Biológia I – 3. blok PDF

Biológia I – 3.blok Prof. RNDr. Marie Korabečná, Ph.D. Stručná osnova predmetu: 1. Bunková teória, stavba prokaryotickej a eukaryotickej bunky, typy buniek (somatické, generatívne, kmeňové, malígne) 2. Bunkové štruktúry (cytoskelet) a organely a s dôrazom na štruktúru a funkcie plazmatickej membrá...

Biológia I – 3.blok Prof. RNDr. Marie Korabečná, Ph.D. Stručná osnova predmetu: 1. Bunková teória, stavba prokaryotickej a eukaryotickej bunky, typy buniek (somatické, generatívne, kmeňové, malígne) 2. Bunkové štruktúry (cytoskelet) a organely a s dôrazom na štruktúru a funkcie plazmatickej membrány bunky (transport látok, medzibunková komunikácia, vnútrobunková signalizácia) 3. Nukleové kyseliny bunky DNA a RNA ( mRNA, rRNA, tRNA a snRNA, snoRNA, miRNA) a ich funkcie 4. DNA v prokaryotickej a eukaryotickej bunke, struktura genomu a způsob realizace genetické informace. Prokaryotický a eukaryotický chromozóm. Chromatín (DNA proteínový komplex), jeho typy, účasť na regulácii genetickej informácie - remodelácia a jej mechanizmy 5. Mechanizmus replikácie DNA a zúčastnené enzýmy. 6. Genetický kód a jeho charakteristika. Mutácie v DNA, typy - rozdelenie, mechanizmus vzniku a dôsledky 7. Štruktúra prokaryotického a eukaryotického génu a základy jeho regulácie. Genová exprese u prokaryot a eukaryot (transkripcia, posttranskripčné úpravy, translácia a posttranslačné úpravy) 8. Delenie buniek (Amitóza, mitóza a meióza). Mitóza – ako súčasť bunkového cyklu. Molekulové základy regulácie bunkového cyklu. Buněčná signalizace Dorozumívání mezi buňkami se vyvinulo již v raných obdobích vývoje života Příklad: Rozpoznávání párovacího typu u kvasinek Figure 15-2 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)  Mezibuněčná komunikace u mikroorganismů Tvorba spór u Myxococcus xanthus Párování u Saccharomyces cerevisiae  Dorozumívající se buňky mohou být těsně vedle sebe nebo navzájem vzdálené Vývoj Parakrinní, organismu, lokální činnost komunikace, imunitního např.růstové systému faktory Autokrinní, působí na buňku, která signál vydala Endokrinní Hormonální regulace, působí na vzdálené buňky, rychlost v minutách (U rostlin přenos hormonů vzduchem - etylén) Figure 15-4 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Přímou výměnu malých molekul mezi buňkami umožňují spojení typu „gap junction“ Třemi stupni mezibuněčného dorozumívání jsou příjem, převod a odpověď Figure 15-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Buněčné odpovědi na signály Buněčné odpovědi na signály  Earl W. Sutherland – Nobelova cena 1971 Studoval se svojí skupinou jak adrenalin stimuluje štěpení glykogenu v jaterních buňkách K tomu je nutná aktivace glykogenfosforylázy v cytoplazmě buněk Po smíchání adrenalinu, , glykogenfosforylázy a glykogenu ke štěpení nedocházelo – reakce vyžadovala přítomnost intaktních buněk Prokázána role cytoplazmatické membrány pro rozpoznání signálu a role převodových mechanismů v cytoplazmě  Příjem signálu na membráně – typy receptorů Receptory s iontovými kanály Receptory spojené s G- proteiny Receptory tyrosinkinázové Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)  Receptory spojené s trimerickými G-proteiny 7 alfa helixů prochází CM, nejrůznější ligandy - např.adrenalin, párovací faktory u kvasinek, neurotransmitery, ontogeneze, smyslové vnímání, 60% léčiv působí prostřednictvím ovlivňování G -proteinových drah Figure 15-30 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Činnost receptoru spojeného s trimerickým G-proteinem Role fosforylácie a kináz Fosforylácia mení štrukturálnu konformáciu proteínu, čo spôsobuje, že sa buď aktivuje alebo deaktivuje, alebo inak modifikuje jeho funkciu. Približne 13000 ľudských proteínov má miesta, ktoré sú fosforylované Činnost receptoru spojeného s trimerickým G-proteinem Činnost receptoru spojeného s trimerickým G-proteinem Činnost receptoru spojeného s trimerickým G-proteinem  Tyrozinkinázové receptory Převážně receptory růstových faktorů, regulují pochody spojené s přechodem buňky buněčným cyklem Mají vlastní enzymatickou – tyrozinkinázovou aktivitu (fosforylace tyrosinů v cílových proteinech) Po obsazení ligandem dochází k dimerizaci receptorů v membráně a vzájemné fosforylaci tyrozinových zbytků v cytoplazmatické části partnerské molekuly Aktivované dimery mohou současně aktivovat deset a více nitrobuněčných proteinů – regulace více drah současně (rozdíl oproti receptorům s trimerickými G-proteiny) Dimerizace mutovaných receptorů bez ligandu se účastní karcinogeneze Tyrozinkinázové receptory  Tyrozinkinázové receptory Ras proteiny jsou ukotveny v cytoplazmatické části plasmatické membrány. Patří do rodiny monomerických GTPas (na rozdíl od G proteinů – trimerické GTPasy). Aktivace a funkce monomerických a trimerických GTPas je však obdobná. Příklady: EGF (epidermální růstový faktor), PDGF (od destiček odvozený růstový faktor), IGF-1 (insulinu podobný růstový faktor) a receptor pro insulin  Dráhy transdukce signálu Navázání ligandu na receptor spouští signální dráhu Tzv. “štafetové“ proteiny se postupně aktivují (domino efekt) Informace je předávána pomocí změny konformace proteinů Těchto změn konformace je dosahováno pomocí proteinkináz – enzymů vážících fosfátovou skupinu na tyrozin, serin nebo threonin cílových proteinů Negativně nabitá fosfátová skupina vstupuje do interakce se zbytky polárních aminokyselin v proteinu a tím dochází ke změně jeho konformace Kaskáda fosforylace umožňuje větvení regulačních drah a zesílení signálu Geny pro proteinkinázy představují 1% všech našich genů Účinky kináz jsou potlačovány proteinfosfatázami, které v nepřítomnosti signálu odštěpují fosfátové skupiny Fosforylační kaskáda Mitogen-activated protein kinase (MAPK) signalling pathway –regulace buněčné proliferace Terapie v onkologii Receptory s iontovými kanály Receptory s iontovými kanály Navázáním ligandu (např. acetylcholin) dochází k otevření membránového kanálku Význam pro fungování nervové soustavy, cíle terapeutického ovlivnění  Nitrobuněčné receptory Ligandy těchto receptorů musí být schopny průchodu CM - jsou hydrofóbní- steroidní hormony a hormony štítné žlázy, oxid dusnatý – NO Příkladem může být testosteron, který se váže na svůj receptor v cytoplazmě a pak komplex vstupuje do jádra, kde pak aktivovaný testosteronový receptor působí jako transkripční faktor Receptory pro estrogeny jsou přímo v jádře  Nitrobuněčné receptory Ligandy nitrobuněčných receptorů: Figure 15-13 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)  Nitrobuněčné receptory Homologie nitrobuněčných receptorů: Figure 15-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Činnost nitrobuněčných receptorů Figure 15-14c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Činnost nitrobuněčných receptorů – dva stupně odpovědi Figure 15-15 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)  Malé molekuly jako tzv. „druzí poslové“ v komunikačních drahách Prvním poslem je ligand na membránovém receptoru Druzí poslové mají schopnost difuze v cytoplazmě -tím mohou usnadnit amplifikaci signálu Druzí neboli sekundární poslové (anglicky second messengers) jsou malé, neproteinové, ve vodě rozpustné molekuly. Vznikají z lehce dosažitelných substrátů a mají krátký biologický poločas. Mezi druhé posly patří cAMP, kalciové kationty, cGMP, inositol-1,4,5-trisfosfát, diacylglycerol, fosfatidylinositol-3,4,5-trisfosfát a další. S výjimkou kalciových kationtů jsou druzí poslové syntetizováni specifickými enzymy po stimulaci membránových receptorů. Aktivita druhých poslů je omezená a jsou degradovány různými enzymy.  Cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) Vzniká činností adenylylcyklázy (membránový enzym) a je odbouráván fosfodiesterázou cAMP aktivuje proteikinázu A (serin- threonin kináza), ta fosforyluje další proteiny podle druhu buňky Cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) Vzniká činností adenylylcyklázy (membránový enzym) a je odbouráván fosfodiesterázou cAMP aktivuje proteinkinázu A (serinthreonin kináza), ta fosforyluje další proteiny podle druhu buňky  Vápenaté ionty Vápenaté ionty využívány jako druhý posel v signálních drahách častěji než cAMP Využíván v drahách s G-proteiny i s tyrozinkinázovými receptory Signální dráhy neurotransmiterů, růstových faktorů, některých hormonů, u rostlin při odpovědi na sucho a chlad Koncentrace vápenatých iontů v cytosolu několikanásobně nižší než vně buňky, v krvi 10.000 x vyšší koncentrace než v buňkách, v buňce nejvyšší koncentrace v ER – důsledek činnosti pump  Vápenaté ionty Koncentrace vápenatých iontů v cytosolu několikanásobně nižší než vně buňky, v krvi 10.000 x vyšší koncentrace než v buňkách, v buňce nejvyšší koncentrace v ER – důsledek činnosti pump Vápenaté ionty, diacylglycerol a (DAG) a inositoltrifosfát (IP3) DAG a IP3 vznikají štěpením specifického fosfolipidu v membráně IP3 otevírá vápníkové kanály v ER Vápníkové ionty se váží na kalmodulin (ten představuje až 1% všech proteinů v buňce) Kalmodulin ovlivňuje proteinkinázy a fosfatázy Ligandem ovíraný vápníkový kanál Amplifikace signálu Buněčný cyklus a jeho regulace G1 fáze (1. přípravná) začíná po cytokinezi, vznikem dceřinné buňky průběh: zdvojení buněčné hmoty, intenzivní syntetické procesy –RNA , proteiny, opravy poškozeného genomu. leží zde hlavní kontrolní uzel cyklu, který rozhoduje o pokračování interfáze na základě vnějších vlastností S fáze (syntetická) replikace jaderné DNA (zdvojení množství DNA), současná rychlá spřažená syntéza histonů (H2A, H2B, H3, H4 & H1), aby se mohly tvořit nové nukleosomy a chromatinové vlákno Duplikuje se centrozom pro tvorbu mitotického vřeténka na konci chromozomy o dvou chromatidách chromatidách spojených v místě centromery; dvojnásobná genová dóza buněk G2 fáze (2. přípravná) závislá na dokončení replikace DNA v S fázi průběh: syntéza a aktivace proteinů (ke kondenzaci chromozomů, ke tvorbě mitotického aparátu a destrukci jaderného obalu), končí zahájením mitózy I = interfáze leží 2. kontrolní uzel buněčného cyklu – rozhoduje o tom, zda buňka do mitózy skutečně vstoupí na základě vnitřních vlastností M fáze (mitotická) kondenzace chromozomů – až 10 000× sesterské chromatidy odděleny a přemístěny k protilehlým pólům buňky (vlastní mitóza) Kontrolní bod na přechodu metafáze a anafáze, kontrola připojení chromatid k mikrotubulům dceřiné buňky obdrží 2 kompletní sady chromosomů a shodnou výbavu cytoplazmatických organel (cytokineze, završuje celý proces) mitóza a cytokineze jsou většinou propojené procesy pro pravidelné rozdělení sesterských chromatid do obou dceřiných buněk je důležitý mitotický aparát buňky (tvoří ho centromery a kinetochory) místo do mitózy může buňky vstoupit i do meiózy (zárodečné buňky) 3 kontrolní body G1 / S – blokáda buněčného cyklu, jsou-li buněčný růst nebo okolní podmínky nepříznivé pro další dělení; G2 / M – zastavení buněčného cyklu, není-li dokončena replikace DNA event. je-li DNA poškozena; M – na přechodu metafáze/anafáze, zastavení, nejsou-li chromozomy řádně připevněny k mitotickému vřeténku.  Buněčný cyklus a jeho regulace Kontrolní systém buněčného cyklu je založen na oscilacích aktivity cyklindependentních kináz – CdK. Jedná se o proteinkinázy, které tvoří komplexy s proteiny cykliny. Katalyzují fosforylaci bílkovinných substrátů (a to pouze, pokud jsou navázány na cykliny), čímž dochází ke změnám v enzymatické aktivitě substrátu a v jeho interakci s jinými proteiny. Kancerogeneze jako neregulovaná proliferace buněk způsobená hromaděním mutací Vnější faktory vedoucí ke vzniku mutací  Mutace Genové Mutace bodová – substituce Delece Inserce Duplikace Inverze Podle důsledků pro strukturu proteinu: Mutace tichá (silent, samesense) - zařazena stejná aminokyselina Mutace missense - zařazena jiná aminokyselina Mutace beze smyslu (nonsense) – vzniká STOP kodón, předčasné ukončení translace Mutace posunová Mutace zpětná Chromozové Genomové Bodová mutace může být tranzicí (purin za purin, pyrimidin za pyrimidin - modře) nebo transverzí (pyrimidin za purin, purin za pyrimidin - červeně) Substituce – bodová mutace + C C A T C G A A T A C C A T C G A A T A G DNA - G G T A G C T T A T G G T A G C T T A T C RNA C C A U C G A A U A C C A U C G A A U A G PROTEIN Pro Ser Asn Thr Ile Glu C.T. + C C A T C G A A T G C C A T C G A A T A G DNA - G G T A G C T T A C G G T A G C T T A T C RNA C C A U C G A A U G C C A U C G A A U A G PROTEIN Pro Ser Asn Ala Ile Glu C.T. Dochází ke změně jedné aminokyseliny v kódovaném proteinu. Mutace tichá + C C A T C G A A T A C C A T C G A A T A G DNA - G G T A G C T T A T G G T A G C T T A T C RNA C C A U C G A A U A C C A U C G A A U A G PROTEIN Pro Ser Asn Thr Ile Glu C.T. + C C A T C G A A T A C U A T C G A A T A G DNA - G G T A G C T T A T G A T A G C T T A T C RNA C C A U C G A A U A C U A U C G A A U A G PROTEIN Pro Ser Asn Thr Ile Glu C.T. Nedochází ke změně v sekvenci aminokyselin kódovaného proteinu. Mutace beze smyslu + C C A T C G A A T A C C A T C G A A T A G DNA - G G T A G C T T A T G G T A G C T T A T C RNA + C C A U C G A A U A C C A U C G A A U A G PROTEIN Pro Ser Asn Thr Ile Glu C.T. + C C A T A G A A T A C C A T C G A A T A G DNA - G G T A T C T T A T G G T A G C T T A T C RNA + C C A U A G A A U A C C A U C G A A U A G PROTEIN Pro C.T. Mutací vznikl terminační kodon (C.T.) a syntéza proteinu je předčasně ukončena – kratší protein. Posunová mutace - delece + C C A T C G A A T A C C A T C G A A T A G DNA - G G T A G C T T A T G G T A G C T T A T C RNA + C C A U C G A A U A C C A U C G A A U A G PROTEIN Pro Ser Asn Thr Ile Glu C.T. + C C A T C G A A T A C C A T C G A A T A G DNA - G G T A G C T T A T G G T A G C T T A T C RNA + C C A U C G A A U C C A U C G A A U A G A PROTEIN Pro Ser Asn Pro Ser Asn Arg Dochází k posunu čtecího rámce a ke změně sekvence aminokyselin od místa mutace. Posunová mutace – delece 3 NT + C C A T C G A A T A C C A T C G A A T A G DNA - G G T A G C T T A T G G T A G C T T A T C RNA + C C A U C G A A U A C C A U C G A A U A G PROTEIN Pro Ser Asn Thr Ile Glu C.T. + C C A T C G A A T A C C A T C G A A T A G DNA - G G T A G C T T A T G G T A G C T T A T C RNA + C C A U C G A U A C U C G A A U A G A G C PROTEIN Pro Ser Ile Leu Glu C.T. Dochází k posunu čtecího rámce mezi 1. a 3. mutací a ke změně sekvence aminokyselin v této oblasti – protein je o 1 AA kratší. Posunová mutace - inzerce + C C A T C G A A T A C C A T C G A A T A G DNA - G G T A G C T T A T G G T A G C T T A T C RNA + C C A U C G A A U A C C A U C G A A U A G PROTEIN Pro Ser Asn Thr Ile Glu C.T. + C C A T C G A A T A C C A T C G A A T A G DNA - G G T A G C T T A T G G T A G C T T A T C RNA + C C A U C G A A U G A C C A U C G A A U A PROTEIN Pro Ser Asn Asp His Arg Ile Dochází k posunu čtecího rámce a ke změně sekvence aminokyselin od místa mutace. Posunová mutace - inzerce 3 NT + C C A T C G A A T A C C A T C G A A T A G DNA - G G T A G C T T A T G G T A G C T T A T C RNA + C C A U C G A A U A C C A U C G A A U A G PROTEIN Pro Ser Asn Thr Ile Glu C.T. + C C A T C G A A T A C C A T C G A A T A G DNA - G G T A G C T T A T G G T A G C T T A T C RNA + C C A A U A C G A A U G A C C A U C G A A U A G PROTEIN Pro Ile Arg Met Thr Ile Glu C.T. Dochází k posunu čtecího rámce mezi 1. a 3. mutací a ke změně sekvence aminokyselin v této oblasti – protein je o 1 AA delší. Tučná mačka sedela Biologické následky mutací  Chromozomové mutace Genomové mutace Molekulární onkologie 1. Teorie karcinogeneze 2. Onkogeny 3. Tumor supresorové geny 4. „Care taker“ geny – reparační mechanismy. Karcinogeneze jako mnohastupňový proces, zjednodušený model Figure 11.6 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Figure 11.7 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)  Důvod č. 1 pro modifikaci původního modelu: Diferencovaná buňka žije jen několik dnů – nemůže nahromadit mutace. Figure 11.5a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Sekvence molekulárních dějů při vývoji kolorektálního karcinomu Figure 11.10 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)  Důvod č. 2 pro modifikaci původního modelu: Karcinomy nemusí nést mutace nalezené u adenomů – více alternativních drah- neexistuje jediná možná cesta Figure 11.11a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)  Sekvence cytogenetických a molekulárních dějů při vývoji karcinomu jícnu (Barrettův esophagus) Figure 11.11b The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)  Princip FACS (Fluorescence-Activating Cell Sorting) Figure 11.13 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)  Důvod č. 3 pro modifikaci původního modelu: Jen malá část buněk tumoru selektovaných na základě přítomnosti povrchových markerů je schopna vyvolat tumor v pokusném zvířeti- většina buněk tumory ve zvířatech nevyvolává Použit karcinom prsu, ESA = epithelial surface antigen Figure 11.14a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)  Zde MUTACE!!!! Figure 11.16b The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)  Molekulární onkologie 1.Teorie karcinogeneze 2. Onkogeny 3. Tumor supresorové geny 4. „Care taker“ geny – reparační mechanismy 5. Hlavní signální dráhy 6. Imunitní mechanismy ve vztahu k nádorovému růstu 7. Racionální biologická léčba a její limity. Buněčná lokalizace proteinů zahrnutých v karcinogenezi Onkogen TS gen Funkce onkogenů a tumor supresorových genů Onkogen TS gen Funkce onkogenů a tumor supresorových genů Onkogeny – AD TS geny - AR  Z protoonkogenů se stávají onkogeny Protoonkogeny jsou normální geny, jejichž produkty se účastní regulace BC a diferenciace Z protoonkogenů se stávají onkogeny: - retrovirovou transdukcí (v-onc c-onc) - změnou chování jako následku aktivace in situ Proteinové produkty onkogenů Růstové faktory (PDGF,FGF..) Receptory růstových faktorů (c-erb-B-1) Přenašeče signálu na vnitřní straně CM (abl, ras..) Jaderné proteiny regulující transkripci (myc, fos, jun..) Cykliny, CDK a proteiny deregulující BC Mechanismy aktivace protonkogenů Bodové mutace (např. v ras) Amplifikace genů (N-myc v neuroblastomu nebo L-myc v malobuněčném karcinomu plic) Translokace (např. při translokaci během níž dojde k připojení c- myc či c-bcl-2 k silným promotorům genů pro syntézu Ig (Burkittův lymfom, folikulární lymfom) nebo c-abl k oblasti bcr (break-point cluster region-CML) a vzniku fúzního poteinu.  Aktivace protoonkogenů amplifikací Figure 4.6b The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Homogeneously staining regions (HSR) a Double Minutes (DM) jako cytogeneticky detekovatelné produkty amplifikace onkogenů (neuroblastom) FISH  FISH v nádorové cytogenetice Onkogen HER-2neu (červeně) na chromosomu 17 (zeleně) vjádrech z nádoru prsu CEP – Centromere Enumeration Probe FISH sondy LSI – Locus Specific Indicator Aplikace FISH Patologie nádorů Multicolor FISH – použití malovacích sond Multicolor FISH – polyploidní nádorová buňka s marker chromozomy Multicolor FISH Figure 4.11a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Figure 15-66 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)  Ras aktivace mutací Figure 4.10 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Onkogeny Onkogeny kódující G-proteiny vazebné proteiny pro GTP H-ras kolorektální, plicní karcinomy, karcinomy močového měchýře K-ras kolorektální karcinomy N-ras melanomy Table 4.2 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Aktivace onkogenů translokací Figure 4.13a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) S translokacemi se setkáváme u lymfomů a leukémií, kde zahrnují různé onkogeny Table 4.4 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)  Vznik filadelfského chromozomu u chronické a akutní myeloidní leukémie Figure 16.24 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)  FISH v nádorové cytogenetice Onkogen HER-2neu (červeně) na chromosomu 17 (zeleně) vjádrech z nádoru prsu CEP – Centromere Enumeration Probe FISH sondy LSI – Locus Specific Indicator Důsledky translokace vedoucí ke vzniku filadelfského chromozomu Figure 4.14 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)  Genom člověka obsahuje 518 genů pro kinázy Lidský kinom Figure 16.12 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)  Cíl Gleevecu Figure 16.13a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Figure 16.10b The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Figure 16.10a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Molekulární onkologie 1. Teorie karcinogeneze 2. Onkogeny 3. Tumor supresorové geny 4. „Care taker“ geny – reparační mechanismy. Onkogen TS gen Funkce onkogenů a tumor supresorových genů Onkogen TS gen Funkce onkogenů a tumor supresorových genů Onkogeny – AD TS geny - AR Ztráta heterozygosity Loss of heterozygosity- LOH Častá u tumor supresorových genů Jedna alela s vrozenou bodovou mutací, druhá s mikrodelecí K detekci se využívá analýzy polymorfismů typu STR Při analýze nádorové tkáně je vhodná mikrodisekce Možnosti laserové mikrodisekce Polymorfismus typu STR a detekce LOH- ztráty heterozygozity v buňkách nádoru V nádoru zde jen jedna alela, druhá deletována Funkce produktu tumor supresorového genu p53 „strážce genomu“  Li -Fraumeni syndrom Vrozená mutace jedné alely genu p53 Riziko vývoje maligních nádorů 25x vyšší než u normální populace Široké spektrum tumorů: sarkomy, leukemie, nádory mozku, prsu.. Příklad tumor supresorového genu: gen pro retinoblastom, Knudsonova dvouzásahová hypotéza Familiární forma Sporadická forma Gen lokalizován na 13. chromosomu, Pro vývoj tumoru nutné mutace obou alel Biologická funkce proteinu Rb V aktivním nefosforylovaném stavu brání vstupu buňky do S fáze Po stimulaci buňky růstovými faktory fosforylován a inaktivován Inaktivován rovněž vazbou virových proteinů ( např. E7 papillomavirů) Biologická funkceproteinu Biologická funkce proteinuRbRb Biologická funkce proteinu Rb Familiární adenomatózní polypóza FAP Vrozená mutace jedné alely genu APC (Adenomatous Polyposis Coli) AD s úplnou penetrancí, 1 : 80 000 APC: 5q21, multifunkční protein- adhese, fce cytoskeletu, regulace BC, regulace transkripce, tumor supresorový gen  HED - Hypohidrotic Ectodermal Dysplasia Patient´s skin without Normal skin sweat glands  HED - Hypohidrotic Ectodermal Dysplasia Tumor supresor CYLD se váže k NEMO a reguluje jeho aktivitu.Inhibition Inaktivace CYLD zvyšuje rezistenci k apoptóze, tímto způspbem ztráta CYLD přispívá k onkogenezi. Cylindromatosis, Brooke-Spiegler syndrome, and multiple familial trichoepithelioma Cylindromatosis, Brooke-Spiegler syndrome, and multiple familial trichoepithelioma  Gen WT1 Wilmsův tumor, 1:10 000, AD chromosom 11p13 transkripční faktor nefroblastom 8 % dětských nádorů, nejčastější solidní nádor u dětí familiární případy – oboustranné (ve věku 30 měsíců) nádor složen z nediferencovaných buněk a vzniká maligní transformací ledvinové kmenové buňky, která ztratila schopnost diferenciace nádor může být izolovaný nebo součástí některých syndromů - např. WAGR – WT, aniridie, závažné urogenitální anomálie, mentální retardace Hereditární formy rakoviny prsu a geny BRCA1 a BRCA2 Hereditární formy 5-10% případů, AD Vrozená mutace v genu BRCA1 u 80% hereditárních forem, v genu BRCA2 u 14% BRCA1 - 17q21, transkripční faktor se „zinc finger“ motivem BRCA2 – 13q12, transkription-coupled repair? Produkty obou genů multifunkční  Molekulární onkologie 1. Teorie karcinogeneze 2. Onkogeny 3. Tumor supresorové geny 4. „Care taker“ geny – reparační mechanismy.  Mechanismy reparace DNA – „proofreading“ zajišťovaný DNA polymerázou –kontrola právě připojenéno nukleotidu Opravné mechnismy - reparace DNA Při replikaci probíhají: Base Excision Repair (BER) Nucleotide Excision Repair (NER) Mismatch Repair (MMR) Postreplikační opravy: Transcription-Coupled Repair (TCR) Homologní rekombinace a „End Joining Repairs“ Translasion DNA synthesis & Replicative Bypass and Recombination  Base Excision Repair (BER) Rozpoznání nespárované odstranění abnormální nebo chemicky modifikované baze baze tento kontrolní systém opravuje velké množství nejběžnějších poškození DNA Vystřižení oprava probíhá za účasti různých DNA-glykosylas, které jsou zbytku kódovány nejméně 8 geny nukleotidu každá DNA-glykosylasa je odpovědná za identifikaci a odstranění specifické purinové nebo pyrimidinové baze po odstranění baze štěpí endonukleasa (AP endonukleasa) a fosfodiesterasa vlákno DNA v pozici špatně zařazené baze a odstraní zbytek nukleotidu (cukr-fosfát) za vzniku mezery DNA-polymeráza pak nahradí chybějící bazi podle originální struktury a DNA-ligasa spojí nový úsek DNA s původní DNA Nahražení správným nukleotidem  odstranění větších úseků DNA tento systém používá komplex jiných enzymů než systém BER Nucleotide Excision Repair (NER) má schopnost opravovat větší úseky DNA i dimery pyrimidinů excizní opravy poškozené DNA sestávají z následujících kroků enzym DNA-endonukleasa rozpozná poškozené místo a označí jej (např. přeruší jeden řetězec DNA v sousedství poškození) DNA-nukleasa odstraní označený Rozpoznáno chybné nukleotid a také několik sousedních párování a bude nukleotidů vystřižen delší úsek následně enzym DNA-polymerasa ssDNA obsahující doplní vzniklou mezeru, přičemž špatně spárované jako templát slouží nepoškozený nukleotidy řetězec DNA reparační proces je ukončen spojením nově syntetizované DNA s původní DNA činností DNA-ligasy Nucleotide Excision Repair (NER) Proteiny, jejichž mutace podmiňují xeroderma pigmentosum  Nucleotide Proteiny, jejichž mutace Excision podmiňují xeroderma Repair (NER) pigmentosum Nucleotide Excision Repair (NER) Mechanismy reparace DNA – excizní reparace Xeroderma Pigmentosum po vystavení UV vznikají závažné kožní léze Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer – HNPCC - Lynchův syndrom Vrozená mutace v genech pro MMR (mismatch repair) Heterogenní - 2p,3p,7p: HNPCC1 až 5 Frekvence 1: 200 !!!! AD V důsledku replikačních chyb (slippage) změněna délka mikrosatelitních oblastí  Mismatch Repair (MMR) geny Hereditární nepolypózní kolorektální karcinom, AD, 10 – 15% všech nádorů tlustého střeva Geny MSH2, MLHl, MSl, PMS2 a MSH6 – různé chromosomy mutace inaktivují proces reparace chybného párování („mismatch repair“) bází - MSI predispozice vzniku rakoviny tlustého střeva bez úvodního polypózního stádia – charakteristická morfologie Mismatch repair systém opravuje chyby, které vzniknou v průběhu replikace DNA enzymy jsou schopné identifikovat špatně zařazený nukleotid (mismatch) a označit ho nebo přímo opravit důležité je, že systém dokáže rozlišit původní řetězec a správnou sekvenci nukleotidů a dceřinný řetězec s mutovanou sekvencí a nahradit nesprávný nukleotid podle originálu řetězce DNA obsahují palindromové sekvence GATC, ve kterých je adenin v templátovém řetězci methylovaný v novém řetězci dochází k methylaci adeninu až po určité době proteiny mismatch repairu jsou schopné rozpoznávat tyto semimethylované GATC sekvence a tak původní a nově syntetizovaný řetězec mutace vzniklé při replikaci a změny struktury DNA jsou bez opravy přenášeny do dalších generací buněk kumulace mutací může vést až ke vzniku tumoru mismatch repair geny člověka jsou označovány jako MSH2, MLHl, MSl, PMS2 a MSH6 mismatch repair je zřejmě univerzální ve všech buňkách s dvouřetězcovou DNA Příklad funkce produktů MMR genů Postreplikační oprava (homologní rekombinace) uplatní se zejména při nápravě zlomů obou řetězců DNA a je mnohem méně objasněný než excizní systémy jedná se o homologní rekombinaci, kdy se jedno vlákno homologního chromosomu spáruje a zrekombinuje s poškozenou DNA mezi lidské geny, které se účastní tohoto způsobu opravy patří gen NBS (gen mutovaný u Nijmegen breakage syndromu) nebo gen BLM (mutovaný u Bloomova syndromu) a geny BRCA1 a BRCA2 Bloomův syndrom autosomálně recesivně dědičný syndrom chromosomální nestability. Zodpovědný gen (BLM, Bloom syndrome, RecQ helicase-like) se nachází v oblasti 15q26.1. Normálním produktem genu je jeden typ DNA helikasy (RECQL3). Již v prvním roku života se u postižených vyvíjí erytém, který je citlivý na sluneční světlo. Imunologické projevy zahrnují poruchy B-lymfocytů s nízkými hladinami imunoglobulinů IgG, IgA a IgM s následnou náchylností k infekcím. U buněk dále pozorujeme sklony ke vzniku cytogenetických abnormalit, které často vyústí v maligní transformaci. Meióza Princip meiózy Profáze I.meiotického dělení Stádia profáze I, párování homologních chromozomů, tvorba synaptonemálního komplexu, vznik crossing - overů Stádia profáze I, párování homologních chromozomů, tvorba synaptonemálního komplexu, vznik crossing -overů  Synaptonemální komplex - laterální, centrální a transverzní elementy Rekombinační noduly Synaptonemální komplex spojuje i pohlavní Synaptonemální chromozomy v jejich pseudoautosomálních oblastechkomplex Crossing-over je také výsledkem činnosti proteinů zajišťujících reparaci DNA Holiday Junction Telomery chromozomů se shlukují v profázi I, což slouží k usnadnění párování homologních chromozomů Koheziny – přispívají k párování homologních chromosomů Nezávislá segregace homologních chromozomů y Spermatogeneze Oogeneze Spermatogeneze Oogeneze Časový průběh oogeneze a fertilizace Nondisjunkce v meioze jako příčina aneuplodií Syndromy spojené s trisomiemi autozomů- riziko stoupá s věkem matky Crossing-over Crossing-over a nezávislá segregace homologních chromozomů jako mechanismy zvyšující genetickou diverzitu pohlavně se rozmnožujících populací Crossing-over v profázi 1.meiotického dělení – vznik nových kombinací alel  Mapování genomů Mapa fyzikální – vzdálenosti v párech bazí DNA (kb)-udává délku molekuly DNA Mapa genetická - popisuje biologické chování, jak často dochází mezi geny k rekombinaci, jednotkou je centiMorgan(cM)  Zjišťování genetické vzdálenosti a b X hybridizačním pokusem: a b Provádíme zpětné křížení s dvojnásobně homozygotním rodičem a sledujeme procento potomků s rekombinovaným fenotypem 1% potomků s rekombinací = genetická vzdálenost 1 cM ( centiMorgan) a b 50 cM znamená volnou kombinovatelnost, X geny mohou ležet i na různých a b chromozomech – viz Mendelovy zákony  Apoptóza - regulovaná smrt buňky Na rozdíl od nekrózy, která je formou traumatické buněčné smrti, která je důsledkem akutního buněčného poškození, apoptóza je vysoce regulovaný a kontrolovaný proces, který poskytuje výhody během životního cyklu organismu. Například oddělení prstů na rukou a nohou ve vyvíjejícím se lidském embryu nastává, protože buňky mezi prsty podléhají apoptóze. Na rozdíl od nekrózy produkuje apoptóza buněčné fragmenty nazývané apoptotická tělíska, které jsou fagocyty schopny pohltit a odstranit dříve, než se obsah buňky může vylít na okolní buňky a způsobit jejich poškození. Ve vnitřní dráze se buňka zabíjí, protože cítí buněčný stres, zatímco ve vnější dráze se buňka zabíjí kvůli signálům z jiných buněk. Slabé vnější signály mohou také aktivovat vnitřní dráhu apoptózy. Vnější dráha Fas ligand (FasL nebo CD95 L nebo CD178) je transmembránový protein typu II exprimovaný na cytotoxických T lymfocytech a NK buňkách. Jeho vazba na receptor Fas (FasR) indukuje programovanou buněčnou smrt v cílové buňce nesoucí FasR. Interakce ligandu a receptoru Fas hrají důležitou roli v regulaci imunitního systému a progresi rakoviny. John Sulston získal Nobelovu cenu za medicínu v roce 2002 za svůj průkopnický výzkum apoptózy.  Apoptóza Vnitřní dráha Fyziologicky nastává např. v embryogenezi nebo při ukončení hormonální stimulace. Dále může být vnitřní - mitochondriální apoptotická dráha iniciována řadou změn v mikroprostředí buňky včetně poškození DNA, defektní mitózou, stresem endoplazmatického retikula, reaktivními formami kyslíku atd. V buňce se vyskytují proapoptické (Bax, Bak) a protiapoptické (Bcl-2, Bcl-X) faktory, jež regulují buněčnou smrt. Tyto faktory musí být ve vzájemné rovnováze. Při jejich vychýlení (↑ proapoptických) nastává apoptóza. Vyskytují se především na vnější membráně mitochondrií. Působením inhibičních faktorů (Bim, Bid) na protiapoptické faktory dochází k jejich inaktivaci. Začnou převažovat faktory proapoptické, které začnou vytvářet kanály ve vnější membráně mitochondrie (MOMP z angl. mitochondrial outer membrane permeabilization). Skrz nově vzniklé kanály uniká cytochrom C do buněčné cytoplazmy, kde se váže na APAF1 (apoptotic peptidase activating factor 1). Na tento komplex se dále váže prokaspáza 9. Takto vzniklý komplex nazýváme apoptozom. Jeho funkcí je vznik plně aktivní kaspázy 9, která je důležitá pro zahájení Vnější dráha Vnitřní dráha efektorové fáze (proteolytickou aktivaci exekučních kaspáz 3 a 7). Apoptóza - srhnutí Aktivace vnitřní dráhy na membráně mitochondrií Kultivace buněk- HeLa buňky Apoptóza v buňkách HeLa je inhibována proteiny produkovanými buňkou. Tyto inhibiční proteiny cílí na tumor supresorový protein Rb. HPV E6 a E7 jsou inhibiční proteiny exprimované lidským papilomavirem, HPV je zodpovědný za tvorbu nádoru děložního čípku, ze kterého pocházejí HeLa buňky. HPV E6 způsobuje, že p53, který reguluje buněčný cyklus, se stává neaktivním. Tyto dva inhibiční proteiny jsou částečně zodpovědné za nesmrtelnost HeLa buněk tím, že inhibují výskyt apoptózy. HeLA buňky Henrietta Lacks - tumor diagnostikován v roce 1951, buňky nádoru převedl do kultury Dr.Oto Gey  v Paramecium caudatum Amitóza při dělení buněk ji podstupuje makronukleus, který je polyploidním vegetativním jádrem a řídí metabolismus buňky, mikronukleus se dělí mitoticky, je generativním jádrem, obsahuje kompletní genom, ale neprobíhá v něm transkripce Nejrychlejší dosud popsaná exocytóza Role amitózy v savčích = vystřelování trichocyst buňkách studována s nejednoznačnými závěry  Genové inženýrství Insulin objeven v roce 1921 Bantigem a Bestem. V roce 1923 udělena Nobelova cena za studium insulinu Macleodovi a Bantingovi. V roce 1928 insulin charakterizován jako polypeptid a jeho aminokyselinová sekvence byla publikována v roce 1952 První insulin izolovaný z pankreatů krav a prasat se dostal na trh v roce 1936 V roce 1978 se díky DNA klonování podařilo získat isulin produkovaný v E.coli. Na trh se dostává pod názvem Humulin pochválení FDA v roce 1982 1978 udělena Nobelova cena za objev restrikčních enzymů W. Arberovi, D. Nathansovi a H.O. Smithovi Využití restrikčních enzymů k vytvoření rekombinantních molekul a klonování Genové inženýrství Využití plazmidů jako vektorů pro přenos upravených genů do bakterií Genové inženýrství