Biochemie Volledige Samenvatting PDF

Biochemie De samenvatting is gebaseerd op de inhoud van de lessen. Alle informatie over een onderwerp is dus terug te vinden zoals ze in de les gegeven is, uiteraard aangevuld met het handboek en de slides. 1. Biochemie: een inleiding (1) 2 2...

Biochemie De samenvatting is gebaseerd op de inhoud van de lessen. Alle informatie over een onderwerp is dus terug te vinden zoals ze in de les gegeven is, uiteraard aangevuld met het handboek en de slides. 1. Biochemie: een inleiding (1) 2 2. Nucleotiden en nucleïnezuren (4+5) 4 3. Suikers en lipiden (11+12+13) 12 4. Aminozuren en proteïnen (2) 17 5. Studie van de proteïnen (3) 21 6. Ligandbinding door hemoglobine (7) 27 7. Enzymkinetiek (8) 30 8. Katalytische strategieën (9) 35 9. Regulatorische strategieën (10) 41 10. Signaaltransductie (14) 46 11. Basisconcepten van metabolisme (15) 51 12. Glycolyse en gluconeogenese (16) 56 13. Citroenzuurcyclus (17) 68 14. Oxidatieve fosforylatie (18) 75 15. Lichtreacties van de fotosynthese (19) 82 16. Calvincyclus en pentosefosfaatweg (20) 86 Quinten Wouters 1 1. Biochemie: een inleiding (1) Biomoleculen bestaan uit twee groepen: de bouwstenen (aminozuren, lipiden,…) en de biopolymeren (proteïnen, membraanstructuren,…). De biochemie bestudeert de chemie van moleculen die betrokken zijn in levensprocessen. Grote moleculen zoals nucleïnezuren noemen we biologische macromoleculen en kleine moleculen zoals glucose noemen we metabolieten. Bij vele van de interacties tussen deze twee groepen moleculen is energie betrokken. Bij verschillende soorten die onderling enorm verschillend zijn, blijken deze interacties en molecules erg gelijkaardig. Deze bevindingen ondersteunen dan ook de theorie van een gemeenschappelijke voorouder. Bindingen tussen atomen of moleculen zijn cruciaal voor de biochemie. Er zijn 4 soorten interacties: Ten eerste hebben we de covalente binding. Dit is de sterkste binding tussen twee atomen. Als tweede sterkste kracht is er de waterstofbinding of waterstofbrug, die gevormd wordt tussen een H-atoom gebonden aan een elektronegatief atoom en een ander elektronegatief atoom. Daarnaast zijn er de elektrostatische interacties waarbij twee groepen met tegengestelde of dezelfde lading elkaar aantrekken of afstoten. De interactie werkt over vrij grote afstand, maar wordt afgezwakt door de diëlektrische constante (permetiviteit) van het oplosmiddel (water). De zwakste interacties zijn Van der Waals krachten. Hun sterkte hangt af van de afstand tussen twee atoomkernen. Op korte afstand stoten die elkaar af, maar op iets langere afstand is er aantrekking. Hydrofobe interacties zijn het zich verenigen van twee groepen apolaire moleculen. (vetdruppels komen samen) Water is een vormgevende factor, ook in de chemie. Ze geven eiwitten, polysacchariden, nucleïnezuren en membranen hun karakteristieke vorm. Het is polair en een permanente dipool. Ze vormen zo veel waterstofbruggen. Desoxyribonucleïnezuur of DNA neemt zijn dubbele helix vorm aan door deze krachten. DNA- strengen zijn opgebouwd uit desoxyribosen die verbonden zijn via fosfaatgroepen. Aan elke desoxyribose bindt een base. Adenine, guanine, cytosine en thymine zijn de vier basen, die onderling partners vormen. Adenine en thymine die op twee complementaire strengen staan zijn gebonden door 2 H-bruggen, guanine en cytosine door drie. De twee complementaire strengen vormen automatisch een dubbele helix. Vanuit een thermodynamische standpunt kunnen we een afgebakend deel dan de ruimte definiëren als een systeem. Volgens de eerste wet van de thermodynamica is de totale energie van een systeem en haar omgeving constant. Deze energie kan aanwezig zijn in de vorm van warmte, beweging of potentiële energie. Een ander belangrijk thermodynamisch concept is entropie S: de hoeveelheid wanorde in een systeem. De tweede wet van de thermodynamica stelt dat de totale entropie altijd zal toenemen. Quinten Wouters 2 Ook in een chemische reactie kan de entropie toenemen. Bij een groter totaal aantal moleculen stijgt ze bijvoorbeeld. De warmte-inhoud van een systeem noemen we de enthalpie H. De verandering in totale vrije energie bepalen we als volgt: ΔG = ΔH − T ΔS Als er energie vrijkomt uit het systeem is de vrije energie verandering negatief. Meestal komt er dan warmte vrij (exotherm proces) en is de enthalpieverandering ook negatief. Zo wordt er bij de vorming van een dubbele helix energie/warmte vrijgegeven doordat de entropie daalt (twee strengen worden een streng). De verloren energie wordt gecompenseerd door het ontstaan van verschillende soorten bindingen. De zuurheid van de omgeving is erg belangrijk voor tal van biochemische processen omdat er in zure en basische omstandigheden er H-atomen aan een molecule worden toegevoegd of onttrokken. In DNA is dit erg belangrijk omdat in een basische omgeving (pH = 9,7) er een proton aan een stikstof van guanine wordt onttrokken. Hierdoor is er geen bassparing meer mogelijk tussen guanine en cytosine en valt de hele helix-structuur uit elkaar (denaturatie). Daarom zijn er in organismen vaak buffers aanwezig die een plotselinge verandering in de pH tegengaan. Quinten Wouters 3 2. Nucleotiden en nucleïnezuren (4+5) De nucleïnezuren (DNA en RNA) zijn opgebouwd uit een ruggengraat van suikers gelinkt door fosfaatgroepen. Aan de suikers kunnen basen binden die dan de genetische code vormen. DNA heeft als suiker een desoxyribose. Dat is een vijfring, gesloten door een zuurstof. Bij RNA zit er op het 2’-koolstofatoom nog een hydroxylgroep. Bij DNA is deze groep vervangen door een waterstof, vandaar ‘desoxy-‘. De basen die op de ruggengraat binden zijn opgedeeld in twee groepen naar hun specifieke vorm. Uracil komt enkel voor in RNA en is het equivalent van thymine. Adenine en guanine zijn afgeleiden van purine en cytosine, uracil en thymine van pyrimidine. Elke fosfodiëstergroep is negatief geladen, wat zorgt voor een lading op de buitenkant van de streng. Wanneer zo’n base gebonden is met een suiker, noemen we het een nucleoside. (adenosine, desoxyadenosine, thymidine,…) Wanneer een base gebonden is met een suiker en een of meerdere fosfaatgroepen, noemen we het een nucleotide. (adenosinetrifosfaat ATP, desoxyguanosinemonofosfaat,…) De fosfaatgroepen kunnen binden aan de 2’, 3’ of 5’ hydroxylgroep van de ribosen (3’ en 5’ bij desoxyribosen). Bij benaming wordt altijd de 5’ positie verondersteld, tenzij anders aangegeven. Deze molecules worden naast als bouwstenen voor nucleïnezuren, ook gebruikt voor vele functies binnen de cel. Zo is ATP in en rond de cel de drager van energie bij uitstek omdat bij de breking van een binding tussen twee fosfaatgroepen, er veel energie vrijkomt. De DNA dubbele helix zijn twee polynucleotideketens die in tegengestelde richting rond eenzelfde as draaien. De basen paren door complementaire waterstofbruggen te vormen. Adenine en thymine (uracil) zijn complementair en binden met 2 bruggen, guanine en cytosine binden door 3 bruggen te vormen. Een winding is typisch 10 basenparen lang of 3,4 Å. De basenparen staan bijna loodrecht op de ruggengraat en vormen ‘treden’. De helix is extra gestabiliseerd door hydrofobe effecten, van der Waals krachten en elektrostatische interacties. Dubbelstrengig DNA is thermodynamisch stabieler, maar kan ontwinden en scheiden bij hogere temperaturen. De smelttemperatuur is de temperatuur waarbij de helft van de DNA-moleculen zo’n denaturatie zijn doorgegaan en dus enkelstrengs voorkomen. De waterstofbruggen die dan gebroken worden, kunnen later renatureren onder een aantal voorwaarden. In de meeste (meercellige) organismen komt DNA echter ‘supercoiled’ voor als chromosomen. Eencellige hebben dan weer meestal circulair DNA. Ook enkelstrengig DNA komt voor, maar door interne basenparing kunnen er secundaire structuren vormen zoals de ‘hairpin’. Bij conventie wordt de basensequentie genoteerd in 5’-3’ richting. De hairpinstructuur is vaak gekenmerkt door een herhalingssequentie van uracil. Quinten Wouters 4 Replicatie van DNA verloopt door het openmaken van de dubbele helix door het verbreken van de H-bruggen (helicase) en het vormen van een complementaire streng uit nucleotiden op beide strengen. De bestaande strengen werken in dat geval als ‘template’. DNA-polymerasen katalyseren dan de fosfodiëster-brugvorming. Er zijn 4 desoxyribonucleoside trifosfaat precursors voor DNA (dATP, dGTP, dCTP en TTP) en deze moeten allemaal aanwezig zijn voor het polymerisatieproces. Ook moeten er Mg-ionen zijn voor de stabilisatie van de negatieve streng. Er moet op de streng eerst een primer aanwezig zijn, een oligonucleotide, waarna DNA-polymerase kan binden en er nucleosiden worden aangebracht. DNA wordt aangevuld in de 5’-3’ richting. De weinig voorkomende fouten in het proces kunnen worden gerepareerd door andere DNA-polymerasen (nuclease). Sommige virussen hebben DNA in hun capsule, dat ze inbouwen in het DNA van de geïnfecteerde cel. Andere hebben RNA, dat ze met behulp van RNA-directed-RNA-polymerase kopiëren in de cel en dan tot expressie brengen. Een derde groep van virussen hebben RNA dat ze met reverse transcriptase omzetten in DNA en dan inbouwen in het DNA van de gastheer. De RNA-streng wordt aangevuld met een DNA-streng, waarna het RNA afgebroken wordt en de DNA-streng aangevuld wordt met haar complementaire DNA-streng. Genexpressie is het omzetten van DNA-code in functionele molecules. De informatie uit het DNA wordt ‘gekopiëerd’ op mRNA in een proces dat we transcriptie noemen. Tijdens de genexpressie worden 3 soorten RNA gebruikt. Het r(ibosomaal)RNA is het meest aanwezig en vormt ribosomen. m(essenger)RNA is de template voor de synthese van eiwitten. t(ransfer)RNA brengt aminozuren aan bij het ribosoom zodat polypeptideketens gevormd worden. Er zijn nog enkele andere vormen RNA die we later bespreken. Transcriptie vindt plaats in de kern, waar RNA- polymerase in aanwezigheid van de 4 ribonucleoside trifosfaat precursors voor RNA (ATP, GTP, CTP en UTP) en Mg-ionen (of andere tweewaardige ionen), het DNA afleest en een pre-mRNA-streng produceert. Er is hier echter geen primer nodig en eventuele fouten kunnen niet hersteld worden (nuclease afwezig). Enkel de 5’-3’ streng wordt hier afgelezen, omdat ze ook in die richting aangevuld wordt. Omdat er geen primer aanwezig is, wordt de reactie geïnitieerd door een promotorgebied. De transcriptie wordt gestopt met een terminatorsequentie (zoals een stabiele hairpin). Bij eukaryoten wordt het transcript gemodificeerd door er een 5’-cap (guanosine nucleotide) en een 3’-poly-A-staart aan te hangen. We hebben nu pre-mRNA. Voor de volgende stap in de genexpressie kan plaatsnemen, wordt het transcript opnieuw aangepast. Spliceosomen knippen onnuttige stukken (introns) uit het pre-mRNA en plakken de nuttige stukken (exons) aan elkaar. Een streng pre-mRNA kan, door de introns en exons anders te kiezen, coderen voor verschillende eiwitten. Exon shuffling is een theorie die stelt dat exoten coderen voor functionele eenheden van eiwitten en dat de evolutie van nieuwe genen is gebeurd door recombinatie of exclusie van exons. De alternatieve splicings zijn een eenvoudige manier om een set van proteïnen te vormen met variaties van een basismodel zonder dat er een apart gen nodig is voor elk proteïne. Quinten Wouters 5  De tweede stap in de genexpressie is translatie. tRNA bezit een hechtingsplaats voor aminozuren, namelijk zijn ACC-arm. aminoacyl-tRNA- synthetase katalyseert de vorming van een binding tussen een aminozuur en tRNA. De tRNA’s zijn aminozuurspecifiek. Het tRNA heeft een sequentie van 3 basen die we het anti-codon noemen en die past op een 3-basensequentie op het mRNA. Er zijn echter meerdere anti-codons en dus ook codons die coderen voor het zelfde aminozuur. Zo coderen UCU, UCC, UCA en UCG allemaal voor alanine. Er zijn dus 64 codons en 61 daarvan coderen voor aminozuren. AUG codeert voor methionine en is ook de startplaats voor eiwitsynthese. UAA, UGA en UAG zijn stopcodons en coderen niet voor aminozuren, maar worden gelezen door release factors. De eerste twee nucleotiden van een codon zijn vaak al genoeg om een aminozuur te specifiëren. Eerst wordt het ribosomaal complex gevormd uit de ribosomale subeenheden, het mRNA, de initiator tRNA en een aantal eiwitten als initiatiefactoren. De initiator tRNA herkent het startcocon en is voor prokaryoten N-formylmethionine-tRNA en bij eukaryoten methionine-tRNA. De codons worden dan ‘gelezen’ en de eiwitstreng wordt samengesteld uit de opeenvolgende aminozuren. Wobble base pairing is een theorie die stelt dat aangezien er 61 codons zijn, er dus potentieel 61 anti-codons en 61 tRNA’s kunnen zijn. Echter, de meeste cellen bevatten zo’n 40 verschillende tRNA’s. Dat betekent dat voor alanine, er bijvoorbeeld maar 1 tRNA zou kunnen zijn, bijvoorbeeld AGA. Toch zijn er 4 anti-codons die coderen voor alanine. Zoals eerder vermeld, zijn de eerste twee nucleotiden van een codon vaak al genoeg om een aminozuur te specifiëren. Bij de derde, zo stelt de theorie, maakt het niet uit welk nucleotide er staat omdat er aan wobble base paring wordt gedaan. Op het anti-codon van tRNA voor alanine AGA past naast UCU ook UCC en de anderen omdat er aan onconventionele paring wordt gedaan. Er wordt dus niet het juiste basenpaar gevormd, maar toch een aminozuur toegevoegd aan de keten. Technieken om genen te bestuderen: Restrictie-enzymen knippen DNA: restrictie-endonucleasen knippen DNA in zeer specifieke fragmenten door op voorhand bepaalde basensequenties van 4 tot 8 paren te herkennen en de fosfodiësterbinding van de strengen op bepaalde punten door te knippen. Ze komen uit prokaryoten, waar ze gebruikt worden om celvreemd DNA te knippen ter verdediging. In het prokaryote DNA wordt niet geknipt omdat de knipplaatsen beschermd zijn door methylatie. De knipplaatsen zijn palindromisch (zie tekening) en bij het knippen vormen zich sticky ends of overhangende sequenties DNA. Andere restrictie-enzymen vormen blunt ends. DNA kan zo in kleine, manipuleerbare stukken worden geknipt. Er zijn veel verschillende restrictie-enzymen die allemaal specifiek zijn voor verschillende sequenties. De verschillende stukken DNA na het knippen kunnen afgezonderd worden door gelelektroforese. DNA is negatief geladen en migreert door een gel naar een positieve pool. De kortere fragmenten migreren sneller dan de lange fragmenten, waardoor er na verloop van tijd en na kleuring ‘bandjes’ van DNA met dezelfde lengte ontstaan. Bredere bandjes hebben een grotere hoeveelheid/concentratie en de positie van de bandjes in de gel toont aan hoe lang ze zijn (tot op 100 basenparen nauwkeurig). Quinten Wouters 6  Blotting en hybridisatie zijn gebaseerd op complementaire basenparing met een complementaire DNA-streng die gemerkt is met een DNA-sonde. Het doel is om een specifiek fragment, waarvan me de sequentie kent, op te sporen en te isoleren in een gel. Eerst wordt een gelelektroforese uitgevoerd in bijvoorbeeld agarose. Daarna wordt een membraan dat de strengen aantrekt op de gel gelegd en worden alle strengen van de gel naar dat membraan getransfereerd. De strengen ondergaan dan denaturatie en dan hybridisatie met de toegevoegde DNA-sonde. Door (auto)radiografie of straling kleurt er op het radiogram een bandje op. Wanneer blotting toegepast wordt op DNA heet het Southern blotting, bij RNA gebruiken we Northern en bij eiwitten Western. DNA-sequentiebepaling is een techniek waarbij de DNA- synthese of -replicatie op een gecontroleerd ogenblik wordt stopgezet met behulp van dideoxynucleotiden. Dat zijn desoxynucleotiden waarvan de 3’-hydroxylgroep ook verwijderd is. Bij het inbouwen van dat dideoxynucleotide is de bindingsplaats voor een volgende deoxynucleotide niet aanwezig en wordt de ketenvorming stopgezet. Als men dideoxynucleotiden van elke base apart toevoegt aan een replicatieproces in verschillende bekers, zullen ze occasioneel worden ingebouwd. De tweede stap is het denatureren van het DNA. Hierdoor krijg je een mengsel van ssDNA van alle verschillende lengten, die eindigen op die bepaalde base. De 4 mengsels die DNA bevatten dat op bepaalde lengten gestopt is met een bepaalde base, zet je in 4 aparte banen op een gel. Door na scheiding een autoradiogram te nemen kan je de lengte van de stukjes DNA zien in de verschillende banen. Zoals getoond op de afbeelding, kan je dan de DNA-sequentie van de hele complementaire streng aflezen op het autoradiogram. Om de fragmenten te visualiseren, moeten er markers aan hangen. Die markers kunnen fluorescent of radio-actief zijn. Als men de primers van de DNA-synthese fluorescent merkt, krijgen we in 4 bekers, 4 gekleurde primers en dus 4 reacties die men kan uitzetten op 1 baan. Dat kan men dan met een laser scannen en zo de sequentie bepalen. Makkelijker is echter wanneer men de 4 ddNTPs fluorescent merkt. Er is dan maar 1 beker nodig en men kan alles uitzetten op 1 baan en de sequentie aflezen met de laser. Quinten Wouters 7  Solid phase DNA-synthesis wordt gebruikt voor het synthetiseren/opbouwen van een DNA- sequentie. Ze zijn vooral belangrijk voor het bouwen van primers, linkers en plaatsspecifieke mutagenese. Als monomeren wordt deoxyribonucleoside fosforamidiet genomen. Daarbij is de 5’-hydroxyl beschermd door een zuurgevoelige beschermgroep (DMT) en de 3’-hydroxyl gekoppeld aan een fosforamidiet die geactiveerd kan worden voor een nucleofiele aanval. In de ketenreactie wordt het fosforamidiet gekoppeld aan de groeiende keten in aanwezigheid van een zwak zuur. Het fosfiet-triëster wordt dan geoxideerd tot fosfotriëster en de DMT-beschermgroep wordt afgesplitst. De ketenvorming verloopt in 3’-5’ richting, dat is omgekeerd t.o.v. de enzymatische reactie. Op deze manier kunnen ketens tot 100 nucleotiden gemaakt worden. Polymerase kettingreactie (PCR) is een methode om een specifieke DNA-sequentie miljoenen keren te vermenigvuldigen in vitro. Als beginpunt is het DNA van 1 cel (of haar of …) voldoende orde reactie te starten. Voor de techniek is er template DNA (van een cel) nodig, samen met 2 primers die binden aan gekende sequenties die naast de beoogde doelwitsequentie staan, een mengsel van de 4 nucleotiden en een hittebestendig DNA-polymerase. In de eerste stap wordt het DNA gedenatureerd bij 95°C voor 15s. Daarna wordt de oplossing gekoeld tot 54°C zodat de primers kunnen binden aan de buursequenties. Een primer bindt altijd op de 3’ kant van de sequentie. Deze primers zijn ongeveer 10-20 nucleotiden lang en zijn in overvloed aanwezig. We noemen dit proces hybridisatie. In de laatste stap wordt de oplossing opgewarmd tot 72°C, de ideale temperatuur voor hitte-stabiele DNA-polymerases zoals Taq-DNA-polymerase (afkomstig van de Thermus aquaticus bacterie) om de strengen te verdubbelen van aan de primer. Deze cyclus kan herhaald worden, louter door het veranderen van de temperatuur en zo kunnen strengen van enkel de beoogde sequentie met haar buursequenties gevormd worden. Na n cycli zijn er 2n strengen aanwezig. De techniek heeft heel wat voordelen. De doelsequentie moet niet bekend zijn en ze kan veel langer zijn dan de primers. De hybridisatie is erg specifiek en kan gecontroleerd worden door temperatuur en zout. DNA-vermenigvuldiging: kloning Het klonen van een DNA-fragment kan ofwel via de PCR-methode zoals hiervoor beschreven, ofwel met kloning d.m.v. een gastheer. Daarbij wordt het DNA dat men wil kopiëren in een vector ingebracht. Die vector is een dragermolecule, een molecule die zich in een bepaalde gastheer autonoom kan vermenigvuldigen. Insertie gebeurt door dat de overhangende uiteinden na het knippen door restrictie-enzymen (beide bij de vector en het fragment) met elkaar binden. De overhangende uiteinden kunnen ook door een chemische linker gevormd worden. Quinten Wouters 8 De in vivo techniek gebeurt in 2 stappen: Een gen of sequentie inbrengen in een vector via knip en plakwerk (restrictie-enzymen en DNA- ligasen). Recombinante DNA-vector in de gastheercel brengen waarin de replicatie autonoom kan plaatsvinden. Men kan als vector een plasmide gebruiken. Dat is een circulair stuk dsDNA dat in de bacterie als mini- chromosoom aanwezig is. Het plasmide kan zich autonoom repliceren dankzij de aanwezigheid van een origin of replication. Zo kan vreemd DNA in een cel (bacterie) worden ingebracht. Een voorbeeld is het plasmide pBR322 (p van plasmide, BR van de onderzoekers en 322 een volgnummer) dat genen bevat voor de resistentie tegen tetracycline en ampicilline, beide antibiotica. Het plasmide heeft een aantal unieke insertieplaatsen. Door insertie van een gen kan het resistentiegen worden uitgeschakeld. Dit noemen we insertie-inactivatie. Een λ faag is een bacteriofaag die zijn gastheer kan vernietigen, of er een deel van kan uitmaken. Dit virus kan een bacterie infecteren en zijn genoom injecteren, waarna het tot expressie wordt gebracht (eiwitsynthese voor bouw van nieuwe bacteriofagen) of het wordt ingebouwd in het genoom van de bacterie, waarbij het mee gekopieerd wordt bij celdeling. We noemen dit respectievelijk de lytische en de lysogene cycli. Na het vormen van nieuwe fagen, wordt lysis geïnduceerd bij de bacterie (=celdood). In de praktijk kan dit worden gebruikt door de niet- essentiële stukken genoom van het virus te vervangen met stukken DNA dat we nodig hebben voor onderzoek en dan na verschillende cycli het DNA uit de virussen te isoleren. We kunnen ook een specifiek gen uit het genoom kloneren. Eerst wordt een genoombank opgesteld, waarin het volledige genoom van een organisme in fragmenten wordt bewaard. Het DNA wordt gefragmenteerd (mechanisch of met restrictie-enzymen) en geïnsereerd in een faag-vector. Het DNA wordt dan in vitro ingepakt in het faag-kapsel. De virionen infecteren dan E.coli zodat amplificatie optreed en er genoeg deeltjes van het genoom aanwezig zijn om een goede vertegenwoordiging van het genoom te hebben. We kunnen dan een specifiek gen gaan opsporen in de genoombank via DNA-hybridisatie. Daarbij worden recombinanten fagen uitgeplaat op een gel met E.coli-cellen op een petriplaatje. Daardoor ontstaan er plaques, heldere zones waar lysis is opgetreden en er grote hoeveelheden identieke faagpartikels aanwezig zijn. (elke faag zorgt voor 1 plaque) Die worden dan op een nitrocellulose membraan gebracht en behandeld met NaOH om de strengen te denatureren en de fagen lysis te doen ondergaan. Dan wordt de filter incubeerd met een radioactieve DNA-probe die specifiek is voor dat gen (die hybridiseert met het complementaire DNA) en dan wordt via een autoradiogram de aanwezigheid van dat gen aangetoond. Quinten Wouters 9 Manipulatie van eukaryote genen We bestuderen eerst de introductie van eukaryote genen in bacteriën om grote hoeveelheden van een belangrijk eukaryoot eiwit te produceren (eiwitfabrieken). Een goed voorbeeld is de productie van menselijke insuline voor diabetici. Een probleem is echter dat de meeste eukaryote genen introns bevatten en dat bacteriën geen splicing doen. Daarom moet er DNA gemaakt worden dat complementair is aan het mRNA dat codeert voor het juiste eiwit. We noemen dit cDNA. Concreet wordt dit voor insuline gedaan door mRNA te isoleren uit de pancreascellen van een mens en er dscDNA van te maken m.b.v. reverse transcriptase. Die reverse transcriptase voegt nucleotiden toe vanaf de poly-T-primer die bindt op de poly-A-staart van de mRNA. Het DNA wordt dan ingeplant in een plasmide met een bacteriële promotor die een hoge graad van RNA-transcriptie geeft. We kunnen ook nieuwe genen in eukaryote cellen inbrengen. Veel eiwitten krijgen niet de juiste post-translationele modificaties in bacteriën omdat de correcte enzymen ontbreken. De DNA- moleculen die aangepast zijn door chemische co-precipitatie, worden de dierlijke cellen binnengebracht door een micro-injectie, waarbij elke cel afzonderlijk geïnjecteerd wordt en er veel technische instrumenten nodig zijn of door infectie van de cellen door genetisch gemodificeerde virussen. (retrovirussen doden de gastheer niet) Er kunnen echter ook genetisch gemodificeerde dieren worden gemaakt. Als men genen toevoegt op een willekeurige plaats in het genoom (niet-homologe recombinatie) noemen we dit transgenese. Als men een inactief gen op een specifieke plaats in het genoom integreert, noemen we dit gerichte mutagenese. We bestuderen transgene muizen via micro-injectie van DNA in de kern van een bevruchte eicel. Eerst wordt dan bij de nakomelingen van de muis een PCR of Southern blot analyse gedaan van hun DNA. 10 tot 30% van hen zal het transgene bevatten in alle weefsels, wat betekent dat er bij hen een stabiele insertie in de ‘germline’ is gebeurd. Dan kunnen we de fenotypische effecten van het transgene bestuderen. Een vreemd gen dat onder controle staat van een nieuwe promotor kan geïntegreerd worden en tot (over)expressie gebracht worden. Voorbeeld: muizen die een groeihormoon van ratten ingebracht krijgen en zo 500 keer meer groeihormoon aanmaken. De functie van een gen kan ook onderzocht worden door het uit te schakelen en de gevolgen te onderzoeken. We noemen deze techniek gendisruptie of knockout. De techniek is gebaseerd op homologe recombinatie die plaatsvindt in de meiose, waarbij gebieden met sterk gelijkende DNA-sequentie fragmenten kunnen uitwisselen. Als de sequentie van een gen gekend is, kan men een inactieve versie maken en die inbrengen in de cel, waarna de actieve vorm erdoor wordt vervangen. Transgene planten kunnen worden bekomen door een gemodificeerde vorm van het plasmide van de Agrobacterium tumefaciens die normaal tumorgroei bij planten veroorzaakt. Het gewenste gen wordt dan in het plasmide toegevoegd en word door de bacterie afgeleverd in de cellen, waarna deze worden uitgeweekt en uitgroeien tot ene plant met de gewenste eigenschap. Ook via een genpistool kan het DNA de cel worden ingeschoten, of als de celwand door cellulase wordt afgebroken en via elektroporatie het celmembraan wordt geopend, kan DNA worden ingebracht. Quinten Wouters 10 Eiwitmanipulatie via plaatsspecifieke mutagenese Eiwitten kunnen gemanipuleerd worden door gericht, in vitro, de samenstelling van DNA te veranderen: Deletie kan geïnduceerd worden door een plasmide op twee plaatsen open te knippen en dan de einden met ligase aan elkaar te maken om zo een korter gen te vormen. Op die manier kan een relatief groot stuk DNA verwijdert worden. Voor kleinere stukken wordt slechts 1 knip gemaakt, waarna er enkele basen te verwijderen m.b.v. een exonuclease. Substitutie van een aminozuur kan gemakkelijk door oligonucleotide-gerichte mutagenese. We kunnen de substitutie uitvoeren als we beschikken over een plasmide (of cDNA) met het gen dat codeert voor het eiwit of als we de basensequentie kennen rond het stuk dat je wilt substitueren. Een oligonucleotide-primer die complementair is met deze regio van het gen wordt aangemaakt en bevat de gesubstitueerde base(n) op de juiste plaats (die dat je wilt substitueren). Die primer bindt dan op de complementaire streng en wanneer er DNA-replicatie is, bevat de helft van het nieuw gevormde DNA de nieuwe, gemuteerde sequentie. Insertie-cassette mutagenese kan een deletie, insertie of substitutie zijn en bestaat er in een ongewenst stuk DNA er uit te knippen (substitutie, deletie) of een plasmide open te knippen (insertie), de overblijvende streng (die sticky ends bevat) op te zuiveren en er een nieuw synthetisch stuk DNA, de ‘cassette’, met matchende sticky ends aan toe te voegen. Het plasmide met het nieuwe gen of met het verwijderde gen uitgeknipt wordt dan gesloten met ligase. Na de studie van DNA worden RNA en eiwitten nu veel belangrijker. Zo is de hoeveelheid mRNA dat onder bepaalde omstandigheden wordt geproduceerd in een bepaalde cel (het genexpressie-patroon) het onderzoeken waard. We noemen dit het transcriptoom (of transcriptie-profiel). Deze studies van genexpressie worden uitgevoerd met DNA-chips waardoor de expressie van duizenden genen kan worden onderzocht. DNA-microarrays zijn opgebouwd uit unieke single-strand oligonucleotiden (20 bp) op een vast oppervlak die elk complementair zijn aan een deel van een specifiek gen. Hun positie op het oppervlak is gekend. mRNA wordt uit een cel (tumor) opgezuiverd en uit dat mRNA wordt cDNA gemaakt in de aanwezigheid van fluorescente tags. Voor bijvoorbeeld gezonde cellen en kankercellen wordt een andere kleur tag gebruikt. Men kan dan zien aan de hand van de kleur van het DNA-microarray welke genen meer en welke minder tot expressie komen. De technieken in de eiwit-en nucleïnezuur-biochemie leiden tot een informatiestroom in twee richtingen: nucleïnezuren coderen voor eiwitten en kunnen gebruikt worden om eiwitten te produceren en eiwitten kunnen gebruikt worden om informatie te bekomen over een sequentie, die dan gebruikt kan worden om een DNA-probe chemisch aan te maken en het nucleïnezuur te detecteren. Quinten Wouters 11 3. Suikers en lipiden (11+12+13) De suikers zijn erg belangrijk in de cel. Niet alleen zijn ze de brandstof waarop de cel draait, maar ze vormen ook de basisstructuur van de nucleïnezuren en vormen signaalmoleculen. Ze zijn daarnaast aanwezig in de celwand van planten en bacteriën. De monosachariden zijn suikers die uit 1 monomeer bestaan. Er zijn aldosen (polyhydroxy- aldehyden) en ketosen (polyhydroxy ketonen). Triosen zijn monosachariden met drie koolstoffen en zijn de kleinst mogelijke monomeren. De monosachariden kunnen ook verschillen in optische draaiing; dit noemen we enantiomeren. Die enantiomeren komen enkel voor wanneer er chirale koolstoffen (met 4 verschillende groepen aan gebonden) zijn in het molecule. De D/L-nomenclatuur zegt dat als de molecule in een Fisher- projectie is afgebeeld met de aldehyde-groep vanboven, we een D-configuratie hebben als de hydroxylgroep op het chirale koolstofatoom langs de rechterkant staat. Bij de L-configuratie staat ze langs de linkerkant. Cyclisatie van aldosen en ketsen komt voor wanneer een alcoholgroep op de keten reageert met een aldehyde/keton ter vorming van een hemiacetaal/-ketaal. Vanaf de vorming van een cyclisch sacharide, gebruiken we de Haworth- projectie zoals in de afbeelding. Er kunnen dan ook isomeren ontstaan. We duiden ze aan met α in het geval dat de hydroxylgroep op de C1 aan de tegenovergestelde kant van de ring staat als de C6 en β als ze langs de zelfde kant staan. Hexoses en pentoses zijn in de ringvorm ruimtelijk niet-planair. Hexoses vormen een ‘chair’ of een ‘boat’ en pentoses vormen een ‘envelope’. Glucose is een belangrijke reductor en reduceert ook hemoglobine, die dan detecteerbaar is in het bloed. Zo kan bijvoorbeeld diabetes worden opgespoord. Suikers worden ook vaak gemodificeerd in reacties met o.a. alcoholen en amines, waarmee ze een glycosidebinding vormen. Ze worden dan gebruikt in verschillende biologische systemen. Soms maken ze ook deel uit van andere (poly)sachariden. Nucleosiden zijn hier een voorbeeld van. Gefosforyleerde suikers zijn erg belangrijk in biosynthese en energieproductie in het lichaam. De eerste stap in de afbraak van glucose is het fosforyleren tot glucose-6-fosfaat. Fosforylatie zorgt er voor dat de suikers een negatieve lading krijgen en zo de cel niet verlaten en niet meer interageren met hun transporters. Twee monosachariden vormen samen een disacharide. De glycosidische binding is de primaire structurele verbinding in al deze polymeren met monosachariden. De meest voorkomende disachariden (in onze voeding) zijn sucrose, maltose en lactose. Omdat grote concentraties glucose in de cel de osmotische balans verstoren, wordt het opgeslagen als glycogeen en zetmeel, beide grote polymeren. Glycogeen en zetmeel gebruiken α-1,4-glycosidische bindingen voor de structuur en α-1,6-glycosidische bindingen voor vertakkingen. Amylase breekt de bindingen gemakkelijk af. Ook cellulose is een netwerk van glucoseverbindingen. Er zijn geen vertakkingen, maar de strengen, die verbonden zijn via β-1,4-glycosidische bindingen, hangen samen door H- bruggen. Pectine is een ander belangrijk polysacharide. Dit polygalacturonzuur ineen oplosbare vezel die de darmtransit vertraagt en zo zorgt voor betere vertering en opname van nutriënten. Inuline is een polymeer van fructose met glucose als eindresidu en is een zoete stof. Het heeft talrijke eigenschappen en toepassingen in de voedingsindustrie. Glycosaminoglycanen zijn onvertakte heteroglycanen van herhalingen van discahariden met meerdere carboxylaatgroepen of gesulfateerde hydroxyl- of aminogroepen. Proteoglycanen zijn glycosaminoglycaan-eiwit complexen die gebruikt worden als smeermiddel in bindweefsels (knie). Quinten Wouters 12 De vorming van glycosidische bindingen is gekatalyseerd door glycosyltransferasen. Suiker wordt toegevoegd onder de vorm van een geactiveerd suikernucleotide. Glycoproteïnes zijn eiwitten met covalent gebonden oligosachariden (oligo = weinig). Serine en threonine vormen een O-binding en asparagine vormt een N-binding tussen het polysacharide en het proteïne. Meestal zijn er (vertakte) polysachariden aan het aminozuur gebonden. Door het grote aantal mogelijke suikers en de verschillende aminozuren, zijn er erg veel glycoproteïnen mogelijk. Alle N-gebonden glycoproteïnen (dus op asparagine) hebben dezelfde basisstructuur van 2 keer glucose en dan 3 vertakte mannose-eenheden. (zie figuur) Een voorbeeld van markers op de biologische cel zijn antigenen op bloedcellen. A en B zijn variaties van het O-gen en worden gevormd doordat glycosyltransferase extra suikers op het galactose van het O-antigen zet. De genen voor een bepaald glycosyltransferase worden geërfd van de ouders. Mensen met bloedgroep A hebben dus het gen dat codeert voor het glycosyltransferase dat GalNAc aan de galactose kan binden. Mensen met het O-fenotype hebben een mutatie die voorkomt dat die bepaalde glycosyltransferasen gevormd kunnen worden. De resusfactor is een extra proteïne in het membraan. Een ander voorbeeld is het hormoon erythropoëthine of EPO, een glycoproteïne dat aangemaakt wordt in de nieren en de aanmaak van nieuwe rode bloedcellen in het beenmerg stimuleert. Glycolysatie is dus een belangrijk proces. N-glycolysatie vindt plaats in het endoplasmatisch reticulum en wordt afgewerkt in het Gogi-complex en O-glycolysatie speelt zich enkel af in het Golgi-complex. De belangrijkste glycolysatie is het koppelen van een oligosacharide gebonden aan dolicholfosfaat met een Asn-residu. Deze N-glycolysatie gaat op in 3 stappen en verloopt als volgt: De glycoproteïnes worden dan naar het Golgi-apparaat gebracht, waar ze op verschillende manieren worden aangepast en verdeeld over de cel. Quinten Wouters 13 Lectines zijn eiwitten die specifieke suikers binden. De diversiteit in suikers en dus ook lectines en de manier waarop ze met elkaar interageren suggereert een groot nut in de biologie. Ze worden daardoor gebruikt in cel-cel interacties. Suikerstructuren op de ene cel interageren (niet-covalent) met lectines op het andere celmembraan. Ze worden opgedeeld in klassen op basis van hun eigenschappen en structuur. De C-klasse (voor Ca-afhankelijk) bindt met suikers doordat er een niet-covalente brug gevormd wordt tussen de calcium en de OH-groepen van de suiker. Ze worden ook gebruikt voor tal van andere processen, waaronder receptor-gemedieerde endocytose. Een voorbeeld van een lectine zijn de selectines, een subgroep van de C-klasse, die immuuncellen binden op ontstekingsplaatsen. Er zijn echter ook veel pathogenen die de cel willen binnendringen door te binden op het membraan aan de lectines. Influenza of griep bindt op siaalzuur dat gebonden is aan galactose dat aanwezig is op cel-gebonden glycoproteïnen. Het virus gebruikt daarvoor een eigen proteïne genaamd hemaglutinine. Door de binding op het oppervlak, doet de cel aan endocytose en is ze geïnfecteerd. Na de replicatie stelt het virus zich samen en doet de cel aan ‘budding’, waarbij er nieuwe virionen vrijkomen. Die hebben echter nog hemaglutinine dat gebonden is met residu’s van het celmembraan. Neuraminidase, een proteïne van het virion, verbreekt dan de glycosidische binding zodat het virion andere cellen kan gaan infecteren. Beide cruciale eiwitten komen voor in verschillende vormen (hoge mutatiegraad). We noteren een variant van het griepvirus dan ook met het nummer van de variant van elk proteïne. (vb. H1N5) Het griepvirus kan bestreden worden door een middel dat deze proteïnen uitschakelt. Lipiden zijn de structurele bouwsteen van membranen. Celmembranen zijn opgebouwd uit een dubbele fosfolipidelaag met een dikte van 60-100 Å die spontaan vormt onder invloed van niet- covalente interacties. In een bembraan zitten voornamelijk lipiden en eiwitten, die vaak gebonden zijn met suikers. De embraaneiwitten bepalen de functie van het membraan. De meeste membranen zijn elektrisch gepolariseerd, met een negatieve lading van -60 mV aan de binnenzijde. Lipiden komen ook voor onder verschillende vormen. De vetzuren (R-COOH) zijn componenten van triacylglycerolen, fosfoglyceriden en sfingolipiden. Fosfolipiden bevatten fosfaatgroepen en glycolipiden bevatten suikergroepen. Ze komen beiden voor in het membraan. De isoprenoïden zijn afgeleiden van het polymeer van isopreen (een C5 alkeen) en functioneren o.a. als steroïden, vetoplosbare vitaminen en terpenen. De vetzuren verschillen in lengte, graad van onverzadiging (smeltpunt) en positie van de onverzadigde bindingen. De meeste vetzuren hebben een even aantal (12-20) koolstoffen. De plaatsen van die dubbele bindingen wordt aangeduid met Δn met n het rangnummer van de koolstof. Een vetzuur met 2 onverzadigde bindingen op posities 9 en 12 en 18 koolstoffen genaamd linolenaat wordt dan: cis,cis-Δ9Δ12-octadecadienoaat. Men kan de koolstoffen ook benoemen met letters van het Griekse alfabet te beginnen bij C2 (alfa). Quinten Wouters 14 De fosfolipiden zijn de meest voorkomende lipiden in membranen en bezitten een glycerol of een sfingosine als ruggengraat. De fosfoglyceriden zijn afgeleid van glycerol. Aan de fosfaatgroep hangt nog een alcohol. Sfingomyeline is een fosfolipide afgeleid van sfingosine en is een tweede belangrijk membraanlipide. De glycolipiden worden opgedeeld in twee groepen. De cerebrosiden zijn glycosfingolipiden met één monosacharideresidu aan de C1 van sfingosine. De gangliosiden bevattende oligosacharide (vanaf 7 suikers) aangehecht aan sfingosine. De steroïden bevatten 4 gekoppelde koolwaterstofringen waarvan drie C6 ringen en een C5 ring. De ringen worden aangeduid met letters zoals in de figuur. Cholesterol is zo’n steroïde dat voorkomt in het celmembraan als structuurmolecule. Door dit gefusioneerde ringsysteem zijn steroïden meer rigide (en dus minder vloeibaar) dan andere lipiden. Cholesterol kan zich daardoor ook afzetten op de bloedvaten. Archae hebben in tegenstelling tot de membranen van andere organismen geen fosfolipiden, maar sterk vertakte etherlipiden die resistent zijn tegen oxidatie en hydrolyse. Zo overleven ze in extremere condities. De membraanlipiden zijn amfifiele (of amfipathische) moleculen die met hun dubbellaag een structurele basis vormen voor alle biologische membranen. Door hun niet- covalente interacties zijn ze flexibele en zelf-sluitend. Membranen bezitten en lage permeabiliteit voor ionen en de meeste polaire moleculen, behalve water (mede door aquaporines). Een biologisch membraan bestaat uit eiwitten geassocieerd met de lipide dubbellaag. In werkelijkheid bestaat het membraan voor 50-70% uit eiwitten afhankelijk van het celtype. Integrale membraanproteïnen bevatten hydrofobe gebieden die passen in de hydrofobe dubbellaag en overspannen meestal de hele laag (buiten-binnen). De perifere membraanproteïnen zijn (tijdelijk) geassocieerd met het membraan via ladingsinteracties of waterstofbinding met de integrale eiwitten of membraanlipiden. Ze kunnen zo sneller dissociëren bij pH-verandering of elektrische lading dan wanneer ze covalente gebonden zouden zijn. Eiwitten kunnen in het membraan verankerd worden door zogenaamde membraanankers (moleculen met een lange apolaire staart) die ze covalent binden. Membranen zijn getypeerd door het ‘fluid mosaic model’. De membraaneiwitten kunnen snel lateraal diffunderen of roteren binnen de dubbellaag. Ze ‘drijven’ als het ware in een fosfolipidezee. De vloeibaarheid/rigiditeit van een membraan hangt af van de flexibiliteit van de vetzuurketens en de hoeveelheid cholesterol die het membraan verstevigt. Meer onverzadigde vetzuurketens zorgen voor meer flexibiliteit. Meer cholesterol zorgt voor meer rigiditeit. Op het membraan kunnen domeinen zijn die verstevigd zijn met erg veel cholesterol. Vaak bezitten die gebieden veel belangrijke functies voor bijvoorbeeld signaaltransductie. We noemen ze ‘lipid rafts’. Sommige bacteriën en archae hebben meerdere membranen met eventueel een celwand tussen. In veel cellen zijn er insluitingen van het membraan die organellen vormen (Golgi-complex, ER). Om stoffen te transporteren over het membraan kunnen verschillende methoden aangewend worden. Cholesterol wordt opgenomen door endocytose: het insluiten van een proteïne met cholesterol in. Neurotransmitters worden door exocytose vrijgezet uit de cel. Quinten Wouters 15 Andere vormen van membraantransport zijn poriën en kanalen. Deze doorgangen doorheen het celmembraan worden gevormd door transmembranaire eiwitten met een centrale (polaire) doorgang voor ionen en kleine moleculen. Ionen en moleculen van de juiste grootte, lading eistructuur kunnen diffunderen in de richting van dalende gratiënt. Dat vereist geen energie en kan toch de maximale diffusiesnelheid benaderen. Er bestaan ook molecuulspecifieke transporters. Uniporters transporteren één type molecule in één richting. Symporters co-transporteren twee stoffen in dezelfde richting en antipotters transporteren ze in twee verschillende richtingen. Dat proces kan passief verlopen indien het met de concentratiegratiënt meegaat. Echter, vaak wil de cel een gradiënt opbouwen en moeten er moleculen tegen het gradiënt in bewegen. Dan is er een energiebron nodig voor het actieve transport. Bij primair actief transport is dit een directe energiebron zoals ATP, licht of elektrontransport, secundair actief transport maakt gebruik van een ionenconcentratiegradiënt. Zowel bij actief als bij passief transport (uniporter, symporter, antiporter) bindt het transporteiwit een specifiek substraat, dat na een conformationele verandering het molecule of ion kan vrijstellen aan de andere kant van het membraan. In E. coli is er secundair actief transport om lactose in de cel te krijgen tegen het gradiënt in. Er wordt daarvoor eerst via oxidatie van Sred een transmembranair protonengradiënt opgebouwd. Lactose permease (een symporter) gebruikt de energie van een proton dat met zijn gradiënt mee beweegt om lactose tegen het gradiënt in te bewegen. In zoogdieren wordt het zelfde principe toegepast bij Na- K-ATPase. Een antiporter die Na de cel uit pompt en K de cel in pompt (de energie van elkaars gradiënt gebruikend) zorgt voor een gradiënt Na-ionen buiten de cel. Een symporter gebruikt dan opnieuw de energie van het Na-ion dat met zijn gradiënt mee beweegt, om glucose de cel in te pompen. (het kan nuttig zijn om de leerstof van celbiologie over transmembranair transport uit de eerste fase nog eens door te nemen of om hoofdstuk 13 verder te lezen voor mee informatie) Quinten Wouters 16 4. Aminozuren en proteïnen (2) Proteïnen zijn zeer veelzijdige moleculen en komen in de biochemie voor als enzymen, opslag en transporters van molecules als zuurstof, conductors van zenuwimpulsen, elementen van het immuunsysteem, structuurmolecule, mechanische krachtleveraars,…. Proteïnes zijn lineaire polymeren opgebouwd uit aminozuren. Op basis van deze aminozuursequentie, vouwen proteïnes zich spontaan op en vormen ze een driedimensionale structuur die een groot deel van hun functie bepaalt. Veel proteïnes vormen dan soms samen nog een quaternaire structuur, die meestal de eindfunctie uitvoert. Ze hebben door hun verschillende samenstelling uit een wijde variatie van monomeren ook veel functionele groepen die chemisch kunnen reageren en zo optreden als katalysator. Verder kunnen proteïnen ook grote complexen vormen en met elkaar interageren, zoals bij de spieren. Een α-aminozuur bestaat uit een chiraal α- koolstofatoom met daaraan een aminogroep, een carboxylgroep, een waterstofatoom en een variabele zijketen. Door het chirale centrum zijn er een L en een D isomeer mogelijk. Alle 20 natuurlijk voorkomende α-aminozuren zijn L- isomeren en bezitten een (bijna allemaal) S- configuratie. Onder normale omstandigheden komen aminozuren voor als zwitterionen, waarbij de carboxylgroep gedeprotoneerd en de aminogroep geprotoneerd is. De protonatie van de groepen hangt af van de pH. Het is belangrijk dat je de verschillende aminozuren van elkaar kunt onderscheiden. Op p 31 t.e.m. 34 in het handboek staan de 20 aminozuren opgelijst. Leer ze zeker vanbuiten! In de natuur komen zeker 200 aminozuren voor, de meeste zijn precursoren voor de algemene aminozuren of zijn chemische gemodificeerd na incorporatie in de polypeptide. De polypeptiden werken op 4 niveaus. De primaire structuur is de lineaire aminozuursequentie. De secundaire zijn de regio’s in de peptideketen met regelmatig herhaalde conformatie (α-helices en β-platen). De tertiaire structuur beschrijft de vorm van een volledig opgevouwde polypeptideketen en de quaternaire de schikking van één of meer ketens in een multi-subeenheid molecule. De primaire structuur is gebaseerd op peptidebindingen. Aminozuren worden gekoppeld door een amidebinding, gevormd door de condensatie van de α-carbonylgroep van een aminozuur met de α-aminogroep van een ander. De massa-eenheid van eiwitten wordt uitgedrukt in dalton. 1 aminozuur is 110 g/mol is 110 Da. In sommige polypeptideketens is er ‘cross-linking’ waarbij er een disuflidebrug is gebouwd (meestal tussen twee eenheden cysteïne). Binnen de cel komt dit echter amper voor. De peptidebinding is een vlakke binding met een dubbelebindingskarakter waarrond geen rotatie mogelijk is. Ze zit meestal in trans-conformatie omdat er bij cis sterische hinder van de zijketens is. De binding is gestabiliseerd door resonantie. De conformatie van de peptidegroep is bepaald door de beperkte draaiing rond de N-Cα en de Cα-C bindingen. We geven die toegelaten hoeken weer op een 2D plot genaamd een Ramchandran diagram. Sommige draaihoeken zijn niet mogelijk door sterische hinder. Quinten Wouters 17  De secundaire structuur wordt gevormd door niet-covalente intramoleculaire interacties. De α-helix is zo’n veelvoorkomende structuur. α-helices worden gevormd door een waterstofbrug tussen de C=O van aminoresidu i met de waterstof van de amidegroep van residu i+4. Er zijn 3,6 aminozuren per volledige omwenteling en de spoed van de omwenteling is 5,4 Å. De lengtetoename per aminoresidu dat toegevoegd wordt is 1,5 Å. De meeste α- helices zijn rechtsdraaiend. Een tweede secundaire structuur is de β-plaat. β-strengen, bijna volledig uitgestrekte polypeptideketens, vormen β- platen door zich zij aan zij te schikken en waterstofbruggen te vormen tussen C=O en N-H van naburige strengen. De β-strengen zijn parallel of anti- parallel of gemengd. Antiparallele β-strengen hebben stabielere H-bruggen omdat ze loodrecht op de strengen staan. β-strengen buigen rechts en de lengtetoename per residu is 3,5 Å. De β-platen en α-helices worden verbonden via draaien en lussen. Op die manier kan een peptideketen zich opvouwen tot een compacte structuur. De lussen en draaien aan de buitenkant van de proteïnen interageren met andere moleculen en proteïnen zodat complexen gevormd kunnen worden. Er zijn Ω-lussen en β-draaien. Die laatsten verbinden verschillende antiparallele β-strengen. De draai wormt zich door een waterstofbrug tussen C=O van residu i en N-H van residu i+3. Een eerste voorbeeld is α-keratine, een structuurproteïne in wol en haar. Ze bestaat uit twee rechtsdraaiende α-helices die een linksdraaiende supercoil vormen. Ze worden bij elkaar gehouden door zwakke hydrofobe Van der Waals krachten tussen de leucine- residu’s. Er zijn ook disulfide crosslinks aanwezig tussen cysteïnes die de helix stabiliseren. De structuur laat toe dat de vezels in wol tot 2 keer langer worden. Daarbij is er α-strekking en worden de zwakke bindingen en S-crosslinks verbroken. In wol zitten minder crosslinks en in hoorn zitten meer crosslinks, waardoor de flexibiliteit verandert. Een tweede voorbeeld is collageen, een structuurproteïne in huid, beenderen, tanden en kraakbeen. Collageen bestaat uit 3 α-helices. Collageen is tot 3000 Å lang en heeft 3 aminozuren per winding. Op elke derde plaats zit glycine dat er voor zorgt dat de 3 spiralen in elkaar draaien. De grote ringen van de proline en de hydroxyproline stoten elkaar af en zorgen voor stabilisatie van de helix. Scheurbeuk wordt veroorzaakt door een gebrek aan vitamine C waardoor er geen OH-groepen op hydroxyproline staan en collageen zijn stabiliteit verliest. Het gevolg is pijnlijke gewrichten en zwakke bloedvaten. Quinten Wouters 18 De tertiaire structuur is de vouwing van de polypeptideketen tot een dense driedimensionale structuur. De tertiaire structuur wordt gestabiliseerd door niet-covalente interacties tussen zijketens. De thermodynamische stabiliteit komt voort uit de verdeling van hydrofobe en hydrofiele aminozuren in de keten. Een voorbeeld is myoglobine, een zuurstofdrager in spierweefsel, dat bestaat uit 1 keten van 153 aminozuren waarvan 70% een helix vormt. De heemgroep (waar de zuurstof bindt) zit in het midden genesteld. Binnenin zijn enkel niet-polaire aminozuren behalve op de zuurstofbindingsplaats, waar histidine zit. Een tweede voorbeeld is het eiwit porine dat bestaat uit β-strengen en het membraan overspant. De binnenkant bestaat dan uit polaire aminozuren terwijl de buitenkant apolair is om in het membraan te passen. Het werkt als kanaalproteïne bij bacteriën. Een derde voorbeeld is bacteriorhodopsine dat het membraan overspant met α-helices. Die methode om het membraan te overspannen is de meest voorkomende vorm van membraanproteïnes. Een laatste voorbeeld is membraangebonden prostaglandine H2 synthase. Hoewel we het een integraal membraanproteïne noemen, is het slechts oppervlakkig verankerd door stel α- helices. De α-helices hebben een hydrofoob oppervlak, zodat ze tussen de lipiden blijven zitten en de hydrofiele buitenkant afstoten. Prostaglandine H2 is een stof die ontstekingsreacties opwekt in weefsels. Aspirine en ibuprofen blokkeren het hydrofobe kanaal waarin de synthese plaatsvindt door serine in het enzym te acetyleren. Tertiaire structuren hebben een motief, een wederkerende eiwitstructuur zoals helix-lus-helix en een domein, onafhankelijk gevouwen, compacte eenheden in eiwitten (25-300 residu’s). Aan de hand van hun aminozuursequentie kan worden voorspeld of een proteïne transmembranaire helices bevat. Men stelt daarvoor een hydropathieplot op. Quinten Wouters 19 De quaternaire structuur is de organisatie van meerder subeenheden of polypeptideketens in een eiwit. Deze subeenheden worden samengehouden door vele zwakke, niet-covalente interacties. De proteïnen worden opgedeeld in globulaire en vezelachtige proteïnen. De uiteindelijke driedimensionale structuur hangt volledig af van de aminozuursequentie. Elk aminozuur heeft een bepaalde affiniteit voor een bepaalde structuur. Sommigen, zoals proline, zijn groot en passen niet in een helix of plaat door de sterische hinder. Anderen, zoals glycine, hebben geen voorkeur en kunnen overal gemakkelijk worden ingebouwd. Globulaire proteïnen zijn meestal wateroplosbaar, compact en zoals de naam doet vermoeden, sferisch. Binnenin zijn ze hydrofoob, vanbuiten zijn ze hydrofiel. Meestal zijn dit enzymen, dragereiwitten en regulatorische eiwitten. Vezelachtige proteïnen zijn meestal belangrijk voor de mechanische structuur. Vaak zijn het lange kabels of draden zoals het geval bij collageen. Denaturatie, het verbreken van de standaardconformatie van het proteïne, zorgt voor het verlies van de (jusite) biologische activiteit. Denaturatie komt door verhitting of door chemicaliën. De S-bindingen en de H-bruggen worden dan gebroken. Sommige eiwitten kunnen zicht ook renatureren. Natieve proteïnen in opgevouwen toestand zijn bijna altijd de meest stabiele vorm van het proteïne. Daardoor zullen proteïnen vaak spontaan tot deze conformatie vouwen. Bij het reantureren zal het proteïne eerder een algemene dan een precieze weg volgen omdat naarmate de energie daalt, er steeds minder gunstige conformaties mogelijk zijn doordat de moleculen compacter worden. De 3D structuur kunnen we voorspellen op twee manieren: Ab initio of op basis van aminozuursamenstelling, waarbij men het model met de laagste vrije energie laat berekenen. Knowledge-based, waarbij men vergelijkt met gekende proteïnestructuren en fragmenten. Een significante overeenkomst kan dan dienen als model. Na het synthetiseren en vouwen van de proteïnen, worden ze vaak nog gemodificeerd. Covalente modificaties zijn toevoegingen die covalent gebonden zijn zoals een acetylgroep op het NH2-uiteinde om degradatie tegen te gaan. Suikerresidu’s maken de proteïnen meer hydrofiel, vetzuurresidu’s maken ze meer hydrofoob. Chemisch herschikken is het herschikken van zijketens en soms de hoofdketen zelf. In GFP (green fluorescent protein), een belangrijk molecule dat fluoresceert, wordt de fluorescentie bepaald door de herschikking van de ser-tyr-glyc-sequentie en oxidatie met zuurstof. GFP is een belangrijke marker voor activiteit van proteïnen in de cel. Het splitsen van inactieve precursoren is ook een modificatie die toestaat om een eiwit dat eerst opgeslagen was in zijn inactieve vorm om te zetten in zijn active vorm door een stuk te verwijderen of aan te passen. (verteringsenzymen) Het onjuist opvouwen van proteïnen kan veel schade aanrichten en leiden tot neurologische afwijkingen fout opgevouwen zoals Parkinson, Alzheimer en de dollekoeienziekte. Een proteïnen kan in de hersenen agrereren en infecties veroorzaken. α-helices kunnen zo aggregeren tot β-platen. Fout opgevouwen eiwitten zetten zo andere eiwitten aan tot fout ofvouwen. Quinten Wouters 20 5. Studie van de proteïnen (3) Proteïnen zijn alomtegenwoordig in de biochemie. Om ze goed te kunnen bestuderen en hun processen te kunnen begrijpen, moeten we ze eerst opzuiveren. We beginnen daarbij met een complex mengsel van biomoleculen uit een cel of orgaan. Eerst willen we nagaan of het proteïne uberhaupt aanwezig is in het mengsel. Daarvoor gebruiken we een detectietest of assay. Via een purificatie- (fractionatie)schema kunnen we dan een oplossing met zuiver proteïne bekomen. Het proteoom van een cel is de verzameling van eiwitten en afgeleiden die het genoom kan produceren in de cel. Het is daarom veel uitgebreider en ligt niet vast, zoals het genoom. Het kan variëren met omgevingsfactoren, niveau van ontwikkeling en type cel. Het proteoom is de functionele voorstelling van het genoom. Om het te bestuderen, moet men de afzonderlijke proteïnen kennen en oplijsten, vaak door ze uit een biologisch mengsel te isoleren. Proteïnen kunnen gescheiden worden op basis van lading, grootte, etc. maar als het gewenste proteïne niet aanwezig is in het mengsel, is dat allemaal verspilde moeite. Om de hoeveelheid van het gewenste eiwit te monitoren doorheen de purificatiestappen, voeren we een detectietest of assay uit. In het geval van een enzym zullen we de enzymactiviteit meten. Daarvoor moeten we weten welke activiteit het enzym uitvoert en daarna deze activiteit kwantificeren. We stellen die activiteit dan in perspectief door ze de delen door de totale hoeveelheid proteïne in het mengsel. Hoe verder de purificatie vordert, hoe groter deze specifieke activiteit wordt. Proteïnes in een cel moeten eerst uit die cel worden losgelaten. Daarvoor wordt eerst het celmembraan verstoord en worden dan componenten met verschillende densiteiten van elkaar gescheiden d.m.v. differentiële centrifugatie. Daarbij wordt het mengsel herhaaldelijk op steeds hogere toerentallen gecentrifugeerd en opgesplitst in steeds lichtere componenten. Op elk van die componenten kan men dan het assay uitvoeren. Een van de componenten is gewoonlijk opvallend meer actief en dient als substraat voor de volgende scheidingsmethoden. Er zitten immers nog veel andere eiwitten bij. Uitzouten is een proces waarbij proteïnes neerslaan bij een hogere zoutconcentraties. Elk proteïne heeft een verschillende kritieke concentratie. Er kunnen zo opnieuw meerdere fracties worden bekomen, waar opnieuw het assay op kan worden toegepast om het meest geschikte te vinden. Dialyse is een techniek om kleinere moleculen zoals zouten terug uit de oplossing te krijgen en van de proteïnen te scheiden. De zoute oplossing wordt daarvoor in een semipermeabel membraan gegoten en in een oplossing met lagere zoutconcentratie gestoken. Het zout zal dan volgens zijn gradiënt diffunderen uit het dialysezakje, terwijl de eiwitten niet kunnen diffunderen. Zo kan bijna al het zout verwijderd worden. Chromatografie is het scheiden van proteïnen op basis van grootte, lading, bepaalde affiniteiten, etc. Gelfiltratie is het scheiden op basis van grootte doorheen een gel. Grote deeltjes vloeien sneller door de gel omdat ze niet tussen de gelpartikels passen en dus een kleiner beschikbaar volume hebben dan de kleine deeltjes. De grootste molecules komen dus eerst uit de gel, waarna fracties met kleinere molecules kunnen worden opgevangen. Quinten Wouters 21 Ionenuitwisselingschromatografie maakt gebruik van negatief geladen kolommen (carboxymethylcellulose) om kationuitwisselingschromatografie te doen. Positief geladen proteïnen binden aan de negatief geladen kolompartikels. Nagatief geladen proteïnen vloeien er wel vlot door. De positief geladen proteïnen kunnen we dan elueren met stijgende concentraties NaCl volgens ladingsdensiteit. D.w.z. dat de meest positief geladen proteïnen slechts vrijkomen bij de hoogste concentraties NaCl. Het zout neemt hier de plaats in van de positieve proteïnen. Analoog bestaan er ook kolommen met positief susbtraat, waarbij we aan anionische uitwisseling doen. Affiniteitschromatografie is een sterke techniek voor scheiding van proteïnen die zijn voordeel haalt uit de affiniteit van verschillende proteïnen om met verschillende chemische groepen te binden. Glucose-bindende proteïnen binden op glucose-residu’s op de kolompartikels. Andere proteïnen vloeien gewoon door de kolom. De glucose-bindende proteïnen kunnen worden losgelaten door toevoeging van glucose, dat de plaatsen op de kolompartikels inneemt. Op deze manier kunnen ook specifieke eiwitten van gekloonde genen worden opgezuiverd. Men kan een affiniteits-tag aan een aminozuursequentie hangen om het dan in een speciale affiniteitskolom over te houden van de andere eiwitten. Algemeen verloopt de techniek als volgt: 1) binden van een chemische groep aan de kolompartikels 2) eiwitmengsel toevoegen met gewenst (eventueel getagged) eiwit 3) kolom spoelen om ongebonden eiwitten te verwijderen 4) elueren van het gebonden proteïne met een hoge concentratie van de opgeloste chemische groep Hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC) is het versneld scheiden van eiwitten door kolommen met fijnere materialen (meer interactieplaatsen). De resolutie (de maat van scheiding) is dan ook veel hoger. Een HPLC wordt machinaal uitgevoerd onder hoge drukken. We kunnen de efficiëntie van het gekozen purificatieschema controleren doordat bij enzymen de specifieke activiteit stijgt. Algemeen kunnen we de totale proteïne-inhoud in de verschillende fracties per niveau visualiseren d.m.v. een gelelektroforese. Gelelektroforese is het bewegen van geladen (bio)moleculen doorheen een gel. Grotere deeltjes bewegen trager door de gel dan kleine deeltjes. De migratiesnelheid van een molecule v = E.q/f hangt af van de sterkte van het elektrisch veld, de lading van het biomolecule en de wrijving van de gel met de molecule. Een veelgebruikte gel is polyacrylamide. Om de proteïnen allemaal gelijk te krijgen (korte eiwitten kunnen breed en groot opgevouwen zijn en grote eiwitten erg dens) wordt er een denaturatie-katalysator gebruikt. SDS (natrium dodecyl sulfaat) breekt alle niet-covalente bindingen. Mercapto-ethanol en dithiotheitol breken de zwavelbruggen. Bij een SDS-PAGE worden de proteïnen eerst opgekookt met SDS waardoor enkel hun primaire structuur overblijft. Per 2 aminozuren bindt 1 molecule SDS. Het proteïne wordt daardoor negatief geladen, proportioneel met de grootte van het proteïne. Ze worden dan toegevoegd aan de gel en gescheiden. Om de lengte van een streng te kunnen weten, kan een mengsel van proteïnen van gekende lengten worden toegevoegd, waarmee men dan kan vergelijken. De bandjes worden zichtbaar in de gel door kleuring met Coomassie blue. Met deze techniek kan de purificatie van een eiwit gevolg worden tussen de stappen en kan de grootte gemeten worden. Quinten Wouters 22  Isoelectric focusing is het scheiden van proteïnen op basis van hun isoëlektrisch punt. Dat is het punt waarbij de pH net een bepaalde waarde bedraagt zodat de netto-lading gelijk is aan nul. Het hangt af van de hoeveelheid zure en basische aminozuren. Eerst wordt een pH- gradiënt aangelegd over een gel door poly- amfolyten. Het proteïnemengsel wordt aangebracht en er wordt een elektrisch veld aangelegd. De proteïnen migreren dan tot men opnieuw bandjes krijgt. Het voordeel is dat proteïnen met 1 netto lading verschil kunnen worden gescheiden. 2D gelelektroforese is een combinatie van beide technieken. Eerst wordt een isoeclectic focus gedaan, waarna deze gel wordt uitgezet als beginband in een SDS-PAGE. Zo krijg je geen bandjes maar eerder een vlekkenpatroon. Op dat patroon kan men zelfs ziektes zoals kanker aanduiden.In de praktijk wordt het vooral gebruikt om de expressie van proteïnen onder verschillende fysiologische omstandigheden te vergelijken. Een purificatieschema kan kwantitatief worden beoordeeld. De aparte stappen worden dan uitgezet op een gelelektroforese. We kunnen de activiteit meten en de specifieke activiteit daaruit bepalen. Een goed purificatieschema heeft een goede opbrengst en een goede zuiverheid. Het bandje moet dus zo vol en dik mogelijk zijn en er mogen geen andere bandjes meer aanwezig zijn. We kunnen nu ook de aminozuursequentie van dat opgezuiverde proteïne gaan bepalen. Dat kan in drie stappen: 1) Hydrolyse van de peptidebindingen door ze 24 uur in een 6M HCl oplossing te brengen en te verwarmen op 110°C. 2) Scheiden en identificeren van de verschillende aminozuren door chromatografie. 3) Kwantificatie van de aminozuren na reactie met ninhydrine dat reageert met de aminogroep. Het product kleurt en via spectroscopie kan men dan de hoeveelheid berekenen. We krijgen dan de absorbanties in een elutieprofiel. Hier voor de denkbeeldige sequentie Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly. (zie afbeelding) De gevoeligheid kan worden verhoogd door het gebruik van fluorescamine i.p.v. ninhydrine. Fluorescentie is namelijk nauwkeuriger dan absorbantie. Quinten Wouters 23 Het N-terminale aminozuur kan worden bepaald in drie stappen. Eerst wordt het N-terminale aminozuur gelabeld, bijvoorbeeld door een fluorescent molecule. Vervolgens wordt het proteïne gehydrolyseerd. Het aminozuur kan nu worden geïdentificeerd via chromatografie. Hierbij is er dus volledige hydrolyse. Een variatie op dit mechanisme leidt tot sequentiebepaling. Edmandegradatie is het bepalen van de aminozuursequentie van een proteïne met behulp van een label. Er vindt hier slechts milde hydrolyse plaats zodat de labeling herhaald kan worden. Het afgesplitste aminozuur kan dan herkend worden via een chromatografie. We zetten de absorbantie uit op een tijdsdiagram. Op een tijdstip t is er een piek van een bepaald aminozuur die we dan kunnen onderzoeken. Dat wordt machinaal gedaan. Eén cyclus duurt al een uur en peptiden van maximaal 50 aminozuren kunnen hiermee onderzocht worden. 1 picomol is echter al voldoende om het proteïne te kunnen onderzoeken. Helaas is de verwijdering van het N- terminaal aminozuur nooit volledig en wordt het staal na elke cyclus meer onzuiver. Peptiden groter dan 50 aminozuren worden daarom opgesplitst in kleinere stukken en apart verwerkt. Die fragmentatie kan chemisch (met cyanogeenbromide) of enymatisch, waarna de stukken chormatografisch opgezuiverd moeten worden. Door op verschillende plaatsen te knippen krijgt men overlappende stukken die dan samen een goed beeld geven van het oorspronkelijk peptide. Voor peptiden langer dan 1000 aminozuren of met een quaternaire structuur gebruiken we eerder de recombinant DNA technologie. We klonen dan het DNA dat codeert voor het proteïne en bepalen daaruit de aminozuursequentie. Problematisch hieraan is dat de posttranslationele modificaties niet worden gedetecteerd, terwijl deze vaak juist cruciaal zijn voor het functionneren van het eiwit. Immunologische technieken voor het bestuderen van proteïnen maken gebruik van antilichamen, antigenen en epitropen. Antilichamen of immuloglobulines zijn eiwitten die geproduceerd worden als antwoord op de aanwezigheid van een antigen. Deze zijn zeer specifiek voor het antigen en hebben er ook een hoge affiniteit voor. Een antigeen is een lichaamsvreemd eiwit. De groep aminozuren die herkend wordt door het antigeen noemen we het epitroop. Quinten Wouters 24 Immuuntechnologie hangt af van de mogelijkheid om antilichamen te produceren die specifieke eiwitten herkennen. Een biochemicus injecteert een konijn met het proteïne 2 keer met 3 weken tussen. De immuunrespons van het konijn is het produceren van antilichamen die het herkennen. Er wordt dan bloed afgenomen van het geïmmuniseerde konijn en gecentrifugeerd tot er enkel serum overblijft. Dat antiserum bevat dan de antilichamen. Er zitten echter nog veel andere antilichamen in die het eiwit niet of matig herkennen. We noemen de antilichamen polyclonaal omdat ze afgeleid zijn van verschillende antilichaam-producerende celpopulaties. Ze herkennen verschillende plaatsen op de oppervlakte van het antilichaam. Dat is handig voor proteïnes die in kleine hoeveelheden aanwezig zijn. Doordat ze op meerdere plaatsen gebonden kunnen worden door de antilichamen, zijn ze gemakkelijker te ontdekken. Het is echter niet erg handig voor het interpreteren van data van biochemisch onderzoek. Monoclonale antilichamen zijn veel handiger. Ze worden geproduceerd door het isoleren van een specifieke antigen-producerende cel. De antigen-producerende cellen van dieren zijn echter kortlevend. Daarom worden ze gehybridiseerd met multiple myeloma (kanker) cellen. De cellen uit het konijn worden nu gehybridiseerd met de myeloma cellen en dan wordt een cultuur gegroeid die het antigen in massa produceert. Antilichamen die zo bekomen zijn kunnen worden gebruikt voor opzuivering van minder voorkomende proteïnen door affiniteitschromatografie, detectie van proteïnen via ELISA en Western Blotting, kwantificatie van proteïnen via ELISA en visualisatie. Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay of ELISA is een assay techniek om proteïnen in een oplossing te detecteren en te kwantificeren. Er wordt gebruik gemaakt van een antilichaam met daaraan een covalent gebonden enzym. Dat enzym reageert met een kleurloos substraat tot een gekleurde oplossing die dan spectroscopisch onderzocht kan worden. Er zijn twee vormen van ELISA. Bij een indirecte ELISA wordt het antigen aangebracht op de wand van een beker. Dan wordt het specifieke antilichaam toegevoegd dat bindt op het eiwit. Dan wordt er enzym toegevoegd dat bindt met het antilichaam. Als laatste wordt substraat toegevoegd dat onder invloed van het enzym zal verkleuren. Tussen elke stap wordt de beker gewassen zodat enkel de gebonden moleculen overblijven. De snelheid waarmee de oplossing verkleurt is proportioneel tot de hoeveelheid antilichaam dat er bij gevoegd werd. Bij een sandwich ELISA zijn het de monoclonale antilichamen die op de wand worden afgezet, waarna antigen wordt toegevoegd en dan een ander monoclonaal antigen dat al gelinkt is met het enzym. Dan kan uit de absorbantie meteen de hoeveelheid antigen worden afgeleid dat toegevoegd werd. Quinten Wouters 25 Western blotting is de immunologische detectie van een specifiek proteïne op een gel. Het proces verloopt als volgt: 1) Het antigen wordt van andere proteïnen gescheiden via SDS-PAGE 2) De proteïnen worden overgezet op een membraan 3) Een antilichaam tegen het antigen wordt toegevoegd en reageert 4) Een tweede antilichaam tegen het eerste antilichaam wordt toegevoegd en reageert. Die laatste heeft een fluorescerende tag. Het eerste antilichaam reageert natuurlijk enkel met het gewenste eiwit en bindt daardoor op dat bandje. Daarna bindt het fluorescerende antilichaam op het eerste antilichaam op het bandje en kan het bandje gezien worden. Proteïnen kunnen dus gevisualiseerd worden door er een antilichaam met fluorescerende groep aan te hangen tot een resolutie van 2000 Å of ze kunnen gemerkt worden met goudpartikels voor een hogere resolutie van 100 Å met de elektronenmicroscoop. De 3D-structuur kan worden bepaald door twee technieken: - Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy: als het proteïne niet uitgekristalliseerd kan worden, sporen we de atoomstructuur op in een oplossing van magnetische nucleï. De naburige nucleï interageren dan, waardoor men informatie krijgt over de structuur. - X-ray diffractie: men kristalliseert eerst het proteïne uit, waarna ze bestraald worden door X-stralen uit een bron met de zelfde golflengte als de lengte van een covalente binding. Een filmdetector toont dan de structuur. Quinten Wouters 26 6. Ligandbinding door hemoglobine (7) Het lichaam heeft energie nodig die geleverd wordt door de afbraak van glucose. In aanwezigheid van zuurstof is die energiewinning 15 keer zo efficiënt. Eencelligen kunnen door hun grote lichaamsoppervlak in verhouding tot hun volume, de benodigde zuurstof uit de omgeving halen. Gewervelden hebben echter een vaatstelsel dat gebruik maakt van proteïnen om zuurstof te vervoeren en op te slaan. Hemoglobine vervuurt zuurstof in het bloed en is aanwezig op de rode bloedcellen. Myoglobine slaat de zuurstof op in de spieren. Leghemoglobine is aanwezig in de stikstofbindende wortelknolletjes van vlinderbloemigen. Alle drie de moleculen zijn erg gelijkaardig. Ze bestaan uit polypeptide(n) en een heemgroep waar de zuurstof tijdelijk bindt. Myoglobine bestaat uit één polypeptideketen met een heemgroep (Fe- protoporfyrine IX). Enkel het ijzerion in de heemgroep bindt de zuurstof. Het ijzerion is omringd en gebonden met de 4 imidazoolringen van de heemgroep en nog een vijfde keer met een proximale histidine. Omdat ijzer te groot is om binnen het heem te passen, ligt het licht uit het vlak. Door binding met zuurstof wordt het ion kleiner en past het wel binnen het heem. De zuurstofbinding moet zorgvuldig worden gereguleerd zodat er geen superoxide kan ontstaan. Superoxide-ionen zijn schadelijk en de geoxideerde vorm van het ijzerion (+III) kan geen zuurstof meer binden. Superoxiden ontstaan door de gedeeltelijke transfer van een elektron van ijzer naar zuurstof. Superoxiden worden voorkomen doordat het distaal histidine interageert met de zuurstof (H-brug). Hemoglobine (A) is een veel efficiëntere drager van zuurstof, met 90% van de capaciteit in tegenstelling tot de 7% van myoglobine. Hemoglobine bestaat uit 4 polypeptideketens als paar van 2 identieke dimeren die elk bestaan uit dezelfde α-helixstructuren als myoglobine. Er zijn dus ook 4 heemgroepen aanwezig. Op nevenstaande grafiek is te zien dat hemoglobine een lagere affiniteit heeft voor zuurstof dan myoglobine. Terwijl de bindingscurve van myoglobine een normaal chemisch evenwicht aantoont, is de curve van hemoglobine sigmoïd. Dat betekent dat hemoglobine een coöperatieve binding maakt met zuurstof. Daardoor wordt bij binding van zuurstof op 1 subeenheid, de binding op de andere subeenheden vergemakkelijkt. (analoog voor afgifte) Dat is belangrijk omdat hemoglobine de zuurstof van de longen met een hoge zuurstofdruk naar de weefsels met lage zuurstofdruk transporteert. Door de vergemakkelijking van de afgifte van zuurstof kan hemoglobine een grotere capaciteit afstaan aan de weefsels. Daarom is het een beter transportmolecule dan myoglobine waarvan de bindingsaffiniteit voor zuurstof te groot is (zie grafiek). Quinten Wouters 27 Bij inspanning is er een zeer lage zuurstofdruk in de actieve weefsels doordat alle zuurstof er opgebruikt wordt. Hemoglobine geeft in de weefsels die in rust zijn maar een kleine hoeveelheid van haar capaciteit af omdat het drukverschil er niet zo groot is. In de actieve weefsels is er echter wel een zeer groot verschil in druk, waardoor de resterende zuurstof daar zeker zal worden afgegeven. De zuurstof wordt dus enkel overgedragen aan de weefsels met de grootste nood. We bespreken nu de coöperatieve binding. Bij binding van zuurstof aan hemoglobine draait het ene dimeer 15° t.o.v. het andere. Binnenin de dimeren zijn er daardoor maar enkele conformatiewijzigingen. De desoxy-vorm noemen we het T-(tense)-stadium en is erg rigide door sterke subeenheidinteracties. Wanneer zuurstof dan bindt roteren de dimeren en komt het complex in het R-(relaxed)-stadium. De bindingsplaatsen kunnen zuurstof dan met een hogere affiniteit binden. Binding van zuurstof op een plaats zal de bindingsaffiniteit op de andere plaatsen beïnvloeden door de overgang van T naar R (of analoog voor afgifte van zuurstof van R naar T). Er zijn 2 coöperatieve modellen voor deze omzetting. Het geconcerteerd model toont dat alle subeenheden van hemoglobine zich óf in R- stadium óf in het T-stadium bevinden. Wanneer er geen zuurstof gebonden is, gaat de voorkeur uit naar het T-stadium, als er meer zuurstof gebonden is, neigt het molecule zich in het R- stadium te bevinden. Er is dus altijd een evenwicht tussen moleculen in R- en T-stadium. Het sequentieel model zegt dat het binden van zuurstof op een bepaalde subeenheid de conformatie van die subeenheid verandert en dat die verandering zelf veranderingen induceert in naburige subeenheden zodat de bindingsaffiniteit daar toe- of afneemt. Er is dus geen volledige conversie van T naar R of omgekeerd. De combinatie (coöperativiteit) van de grafieken van beide modellen geeft de actuele curve. De binding van zuurstof brengt het ijzer in verplaatsing en zorgt er voor dat het proximaal histidine naar de porfyrine-ring wordt gebracht. De α-helix waaraan die histidine verbonden is verandert dan het contactoppervlak tussen de dimeren, waardoor een draaiing ontstaat. Het T-stadium wordt gestabiliseerd door 2,3-bisfosfoglyceraat tot er genoeg zuurstof gebonden is voor omzetting naar de R-vorm. Het molecule bindt in het midden van het complex, tussen de 4 subeenheden. We noemen 2,3-bisfosfoglyceraat een allosterische factor, het is nodig voor de omzetting van de T naar de R vorm en dus voor de verandering van sterische configuratie. Foetaal hemoglobine (F) is verschillend in samenstelling. De αβ-dimeren zijn vervangen door αɣ-dimeren. Het ɣ- monomeer is 72% identiek met β maar his 143 is vervangen door ser, waardoor de bindingsplaats voor 2,3- bisfosfoglyceraat een veel lagere affiniteit heeft. De affiniteit voor zuurstof stijgt daardoor en dus wordt zuurstof efficiënt overgedragen van moeder naar foetus. Quinten Wouters 28 Koolstofmonoxide bindt 200 keer sterker aan hemoglobine dan zuurstof en vormt carboxy- hemoglobine. De binding van 1 molecule CO op 1 subeenheid zal de verzadigingsdruk voor zuurstofbinding verhogen en het evenwicht naar de R-vorm verschuiven. Zuurstof van de andere drie subeenheden blijft daarom zodanig sterk gebonden dat het niet meer wordt afgegeven aan andere weefsels. Een CO-vergiftiging kan worden behandeld met een hyperbare (hogedruk) zuurstoftherapie. Ook de pH van de weefsels heeft ene invloed op de capaciteit van hemoglobine. CO2 en H* zijn allosterische effectors in metabolisch actieve weefsels. Wanneer vanuit de longen (pH 7,4 en 100 torr zuurstofdruk) bloed wordt getransporteerd naar weefsels met pH 7,2 en 20 torr druk, wordt 77% van de bindingscapaciteit vrijgegeven i.p.v. 66%. Het Bohr-effect: In deoxyhemoglobine vormt de COO--groep van β1his146 een zoutbrug met α2lys40 waardoor de eerste in de positie komt om nog een zoutbrug te vormen met β1asp94 als ze tenminste geprotoneerd is. Daardoor wordt het T-stadium gestabiliseerd waardoor zuurstof gemakkelijker wordt vrijgegeven. CO2 kan de rode bloedcel binnenkomen en de pH doen dalen door zuur te vormen in de reactie met water. Die pH-daling stabiliseert het T-stadium. In een tweede mechanisme kan CO2 deoxyhemoglobine stabiliseren door de vorming van carbamaatgroepen op NH2-uiteinden die op het contactoppervlak van twee dimeren liggen. De negatieve lading van die carbamaatgroep participeert in zoutbrugingeracties, stabiliseert de T-vorm en stimuleert de afgifte van zuurstof. Door de aanwezigheid van CO2 is het transport van zuurstof naar de weefsels veel efficiënter. Hiernaast nog een afbeelding van het mechanisme voor CO2-transport van de weefsels naar de longen. Er kunnen echter ook mutaties optreden aan de rode bloedcellen. Sikkelcelanemie is een ziekte waarbij rode bloedcellen een abnormale vorm krijgen. Er vormen zich daardoor lange vezelachtige aggregaten van hemoglobine waardoor er zich slechtere bloedsomloop, risico’s op bloedinfecties, bloedklonters en bloedarmoede kunnen voordoen. De ziekte ontstaat doordat glu6 in de β- subeenheid door mutatie wordt vervangen door val6. De desoxyvorm van hemoglobine S heeft een sterk verminderde oplosbaarheid. Doordat leucine in de desoxy-vorm in het T- stadium aan e oppervlakte licht, interageert ze met andere aminozuren van naburige moleculen en kunnen er aggregatie gevormd worden van tot 14 eenheden hemoglobine S lang. In de oxy-vorm is er geen verandering omdat leu dan onder de oppervlakte ligt. Sikkelcellen ontstaan dus wanneer de rode bloedcellen door zuurstofarme capillairen passeren. Sikkelcelanemie is een recessief gen. Mensen met 1 allel HbB en 1 allel HbS hebben aanleg voor sikkelcelanemie, maar zijn resistent tegen malaria. Thalassemie is de onevenwichtige productie van 1 van de monomeren en geeft ook verschillende complicaties. Quinten Wouters 29 7. Enzymkinetiek (8) Enzymen zijn katalyserende moleculen die onveranderd uit de reactie komen, maar ze wel versnellen. Het reactie-evenwicht wordt daarbij niet veranderd, ze kunnen er echter wel voor zorgen dat er minder of geen nutteloze bijproducten gevormd worden. Het zijn bijna altijd eiwitten en ze zijn erg specifiek voor bepaalde reagentia (substraten) en zelfs voor de stereochemie van dat substraat. De ‘sterkte’ van een enzym bepalen we aan de hand van het omzettingsgetal: het aantal mol omgezet substraat per seconde per mol toegevoegd enzym. Sommige enzymen hebben cofactoren nodig om te functioneren. Dat kunnen essentiële ionen of co-enzymen zijn. Een inactief enzym in haar eiwit-vorm, noemen we een apoenzym. Het kan reageren met een cofactor ter vorming van een actief holoenzym. Veel vitaminen vormen een precursor van een co-enzym. Enzymen worden opgedeeld in 6 klassen: 1) Oxidoreductasen of dehydrogenasen katalyseren oxidatie-reductie reacties. 2) Transferasen katalyseren de transfer van een chemische groep. 3) Hydrolasen katalyseren hydrolyse-reacties met water als acceptor van de getransfereerde groep. 4) Lyasen katalyseren substraatlysis. Er wordt een dubbele binding gegenereerd in een niet- hydrolytische eliminatiereactie. Synthasen katalyseren de additie van een dubbele binding en doen de omgekeerde reactie van een lyase. 5) Isomerasen katalyseren isomerisatie reacties en veranderen dus de stereochemie van het substraat. 6) Ligasen of synthetasen katalyseren ligatie of de verbinding van twee substraten, waarbij ze chemische energie verbuiken (ATP). Enzymen worden ook geklassificeerd a.h.v. een nummer. Het eerste cijfer is de enzymklasse. The tweede stelt het soort molecule voor waarop het inwerkt (bijvoorbeeld elektronendoner = 1). Het derde cijfer geeft verdere toelichting over het enzym (bijvoorbeeld elektronenacceptor = 1) en het 4-de cijfer is het volgnummer. Zo is EC 1.1.1.1 een oxidoreductase dat met CH-OH, een elektronendonor, reageert, gebruik maakt van NAD+ of NADH+ als elektronenacceptor en het volgnummer toont ons dat het alcohol dehydrogenase is. De verandering is vrije energie bepaalt de spontaneïteit van een reactie. Als de vrije energie verandering negatief is, verliest het systeem energie en gaat de reactie spontaan op. We noemen de reactie dan exergonisch. Als energie het systeem moet binnengepompt worden voor de reactie kan omgaan, en de vrije energie verandering positief is, noemen we de reactie endergonisch. Er wordt echter geen informatie gegeven over de snelheid van de reactie. [C][D] ΔG = ΔG° + RT ln De reactiesnelheid wordt bepaald door de activatie-energie. Enzymes [A][B] hebben geen invloed op het chemisch evenwicht van een reactie, maar ze verlagen de activatie-energie waardoor de reactiesnelheid stijgt. Enzymen positioneren de substraten op de juiste manier voor de reactie (substraatbinding) en kunnen de transitietoestand binden dan het substraat, waardoor de activatie-energie verlaagd wordt. Op een Boltzmann-verdeling kan men dan ook aflezen dat bij lagere activatie-energie er meer moleculen de reactie kunnen aangaan. Quinten Wouters 30 De eerste stap in een ezymatische reactie is de vorming van het enzym- substraat complex (ES). Hiernaast een afbeelding van het enzym cytochroom dat het substraat volledig omgeeft en als cofactor een heemgroep heeft. Het substraat bindt het enzym op de actieve plaats. Soms hebben het enzym en het substraat een complementaire vorm. We noemen het complex dan een ‘lock-and-key’ model. Het substraat kan echter ook een fit induceren bij een enzym dat eerst niet, maar na binding wel complementair is. Dat noemen we een ‘induced-fit’ model. Een actieve plaats is een driedimensionale gleuf die maar een klein deel van het enzymvolume inneemt. Er is in die gleuf een unieke micro-omgeving aanwezig die een zwakke binding met het substraat kan aangaan. De specificiteit hangt af van de specifieke schikking van de atomen in de actieve plaats. De meeste aminozuren van het enzym (100+) komen dus niet in contact met het substraat. Ze hebben een regulatorische plaats of vormen kanalen om het substraat naar de actieve plaats te brengen. De actieve plaats is meestal apolair om het water af te stoten. De enkele polaire aminozuren die wel aanwezig zijn in de actieve plaats hebben eigenschappen voor substraatbinding of katalyse. Die substraatbinding kan een elektrostatisch binding (-6 kJ/mol), een waterstofbrug (-(4-20) kJ/mol) of een Van der Waals interactie (-(2-4) kJ/mol) zijn. Een covalente binding (-(210-460) kJ/mol) is veel te sterk, waardoor het substraat niet kan loskomen. De Van der Waals interacties worden vooral belangrijk wanneer het substraat dicht bij het enzym komt. Er vormen zich dan erg veel bindingen op korte afstand. Als we de productconcentraties bij verschillende substraatconcentraties in functie van de tijd te plotten, kunnen we de initiële reactiesnelheid berekenen door de raaklijn aan het begin van de curve te maken. De vergelijking voor een ketalytische reactie gaat als volgt: Hierbij zijn k1 en k-1 de snelheidsconstanten voor de snelle associatie/dissociatie van het substraat op de actieve plaats van het enzym. Dan is k2 de snelheidsconstante voor de vorming van het product uit het enzymatisch complex. Er gelden de volgende snelheidsvergelijkingen: v = k2 [ES] (1e orde) v = k-1 [ES] (1e orde) v = k1 [E][S] (2e orde) De Michaelis-Menten voorstelling is een grafiek die de initiële reactiesnelheid uitzet in functie van verschillende substraatconcentraties. Uit de grafiek kan de initiële reactiesnelheid voor elke beginconcentratie berekend worden a.h.v. de Michaelis- Menten vergelijking: [S] met KM de Michaelis- v0 = vmax constante die af te lezen K M + [S] is in de grafiek. Op de grafiek zien we ook dat bij hoge [S], deze geen invloed meer heeft op de reactiesnelheid (alle actieve centra zijn immers al bezet). De volledige afleiding van de Menten-vergelijking vindt je HIER. (klik op de link) Quinten Wouters 31 Een tweede voorstelling is de Lineweaver-Burk grafiek, die een aantal interessante punten bevat. 1 ⎛ KM ⎞ ⎛ 1 ⎞ 1 =⎜ ⎟ ⎜ ⎟ + v ⎝ vmax ⎠ ⎝ [S] ⎠ vmax Als derde is er de Eadie-Hofstee voorstelling, die ook nuttige informatie oplevert: v v = vmax − K M [S] Deze waarden hebben ook hun betekenis. Hoe lager de KM, hoe sterker de substraatbinding, waardoor het dus een maat is voor de affiniteit van het enzym voor een substraat. De maximale reactiesnelheid vmax bepaalt het ‘turnover’ getal (kcat) van een enzym. Dat zijn het aantal moleculen van het substraat omgezet in product door 1 enzymmolecule per tijdseenheid bij volledige substraatverzadiging van het enzym. kcat = vmax/[E]T De kcat is een eerste orde snelheidsconstante voor de omzetting van ES naar E+P. Bij lagen concentraties [S] is de verhouding kcat/KM een tweede orde snelheidsconstante voor E+S —> E+P en ze is ook een maat voor enzymspecificiteit voor een substraat. (specificiteitsconstante) De reactiesnelheid wordt gelimiteerd door de diffusie van substraat uit de actieve plaats. We hebben tot nu toe enkel enzymatische reacties met één substraat bekeken. Voor reacties met meerdere substraten zijn een een aantal mogelijkheden. De substraten kunnen in verschillende volgorde met het enzym binden. Om die volgorde weer te geven, gebruiken we een Cleland- notatie. Bij een geordende sequentiële reactie moeten alle substraten eerst binden aan het enzym, vooraleer een product wordt vrijgegeven. Bij een niet-geordende sequentiële reactie is de volgorde van het aanhechten van de substraten willekeurig. Bij een dubbele verplaatsing of ping-pong reactie worden 1 of meer producten vrijgegeven vooraleer alle substraten gebonden zijn aan het enzym. Het enzym is daardoor tijdelijk gemodificeerd. (vorming van een gesubstitueerd enzym intermediair) Quinten Wouters 32 Allosterische enzymen zijn een groep van enzymen die de Michaelis-Menten kinetiek niet volgen. Wanneer een Michaelis-Menten grafiek wordt uitgezet, vertoont het enzym een sigmoïdale curve. Dat komt omdat allosterische enzymen vaak meerdere subeenheden en actieve plaatsen bezitten. De conformationele verandering door substraatbinding aan één subeenheid kan de eigenschappen van de andere actieve plaatsen beïnvloeden. Net zoals bij ligandbinding bij hemoglobine is de substraatbinding hier een coöperatief proces. Dat kan ook zijn voorde