Bactériologie générale - Taxonomie et Structure Bactérienne PDF

Bactériologie générale Taxonomie Définitions : Taxonomie = Lois de la classification : l’ensemble des principes qui permettent de classer et de valider le classement des organismes, science de la délimitation des groupes, consiste en l’identification, la...

Bactériologie générale Taxonomie Définitions : Taxonomie = Lois de la classification : l’ensemble des principes qui permettent de classer et de valider le classement des organismes, science de la délimitation des groupes, consiste en l’identification, la classification et la nomenclature des organismes Identification : assimiler une bactérie à une espèce déterminée en fonction des caractères communs Classification : attribution d’une identité à une bactérie après études taxonomiques et selon des règles appelées nomenclature Phylogénie : science de l’évolution génétique dans le temps d’un organisme Principaux niveaux de classification : Unité de la classification = espèce : un groupe d’individus qui possèdent un degré de similitude phénotypique associé à une importante dissemblance avec d’autres groupes d’un type semblable A l’intérieur de l’espèce, il peut exister des variants qui se différencient de l’espèce-type par des caractères mineurs n’entrant pas dans la définition de l’espèce : Biochimique : biovar Antigénique : sérovar, sérotype Pathologique : pathovar Enzymatique : zymovar Sensibilité à un bactériophage : lysovar Sensibilité aux antibiotiques : antibiotype Clone : descendance d’une même cellule bactérienne = souche Colonie : multiplication d’une cellule bactérienne sur gélose Méthodes de classification : Classification phénotypique : Regroupant les bactéries suivant la similitude de leurs caractères phénotypiques Les plus accessibles et les plus utilisés Classification génotypique Classification phénotypique Classification génotypique Critères morphologiques : forme et Objectifs : groupement des bactéries, présence de Détermination des groupes génomiques flagelle, nature de la paroi, type de Détermination des filiations (évolution) par mobilité, présence endospore études phylogéniques Tests biochimiques : Méthodes : ✓ Critères physiologiques (type Etude du génome complet : métabolique, source d’énergie, de ✓ Composition en bases de l’ADN : % carbone, d’azote, substrat utilisé, ✓ guanine + cytosine capacité à produire certaines molécules, ✓ Hybridation ADN/ADN total  produits de fermentation, métabolites ✓ Mesure de la température de fusion secondaires…) ✓ (Tm) de l’ADN ✓ Critères de pathogénicité ✓ Polymorphisme de restriction de l’ADN total ✓ Critères antigéniques ✓ Séquençage du génome complet Analyses structurales de molécules : Etude d’une portion du génome : chimiotaxonomie : analyse chimique des ✓ Polymorphisme d’une portion d’ADN total constituants cellulaires ✓ Séquençage des ARN ribosomiques ou séquençage des gènes codant les ARNr Structure bactérienne Définitions : Bactérie : organisme unicellulaire de petite taille (micromètre) de structure relativement simple, de formes différentes, doués d’un pouvoir de multiplication autonome et qui présente des caractéristiques propres (procaryote : être vivant unicellulaire ne comportant pas de noyau) Procaryote : Paroi caractéristique (sauf Mycoplasmes et Uréaplasmes) Dépourvues d’organites (sauf ribosomes) Sans vrai noyau (pas de chromatine ni de membrane) Génome haploïde sous forme d’une unique molécule d'ADN généralement circulaire Division par scissiparité L'étude de la morphologie bactérienne est le premier acte diagnostique bactériologique Trois critères morphologiques : Taille : variable de 0,1 à 600 µm Forme : sphérique, cylindrique et spiralée Mode de groupement : chaîne, amas, palissade Structure générale d’une bactérie : On distingue : Des structures obligatoires : présentes chez toutes les bactéries Des structures facultatives  Structures obligatoires Structures facultatives Le cytoplasme Polysaccharides de surface : enveloppes Les ribosomes : 66% d’ARN ribosomal et supplémentaires plus ou moins structurées 33% de protéines, composés de deux sous- Capsule : unités, lieu de traduction du code génétique ✓ Vraie : structure bien organisée, Les inclusions : renferment des matières condensée et bien délimité autour de la organiques ou inorganiques constituant des bactérie, facteur de virulence, substances de réserve antigénique (les antigènes capsulaires Appareil nucléaire : chromosome unique sont dénommés antigène K) circulaire de 1 mm, ADN bicaténaire ✓ Diffuse/biofilm/slime : glycocalyx : Membrane cytoplasmique : identique à constituants polysaccharidiques, permet celle des eucaryotes, transport actif, l'adhésion bactérienne à des surfaces réactions énergétiques, systèmes assurant inertes l’excrétion vers l’extérieur de différentes Couche de surface cristalline : chez les Gram substances (+) la couche S en périphérie du PG et chez Paroi bactérienne : structure la plus externe, les Gram (-) associée à la ME constante à l’exception des mycoplasmes Flagelles/cils : naissent de la membrane cytoplasmique, permettent la mobilité des bactéries. AG des flagelles = AG H NB : D'une manière générale, la mobilité s'observe chez les bacilles Fimbriae (Pili communs) : visible au ME, structures filiformes, non impliquées dans la mobilité, très communs chez les Gram (-) Rôle : pouvoir pathogène, facteurs de virulence, utiles pour l'adhésion des bactéries aux interfaces et particulièrement aux muqueuses, adhésion bactérie – bactérie et propriétés hémmaglutinantes Pili sexuels : plus longs, peu nombreux (1 à 4), relient deux bactéries et sont les voies d'échanges de matériel génétique : la conjugaison Endospore : se forme au sein du cytoplasme pour résister à des conditions de vie défavorables, certaines Gram (+) (Bacillus, Clostridium) sont capables de former des endospores Les plasmides : molécules d’ADN bicaténaires, circulaires, extra- chromosomiques, réplication autonome (réplicon) et transmissibles de façon stable à la descendance, pouvant être transmis sur un mode horizontal Rôle : informations génétiques supplémentaires non indispensables (propriétés métaboliques, pouvoir pathogène, résistance aux ATB) Selon la composition et la structure, deux groupes de bactéries sont décrits, les Gram (+) et les Gram (-) : Paroi des bactéries à Gram (+) Paroi des bactéries à Gram (-) Structure apparaît homogène et Structure complexe et peu épaisse 10 épaisse de 10 à 80 nm nm Composée essentiellement de Composée de : Peptidoglycane (mince) peptidoglycane (épais) associé à l’acide et d’une membrane externe (protéines, téichoïque, mais pauvre en lipides lipides, lipopolysaccharides) Particularités des Mycobactéries : ✓ Traversée par des porines Gram (+) à paroi très riche en AG ✓ Ancrée au peptidoglycane par complexes dont les acides mycoliques : lipoprotéines et protéine OmpA acido-alcool résistance ✓ Lipopolysaccharides jouent un rôle d’endotoxine Espace périplasmique = entre MC et ME Rôle de la paroi bactérienne : Confère à la bactérie sa morphologie véritable Résistance : ✓ Maintient la pression osmotique et les constituants ✓ Protège contre les agressions physico chimiques ✓ Blocage de l’extraction de certains colorants Echanges : ✓ Contrôle la diffusion des molécules en fonction de leur taille, degré d'hydrophobicité... : rôle de membrane semi perméable ✓ Assure le captage des nutriments importants ✓ Effectue le rejet des composés nocifs dans le milieu extérieur : pompes d'efflux Spécificité antigénique : antigène somatique O Activation du complément : effet chimiotactique et opsonisant (rôle important dans la défense non spécifique contre l'infection) Cible de l’action : ✓ D’enzymes exogènes (lysozyme) ou endogènes (autolysines) ✓ Antibiotiques, notamment les bêtalactamines (pénicillines) inhibent la synthèse du peptidoglycane (PLP=transpeptidases) NB : Elle n'est pas une structure figée, mais elle est continuellement en synthèse (et dégradation) Peptidoglycane : Peptidoglycane : un hétéropolymère composé de chaînes glucidiques reliées les unes aux autres par des chaînons penta peptidique La synthèse du PG se fait en trois étapes : intracytoplasmique, membranaire et pariétale Méthodes d’études : Microscope électronique : Mettre en évidence trois régions architecturales : Cytoplasme avec le génome cellulaire (ADN), ribosomes et inclusions Une enveloppe qui consiste en une paroi et une membrane plasmique Des structures externes : capsule, cils, flagelles et fimbriae Microscope optique : État frais : Permet d’avoir une idée sur la forme et la mobilité Après coloration : ✓ Met en évidence les affinités tinctoriales et précise la forme des bactéries ✓ Différents colorants sont utilisés : Gram, Bleu de méthylène, Ziehl-Neelsen (BAAR), l’imprégnation argentique… Fractionnement des bactéries puis séparation par techniques physicochimique Génétique bactérienne Spécificités génétiques des bactéries : Haploïdie : une copie (Allèle) de chaque gène, expression facile des mutations Temps de génération court : expérimentation facile Reproduction asexuée : par division cellulaire, obtention facile de clones ADN bactérien : Chromosome (indispensable) Plasmides (facultatifs) Unique (exceptions) Petits Circulaire Multiples Taille : 1 mm Circulaires Différents niveaux d’expression Le chromosome bactérien : ✓ Taille très variable 6x105bp à 109bp ✓ Pas d’introns ✓ ARN messagers polycistroniques : possède plusieurs codons d’initiation et codons-stop sur un même ARN qui permet la synthèse de plusieurs protéines à partir du même ARN Stabilité des espèces assurée par : ✓ Réplication chromosomique ✓ Transfert aux bactéries filles ✓ Réparation des erreurs ✓ Enzymes bactériens : restriction / modification Caractéristiques des plasmides Rôles des plasmides ✓ ADN à double brin, circulaire, A l’origine de la multirésistance : cytoplasmique douées de réplication Croisée : au sein d’une même autonome et de taille variable famille ✓ Médiateurs de propriétés permettant Associée : familles différentes une meilleure adaptation des bactéries, Co-transfert et co-sélection de ces gènes non indispensables au métabolisme normal de la cellule-hôte ✓ Transmission naturelle d'une cellule à l'autre s'effectue par conjugaison, les autres modes de transfert sont possibles ✓ Sans spécificité d’hôte : diffusion entre espèces bactériennes différentes Les mécanismes de plasticité du génome bactérien :  Mutation : Modification de l’ADN, donc de la séquence désoxyribonucléotidique, entrainant quelquefois une modification de la structure primaire de la chaine polypeptidique correspondante (1 base changée peut entrainer un 1 aa changé) S’exprime si : Nouveau codon = nouvel aa et site actif touché Si non silencieuse ou léthal (le plus fréquent) Caractères de la mutation : Spontanées : Seule est provoqué la sélection des formes variantes préexistantes dans une population bactérienne (cas de ATB) Induites : UV ou de substances chimiques génotoxiques Discontinues ou brusque : apparait selon la loi du tout ou rien Stables : transmissible à la descendance Rares : mesurable par le taux de mutation (probabilité pour une bactérie de muter pendant une unité de temps définie (temps de génération). Il est de l'ordre de 10-5 à 10-10 Spécificité - Indépendance : la probabilité pour une bactérie de subir simultanément deux mutations distinctes est le produit des probabilités individuelles de ces mutations NB : En apparence, la présence de l’antibiotique est suivie de l’apparition de mutants résistants Acquisition de matériel génétique : Transformation bactérienne Conjugaison ou sexualité bactérienne Transduction Transfert d’ADN libre, qui est fixé Transfert de gènes par contact Transfert d'ADN bactérien partiel, et absorbé par des bactéries cellulaire par l'intermédiaire de réceptrices, dites en état de Processus sexuel strict qui nécessite bactériophages (Virus spécifique compétence un contact préalable et un des bactéries) dont le rôle est Il doit y avoir de l'ADN libéré appariement entre bactéries de ‘’sexe passif (vecteur) d'une bactérie différent’’ avec la formation d'un pont Le bactériophage est virulent et (exogénote). Celui-ci doit être fixé cytoplasmique permettant les se multiplie dans la bactérie sur une bactérie réceptrice en échanges bactériens dont celui du Lors de la phase d'encapsidation, phase de compétence. chromosome il incorpore de l'ADN bactérien L’absorption d'ADN polymérisé Le facteur de sexualité ou de fertilité fragmenté est suivie de recombinaison (F) est un plasmide conjugatif permet Caractéristiques : génétique avec acquisition de la synthèse de pilis sexuels chez la ✓ Incidence : nombreuses nouveaux caractères génétiques bactérie donatrice ou mâle et donne souches lysogènes stables (recombinants ou la polarité au chromosome ✓ Types : Trois variantes transformants) Le transfert d'ADN chromosomique conditionnent les autres Ce transfert d'ADN bactérien est est à sens unique, orienté, progressif caractères tels : ✓ Limité à quelques espèces : et quelquefois total (2h) La spécificité du ou des Streptococcus, Neisseria, Caractéristiques : caractères transduits Haemophilus ✓ Permet le transfert de gènes La fréquence de ✓ Partiel : une partie de chromosomiques ou transduction l'exogénote (1-2% du plasmidiques Existe chez les génome) pénètre et se bactéries à Gram (+) et à Gram (-)  recombine (si homologie ✓ Importance majeure dans la La recombinaison suffisante) dissémination des gènes de génétique ou non Conséquences : résistance ✓ Émergence d'espèces ✓ Principal facteur d'évolution des résistantes aux ATB : bactéries, en particulier pour pneumocoque, l'acquisition de la résistance aux méningocoque (transfert de ATB gènes de streptocoques ✓ Le transfert d'ADN buccaux mutants résistants) chromosomique suivi de ✓ Une application « bénéfique recombinaison est spécifique » : nombreuses utilisations en (intra espèces), mais limité, en biotechnologies : clonage particulier aux espèces à Gram (-) Mécanismes de mobilité des gènes au sein d’une cellule : Transposons : éléments d’ADN qui peuvent se déplacer d’un endroit à un autre sur un même brin d’ADN ou sur un autre brin Séquences d’insertion : éléments transposables les plus simples Intégrons : Retrouvés exclusivement chez les bactéries, système naturel de capture, d’expression et dissémination de gènes Physiologie bactérienne Principaux éléments de la physiologie bactérienne : Besoins nutritifs des bactéries : Source d’énergie Sources de carbone Composés minéraux ou organiques : Bactérie autotrophe : CO₂ exclusivement bactérie chimiotrophe Bactérie hétérotrophe : CO₂ ou substances Élément minéral : bactérie hydrocarbonées (alcool, acide acétique, chimiolithotrophe acide lactique, sucres divers…) Élément organique : bactérie chimioorganotrophe Lumineuse : bactérie phototrophe Source d’azote et de soufre L’O2 et l’H2 : apportés par l’eau et par l’aire Autres éléments : besoins inorganiques, ions, oligoéléments, facteurs de croissance (auxotrophe) Pénétration des nutriments dans les bactéries : Tous les nutriments doivent traverser la paroi bactérienne puis la membre cytoplasmique grâce à des protéines de transports et la diffusion libre (petit nombre de molécules) La sortie des métabolites : même mécanismes ou lors de la lyse bactérienne Conditions environnementales : Le pH : certaines bactéries se développent à pH ✓ Entre 6 et 8 bactéries neutrophiles (Escherichia coli) ✓ pH alcalin (>8) bactéries alcalinophiles (Pseudomonas) ✓ pH acide ( 80°C Exigences gazeuses : Quatre modes respiratoires : ✓ Aérobies strictes (exemple : Pseudomonas) nécessitant une teneur en oxygène moléculaire suffisante pour pouvoir se multiplier ✓ Micro-aérophiles (exemple : Campylobacter) se développant si lorsque la teneur en oxygène moléculaire est réduite (5%) ✓ Aéro-anaérobies facultatives (exemple : Escherichia coli) : la croissance n’est pas affectée par la concentration en oxygène moléculaire ✓ Anaérobies stricts ne se développant qu’en absence d’oxygène (exemple : Clostridium) Croissance bactérienne : Les milieux de culture : supports nutritifs stériles qui permettent la croissance bactérienne Milieux complexes de réalisation empirique (extraits de viande, de levure, extraits enzymatiques, protéines ou peptones) Milieux synthétiques de composition définie Milieux semi-synthétiques Milieux d’enrichissement : permettent la croissance des bactéries exigeantes Milieux sélectifs : favorisent la croissance d ’un type bactérien particulier tout en inhibant celle des autres types bactériens Liquides : bouillons de culture en tubes ou en flacons Solides : milieux gélosés en boîte de Pétri Les bactéries : organismes asexués dont la reproduction a lieu par division cellulaire ou reproduction binaire encore appelée scissiparité. La reproduction se fait selon trois phases : Allongement de la bactérie Duplication des constituants Séparation Temps de division et délais de croissance dépendent de l’espèce bactérienne et des conditions du milieu extérieur Dynamique de la croissance bactérienne : Phase 1 : 2-3 h phase de latence, la croissance est nulle, il y a accoutumance des bactéries à l’environnement Phase 2 : phase d’accélération avec augmentation de la vitesse de croissance Phase 3 : phase de croissance exponentielle durant laquelle le taux de croissance est maximal  Phase 4 : phase de ralentissement : la vitesse de croissance diminue, épuisement des nutriments du milieu de culture et accumulation des déchets Phase 5 : phase stationnaire : arrêt de la reproduction due à un facteur limitant dans l’environnement, le taux de croissance est nul Phase 6 : phase de déclin : les ressources sont épuisées et le nombre de bactéries diminue Métabolisme bactérien : Ensemble des transformations des composés biochimiques de la cellule bactérienne Réactions de récupération et de transfert d’énergie obtenues à partir des nutriments Energie utilisée pour la croissance et l’édification des structures cellulaires Transfert d’énergie grâce à des molécules contenant des liaisons riches en énergie : ATP… Deux modes principaux de production d’énergie : métabolisme respiratoire et métabolisme fermentatif Recherche de l’apparition d’un produit ✓ Acide : virage d’indicateur coloré ✓ Nitrate réductase : disparition des nitrates et apparition des nitrites Recherche de l’enzyme elle même Implications lors de l’examen bactériologique : Phase pré-analytique : Conditions de prélèvements : ✓ Avant traitements antibiotiques ou antiseptiques ✓ Au cours d’une décharge bactérienne, cas des hémocultures ✓ Parfois prélèvements répétés Conditions de transports : ✓ Milieux de transport ✓ Environnement de transport ✓ Délai de traitement du prélèvement Phase analytique : L’identification phénotypique des bactéries repose sur l’étude de : Morphologie Exigences nutritives Croissance en présence de divers substrats Conditions physicochimiques de croissance Type respiratoire et présence d’enzyme respiratoire (oxydase, catalase) Etude du métabolisme bactérien (métabolisme protéique, glucidique, lipidique) La combinaison des différents résultats = profil métabolique de la bactérie analysée ce qui permet de le comparer aux profils d’espèces type et d’identifier ainsi la souche étudiée Complément d’identification parfois : serotypie, lysotypie, toxinotypie, génotypie Autres implications :  Stérilisation Conservation des souches : froid, lyophilisation, congélation Microbiologie industrielle : ✓ Dosage microbiologique des vitamines et d’autres substrats ✓ Production d’enzyme, d’acides amines Relation hôte – bactérie Moyens de défense d’hôte : Barrières cutanéo-muqueuses : C’est la première ligne de défense, rôle primordial des épithéliums : niveau de la rencontre hôte – bactéries La peau La muqueuse Barrière physique : 2 couches, Barrière physique : rôle de mucus : épithélium stratifié, kératinisation, emprisonnement des bactéries à desquamation superficielle distance de surface des cellules Barrière chimique : inhibent la épithéliales et élimination des bactéries croissance bactérienne : pH acide, avec mucus sécheresse de la peau et T24H Identification : 24H Études de la sensibilité : 24H Détection antigénique voir toxinique : 1H Détection de gène : 2H à 24H L’examen direct :  L’examen clef de la microbiologie État frais  ✓ Cellules (hématies, leucocytes) ✓ Bactéries (forme / mobilité) Après coloration de frottis : coloration de Gram, autres…  Grande valeur d’orientation  Interprétation correcte : expertise du microbiologiste  Examen qualitatif ou semi quantitatif : données visuelles NB : Validité et utilité, dépend de la bonne qualité du prélèvement et de l’orientation clinique Interprétation des données de l’examen direct : Dépend du site prélevé et de la présence ou non sur ce site d’une flore microbienne physiologique S’il existe une flore résidente (prélèvements de fécès, cutanés, voies respiratoires supérieures) : Peu d’utilité de l’examen direct, sauf si présence d’une flore mono microbienne Dans un site normalement stérile : Il faut s’assurer de la qualité du prélèvement : absence de contamination par flore cutanée, digestive ou aérodigestive Examen direct positif même polymicrobien : grande valeur Les prélèvements de sites stériles réalisés à travers une flore riche : interprétation : Qualité de la décontamination : cas des prélèvements urinaires Les prélèvements respiratoires pulmonaires profonds doivent être protégés : LBA ou prélèvements distaux Pièges de l’examen direct : Dépôt de colorants, contamination des colorants Variabilité des formes et de la coloration NB : Toujours confronter les données de l’examen direct avec la clinique Identification : Délai, exigence et conditions de la culture Aspect macroscopique de la colonie Vérification de la morphologie et l’affinité tinctoriale au Gram Tests biochimiques d’orientation Les galeries biochimiques d’identification Le typage antigénique L’identification moléculaire ✓ Hybridation ✓ Amplification Identification par spectrométrie de masse (MALDI-TOF) Diagnostic indirect : les sérologies : Prélèvements : minimum deux à 10 – 15 jours d’intervalle Différentes méthodes Interprétation fonction de plusieurs éléments : ✓ La technique  ✓ Les antigènes ✓ La cinétique des anticorps La technique : ✓ Problème de sensibilité et spécificité : les plus sensibles (peu de faux négatifs) mieux pour un dépistage / les plus spécifiques (peu de faux positifs) mieux pour une confirmation ✓ Dans certaines cas, nécessité de mise en œuvre de plusieurs techniques, simultanément (syphilis) ou successivement Dans les réactions d’agglutination, une concentration d’anticorps trop élevée : saturation des sites antigéniques du réactif et empêcher l’agglutination : phénomène de zone Techniques immuno chromatographiques : ✓ Systèmes unitaires ✓ Réactifs sont fixés à l’état déshydraté sur un support (bandelette, filtre) ✓ Bonne sensibilité et une spécificité satisfaisante Toujours : sérums témoins positifs et négatifs qui valideront la qualité de la technique mise en œuvre L’antigène : ✓ L’antigène réactif n’est jamais pur ✓ Réactions croisées : résultats faussement positifs La cinétique d’apparition des anticorps : ✓ Latence puis apparition et élévation rapide des anticorps puis stabilisation ✓ Les IgM apparaissent les premiers lors d’une primo-infection. Ils disparaissent assez vite et sont remplacés par des IgG ✓ Comparaison des résultats sur deux sérums prélevés à 10 jours d’intervalle pour reconnaitre une infection actuelle Les défaillances du sérodiagnostic : ✓ Agents pathogènes incapables de stimuler une réaction immunologique décelable in vitro ✓ Sujets immunodéficients ✓ Sujet vacciné ou naturellement immunisé et réinfections : pic transitoire et titre des IgG difficile à interpréter Interprétation des sérologies : ✓ Tenir compte du contexte clinique et épidémiologique, de l’état immunologique du sujet concerné et du but de l’examen (diagnostic, suivi ou appréciation de l’état d’immunité) ✓ Maitriser la technique, et l’exécuter avec rigueur et réaliser des contrôles