Bioinformatica e Oncologia Molecolare PDF

LEZIONE 1: introduzione iperplasia: aumento delle dimensioni di un organo o di un tessuto dovuto ad una abnorme moltiplicazione delle cellule che lo compongono. Metaplasia: trasformazione istologica di un tessuto differenziato in un altro tipo di tessuto, vd esofago di Burkett che da epitelio dell'e...

LEZIONE 1: introduzione iperplasia: aumento delle dimensioni di un organo o di un tessuto dovuto ad una abnorme moltiplicazione delle cellule che lo compongono. Metaplasia: trasformazione istologica di un tessuto differenziato in un altro tipo di tessuto, vd esofago di Burkett che da epitelio dell'esofago diventa epitelio dello stomaco dato dal reflusso gastrico. Displasia: alterazione qualitativa, quantitativa e morfologica della struttura cellulare di un tessuto o di un organo. Adenoma: tumore benigno di origine ghiandolare. LEZIONE 2: iperplasia, metaplasia e displasia, adenomi (scrivere la definizione). Dopo di che si ha la formazione di un carcinoma invasivo. Il passaggio fra zone benigne a zone maligne inizia quando le cellule epiteliali escono dalla posizione istologica normale uscendo dalla membrana basale e invadono il connettivo. In genere i clinici riservano la parola cancro a questo. L'incidenza del cancro aumenta continuamente ma anche il tasso di cura aumenta. La tecnologia diagnostica ha fatto grandi passi per cui lesioni sconosciute vengono individuate a livello di diagnostica. Possiamo individuare lesioni maligne piccole, questo ha aumentato l'incidenza dei tumori, però queste piccole lesioni sono un grande punto interrogativo perchè alcuni pensano che queste non daranno nel corso della vita pericolosità all'individuo. Un tumore può essere monoclonale solitamente, come facciamo a dimostrare che è monoclonale? Per esempio abbiamo una disattivazione casuale del cromosoma X , abbiamo due alleli che danno vita alla glucosio 6 fosfato deidrogenasi che è sul cromosoma X, se abbiamo una femmina eterozigote abbiamo due proteine diverse e quindi due alleli diversi sul cromosoma X, questa attivazione/inattivazione avviene nell'embrione. Nel tessuto adulto se guardo un organo come il fegato o colon abbiamo due componenti diverse che esprimono o un gene o un altro gene, se avessi che il tumore viene da più di una cellula dovrei avere due popolazioni differenti, invece vediamo che in un tumore non succede questa cosa ma è sempre solo una cellula che origina il tumore (dimostrazione vecchio stile). Per dimostrare la monoclonalità possiamo anche vedere che quando prendiamo il sangue di un individuo e facciamo correre le proteine del plasma su un gel vediamo varie bande e poi abbiamo che immunoglobuline, che normalmente migrano in modo differente perchè sono eterogenee, in un individuo in cui ho il mieloma multiplo questa eterogeneità non si osserva ma vedremo che nella banda su gel abbiamo una unica banda di una singola specie anticorpale. Un altro modo deriva dallo studio delle traslocazioni cromosomiche, vediamo che una traslocazione che crea una filma caratteristica che distingue la cellula interessata da quella circostante che hanno un cariotipo normale. Quindi i tumori sono tutti di derivazione monoclonale; inoltre altro un metabolismo energetico diverso dalle cellule normali questa teoria arriva dal 1965. le cellule normale quando sono ipossiche usano solo la glicolisi generando il lattato, mentre le cancerose anche quando hanno ossigeno usano la glicolisi producendo il lattato (quindi anche in condizioni aerobiche). Il glucosio usato dalle cellule normali finisce nel ciclo dell'acido citrico mentre nelle tumorali abbiamo GLUT1 che porta nel citosol glucosio e lo usano tramite glicolisi anaerobia quindi non producono ATP. Tutto questo porta a grande produzione di acido lattico da parte delle cellule cancerose. Il fatto che usino molto glucosio è alla base della PET ovvero tomografia ad emissione di positroni e in questo caso individua le cellule cancerose, viene usato fluoro-D-glucosio che viene importano nelle cellule cancerose, vengono individuate piccole aree che sono impossibili da vedere con altre metodologie. Non si sa perchè le cellule cancerose utilizzino questo metodo anaerobico che è svantaggioso a livello energetico perchè produce sono 2 molecole di ATP al contrario delle 32 prodotte per la glicosi aerobia, comunque l'80% delle cellule cancerose usano questo metodo. L'incidenza è diversa delle varie tipologie di tumori a seconda dell'area geografica: per esempio il melanoma ha un rischio maggiore di presentarsi in Australia rispetto al Giappone di 155 volte questo perchè per esempio in Giappone non c'è mai il sole al contrario dell'Australia. Per esempio è molto a rischio un maschio dell'Europa dell'est di tumore al polmone rispetto a uno dell'africa occidentale. Queste cose si verificano perchè c'è sia differenza di ambiente che differenza genetica. Studio:Osaka anni 70, e Hawaii giapponesi e caucasici, vediamo per esempio che nel tumore al seno l'incidenza è più bassa in giappone che nelle hawaii ma si può vedere anche che un giapponese che va alle hawaii ha un rischio più alto di cancro, in questo caso è quindi l'ambiente ad avere una marcata influenza. Negli anni 50 si è scoperto che i fumatori hanno un rischio 20 volte più alto di avere tumore al polmone. Anche la dieta incide molto sui tumori dell'intestino e delle stomaco. In questi anni si sono fatti studi su composti mutagenici, ovvero che inducono mutazioni del DNA e allo stesso tempo studi di carcinogenesi ovvero composti chimici che aumentano il rischio di insorgenza di tumore nell'animale. Parliamo del test di Ames, sappiamo che l'organismo ha la centrale chimica che è il fegato che detossifica l'organismo tramite diversi enzimi. Per vedere se ho un composto carcinogenico mi serve tempo perchè devo testare molti topi e seguirli per anni. Ames vede che possiamo mescolare in provetta sostanze chimiche con un megato omogeneizzato, per cui mescolò omogeneizzati di fegato di ratto con i suoi composti di prova e poi introdusse questa miscela in piastre batteriche di salmonella. Questo test ha rilevato che un certo numero di cancerogeni noti erano anche attivamente mutagenici. Ancora più importanti erano le correlazioni che Ames aveva trovato, le sostanze che erano potenzialmente mutagene era anche potenti cancerogeni, quelle che invece erano debolmente mutagene inducevano scarsamente il cancro. Ci sono eccezioni ovvero ci sono composti che danno tumore senza dare mutagenesi. Adesso sequenziando il DNA possiamo dire quale avente ha mutato effettivamente il DNA in mezzo a tante sostanze mutagene, per esempio è avvenuta tramite i raggi solari. È possibile fare una correlazione tramite un log-log plot dove mettiamo nella X i microgrammi delle sostanze e vediamo che ci sono programmi molto mutagenici anche a piccolissime dosi come microgrammi, nanogrammi. Mg x Kgx gg per due anni è il modo per testare un composto se è mutagico senza usare il test di Ames. LEZIONE 3: gli studi iniziarono sui tumuri all'inizio del 900 quando erano noti ad allevatori di polli che questi sviluppavano tumori e un esprimento venne fatto su polli che sviluppavano leucemia, e si vide che questa poteva passare da un pollo all'altro attraverso una trasfusione di sangue. Successivamente venne fatto con dei sarcomi e li iniettava nei polli e anche in questo caso i polli sviluppavano leucemie. E dagli esprimenti emergevano alcune caratteristiche. Le cellule cancerose hanno una morfologia diversa delle cellule normale, abbiamo perdita di inibizione da contatto quindi le cellule crescono una sopra l'altra, inoltre se viene inserito un terreno semisolido vediamo che le cellule trasformate formano colonie e posso no crescere in modo indipendente dall'ancoraggio. Se prendiamo dei fibroblasti normali e li mettiamo in coltura di replicano per un numero di mitosi predefinito (circa 50 volte) perchè hanno il fenomeno della senescenza, mentre le cellule trasformate sono immortalizzate e danno vita a un numero di mitosi indefinito. Inoltre non hanno necessità di fattori di crescita per andare in mitosi; importano maggiore glucosio rispetto alle normale; e sono tumorigeniche ovvero se vengono iniettate in un topo immunodepresso, queste cellule se trapiantate inducono tumori. Questi topi vengono definiti nudi sia perchè sono senza peli ma anche perchè non hanno il timo e quindi sono immunocompromessi. VIRUS CHE POSSONO PROVOCARE CANCRO: la maggior parte dei tumori non ha origine virale, ma ci sono virus che possono essere fattori predisponenti l'insorgenza di alcuni cancri. Per esempio il primo scoperto era SV40, virus associato a trasformazione delle cellule, vediamo una colorazione dove SV40 è stato messo in evidenza in immunofluorescenza e vediamo la colorazione verde nel nucleo e quella rossa dovuta alla falloidina nel citoplasma (si lega alla actina della cellula) normalmente questo virus non è molto pericoloso. Abbiamo anche il virus BK che è umano e può essere oncogenico in un individuo trapiantato in cura con farmaci immunosoppressori, in alcuni casi può dare tumore (es individuo che ha avuto un trapianto di rene BK ha dato tumore alla vescica). SV40 e poliomavirus nel topo sono a DNA e si integrano nel genoma delle cellule, questo fatto può dare trasfromazione cellulare. In caso in cui abbiamo virus a RNA come RSV questi passano ad un intermedio a DNA e tramite la retrotrascrizione riescono ad in integrarsi, il virus quando entra ha già la trascrittasi inversa che funge anche da integrasi, tutto il genoma viene integrato per fare in modo che il virus venga totalmente riprodotto. Mentre SV40 e BK non si integrano totalmente,o questi rimangono episomali per la maggior parte delle volte. Quindi i genomi a RNA si integrano, mentre quelli a DNA rimangono per la maggior parte episomali Human src: due ricercatori si sono impegnati a realizzare delle sonde a DNA che riconoscesse in modo specifico le sequenze associate alla trasformazione (src che sta per sarcoma) del genoma RSV per comprendere le origini e le funzioni. Tramite la sonda src si è scoperto che vi erano sequenze src erano presenti fra le sequenze di DNA di cellule di pollo non infette. La presenza di un gene src altamente conservato nel genoma di un organismo normale implicava che questa versione cellulare di SRC avesse svolto un ruolo nella vita di questo organismo ovvero il pollo e delle sue cellule. Le azioni oncogene del virus come il virus della leucosi aviaria AVL che non ha oncogeni acquisiti protrebbee essere speriagto dall'integrazione del loro DNA provirale adiacente al un proto-oncogene cellulare. L'analisi di numerosi linfomi a cellule B indotti da AVL ha rilevato che una grande proporzione dei provirus era integrata.(si palra di inserzione mutagenica). Protooncogene: oncogene cellulare endogeno provirus: genoma virale integrato nel genoma Dulbecco ha proposto che per capire i meccanismi tumorali era necessario sequenziare il genoma, questo lo disse negli anni 80, e si potevano sequenziare circa 1000-5000 kb per esperimento. Adesso abbiamo macchine che sequenziano il genoma umano in 25 ore e si parla di miliardi di nucleotidi. Nel 2005 si pensò che vi erano tecnologie per sequenziare sia il genoma umano ma anche genoma tumorale, l'idea era sequenziare 10 mila tumori e farlo in pochi anni. Si voleva dimostrare che nei tumori vi erano mutazioni a livello degli oncogeni e non solo. Era chiaro che vi fossero mutazioni diverse in ogni individuo. Il progetto fu concluso circa 10 anni fa. Noi vogliamo classificare un tumore, in modo da dare il trattamento migliore ai pazienti, quindi classificare significa distinguere in gruppi a seconda delle mutazioni. Per quanto riguarda il cancro al seno abbiamo luminali A e B che derivano delle cellule che formano il lume del dotto, HER2 arricchiti sono quelli che hanno questo oncogene amplificato quindi un numero di copie superiore, e poi abbiamo il basal like ovvero ha un trascrittoma che assomiglia alle cellule basali staminali. Si è visto che le mutazioni somatiche non silenti sono distribuite in modo diverso a seconda del sottotipo. Inoltre rispondono a ormoni e terapie differenti. Focus Dato raw: sono dati grezzi che derivano dal macchinario, la macchina fa delle foto che vengono trasformati in numero e sono tracce che rimangono nel computer dati processati: sono dati che da numeri diventano sequenze nucleotidiche. LEZIONE 4: oncogeni cellulari. Abbiamo visto che i virus possono alterare la cellula e diventare oncogeni, ma la maggior parte dei tumori arriva da geni alterati nel genoma, quindi le mutazioni predispongono alla insorgenza di cancro. I virus rubano geni alla cellula in modo da diventare maggiormente replicativi e invasivi rubando gli oncogeni alla cellula. Abbiamo visto una lista di virus che hanno carpito gli oncogeni alla cellula come SRC, KIT, SIS, ETS, quindi gli oncogeni cellulari sono molti. Gli oncogeni sono classificati in base alla proteica che codificano, possono essere TK quindi tirosina chinasi di tipo recettore o no, fattori di trascrizione, serin treonin chinasi, e possono dare carcinomi, linfomi, sarcomi. Si è visto che il numero di oncogeni è circa centinaia di geni diversi e si possono vedere tramite saggi funzionali, ovvero identificare qualcosa in base alla sua funzione. Alcuni di questi oncogeni sono stati isolati in modo peculiare, si è visto che un sottogruppo di tumori al seno è amplificato in HER2 (detto anche erbB2 e neu), che è stato isolato con un southern blot ovvero si andava a verificare come era la copia genomica di un oncogene su un DNA. Tecnologia simile sul Rna è il northen blot e western blot per verificare la proteina. Usando queste tecnologie si era visto che questo HER2 era oncogene cellulare, amplificato in alcuni pazienti con tumore somatico al seno e vi era anche più RNA e la proteina. Si può fare anche immunoistochimica con la fettina di tessuto per verificare quello che è emerso dai test. Adesso viene eseguito NGS. Esempio macro array venivano testati 360 rimary breast tumors dove ogni colonna è un tumore e i puntini sono i geni che stanno nel cromosoma 17, che contiene erbB2 nel grafico il verde esprime che il gene è in una quantità normale mentre il rosso che è super espresso, in questo grafico possiamo vedere che abbiamo una zona molto concentrata di rosso dove 1/5 dei pazienti hanno molto rosso e quindi l'amplificazione di erbB2. Possiamo cercare oncogeni anche in un altro modo, in modo funzionale tramite la trasfezione del DNA di cellule trasfromate, in questo caso prendiamo della cellule di cancro trasformate e le mettiamo in una capsula Petri sopra dei fibroblasti in modo da fare entrare il DNA tumorale nei fibroblasti, per cui le cellule normali vengono trasformate in cancerose. Dopo un po' di giorni sviluppiamo un clone cella piastra di fibroblasti trasfromati. Dopo di che vado a iniettare queste cellule in un topo e vediamo se al topo nasce un tumore nel punto di iniezione. Così venne fatta la prima sequenza dell'oncogene, sono state usate sonde ALU per isolare il genoma del tumore umano entrato nel topo, e si vide che questo oncogene era H-ras che aveva una mutazione singola all'inizio della proteina e la mutazione cambiava una glicina in valina (da proto- oncogene ad oncogene. K-ras è l'oncogene che ha le mutazioni più comuni a livello somatico nell'uomo e N-ras. K-ras ha le mutazioni più frequenti nel codone 12-13-61 e queste mutazioni sono definite hotspot e queste sono le mutazioni che rendono la proteina maggiormente attiva. Queste mutazioni le troviamo frequentemente nei tumori del pancreas 90%, nella tiroide 60%, nel melanoma ho un 15% n-ras, anche nel fegato per un 30% ho N-ras. Queste tre proteine sono tessuto specifiche H-K-N ras. Un altro oncogene è n-myc che a seconda della sua espressione o meno cambia la severità la patologia mostrato in un tumore pediatrico ovvero neuroblastoma. Il grafico ci dice che se abbiamo una over espressione di n-MYC la sopravvivenza libera di eventi inferiore. I pazienti con basso numero di MYC hanno una sopravvivenza vicino a 1. per cui questa amplificazione rende il tumore molto aggressivo. (grafici di Kaplan-Mariel). Il tumore può insorgere in caso di duplicazioni e mutazioni puntiformi e possiamo avere anche traslocazioni cromosomiche prima scoperta nel linfoma di Burket, dove vi era mic e il resto del cromosoma 8 si fondono nel cromosoma 14 questo porta al trasferimento di mic nel gene dell'immunoglobulina che ha un enhancer e promotore molto forte facendo molte copie per cui vi è una maggiore espressione di MIC. Il promotore IgH è espresso sono nelle cellule che esprimono le immunoglobuline per cui non può dare tumori solidi per questo da linfomi. Oltre alla traslocazioni che attivano MIC abbiamo anche bcl-2-3-6. Le traslocazioni danno maggiormente origine a leucemie e linfomi, danno pochi tumori solidi. La traslocazione più famosa è quella che mette insieme due geni bcr-abl del cromosoma 9 e 22, sono entrambe proteine che si fondono e si crea una nuova proteina che ha il promo pezzo di bcr e il secondo pezzo di alb per cui si forma una proteina di fusione che normalmente non esiste nel nostro organismo dando luogo alla leucemia mieloide cronica CML. Questo è stato il primo caso di terapia mirata ad un oncogene. Molti oncogeni sono tirosina chinasi, ovvero trasferiscono il gruppo fosfato da ATP a proteina sulla tirosina, queste proteine sono per lo più recettori. I fattori di crescita e i recettori sono spesso alterati nel cancro. Myc: fattore di trascrizione questi fanno tutti parte della trasduzione del segnale di una HER2: recettore cellula. SRC-ABL: tirosina chinasi. PDGF: fattore di crescita che è legato alle piastrine. Come fa un visrus a diventare tumorale? La proteina src nella cellula è una proteina chinasi. Vediamo l'esperimento dove prendiamo delle cellule di fibroblasti infettiamo con ALV (che non ha src) e poi RSV, abbiamo poi preso ATP radioattivo e si incubano le cellule con l'anticorpo contro src, se è presente si formano immunoprecipitati e vediamo che solo le cellule infettate con RSV creano una banda. Questo perchè SRC prende il gruppo fosfato e si autofosforila nel suo sito catalitico. La fosforilazione può portare alla attivazione o inattivazione della cascata del segnale a seconda della proteina bersaglio. LEZIONE 5: le proteine kinasi hanno target multipli. L'effetto di un oncogene che va a trasformare una cellula va ad agire su tanti livelli differenti andando a regolare diverse proteine in una cellula. I saggi che usiamo per separare gli amminoacidi sono le cromatografie fatto su un supporto di plastica dove mettiamo in un punto il substrato proteico, e migriamo la piastr a 2 dimensioni con un pH verso sinistra e un altro pH nell'altra dimensione e abbiamo la separazione. SRC virale c'è nel virus e anche nella cellula normale. Vediamo un esprimento degli anni 80 dove usando il sequenziamento proteico si è identificato la sequenza di erb-B (aviario), la proteina di questo oncogene è simile ad una proteina umana che è EGF-R (recettore). EGF-R usa un dominio extracellulare per legare EGF mentre erb-B non ha il dominio e non lega un livando ma conta quello che c'è dentro alla cellula, che provoca attività mitogenica anche in assenza di ligando. Un oncogene non ha il dominio che lega il ligando perchè è già attivo di per se, basta che vada nella cellula e la manda in mitosi anche in assenza del ligando. Tutte le proteine chinasi hanno un regione di omologia con SRC che è la regione della tirosina chinasi. I recettori tirosina chinasi RTK sono parecchi, e hanno tutti un dominio transmembrana, un dominio intracellulare tirosinico possiamo avere un dominio interrotto e quindi è diviso in due (definito inserto per la chinasi) mentre gli altri sono interi, sono diversi nella componente extracellulare che è quella che da specificità per il ligando. Tutti questi recettori cellulari hanno un corrispettivo oncogenico virale come SCF (lega un fattore di crescita) ha il corrispondente Kit, NGF ha il corrispondente trk. I virus hanno recettori sempre attivi perchè non hanno il dominio che lega il ligando, quindi si ha sempre attivazione della tirosina chinasi. Normalmente si ha un segnale mediato da recettore-ligando, questo è prodotto da una cellula diversa rispetto a quella dove è presente il recettore, per cui recettore e ligando sono sempre su cellule diverse (es una cellula mesenchimale manda il ligando TGF-ALFA che si lega al recettore della cellula epiteliale che poi va in mitosi). Siamo in presenza di una segnalazione paracrina, due cellule vicine ma distinte si regolano una con l'altra. I fattori di crescita viaggiano nel sangue ma anche nella matrice extracellulare. Se invece abbiamo ligando recettore sulla cellula abbiamo un loop autocrino (cellule tumorale) ovvero la cellula si va ad autostimolare quindi siamo in presenza di patologia. Kit recettore mutato nel tumore stromale gastrointestinale, ret mutato nella tiroide, FGF mutati in molti tipi di neoplasie. Ad oggi se troviamo le mutazione possiamo usare farmaci specifici. Il loop autocrino fu identificato da un laboratorio che studiava sequenze proteine nel 83, fu il primo lavoro che confrontava un oncogene del sarcoma della scimmia SIS, il gruppo sequenza PDGF delle piastrine, vediamo che nella banca dati esisteva una omologia fra le due sequenze. Per cui abbiamo implicazione di un oncogene con un fattore di crescita nella cellula. I fattori di che hanno questo aspetto autocrino sono molti nel nostro corpo (VEGF, citochine IL-6/8, HGF epatociti). La fosforilazione è reversibile e veloce, se diamo EGF alla cellula possiamo misurare la fosforilazione del recettore tramite la marcatura con un anticorpo monoclonale che vada a legarsi alla tirosina fosforilata. SH2 e SH3: regione di omologia 2 e 3 di src. Nella proteina SRC abbiamo tre domini abbiamo il dominio SH1-SH2-SH3, il dominio SH1 è a sua volta suddiviso in sottodomini terminali all'N e al C terminael. In mezzo a questi due lobi abbiamo in sito catalitico di binding dell'ATP. Mentre SH2- 3 sono due domini importanti per il riconoscimento del substrato e la regolazione della attività catalitica. RAS: è a valle dei recettori tirosina chinasi. È legato alla membrana basale tramite un acido grasso, è inattivo quando vi è legato GTP ma se abbiamo il segnale di SOS che è un GEF ovvero un fattore di scambio del GTP ovvero toglie GTP e mette GDP con attivazione di Ras. Cosa c'è dopo RAS? Questo perchè ras non è nel nucleo, per cui è presente Raf che è una proteina oncogenica e poi da luogo ad una cascata di eventi che danno tutti fosforilazione attivando tante proteine MAP, quindi abbiamo una cascata di proteine chinasi, in pochi secondi si possono fosforilare 100, 1000 proteine chinasi e si ha una cascata di segnale. Si attiva anche una altra cascata del segnale parallela che è quella di PI3 chinasi che catalizza il trasferimento di ATP su un fosfolipide di membrana, si ha produzione di fosfatidilinositolo 3 fosfato che funge come secondo messaggero. E questo produce la attivazione di altri oncogeni implicati per esempio nella apoptosi, proliferazione e crescita cellulare. LEZIONE 6: Pyton è un linguaggio di programmazione. È dotato di efficienti strutture-dati di alto livello e propone un approccio alla programmazione a oggetti semplice ma efficace. Pyton è estensbile ovvero possiamo fare 1+1 e fa due, ma possiamo dirgli prendi dati di biologia molecolare e fai una interpretazione e lo facciamo tramite librerie o moduli. APPUNTI SUL TABLET LEZIONE 7: metodi di sequenziamento sanger e illumina (vedi genetica medica) Oxoford nanopore: abbiamo una membrana con i nanopori e una elicasi e quando uno strand di DNA passa per la membrana e si ha un potenziale di azione che viene rilevato dallo strumento ma dato che non abbiamo una amplificazione non vi è una verità assoluta. Adesso si fa un single cell sequencing (sc-seq) è una metodica che serve ad analizzare il materiale genetico cellula per cellula. Se abbiamo un tessuto se facciamo una analisi illumina abbiamo un mix mentre il single cells ci fa individuare che cellula parliamo in base ai marker che esprimono e quindi avremo una divisione delle cellule. I costi sono elevati, anche più difficili i lavori, ma abbiamo una risoluzione più alta, ci permette di discriminare l'eterogenità del tessuto e l'analisi bioinformatica è complessa. Una delle applicazioni è la trascrittomica che sfrutta tecniche di coding e ci permette di identificare rari tipi cellulari e questo è molto importante nella oncologia e questo è utile anche per identificare il trattamento migliore. Posso individuare diversi cloni e mutazioni in un tumore. ATAC sic: studio della accessibilità cromatidica. Le applicazioni di questa tecnologia sono immunologia, cancro, e neuroscienze, si può studiare lo sviluppo fetale per studiare i lineage cellulari e il loro differenziamento, medicina rigenerativa per vedere l'organo genesi. Per il cancro è importante per studiare l'evoluzione clonale, l'eterogenità intratumorale, i l'ambiente ambientale. Ci sono diverse metodiche di sequenziamento single-cells: ci sono metodi di isolamento cellulare diverso, la lisi cellulare che può avvenire tramite detergenti o di tipo enzimatico; il coverage del trascritto come quelle che leggono solo una parte del trascritto 5'-3' oppure quelli che leggono tutto il trascritto; e poi UMI ovvero unique molecular identifiers ovvero se abbiamo 30 mila geni diversi abbiamo 30 mila oligonucleotidi diversi per identificarli per ridurre errori e bias quantitativo. Dopo che ho tutte le mie reads devo fare un allineamento con un genoma di riferimento. Dopo di che devo andare a contare quante volte il mio gene è stato espresso. Single cell: spesso in una goccia c'è una singola cellula e dentro a questa ci sono i trascritti, ma ci sono gocce che non hanno nessuna cellula e queste sono scartate. E vengono escluse anche le gocce con contaminazioni. coverage: numero di volta che è stato letto il nucleotide per verificare che siamo in presenza di cellule sane si va ad indagare il DNA mitocondriale che se è al 5% rispetto al totale significa che sono cellule sane, se invece è maggiore le cellule sono morte o stanno morendo. Cellule omo ed eteroschedastiche., questa crea sottopopolazioni che crea artefatti perchè non ho normalizzato i dati. Per la normalizzazione si ha un logaritmo shiftato o residui di pearson. Se sequenzio una cellula posso avere 20 mila geni espressi, ma la metà sono geni espressi anche in altre cellule come le tumorali o altre cellule che non ci interessano, e quindi non danno informazioni utili per cui vengono esclusi dalla analisi totale si fa features selection dove riduco di circa 10 volte il numero di geni totali e sono quelli che identificano davvero il tipo cellulare. Batch effect: faccio un esperimento sulle cellule, e faccio una PCR per vedere quanto è espressa p53 nelle cellule e trovo un valore ma il mio collega ne trova un altro, e questi effetti possono essere dati dalla strumentazione o dal materiale biologico che uso. Questi si eliminano con l'integrazione dei dati, come fare lo stesso esperimento volte diverse. Dopo di che il software divide in cluster e dopo da questi cluster dovrò dare un nome in base ai marcatori se conosco le cellule sennò il mio software fa una notazione automatica. LEZIONE 8: le cellule epiteliali dei carcinomi sono cellule che aderiscono ad un substrato come la membrana basale. I recettori coinvolti nella adesione cellulare e i meccanismi li vediamo: vediamo un immagine di un recettore che sono le integrine che hanno due subunità una alfa e una beta e queste legano la matrice extracellulare, quando sono attivati la talina e FAK che è una chinasi che si attiva nei punti di adesione focale. L'integrina oltre ad attivare FAK attiva CRK, RAF, NEK e interagisce anche con il citoscheletro di actina e si ha quindi riarrangiamento del citoscheletro. ANOIKIS: cellule epiteliali che si staccano dalla matrice e vanno in apoptosi quindi avremo le integrine che non toccano la membrana basale e la cellula muore. Per esempio se abbiamo una ghiandola, al centro vi è un dotto perchè le cellule epiteliali al centro non toccherebbero la membrana basale per cui andrebbero in apoptosi per questo si crea un dotto e nella figura viene indicato questo processo dalla caspasi 3; ma se non abbiamo più la caspasi 3 che da il segnale di apoptosi non si ha anoikis e nella nostro esperimento si ha espressione di Bcl-xl che è una proteina apoptotica e le cellule non vanno in apopotosi. Oltre le integrine abbiamo anche altri recettori come caderine (fra cellule fiancheggianti) che è formata da dimeri di catenelle che escono nello spazio extracellulare e all'interno della cellula c'è sempre una connessione con l'actina. L'impatto sul citoscheletro avviene tramite alfa e beta catenina insieme a p120. La cadenina può anche andare nel nucleo e attivare una via del segnale tramite il recettore freezzeld che è un recettore a 7 domini transmembrana e un ligando di questi è WNT che è un oncogene attivato spesso anche per integrazione di virus nella cellula, quando si legano ligando- recettore si ha una proteina che lega l'axina che giungono in membrana e si stacca il complesso B- catenina-APC-JSK3BETA. La beta catenina quando non c'è WNT viene degradata e non attiva il segnale nel nucleo, ma se WNT si lega al recettore transmebrana si ha la liberazione di B-catenina- APC-JSK3BETA, si ha trascrizione nucleare. Anche la caderina può essere mutata quindi è un oncogene. Questi recettori a 7 domini transmembrana sono recettori accoppiati alle proteine G, eterotrimeriche, che legano GTP, quando il recettore non è legato al ligando le proteine G sono spente, se arriva il ligando si ha il distacco di alfa,beta e gamma che erano legate al GTP e alfa degrada il GTP, si ha attivazione di enzimi intracellulari che rientrano nelle componenti di trasduzione del segnale come l'adenilato ciclasi che produce AMP ciclico; una fosfolipasi. Nel melanoma, tumori ovarici, adenoma ipofisi, possiamo avere attivazione dei recettori accoppiati a proteine G. NOTCH oncogene attivato in alcune leucemie. Questo è ancorato alla membrana plasmatica e può legarsi ad alcuni fattori di crescita o oncogeni, quando si forma il complesso ligando-recettore abbiamo un taglio del recettore e quindi non abbiamo più il segnale, il pezzo di notch intracellulare si trasferisce al nucleo e attiva la cascata del segnale. Si autoestingue quando attivato solitamente ma non lo fa nel gliobastoma e nella leucemia linfoide cronica. Immaginiamo se tutto quello che abbiamo detto avviene in una singola cellula. La cellula dovrebbe avere chiari segnali si proliferazione, expressione genica e sopravvivenza. Avremo anche segnali a feedback negativi, quindi dobbiamo spegnere un segnale. (da rivedere la fosforilazione di RAS) Un altro meccanismo di inattivazione di RTK che richiede l'interazione fisica tramite vescicole del recettore in modo che non si possa creare il binding con il ligando. RAS può avere diversi effetti può dare trascrizione cellulare, può essere implicato nella produzione delle proteine, il riarrangiamento dello scheletro, impatta sul calcio intracellulare. Parliamo di oncogeni perchè ci interessano i geni attivati e mutati durante l'oncogenesi cellulare, alcuni oncogeni sono molto generici mentre altiri sono attivato solo in particolari tipi di tumore. TUMOR SUPPRESSOR GENES 1: affinchè un tumore possa originarsi è necessario che nei due cromosomi omologhi almeno qualcosa deve essere mutato. Abbiamo visto che ci sono gli oncogeni come RAS RB2 che attivano la proliferazione cellulare, ma ci sono anche geni che fanno l'opposto ovvero sono contrari alla crescita e si chiamano tumore soppressori, in questo caso se il gene è inattivato o perso avremo la trasformazione oncogenica. Questo è stato dimostrato tramite saggi funzionali, per esempio inclusione cellulare dove fondiamo due cellule con agenti fusogenici e avremo una cellula con più di un nucleo all'inizio e poi quando vanno in mitosi cambiano e si assettano in modo diverso dalla cellula originale. Possiamo prendere una cellula cancerosa e la fondiamo con quella normale e se alla prima manca qualcosa può succedere che la cellula ibrida rimane cancerosa oppure no, nel primo caso possiamo dire che il gene che manteneva cancerosa la cellula era dominante (RAS mutato è dominante) ma se abbiamo un gene spento che si è rotto la cellula normale ha il gene normale e la cellula ibrida rimane normale e in questo caso di parla di gene recessivo. (gain of function=dominante/ loss of function=recessivo). Il classico esempio di gene tumore soppressore è quello del retinoblastoma, il retinoblastoma è una patologia che colpisce la retina, la retina ha diversi strati, in questo caso abbiamo la crescita di un tumore dentro la retina, è tipica dei bambini. Questa malattia può essere in due forme, con patologia unilaterale senza genitori con la patologia in questo caso si parla di sporadico, e genitori con la forma e la patologia poteva essere bilaterale in questo caso di ereditario. Possiamo vedere che l'incidenza di patologie che non sono della retina è maggiore nelle persone che hanno la forma bilaterale 36% mentre quelli unilaterali hanno un 5%, per cui quando è famigliare predispone l'insorgenza di tumori. Nella forma bilaterale basta un evento nel cromosoma per avere retinoblastoma mentre nel caso sporadico per avere la malattia ci vogliono due eventi cromosomici. Il gene RB sta sul cromosoma 13. In un tumore si mostra che si perde la copia di un gene, tramite la loss oh heterozygosity (LOH) ovvero abbiamo due loci in un gene quando si perde la eterozigosità significa che abbiamo perdita di un locus, e si ha nascita di un tumore che diventa omozigote e questo dimostra che un pezzo di cromosoma o il cromosoma intero si è perso. Questa tecnica è stata usata per scoprire pezzi del cromosoma che durante i tumori diventavano omozigoti. Adesso si può usare NGS. LEZIONE 9: tumor suppressor genes 2: l'evento di perdita di eterozigosità può essere un modo per trovare i tumori. La metilazione è un meccanismo importante per la regolazione della attività genica. Alcuni anti oncogeni possono essere perdi per metilazione del promotore quindi blocco della proteina. Un esempio può essere la metilazione del promotore di RASSF1A che è antitetico a RAS, nel grafico vediamo che abbiamo preso il DNA del tratto del promotore del gene e abbiamo guardato quando è metilato nel DNA di individui normali vediamo che nelle persone normali non c'è metilazione mentre in un paziente con tumore vediamo che è metilato, quindi questo gene è metilato nei tumori e abbiamo mancata trascrizione e la proteina non viene prodotta. Se la metilazione spegne un antioncogene, cosa ci aspettiamo succeda se abbiamo ad esempio un gene che provoca la metilazione dei promotori sul DNA di antioncogeni? Ci aspettiamo che abbia una funzione oncogenica. Per esempio espressione di DNMT3B (DNA metil trasferasi) che ipermetila molte isole CpG durante lo sviluppo dei tumori e si è preso un anticorpo per questa proteina. gli antioncogeni sono solitamente tessuto specifici. Una strategia terapeutica può essere dare agenti demetilanti che vanno a spingere i tumori in uno stadio differenziato e quindi meno aggressivo. Ci sono altri anti-oncogeni importanti? Il retinoblastoma è stato uno dei primi dato che è mutato in alcune malattie ereditarie. Anche nella neurofibromatosi che è una malattia ereditaria e si divide in 1 e 2 e con il tempo si è scoperta la proteina responsabile della malattia di tipo 1 e il gene è chiamato NF1 e questa proteina va a regolare un oncogene che è RAS. La patologia è associata a un singolo gene ma viene considerata una sindrome dato che RAS è molto importante, gli individui hanno noduli sottocutani (neurofibromi) sulla pelle e appaiono come macchie, si può notare l'iride e anche questa presenta noduli. Andando a fare istologia di queste strutture si vede che sono neurofibrimi benigni ma essendo tanti è possibile che uno progredisca in uno stato maligno e avviene soprattutto a livello di tessuto nervoso periferico. NF1 regola la segnalazione di RAS (oncogene che si spegne perchè una intrinseca attività GTPasica e se abbiamo mutazione oncogenica questa viene abolita) e regola lo scambio GTP, GAP proteina che attiva la GTPasi di RAS e quando c'è normalemente abbiamo RAS spento, ma se la proteina è mancante non si ha spegnimento di RAS. NF1 accelera l'idrolisi di GTP normalmente tramite un dito di arginina. APC: individuato nella adenomatosi poliposi famigliare dove si ha insorgenza in giovane età e in grande numero di polipo nel colon, la progressione maligna dei polipi è rara, ma se abbiamo mille polipi aumentiamo la possibilità che questa possa diventare maligno. Questi individui oltre ad avere problemi hanno anche un insorgenza più alta di tumori maligni e fu scoperta la posizione del gene sul cromosoma 5 e la proteina codificata. APC gene facilita l'uscita delle cellule dalle cripte del colon. Il 90% delle mutazioni somatiche ha a che fare con l'accumulo della beta catenina, solitamente si forma un complesso fra APC, axina e beta catenina quando arriva WNT, APC collabora per tenere in vita beta catenina che poi andrà nel nucleo e poi la cellula va in mitosi (normale). Nella situazione patologica quando APC è mutato si accumula la beta catenina, APC può anche essere metilato, oppure la beta catenina ha mutazioni puntiformi e non è fosforilata da GSK3beta che la porterebbe alla degradazione se fosse fosforilata. Come antioncogene APC blocca l'attività della beta catenina. (oncogene beta catenina- antioncogene APC). Nella situazione patologica nella cripta i progenitori proliferano come progenitori indifferenziati e poi proliferano con la beta catenina ma poi senza APC il segnale non si spegne più e si creano polipi, normalmente WNT attiva beta catenina e si producono progenitori indifferenziati che poi differenziazione non vanno più in mitosi, con disattivazione di beta catenina. Con polipi si ha alta probabilità di avere una mutazione che produce cellule maligne. Von Hippel-lindau: gene VHL e proteina pVHL implicata nella risposta alla mancanza di ossigeno. I tumori possono crescere anche ipossici e la vascolarizzazione è deficitaria. Con questa sindrome si possono creare carcinomi a cellule chiare al rene, feocromocitoma e amangioblastoma sono situazioni rare ma tutti i pazienti che hanno questa patologia hanno mutazioni nel sopressore VHL. Quando la proteina non ha mutazioni possiamo avere un silenzimaneto trascrizionale per metilazione del promotore. VHL nella cellula è coinvolto nell'adattamento della cellula all'ipossia, abbiamo HIF-1 fattore di trascrizione indotto dall'ipossia insieme a HIF-2alfa e si ha attivazione di un programma trascrizionale che adegua l'organismo alla bassa tensione di ossigeno e si crea neovascolarizzazione ed è necessario produrre VEGF che produce nuovi vasi nell'organismo. In condizioni normali c'è HIF-1alfa ma viene degradato, lui c'è perchè avere poco ossigeno è una condizione letale per cui è meglio averlo in circolo che aspettare 8 ore per la produzione. La proteina fosforilata si lega a pVHL che ubiquitinna HIF-1 alfa e abbiamo la degradazione. In assenza di ossigeno VHL non ubiquitizza HIF-1. Le conseguenze biologiche di mancanza di VHL sono l'attivazione di HIF-1 alfa. Un tumore ha un centro ipossico mentre diventa più ossigenato andando verso l'esterno. Prb and control of cell cycle: abbiamo il gene RB che da patologie invalidanti, ma perchè abbiamo questo gene nell'organismo, non è meglio rimuoverlo? La funzione di RB è importante perchè fa parte del controllo del ciclo cellulare. Le integrine, il recettore di tgf beta, i fattori di crescita sono tutti fattori che regolano il ciclo cellulare. ci sono geni che aumentano la proliferazione cellulare, mentre altri fanno crescere la cellula senza andare in proliferazione. Tubero: crescita benigna di cellule giganti presenti a livello cerebrale visualizzate con un anticorpo della proteina S6 fosforilata (controlla la sintesi proteica) queste cellule diventano giganti perchè fanno molte proteine. Nella proliferazione cellulare possiamo ricordare che il ciclo cellulare ha dei controlli che impediscono che il ciclo continui se ci sono problemi, per esempio la sintesi del DNA replica i cromosomi e abbiamo i checkpoint sull'eventuale danno di DNA, se il DNA ha dei problemi la cellula non continua nel ciclo cellulare. L'ultimo controllo avviene durante la segregazione dei cromatidi in anafase e se i cromatidi sono assembrali in modo sbagliato abbiamo blocco del ciclo. Supponiamo ci sia un gene che controlla la segregazione dei cromatidi e questo non funziona bene avremo degli errori durante la mitosi, potremmo avere endodupplicazione perchè un gene che controlla l'assemblalemnto dei cromatidi non funziona e abbiamo alterazioni cromosomiche. LEZIONE 10: Rad17 proteina che fa parte del complesso che controlla che la metafase sia organizzata per cui aumentano i corredi aploidi della cellula e li vediamo nelle cellule cancerose dove i checkpoint del DNA sono inattivati. Il nostro organismo controlla la crescita delle cellule e quindi abbiamo i tessuto organizzati, il periodo del ciclo cellulare che controlla che la cellula vada in mitosi o diventi quiescente è la G1. La G2 è una fase corta e costante, mentre la G1 si può bloccare per mesi, giorni o anni dove le cellule rispondono ai fattori di crescita mitogenici che influenzano l'entrata delle cellule in fase S. abbiamo anche segnali inibitori come il TGFbeta. Abbiamo un punto R che è particolare, prima di questo punto le cellule sono sensibili ai fattori di crescita, passato questo punto anche senza fattori di crescita le cellule vanno in fase S. Le cicline e le chinasi che dipendono dalle cicline, sono importanti per il ciclo cellulare, CDK4-6 importante perchè le cellule vadano in mitosi. La ciclina B ha il picco massimo in mitosi, la E prima della fase S, la A aumenta quando la E cala, la D1 corrisponde con la fase G1. Per cui le varie fasi del ciclo si possono dedurre a seconda della presenza delle cicline. Se noi sappiamo che il ciclo avanza solo quando abbiamo fattori di crescita e solo in fase G1, vediamo che abbiamo ciclina D CK4-6 per cui deduciamo che questo complesso è richiamato dai fattori di crescita. Quando una cellula in G1 è bloccata D1 è bassa. La ciclina D1 è un oncogene. I fattori di crescita di legano ai recettore tirosina chinasi e tramite fosforilazione si ha attivazione SOX E RAS e abbiamo poi la cascata di chinasi nel nucleo e si attiva il programma di mitosi, si ha trascrizione della ciclina D1 che poi nel nucleo materializza il legame fra fattori di crescita e recettori per la mitosi cellulare. Anche la beta catenina trascrive la ciclina D1 secondo una via diversa di quella di RAS, anche le citochine possono arrivare D1. Le proteine che trascrivono per D1 sono due oncogeni e sono FOX e JUN che insieme formano AP1. È presente anche la ciclina D2 che è attivata da MIC, AMP ciclico, Bcr-Abl. Il punto di restrizione R è il punto dove le cellule prime hanno bisogno di un fattore di crescita e poi entrano in un programma autonomo. Nella cellula abbiamo anche inibitori delle CDK, come le p57, P27, p18 queste sono diverse prima e dopo il punto R. vediamo TGFbeta che controlla il ciclo cellulare in modo negativo quindi è un segnale antimitogenico, e per fare ciò attiva la trascrizione di 15ink5 inibitore di CDK e poi attiva p21 che blocca altri complessi CDK, oppure può mandare un segnale endogeno nella cellula come un danno al DNA che porta a blocco dei complessi ciclina-CDK. Una delezione di p21 potrebbe dare cancro perchè non abbiamo più inibizione dei CDK. Supponiamo di avere un fattore di crescita che lega EGF recettore, vogliamo che la cellula vada in mitosi, abbiamo dei cross talk fra i recettori, AKT può bloccare gli inibitori delle CDK tramite fosforilazione di P21 e P27 questa previene la traslocazione delle molecole nel nucleo quindi si può avere mitosi perchè queste molecole restano nel citoplasma. Le cellule sono strutture che regolano la loro vita in modo accurato bilanciando segnali diversi all'interno della cellula. Abbiamo parlato di retinoblastoma antioncogene per eccellenza: RB fa parte anche del controllo del ciclo cellulare. Si è visto che è coordinata con il ciclo cellulare non tanto come quantità ma in un modo diverso ovvero cambia la fosforilazione di Rbp durante il ciclo cellulare. La fosforilazione cambia dopo il punto R, quando la cellula va in mitosi dopo il punto R, RB è iperfosforilato per cui abbiamo tanti AA fosforilati in particolare serina e treonina e abbiamo 14 siti in RB fosforilati dopo la mitosi invece viene defosforilato, è invece ipofosforilato in G1. Quindi la fosforilazione coincide con punti critici del ciclo cellulare. Oncogene E1 virale si è scoperto che può legare RB, ma anche due proteine simili p105 e p300. Il complesso CDK-46 ciclina D1 ipofisforila RB nella fase G1, nella fase R la ciclina CDK2 è iperfosforilato ed è inattivato in questo caso. RB funziona insieme a fattori di trascrizione della famiglia E2F che implementano l'entrata in mitosi quindi spingono la cellula verso la quiescenza. Quando RB è ipofosforilato ed è legato a E2F1 quando invece è iperfosforilato si stacca il fattore di trascrizione in tarda fase G1 e va nel nucleo, in fase S E2F1 viene degradato. Quando RB è legato si lega una istone deacetilasi che toglie i gruppi acetile agli istoni e la cromatina non è accessibile. Perchè una volta passato R la cellula in autopilota? I motivi sono che si instaura un feedback positivo ovvero una volta che ho iperfosforilato RB libero E2F che attiva vari geni fra cui la ciclina E che aumenta nella cellula CDK2 e questo aumenta la fosforilazione di RB fino a saturazione della cellula. Inoltre il complesso ciclina E e CDK2 va inibire gli inibitori di CDK come p27 fosforilandola e viene anche ubiquinato con digestione da parte del proteasoma. Altri oncogeni che abbiamo conosciuto sono per esempio MIC che è coinvolto nella decisione della proliferazione o differenziamento, mic lavora insieme a max che legano i promotori dei geni quando hanno una sequenza e-box si ha trascrizione dei geni e questi attivano i segnali mitogenici, ma abbiamo un'altra faccia della medaglia quando vogliamo differenziare la cellula dobbiamo reprimere i segnali mitogenici per cui devo cambiare il modo in cui le proteine di legano all'e-box per cui viene sostituito mic con MXD che insieme a MAX lega gli e-box e si ha minore mitosi e maggiore diffferenziamento. MIC per la proliferazione attiva la ciclina D2 CDK4 e si ha iperfosforilazione di RB, si ha anche inibizione di p21 e 27 per fare in modo che siano inibiti e quindi si attivi la CDK2 e poi abbiamo attivazione di E2F1 che va nel nucleo e poi si va in sintesi. Modo con cui possiamo controllare l'entrata di mic nel nucleo: se uso un pezzo di recettore degli estrogeni legato a mic fatta in un vettore (si crea così una proteina di fusione) che quando è presente nella cellula è nel citoplasma ma con il ligando degli estrogeni vanno nel nucleo e si lega al MAX e il fattore diventa attivo. Così si induce nel nucleo la traslocazione immediata nel nucleo. Il gene per la ciclina G1 è amplificato nel cancro con un meccanismo di amplificazione. LEZIONE 11: P53 e apoptosi. Nel caso della morte cellulare sono state investigate le cause, vediamo delle cellule epiteliali ghiandole mammario e abbiamo il connettivo e quindi si forma il dotto, abbiamo colorato le cellule per un anticorpo per antigene virale del virus SV40 si scimmia con attività sulla proliferazione cellulare, il virus trasforma le cellule epiteliali e soprattutto si colora il nucleo. Vediamo la proteina grande T che è il portante per il virus studiando questa si è scoperto che si lega ad una proteina umana che è p53 ed è un oncoproteina. P53 è perturbata da una serie si stimoli virali, come adenovirus con E1A (che questo lega anche RB), anche E6 dei HVP quindi vari virus legano e inattivano RB e P53. Si pensava fosse un oncogene perchè era presente nelle cellule cancerose anche in assenza del virus, gli oncogeni possono trasformare le cellule da soli ma quando sono in combinazione lo fanno meglio. C'è stato un esprimento dove c'erano le colonie di cellule trasformate con oncogeni se abbiamo ras e p53 con la valina 135 mutata abbiamo molte colonie trasformate; ma se mettiamo insieme ras e p53 wild type non c'era nessuna mutazione, per cui subentrò un dubbio che p53 fosse un antioncogene e solo mutata poteva cooperare con oncogeni. Le mutazioni che troviamo in p53 sono molto frequenti, ma non sono come quelle di ras che lo attivano, in questo caso spengono la sua attività per cui a dimostrare che è un oncosoppressore. Possiamo vedere la funzione di p53 come antioncogene in topi: se mettiamo delle mutazioni nei topini: se abbiamo wild type i topi vivono normale, se ho una mutazione con una copia wild type e una negativa a un anno la mortalità dei topi aumenta dovuta allo sviluppo di sarcomi e leucemie dovute all'invecchiamento; se invece andiamo a vedere i topi con una delezione in doppia copia di p53 abbiamo una mortalità alta. P53 è uno dei geni più mutati nei tumori la maggior parte delle mutazioni sono mutazioni missenso ovvero cambio di un amminoacido. Invece per quanto riguarda APC, ATM e BRCA1 circa ¾ delle proteine hanno un codone di stop e la proteina viene distrutta. frameshift: perdita della lettura della proteina, e abbiamo codoni di stop prematuri e le proteine vengono degradate nonsenso: codone di stop In p53 le mutazioni sono particolari e sono diverse dalle altre proteine indicate. P53 è un fattore di trascrizione con un dominio di trasnattivazione, dominio che lega il DNA dove abbiamo la maggior parte delle mutazioni, poi ha un dominio di tetramerizzazione (ovvero p53 funziona come un integrale di 4 proteine) e poi abbiamo un dominio ricco in serina. Come abbiamo detto p53 funziona come un tetramero, se una copia è deleta e l'altra c'è farò tetrameri con la copia funzionante e la proteina c'è, se ho una proteina wild type blu e una mutante ho due subunità ho poca proteina wild type mentre le altre combinazione non sono del tutto funzionanti quindi mi basta che uno dei due geni abbia una mutazione missenso che viene prodotta una proteina funzionante su 16 quindi 85% delle proteine non funzionanti e questo tipo di mutazioni viene definito dominante negativo ovvero distrugge l'attività di tutta la proteina nella cellula. P53 viene regolata da molti stimoli cellulari che vanno a intossicare la cellula come uv, oncogeni, ipossia, mancanza di nucleotidi, e la proteina può dire di riparare il DNA, può portare all'arresto del ciclo cellulare, oppure manda la cellula in apoptosi. Es: prendiamo timociti per p53 wild type, eterogizoti e p53 negativi dopo di che le irradiamo con i raggi x e vediamo dopo un giorno quante cellule sono morte, se le cellule sono normali queste muoiono grazie a p53, se vediamo i topi eterozigoti le cellule muoiono un po' meno, ma se prendiamo quelle negative a p53 irradiate dopo un giorno sono ancora quasi tutte vive, ma non perchè stanno bene, ma essendo difettive per la proteina non riescono a morire, accumuleranno le mutazioni e moriranno per necrosi. Uno degli effetti di p53 è che la cellula va in arresto nel ciclo cellulare, questo avviene perchè i segnali riducono le cicline oppure gli inibitori delle cicline. Se prendiamo anticorpi per gli inibitori delle CDK per esempio p21 è indotto dopo 24 che è stata irradiata la cellula per cui avremo arresto del ciclo cellulare per comparsa di inibitore delle CDK. Si può pensare che p53 trascrive direttamente p21 essendo fattore di trascrizione. Fra i geni che sono regolati da p53 abbiamo anche Mdm2 che è una proteina che lega p53 e la ubiquinizza e quindi la porta a degradazione al proteasoma, per cui è il suo regolatore negativo per cui questo è un feedback negativo per il controllo di p53. Il vantaggio di avere p53 funzionante è che uccide le cellule che non sono sane per cui è un modo per ridurre l'aging cellulare. Il dominio che lega Mdm2 è nella parte amminoterminale dove ci sono siti di fosforilazione, se è fosforilata MDM2 non si lega per cui non avremo degradazione. I geni che regolano p53 sono importanti a livello di insorgenza del cancro: quando la proteina è fosforilata non lega Mdm2 non viene degradata, ma è attivata e va a trascrivere vari geni, come Mdm2 che va nel citosol viene tradotto e poi lega p53 stessa, ma Mdm2 deve essere fosforilato per legare p53 tramite AKT (oncogene). Le proteine che invece fosforilano p53 e quindi la attivano e la cellula può andare in apoptosi, tramite la foasforilazione da parte di ATM attivata quando il DNA a doppia elica ha un danno, se il danno è a singola elica ATR è attivata che vanno a fosforilare il checkpoint 2 e poi va a fosforilare p53. Spesso nei tumori abbiamo un accumulo di p53 che diventa resistente a Mdm2 e n0n viene più degradata. Il rilascio del mitocondrio del citocromo C è il momento in cui la cellula capisce che deve andare in apoptosi. L'apoptosi è fondamentale per il mantenimento della salute di un individuo pluricellulare. P53 è mutato in alcune famiglie dove da origine ad una patologia ereditaria con alta incidenza di neoplasie di tipo diverso e viene definita sindrome di Li-Fraumeni. Un altro oncogene indotto e regolato da p53 è Bcl2. Bcl2 è un gene che di per se non fa nulla ma topi che hanno l'oncogene myc attivato sviluppano il tumore, vediamo che se abbiamo topi con myc e Bcl2 espressi insieme la curva è ancora maggiore verso la mortalità quindi abbiamo una amplificazione della funzione di myc. La stessa cosa avviene con Bcl-xl. Questo significa che abbiamo cooperazione per amplificare la attività dell'oncogene. LEZIONE 12: Bcl-2 sono geni mutati in leucemia delle cellule B, si è visto che sono svariati e fanno parte di una famiglia che hanno in comune che hanno dei domini BH1-2-3-4 domini di omologia a Bcl-2 vediamo che abbiamo alcune proteine che sono simili a Bcl2 che hanno alcuni di questi domini. Si è visto nel tempo che possono essere divisi in proteine che contrastano l'apoptosi come Bcl2, e proteine pro apoptotiche come Bax-bak, Bid, Puma questi mancano del dominio BH4. Le proteine come Bax sono in una forma inattiva nella membrana mitocondriale esterna o nel citosol, quando sono attivate vengono traslocate al mitocondrio e questo viene bucato con il rilascio di citocromo C. ci sono molte proteine coinvolte nella apoptosi sia come regolatori positivi che negativi questo perchè è importante controllare la vita e la morte della cellula stessa e questo implica che l'equilibrio è importante e delicato con vari punti di controllo. Vediamo un embrione di topo, parenchiama di rene di topo se rimuoviamo Blc-2 ambe due le copie si ha la formazione di cisti quindi rene policistico con apoptosi di cellule del parenchima renale (tolta del segnale antiapoptotico) ma basta rimuovere una copia di un gene pro apoptotico che il parenchiama è simile al wild type. Bax-bak: scatena apoptosi tramite le caspasi. bcl2-bcl-xl: bloccano bax-bak e impedire che venga bucata la membrana mitocondriale (freno apoptosi) se vogliamo avere apoptosi dobbiamo bloccare BCL-2-BCL-XL e questo lo si può fare tramite puma, bim, bad, noxa che sentono i segnali e possono andare a inibire il complesso e si ha apoptosi a seguito di un danno al DNA. Per esempio quando abbiamo un danno al DNA viene attivato p53 si attiva noxa e puma e poi repressione di Bcl-2-bcl-xl. Bad invece per esempio è dovuto alla deprivazione di fattori di crescita o citochine. Anche gli ultravioletti attivano Bim. Si sono anche altri segnali come grnazime B e recettore di morte passano da tBird. Parliamo di come funzionano bad è sotto a raf e akt (regolati da fattori di crescita e recettori tirosina chinasi) i segnali convergono in una proteina che si chiama 14-3-3 che porta alla fosforilazione di Bad e in questo caso è inattivo. Se i recettori tirosina chinasi non sono attivi bad si stacca da 14-3-3 ed è libero di inibire bcl2 e quindi avremo apoptosi. Bid invece deve essere tagliato con un meccanismo proteolitico per essere attivo dalle caspasi. E7 è una proteina appartenente ad HPV (papilloma) questa è un oncoproteina che blocca Rb (anti oncogenica), il virus del papilloma ha anche E6 che va a bloccare p53. Vediamo una sezione istologica di un epitelio cervicale in cui abbiamo usato un anticorpo contro HPV, l'epitelio sembra normale ma quando usiamo l'anticorpo vediamo zone marroni vi è il virus che fa diventare displastiche le cellule tramite il blocco di Rb e P53 tramite E7-E6. RB impedisce il differenziamento quindi non vanno in stato post mitotico, mentre p53 sopprime l'apoptosi quando è bloccato. Con una certa frequenza poi nel tempo possiamo avere lo sviluppo di carcinomi cervicali tramite questo blocco temporaneo di differenziamento e apoptosi. Recettori di morte: FAS può essere attivato dal ligando FAS-L per scatenare direttamente apoptosi e questo avviene perchè andiamo ad attivare le caspasi. Quando p53 è attivata anche in presenza di fattori di crescita, abbiamo il legame con foxo e IGFBP-3 che va a bloccare i fattori di crescita bloccando IGF receptor che è una via antiapoptotica. E viene anche trascritto FAS. Per cui l'attivazione di p53 va ad attivare molti attori cellulari. Autofagia: meccanismo che si sovrappone alla apoptosi e fa parte di questi che il nostro organismo usa per distruggere organelli o complessi proteici grandi che devono essere rimossi. Nella parte N terminale p53 viene fosforilata e questo avviene grazie a moltissimi enzimi, si ha anche acetilazione del nucleo della proteina, ubiquitazione regolano la proteina P53. LEZIONE 13: immortalizzazione e tumorigenesi: la divisione nelle cellule limitato nel tempo è vero per gli organismi superiori, per esempio il nematode c.elegans ha le divisioni limitate e anche le mitosi e possiamo sapere quante cellule avrà un organismo quando è adulto che in questa specie sono 959. quindi un organismo pluricellulare è diverso dai lieviti unicellulari. Questo è importante perchè tutto questo è stato verificato per l'uomo, se prendiamo derma (connettivo) dalla pelle possiamo mettere fibroblasti in cultura e le vediamo succede che se noi andiamo a vedere nel corso del tempo il numero di raddoppiamenti quindi mitosi, vediamo che dopo un po' le cellule non si raddoppiano più quindi smettono di crescere non perchè si riempie la piastra, se facciamo una curva nel corso del tempo vediamo una fase esponenziale e poi lineare e si va a plateau questo è definito limite di Hayflick e le cellule vanno in senescenza. Se prendiamo le cellule e le vediamo a microscopio con contrasto di fase le cellule iniziano ad avere un aspetto appiattito dovuto al citoplasma allargato (di solito sono affusolati) e questo è l'aspetto delle cellule senescenti in coltura e producono molta beta galattosidasi e se mettiamo un substrato in coltura diventano blu. Questa perdita di capacità proliferativa si vede anche con l'età vediamo lo strato di cheratinociti molto sottile, non abbiamo ramificazioni nel connettivo e le cellule di questo sono poche questo conferma che con l'invecchiamento anche nell'organismo decresce la capacità proliferativa. Linee cellulari tumorali in cultura non vanno in senescenza per cui diventano immortalizzate, se fossero senescenti non si sarebbe un tumore. Questo implica che il tumore cresce in fretta e forma una massa molto grande. Per avere un tumore visibile ai raggi X ci servono 100 milioni di cellule, per arrivare a quel numero ci servono 27 raddoppiamenti, un tumore può essere palpabile con un miliardo di cellule e siamo ad un centimetro. Nell'organismo in realtà non tutte le cellule del tumore che si replicano riescono a sopravvivere, già alla prima replicazione può succedere che una cellula su due muoia, e anche nelle successive per cui ci possono volere parecchie mitosi per avere un numero superiore di cellule, questo avviene perchè le cellule vanno in apoptosi. Tunel è una tecnica che con coloranti specifici per mettere in evidenza del DNA frammentato di cellule e questo indica che queste vanno in apoptosi. La cellula normalmente va in senescenza perchè il nostro organismo è settato per attuare un numero finito di mitosi che variano in modo individuale, questo per non avere danni prima. Per esempio in fibroblasti in coltura dove le cellule dove 43 raddoppiamenti sono andate in senescenza, e vediamo le proteine che frenano il ciclo cellulare come p21 e p16 sono molto espresse alla 43esima replicazione, mentre all'inizio non sono espresse. Questo si è visto anche in un tessuto vivo in un tessuto di colon sono andati ad indagare p16 proteina per la senescenza e KI67 quella della proliferazione. Il trattamento con chemioterapici porta il tumore alla senescenza. Uno dei controlli della senescenza è la lunghezza dei telomeri dei cromosomi, fu scoperta la sequenza di DNA che componeva il telomero e la possiamo usare come sonda per evidenziare cromosomi tramite FISH. Se prendo i DNA di campioni di cellule in coltura possiamo usare la sonda per i telomeri e faccio un sauthern blot (frammenti più lunghi in alto e più corti in basso), a mano mano che passa il tempo ho un abbassamento della lunghezza dei telomeri e questo coincide con la senescenza ma a un certo punto può essere che qualche cellula inizi a replicarsi di nuovo e diventa immortale (senescenza-crisi con telomeri di 3kb -morte cellulare- immortalizzazione). TTAGGG è la sequenza del telomero. Come possono le cellule cancerose diventare immortali? Abbiamo diverse teorie in risposta alla domanda, sappiamo che possiamo usare le oncoproteine dei virus per provocare tumore e possono incrementare o rallentare la senescenza. Gli eventi che possono accadere sono che per mantenere i telomeri ci serve la telomerasi che li produce e la proteina umana è fatta di due subunità ovvero Htert la proteina e HTR un RNA per cui è una riboproteina per cui questa riesce ad allungare i telomeri e produrre le copie funzionali. Possiamo fare un saggio dove misuriamo RNA di HTERT e vediamo che ne abbiamo di più nelle cellule immortali, quello di Htr è presente in entrambi i casi, inioltre vediamo l'attività della telomerasi nelle immortali. Per cui si attiva la telomerasi nelle cellule immortali per ricomporre i telomeri. Se noi aggiungiamo la telomerasi a cellule mortali diventano immortali. A questo punto possiamo dire che la telomerasi gioca un ruolo anche in vivo e questo è più complicato da dimostrare, possiamo prendere 4 linee cellulari: vediamo che abbiamo un vettore di controllo azzurro, wild type verde dove sovraesprimo la telomerasi e rosso è dominante negativo per la telomerasi in modo da bloccare la sua attività e vediamo che anche in vitro vediamo la stessa cosa. Le cellule di topo sono facili da immortalizzare mentre nell'uomo bisogna introdurre due mutazioni per avere una linea cellulare ovvero un oncogene che ci fa evitare la senescenza e Hter che ci fa evitare la CRISI. L'uomo ha 100 mila volte la mitosi in più del topo per cui i telomeri sono diversi e più importanti rispetto al topo che ha una vita nettamente inferiore. Se i telomeri sono troppo corti si ha perdita di tessuto e mancato rinnovamento dei tessuti con invecchiamento precoce. Anche nell'uomo nella discheratosi congenita dove abbiamo la mancanza di una telomerasi funzionante (mutazioni nel gene Htr, e vediamo per esempio che in questi pazienti il midollo osseo invece di essere attivo, ha un tessuto con poche cellule. Nella crisi i telomeri vengono erosi, quindi le tumorali perdono i telomeri anche se la telomerasi risulta essere più efficiente. Nell'uomo l'accorciamento dei telomeri da problemi nei cromosomi. LEZIONE 14: eventi che consideriamo nella trasformazione cellulare in vivo. Sappiamo che ci vogliono molti anni per sviluppare una massa neoplastica, a livello di popolazione l'età è un fattore importante per l'incidenza del cancro. Le curve della predisposizione al cancro si alzano dopo i 45 anni poi crescono fino ai 70 anni. Una delle prime cose che si è visto è stato che il fumo di sigaretta è correlato con l'insorgenza del cancro ma abbiamo un ritardo nel tempo per l'insorgenza rispetto all'inizio del fumo, quindi il tumore al polmone insorge tempo dopo. Non basta un evento che aumenti il tasso di insorgenza di neoplasia ma ci serve tempo perchè questa diventi clinicamente rilevante. Ci vuole del tempo perchè si accumulano eventi molecolari, ci possono volere 5 o 6 eventi. Nel colon 50 milioni di cellule vanno in mitosi. LEZIONE 15: python LEZIONE 16: ripasso python. Pyton ha diversi tipi di valori interi, stringhe che sono una serie di caratteri le stringhe sono immutabili ovvero non sono modificabili. Esistono poi le analisi boleane che sono 0-1 ovvero falso e vero. Le liste sono un insieme di numeri o stringhe, si possono filtrare e ordinare in ordine alfabetico in ordine crescente, queste sono mutabili. Le tuple sono oggetti simili alle liste ma non si modificano questo è utile quando immagazzino dati che non devono modificare e si indicano con le parentesi tonde. Si sono poi i set elementi unici e non ordinati e servono per vedere se esiste un elemento interno (per esempio lista di 30 mila geni e mi chiedo se c'è ne'è uno che cerco all'interno). I dizionari invece sono fra parentesi graffe e inseriamo una chiave per esempio un nome e ci dirà tutto su quel nome (per esempio Alice, 25 anni, new york). Liste: hanno delle espansioni, o funzioni che si possono aggiungere tramite la parola append, list-extend: voglio aggiungere 4 elementi di un'altra lista nella mia di interesse. List..insert: inseriamo un elemento inserito nel punto che vogliamo di una lista. List-.Pop: da una lista estrae un gene ma non lo cancella come se facessimo (remove) list count: conta quante volte c'è un nome nella lista. List.Sort*: ordinare, la lista viene modificata e stampata su quella che c'era list.copy: crea una copia esatta della mia lista con un altro nome Quindi possiamo dire che sono: mutabili: dizionari, set, liste immutabili: float, complex, bool dtringhe, tuple, int for: per ogni elemento di una collezione fai quello che ti dico io while: mantenere una condizione temporanea, per esempio se il count resta inferiore a 5 stampami i numeri. Break: blocca quello che sto facendo, viene usato per segnalare errori importanti. Continue: elimina dalla considerazione un elementi specifico. Quando si fa un single cell è importante sapere quali sono le cellule presenti nei grafici che ci escono. Quando escono i grafici le cellule che hanno meno di 1000 trascritti vengono escluse e anche più di 52 mila trascritti. Inoltre se ho molti geni mitocondriali la elimino perchè potrebbe essere morte. Si fa una riduzione della dimensionalità in modo da distinguere le categorie di cellule in cluster diversi. La prima cos che devo fare è capire quanti cluster sono, per annotare le cellule o lo faccio in modo automatico tramite dei software, ma quando si hanno dati complessi non è ottimale. Nel breast cancer ho sia cellule epiteliali che mesenchimali per cui cerco dei marker di questi come la vimentina le cellule che la esprimono sono molto metastatiche, ma la vimentina la esprimo anche le cellule del sistema immunitario, per cui devo usare anche altri marcatori come PTPRC in modo che io possa eliminare le cellule immunitarie. LEZIONE 17: R è un linguaggio statistico che ci permette di analizzare dei dati. Lettura introduzione R studio. Data frame: come una tabella ma in 3 dimensioni LEZIONE 18: immunologia dei tumori: i primi esprimenti che dimostravano l'effecacia del sistema immunitario nel prevenire l'attecchimento di tumorali in topi è: abbiamo ceppi di topo identici con lo stesso patrimonio immunogenetico, se creiamo tumori con linee cellulari e le inoculiamo irradiate in topi che abbiamo immunizzato, proteggiamo il topo dall'attecchimento delle cellule tumorali e abbiamo efficacia del sistema immunitario, questo non accade se inoculiamo un'altra linea cellulare diversa da quello con cui abbiamo immunizzato i topo e quindi non abbiamo protezione. Un topo immunicompromesso non riesce a controllare la crescita di tumori trapiantati, se invece lo facciamo in un topo wild type abbiamo una protezione anche se parziale. Se un paziente è immunodepresso ci sono virus che riescono a trasformare le cellule e fare progredire i tumori grazie a oncogeni a virus collegati e quindi abbiamo tumori che possono essere maggiormente presenti rispetto ad altri (prostata, melanoma). Noi abbiamo una immunità prevalentemente adattiva mediata da linfociti T che esprimono CD3, se vediamo in un carcinoma orale e marchiamo un tessuto tumorale con anti CD3 possiamo vedere quanti linfociti sono presenti e ne vediamo molti. L'efficacia immunitaria nell'uomo la possiamo osservare sia perchè abbiamo una incidenza più bassa di tumori rispetto quella che sarebbe presente se questo non ci fosse (100 cellule al giorno possono essere riconosciute), ma anche perchè vediamo pazienti che presentano molti CD8 nei noduli tumorali del polmone per esempio si è visto che sopravvivono più a lungo. Partiamo dal tessuto normale dove abbiamo senescenza, riparazione o apoptosi diretta che ci servono come tumoresopressore, perchè dobbiamo ricordare che infiammazione cronica, virus possiamo avere mutazioni, vengono espressi antigeni tumorali e fanno da ligandi per le NK, a questo punto abbiamo una cellula trasformata. Vi è una fase dove queste cellule trasformate le possiamo eliminare tramite CD8, NK, macrofagi e successivamente linfociti T, poi tutta una serie di fattori come IFN-alfa beta gamma. Se la prima fase di eliminazione non funziona possiamo avere una fase di equilibrio dove il tumore nascente viene tenuto sotto controllo del SI, dove le cellule nuove sono uguali a quelle eliminate ma quanto più una cellula tumorale rimane viva, tanto più data l'instabilità genetica delle tumorali queste possono evadere sempre meglio il controllo immunologico dell'organismo e quindi possiamo avere un escape immunologico con crescita incontrollata. Inoltre possiamo avere promozione della crescita tumorale immunologica, ovvero le cellule mandano segnali soppressivi al sistema immunitario e si ha anche neo angiogenesi. (cancer immuno editing eliminatio-equilibrium-escape sono le tre tappe della cellula tumorale che deve superare per diventare tumore vero e proprio). Ci sono diversi modi tramite i quali un tumore può arrivare all'escape, se caratterizziamo un fenotipo del tumore per esempio l'infiltrazione immunitaria possiamo osservare tre tipi di fenotipo ovvero deserto immunologico dove non vediamo cellule immunitare, oppure possiamo avere immune excluded masse di linfociti che circondano i confini del tumore per ultimo possiamo avere inflamed ovvero le cellule immunitarie possono arrivare all'interno del tumore dove osserviamo una popolazione importante di cellule. Una cellula tumorale che nella trasformazione neoplastica può essere uccisa e libera antigeni che possono evocare la risposta immunitaria, come morte per apoptosi da chemioterapici, se abbiamo neo antigeni tumorali che sono diversi dal self, espressione di antigeni virali o di tumor associated antigen (es p53 aumenta se c'è un danno al DNA in modo wild type, se invece muta si accumula e quindi ne abbiamo una quantità per il quale il sistema immunitario la possa vedere e mandare cellule immunitarie), cancer testing antigens antigeni oncofetali e che nell'adulto si presentano in testicolo e ovaie ma nei tumori possono essere espressi anche a livelli elevati. I fattori che invece impediscono che ci sia una risposta immunologica sono una morte per necrosi, lipidi ossidati, il gradiente trasmembrana per cui non abbiamo una presentazione efficacie di antigeni e ci troveremo in una situazione di deserto immunologico. Può anche succedere che le cellule dendritiche che di solito presentano l'antigene, hanno una ridotta funzionalità attivante e quindi non presentano gli antigeni ai linfociti delle cellule tumorali e quindi non averemo l'attivazione. Nel linfonodo gli antigeni presentati dalle cellule dendritiche incontrano i linfociti T e abbiamo i fattori che vanno a intensificare o depoteniare la risposta immunitaria (priming e attivazione dei linfociti). Se i linfociti vengono attivati devono essere spostati nel sangue e vanno nella sede del tumore per espletare la funzione ma non riescono ad entrare per fattori come il pH, ossigeno, nutrienti alterazioni genetiche di alcuni oncogeni (beta catenina mutata induce esclusione immunitaria dal letto tumorale), mentre la produzione di chemochine nel letto tumorale fa si che i linfociti possano entrare e per il loro accumulo nello stroma l'interazione con altre cellule del microambiente tumorale che mantengono la funzionalità e lo stato degli effettori immunologici. Macrofagi; M1 sono associati ad una protezione per agenti infettivi e anche tumore, i tipo 2 sono maggiormente associati a una riparazione di un tessuto e una guarigione. La classe di tipo 2 è suddivisa in 3 sottogruppi con funzioni distinte. LEZIONE 19: multi step carcinogenesi. Abbiamo una serie di eventi sia a livello cellulare che molecolare che portano da una istologia normale a una patologica abbiamo un accumulo di mutazioni con espansione clonale. In alcune lesioni nella stessa persona possiamo avere una parte del tumore dove abbiamo p53 wilt type mentre nell'altra mutato. Lo sviluppo del cancro segue regole darwiniamo ovvero le cellule assumono un vantaggio selettivo, abbiamo espansioni clonali una dopo l'altra dove si accumulano mutazioni e ogni clone ha una velocità di crescita maggiore del precedente. Una delle complicazioni ad immaginare un sistema darwiniamo è che è stato proposto che anche i tessuti normali sono tessuti complessi e all'interno hanno cellule che fungono da staminali, vediamo un esempio di arricchimento di cellule, prendiamo delle cellule tumorali (un tumore ha cellule epiteliali, ma queste possono essere di diverso tipo, possiamo avere anche cellule del sistema immune, cellule mesenchimali e stromali queste sono importanti per il microambiente tumorale e quindi per il suo mantenimento. Per isolare le staminali di un tumore, dobbiamo prendere un pezzetto e separare le cellule cancerose da quelle stromali, si possono usare diversi marcatori fra cui CD24 (epiteliali differenziate) e CD44 (marcatore di cellule mesenchiamali)e li mettiamo nelle cellule che sono in un fax, se noi misuriamo le cellule e le separiamo in base alla fluorescenza per CD24-44 possiamo vedere che molte cellule sono alte nel grafico per uno dei due anticorpi. Ci sono anche cellule che hanno poco CD24 e tanto CD44 per cui cellule epiteliali poco differenziate con caratteristiche di cellule mesenchimali, in questo caso queste si presumeva fossero le staminali della ghiandola mammaria. Se prendiamo queste cellule CD24 e le usiamo per indurre tumorigenesi nei topi nudi, tante cellule non riescono a formare tumori nei topi, mentre de prendiamo CD44 + ne servono pochissime per formare un tumore per cui sono quelle più staminali. CD133 associato a staminalità nelle cellule nervose. Eterogeneità intratumorale: Aabbiamo svariate ondate di espansioni e ci porta ad avere cloni con mutazioni somatiche diverse, per cui abbiamo dei cloni separati. Se noi nel tempo misuriamo una popolazione se avessimo sempre lo stesso tipo di eventi avremmo un unico clone con mutazioni tutte uguali, ma invece nel tempo si formano gruppi diversi di tumorali, ma può succede che dopo un tot di divisioni una popolazione può sopprimere le altre e crescere maggiormente, per cui abbiamo una competizione fra cloni. Non basta una singola mutazione per avere insorgenza di un tumore, vediamo un grafico dove abbiamo delle nazioni e lo studio prende in considerazione gemelli che hanno sviluppato lo stesso tipo di leucemia, vediamo che c'è un periodo di tempo fra la diagnosi del primo gemello e quella del secondo, è chiaro che i gemelli sono identici a livello genetico, hanno leucemie molto precoci per cui possiamo dire che già avevano una mutazione in un gene ereditata o dalla famiglia o mutazione a livello germinale mentre l'altra mutazione avviene dopo la nascita. Possiamo avere degli agenti non mutagenici che possono dare un importante contributo alla tumorigenesi come i fattori di crescita che possono indurre la proliferazione. Possiamo misurare in vitro fattori che non sono mutagenici però sono carcinogeni, inducevano lesioni pre neoplastiche sulla pelle come papillomi, per esempio componenti del catrame (come dimetilbenzantracene DMBA) l'esprimento prevedere di spalmare sulla pelle del topo un agente e dopo alcuni mesi si sviluppava una lesione neoplastica. Per cui è sufficiente dare due composti uno che è definito iniziatore come DMBA e uno che si chiama promotore come TPA che dava crescita vigorosa alle cellule che erano state sottoposte ad un iniziatore, la cosa non avveniva se le cellule non erano esposte all'iniziatore. Nel tempo questi trattamenti fanno si che l'iniziatore è un prodotto genotossico e può mutagenizzare Ras mentre il promotore fa espandere i cloni senza altre mutazioni quindi collabora con la cellula che ha già Ras mutato, ma se do ancora un inziatore possiamo avere un'altra mutazione come in p53 e successivamente i due cloni collaborano in modo inziatore indipendente. Questa situazione descritta per i topi nell'uomo è complessa, ma si è visto che l'infiammazione è un elemento importante per la promozione del tumore equivale al TPA, si è visto un caso particolare dove dimostriamo che lo sviluppo di adenomi e carcinomi nel colon dipende da una infiammazione cronica di questo, vi sono topi che non riescono a fare TGF-BETA (soppressore della risposta immune) e muoiono presto perchè hanno una patologia autoimmune, ma se noi in questi mettiamo un sistema immune dove abbiamo inattivato RAK2 queste cellule non fanno ne anticorpi ne T-cell receptor funzionali. I topi inizialmente hanno un epitelio normale, se mettiamo elicobater il batterio infetta l'intestino dei topi e si ha generazione di adenomi e carcinomi, quindi è l'infiammazione cronica che porta allo sviluppo del tumore. Esistono pazienti con colite cronica che comporta anche ulcerazioni, e nel corso del tempo abbiamo un aumento del rischio di tumore al colon. Un altro esempio infiammazione nel fegato in un tipo, viene rimosso un gene MDR e la zona del fegato risulta infiammata, se poi addizioniamo con ibuprofene abbiamo una diminuzione dell'infiammazione con calo del rischio di carcinoma. Se togliamo Mdr si ha accumulo di bile nel fegato e quindi si ha infiammazione cronica nel fegato, si accumulano linfociti con rischiamo di altre cellule grazie alle citochine, queste cellule accumulate nel fegato rilasciano un segnale mediato da TNF-ALFA che può legarsi al recettore TNF sugli epatociti e attivare una via che comporta un aumento della secrezione di TNF-ALFA con aumento del segnale infiammatorio (loop positivo) attiva anche nf-kb fattore di crescita che attiva il gene della ciclina D1, attiva Myc per proliferazione cellulare e anche geni anti-apoptotici con la formazione di noduli displastici (primo eventi per la formazione di neoplasia). Promotori tumorali possono essere ormoni come estrogeni e testosterone, alcuni farmaci possono spingere la promozione tumorale in alcuni tessuti come il fegato, alcuni virus come quello dell'epatite B, agenti chimici, il flusso acido per l'esofago, il tabacco masticato che può dare neoplasie orali, i calcoli alla cistifellea, colite ulcerativa per il colon, per cui il numero di promotori tumorali umani è molto alto. LEZIONE 21: integrità genomica: è importante che venga mantenuta l'integrità del genoma e abbiamo enzimi in modo tale che questi eventi avvengano il meno possibile. L'attività di proofreding ovvero la correzione di bozze di sequenza di DNA da parte di DNA pol e incidenza di cancro: sullo studio delle persone sopravvissute alle bombe atomiche, in un topico possiamo indurre una mutazione puntiforme in un gene che codifica per una pol ovvero la delta, che è responsabile per la sintesi della legging strand ovvero l'elica in 3', la mutazione è nel dominio della correzione di bozze della polimerasi ovvero l'attività sintetica della polimerasi è uguale ma non va più a correggere gli errori e vediamo che in omozigosi la mutazione ha un impatto notevole per l'insorgenza di neoplasie in questi animali. Il modello animale è stato confermato da dati di genetica umana. Mutazioni nelle polimerasi nel dominio di correzione ci fanno ipotizzare che altri geni coinvolti nel controllo dell'integrità del DNA se mutati possono avere conseguenze simili. Vediamo l'instabilità dei microsatelliti (sequenze ripetute e vengono compiuti errori di replicazione in questi) MIN che causa espansione o cambiamento di queste sequenze ripetute. Ci sono casi in cui la neoplasia incorpora mutazioni somatiche rispetto altri tumori, se noi prendiamo 200 pazienti con tumori e mettiamo il numero di mutazioni per mega base di DNA sulla Y, e sulla x i tumori, vediamo che il 5% dei tumori ha più di 20 mutazioni per megabase. Le mutazioni sono antigeniche per il sistema immune, le cellule con molte mutazioni vengono chiamate cellule Hot ovvero calde e vengono maggiormente riconosciute dal sistema immune anche se il tumore è spesso più aggressivo. In p53 per esempio le mutazioni maggiormente presenti sono un g-c che diventa t-a, una c-g che diventa t-a in isole non CpG, mutazioni G-C che diventa T-A in isole CpG, possiamo avere poi un AT che diventa TA possiamo anche avere delezioni o inserzioni. Il rischio aumentato è dato da difetti ereditari in vari tipi di meccanismi di riparazione del DNA, sappiamo che BRCA1-2 implicati in tumore al seno e ovaie ereditario questi geni sono implicati nel riparo delle rotture a doppia elica del DNA indirizzato dall'omologia, un altro esempio è per l'adenomatosi famigliare con mutazione in MyH che è implicato nella riparazione tramite base- excision. Quando abbiamo rotture a doppia elica in una cellula, possiamo avere uno scambio di materiale genetico fra i cromosomi quindi traslocazioni, solitamente non sono attivanti oncogeni, le cellule che presentano tante traslocazioni di solito muoiono però può succede che a volte avvenga in un oncogene. Abbiamo detto che BRCA1-2 sono responsabili della riparazione omologa ma abbiamo anche PARP può riparare alcuni tipi di danno, quando la cellula non ha BRCA usa PARP per riparare i danni, si è pensato di andare ad inibire questo PARP in modo che non ci siano riparazioni e la cellula possa morire, se invece hanno BRCA1-2 e inibiamo PARP verranno riparate da BRCA. Cromotripsi: rottura catastrofica di un cromosoma. Spesso il cariotipo di cellule tumorali mostra alterazioni possiamo per esempio avere delle trisomie per cui abbiamo una instabilità cromosomica associata alle cellule cancerose. Questa situazione avviene anche in vivo e possiamo misurarla come perdita di pezzi di cromosoma (eloage) possiamo avere appunto perdita di materiale importante come oncosoppressori. Interazioni eterotipiche e angiogenesi: se prendiamo una biopsia ci sono le cellule epiteliali neoplastiche e poi ci sono cellule non cancerose e lo chiamiamo stroma ma alcune le troviamo solamente nel tumore e non in un epitelio normale. Spesso troviamo miofibroblasti in una ghiandola, macrofagi. Nei nostri tessuti abbiamo sempre una componente che deriva dal sangue che cambia nel momento in cui abbiamo un tumore. LEZIONE 22: tumor immunology and immunotherapy: la morte che vogliamo indurre nelle tumorali deve essere immunogenica ovvero creare un microambiente con segnali di pericoli in modo tale che le cellule dendritiche possiamo esporre gli antigeni ai linfociti T, che vadano nel microambiente tumorale e facciano il loro dovere. La chemioterapia è uno di questi farmaci, nelle persone immunocompromesse come pazienti trapiantanti o AIDS conclamato per ottenere una risposta simile al paziente non immunocompromesso dobbiamo dare dosi di chemioterapici maggiori questo perchè hanno un difetto nel sistema immunitario. Quindi i chemioterapici inducono una morte immunogenica e una modificazione del microambiente per favorire il processo. Alcuni chemioterapici come i taxani inducono l'espressione del mannosio 6 fosfato che lega il granzima B (linfociti e Nk seceronono e innasca apoptosi e la cellula muore. Anche la radiazioni ionizzanti inducono un ambiente immunologico. Più recenti sono i virus oncolitici alcuni già approvati e inducono in maniera diretta o indiretta la morte immunogenica: entrano nelle tumorali le infettano, danno replicazione e lisi delle tumorali oppure le cellule tumorali con il virus oncolitico rilasciano segnali di pericolo e riescono a revertare un quadro di immunosoppressione. Si ha espressione di interferoni che possono indurre la morte della cellula infetta, questo spiega come mai abbiamo una categoria di farmaci che può indurre morte immunogenica. Abbiamo anche anticorpi che riconoscono antigeni espressi preferenzialmente dalle tumorali e sono coniugati ad un farmaco citotossico. Per cui l'anticorpo attiva il complemento, e il farmaco uccide la cellula tumorale. Le cellule responsabili della presentazione di antigeni sono le APC, uno dei farmaci che sta dando risultati promettenti sono vaccini a neoantigeni: i tumori mutano, i responsabili della produzione di queste mutazioni sono i carcinogeni come sole, fumo. Le mutazioni sono la causa di tumore stesso ma in seguito a questo processo di producono nuove proteine diverse dal self e possono essere viste dal SI, le sorgenti dei neoantigeni possono essere geni di fusioni, varianti trascrittomiche, delezioni, RNA non codificanti a un certo punto diventano codificanti e poi producono nuove proteine, queste vengono presentate a HLA di classe 2 per evocare una risposta immunitaria. I vaccini neoantigeni usano frammento di RNA che vengono montati insieme per potere essere iniettati. Ci sono anche TLR agonisti (da rivedere). Possiamo anche agire sul riconoscimento da parte dei linfociti T delle tumorali, parliamo qui di terapie cellulari personalizzate perchè si parte dalle cellule T di un paziente, possono essere ingegnerizzate inserendo vettori oncolitici per un T cell receptor oppure possono essere trasferrati con un recettore antigenico chimerico (non esiste in natura ha la parte di sgnaling del recettore, ma la parte di riconoscimento è quella del riconoscimento di un antigene di un anticorpo) vengono poi espanse e reinfuse, vengono usati soprattutto per leucemie infantili. Differenza fra cellule CAR-T (chemeric antigen receptors) e TCR-T, in questo caso la tumorale mostra a HLA, ma sappiamo che potremmo avere down regolazione di questi. # IO SONO CONFUSA -CAR-T: La cellula tumorale esprime un antigene tumorale che viene riconosciuto da CAR-T nel dominio di riconoscimento legato a un dominio di signaling che induce una risposta per cambio conformazionale del recettore, in questo caso le cellule T secerono i granuli citotossici e vanno ad agire sulla cellula tumorale. -CD3 T cell engager: parte di riconoscimento e un anticorpo anti CD3 attivante per le cellule T -Check point immunlogici: recettori e ligandi che veicolano messaggi co stimolatori ovvero una cella che è parzialemte attivata tramite il riconoscimento T cell receptor e peptide immunogenico, oppure cellula immunitaria e dendritica, oppure inibitori. Queste molecole le possiamo bersagliare anti-CTLA4; PD1-PDL1; anti LAG3 efficaci nei tumori hot. Il sistema immunitario è come una macchina, freni accensione, acceleratori, tutte le molecole considerate come la centralina dell'iniezione che permette al motore di funzionare al meglio. LEZIONE 23: Fino ad oggi vengono usati una serie di composti che vanno a colpire il DNA, la chemioterapia come la ciclofosfamide modifica la guanina, possiamo averne altri che formano legami stabili fra le che eliche di DNA che poi viene rotto, oppure può esserci una metilazione della guanina si è scoperto poi che questi farmaci davano delle neoplasie secondaria come leucemie mioloidi. Ad oggi abbiamo una maggiore medicina di precisione, perchè si aspira ad avere una diagnosi precisa per la tipologia e intraprendere delle terapie mirate andando ad agire sulle cause genetiche ce la provocano. Ad oggi comunque si utilizzano anche la chirurgia e radioterapia. Neoadiuvante: terapia prima della chirurgia adiuvante: dopo la chirugia. Antimetaboliti: antagonisti di alcuni enzimi del metabolismo quindi con le normali funzioni cellulari, quindi non rompono il DNA. Spesso non è chiaro come le cellule tumorali muoiono con questi prodotti maggiormente delle cellule normali questo può essere spiegato perchè le cellule sono attivamente proliferanti. Inoltre una cosa importante è che le cellule possono acquisire delle resistenze: magari ci sono altri farmaci che sono utili per un anno per esempio e poi il paziente diventa resistente. I meccanismi di insorgenza di reistenza a un farmaco: la cellula può rimuovere un farmaco quindi efflusso, tumore si circonda da fibroblastiche è un ambiente protettivo, invece di produrre una proteina normale si ha una proteina mutata con mancato attacco del farmaco, posso avere una compensazione adattativa con cui cambio il recettore con un altro. Nella maggior parte dei casi quando una cellula è trattata con farmaci queste muoiono per apoptosi, ma dato che le tumorali sono indifferenziate una delle strategie è fare differenziare le tumorali, con riduzione del tumore. ES: nella leucemia promielocitica acuta, ovvero uno degli stadi fra cellule staminali e mielociti, in questa patologia abbiamo la fusione RAR alfa,che è il recettore dell'acido retinoico, con PML e si forma una proteina di fusione (traslocazioni cromosomi 15-17), si è visto che possiamo i promielociti alla differenziazione in promielociti neutrofili usando acido trans retinoico (ATRA) con riduzione della leucemia perchè viene degradata la proteina di fusione PARALFA-PML. Dopo un iniziale beneficio nella maggior parte dei casi i pazienti diventano resistenti. Si è scoperto che addizionando il triossido di arsenico (ATO) con l'acido trans retinoico vi è un successo di terapia di ALP del 90% senza chemioterapia. Possiamo anche sviluppare anticorpi monoclonali che colpiscono la cascata del segnale di tirosina chinasi dei recettori che sono attivati da diversi oncogeni. Possiamo anche andare a bloccare un oncogene e il tumore potrebbe regredisce, ma ci sono casi dove regredisce e poi ritorna diventando più grande, avrò altre mutazioni che fanno si che la mutazione iniziale (quella dell'oncogene) non è più necessaria per la crescita del tumore, oncogene addiction. Le molecole druggable sono quelle che possono essere targettate con farmaci. Gleevec: farmaco usato nella leucemia mieloide cronica con Bcr-Abl (tirosina chinasi) per cui questo farmaco è un inibitore della tirosina chinasi Abl. LEZIONE 24: SLIDE