB e RecD sono elicasi (rompono i legami a H) e usano ATP, il primo lavora in 3’-5’ e si comporta anche da endonucleasi. RecB ha anche attività esonucleasica. RecD lavora invece 5’-3’. Vengono così aperti i filamenti grazie a queste due. Quest’ultima è più veloce perchè non taglia anche il DNA. Si forma così un’ansa nel filamento di DNA superiore. Quando incontrano un sito Chi, ovvero una sequenza di 8 nucleotidi, che si chiama Crossover Hot Spot Istigatore, dunque il punto di massima ricombinazione di istigazione al crossing over. RecC si lega a Chi e rallenta l’attività. Viene così persa l’attività esonucleasica di B su 3’, che non viene più spezzettato e rimane fisso, viene mantenuta quello di 5’ e continua a dissociarsi. Questa sequenza Chi si trova ogni 5-10kb. È dunque più presente della probablità attesa. Questo perchè sono punti importanti per il riparo del DNA. L’invasione del DNA omologo, l’appaiamento della giunzione di Holliday è mediata da RecA che scannerizza il DNA alla ricerca di regioni omologhe. RecA è una proteina con 6 subunità diverse della stessa proteina. Si avvolge a spirale attorno al filamento 3’ protrudente. In realtà RecA quando si avvolge attorno al DNA, lascia spazio per far si che entri il doppio filamento omologo per poter ricercare la zona di omologia. Il triplex si ritrova avvolto da RecA. Ogni molecola riesce a tenere legati tre fili.  RecA ha siti di legame abbastanza stabili sul DNA a singolo filamento protrundente in 3’. Un’altra molecola ha un sito secondario di legame che va ad avvicinare il doppio filamento omologo che è un legame debole e transitorio per andare a ricercare l’omologia e permettere che il doppio filamento possa scorrere. Una regione è considerata di omologia per 15basi, che sono considerate abbastanza per identificare un locus. RISOLUZIONE GIUNZIONE DI HOLLIDAY RuvAB riconosce la giunzione di Holliday e ne promuove la migrazione RuvA è un tetramero, RuvB un esamero con attività ATPasica. RuvC è una resolvasi che risolve il complesso tagliando in una delle due direzioni, è un’endonucleasi RuvA si lega specificamente alla Holliday Junction. Recluta RuvB che è un’ATPasi simile a elicasi, che muove la Holliday J. RuvC è un dimero che risolve la giunzione di Holliday effettuando il taglio quando riconosce la sequenza A/T TTT G/C. La ligasi richiude EUCARIOTI Negli eucarioti vi è anche la meiosi durante la quale può avvenire crossing over. La proteina Spo11, è un dimero che ha una tirosina con un ossidrile, che si attiva quando i cromosomi omologhi iniziano ad appaiarsi, ha poca selettività e forma un legame intermedio. Attacca il legame fosfodiesterico. Il fosfato rimane legato all’enzima grazie all’-OH, così si ha la rottura del singolo filamento per iniziare il crossing over. Non si basa su rotture casuali del genoma. È leggermente sfalsato in 5’-. Nel momento della mitosi, vengono richiamati dei complessi MRX che corrispondono di fatto alle Rec dei procarioti. Ha varie component tra cui elicasi e nucleasi. MRX (Mre11, Rad50 e Xrs2) è un complesso con attività esonucleasica. Degrada i filamenti con estremità 5’, attaccati da Spo11. Produce filamenti con estremità 3’ protrudenti. Dmc1 e Rad51 sono gli omologhi di RecA, Dmc1 è espresso solo in cellule che vanno in meiosi mentre Rad51 in cellule mitotiche e meiotiche. La ricombinazione avviene tra cromatidi omologhi non- fratelli. Dmc1 favorisce recombinazione tra cromatidi NON fratelli (non hanno la stessa sequenza) Il meccanismo in generale si pensa sia lo stesso, con avvolgimento a spirale, rilevazione punti omologhi e ricombinazione. BRCA2 sono importanti per reclutare RAD e depositarla sul filamento. Se non funziona e ci sono delle mutazioni possono esserci maggiori propensioni al tumore al seno, dovuta alla minore capacità di riparare danni al DNA. Le riparazioni avvengono sopratutto con non homologus end joining e dunque vengono introdotte mutazioni. RecQ è molto importante poichè mutazioni geniche su questo causano malattie come invecchiamento precoce della Sindrome di Bloom. Serve infatti perl’apertura dell’elica durante il riparo. Principalmente molecole che stanno Molecole che molto in mitosi stanno meno in mitosi, tipo quelle che non replicano.  Se avviene una rottura del DNA a doppio filamento ci sono dunque due possibilità per le cellule: 1. Il riparo del DNA in maniera fedele che porta la formazione di estremità protendenti al 3’ e la deposizione di Rad51. Per avere una copia del DNA in modo che possa avvenire bisogna trovarsi in tarda fase S, dove il DNA è stato replicato, in modo che ci sia una copia di DNA omologo. Solo cellule che replicano molto e per questo possono fare ricombinazione omologa. 2. I neuroni e le cellule muscolari sono germe in G0 dunque non possono fornire la copia per oreggerei il DNA e utilizzano la non homologous end-joining, che porta a delezioni e inserzioni. DANNO RIPARAZIONE PROCARIOTI UOMO Errori Pol In fase di riparazione MutS, MutH, MutL MSH, MLH \ UV, Agenti Alchilanti Dimeri TT, Fotoriattivazione Fotoliasi Metiltransferasi Eliminazione Metilazione Metiltransferasi Glicosilasi, Escissione Basi Glicosilasi endoAP Escissione Nucleotidi UvrA XPC UvrB XPA,XPD UvrC XPF, XPG SSB PARP Yk0 70/80 Ku70/80, Pr, Artemide NHEJ RecC, RecB, RecD MRX DSB HR RecA BRCS, RadS1, DLM1 RuvA, RuvB RuvC RadS1C Si è visto che la capacità di riparo quando c’è stata la rottura del doppio filamento è correlata alla lunghezza della vita. Chi ha un sistema di riparo meno efficiente ha una vita corta, l’uomo ne ha di molto più efficienti. Per il riparo con taglio di nucleotide si è visto che questo è correlato all’esposizione alla luce, animali notturni sono meno propensi a riparare questi danni. Questo poichè il danno è più sensibile alle radiazioni del sole. I