Nanotossicologia PDF

Nanotossicologia LEZIONE 1: Definizione di nanotossicologia: branca della medicina che studia gli effetti avversi dei nanomateriali sulla salute umana. Definizione di nanoecotossicologia: studia gli effetti del rilascio dei nanomateriali nellʼambiente. Alcuni esempi di nanomateriali: Nanomateria...

Nanotossicologia LEZIONE 1: Definizione di nanotossicologia: branca della medicina che studia gli effetti avversi dei nanomateriali sulla salute umana. Definizione di nanoecotossicologia: studia gli effetti del rilascio dei nanomateriali nellʼambiente. Alcuni esempi di nanomateriali: Nanomateriali a base di C: fullereni, grafene, nanotubi di carbonio. TiO2 (diossido di titano): utilizzato soprattutto nella carta, plastica, cibo, medicine, cosmetici e creme solari perchè assorbe radiazioni nellʼUV. Ag: utilizzato in molte applicazioni mediche sfruttando le proprietà antimicrobiche, antibatteriche e antifungine, utilizzato ad esempio nei vestiti. LEZIONE 2: Classificazione dei nanomateriali: nanomateriali naturali: nanomateriali derivati da processi naturali generati ad esempio dalla combustione (incendi boschivi, emissioni vulcaniche). nanomateriali accidentali: nanomateriali prodotti come sottoprodotto derivante da un processo (combustibili, emissioni industriali, traffico veicolare) nanomateriali ingegnerizzati (artificiali): materiali fabbricati appositamente con struttura tra 1-100 nm (calzini, vestiti, racchetta da tennis Definizioni di nanomateriali: La definizione generale di nanomateriali è: i nanomateriali sono normalmente definiti come particelle più piccole di 100 nm, o che abbiano una dimensione compresa tra 1 e 100 nm. A seconda del ramo scientifico il particolato atmosferico è definito diversamente: in ambito di scienze ambientali il particolato atmosferico è classificato in: particelle ultrafini (diametro 2,5 micron) In ambito di scienze sanitarie e epidemiologiche il particolato atmosferico è classificato in PM che presenta un pedice che indica la dimensione, se ha componenti con diamentri inferiori a 10 micron è abbreviato con PM10, il PM2,5 è chiamato generalmente polveri fini, mentre il PM1 polveri ultrafini. Le particelle di diametro inferiore a 10 µm costituiscono la frazione inalabile in grado di raggiungere lʼarea broncotracheale, mentre le particelle di diametro inferiore a 2,5 µm costituiscono la frazione respirabile e sono in grado di raggiungere gli alveoli polmonari veicolando nellʼorganismo le sostanze delle quali sono composte. La nanotossicologia si occupa dellʼeffetto dei nanomateriali ingegnerizzati sulla salute umana. Nel caso di nanoparticelle ingegnerizzate il riscontro di numerose proprietà chimico-fisiche connesse alla loro dimensione ha richiamato lʼattenzione del mondo scientifico per eventuali effetti sulla salute; ciò ha portato alla nascita della “nanotossicologia” ovvero della disciplina che si occupa dello studio delle interazioni delle nanostrutture con i sistemi biologici. La caratteristica più importante delle nanoparticelle metalliche sono le proprietà ottiche fortemente dipendenti dalla dimensione e dalla forma, questo dipende dallʼinterazione con la luce. Microscopia a scansione di sonda (STM e AFM) permettono di conoscere la materia nanometrica: STM (microscopio a scansione ad effetto tunnel): questa tecnica consiste in un “tip”, ovvero una punta costituita da pochi atomi, che viene spostata lungo le tre dimensioni dellʼoggetto che si vuole studiare. La condizione necessaria per utilizzare questa tecnica è che la superficie dellʼoggetto sia conduttiva, in quel caso si osserva lʼinstaurarsi di una corrente grazie alla quale è possibile avere una valutazione della conformazione della superficie. Questa tecnica si basa sul principio dellʼeffetto di tunnel quantomeccanico che si verifica quando si applica una piccola tensione di polarizzazione (da mV fino a 3V) tra il tip ed un campione conduttore e la punta è posizionata ad alcuni nanometri dalla superficie. Lʼintensità della corrente di tunnel è data da: V = tensione di polarizzazione C = termine costante d = distanza tra sonda e superficie Lʼequazione della corrente di tunneling ci dice che la corrente di tunnel diminuisce esponenzialmente con la separazione tra la punta ed il campione. LʼSTM può funzionare in due modi: 1. modo ad altezza costante: in cui la posizione della punta viene mantenuta costante in direzione z, mentre viene monitorata la corrente di tunnel. 2. modo a corrente costante, in cui viene mantenuta costante la corrente di tunnel mentre la posizione z della punta varia per mantenere costante d. In questo caso si monitora la posizione z della punta. Il movimento in su e giù della punta riflette quindi la topografia della superficie. La punta è connessa ad un trasduttore piezoelettrico che ne regola la distanza dal campione e la flessione laterale. La piezoelettricità è la proprietà di alcuni materiali cristallini di polarizzarsi quando sono soggetti a una deformazione meccanica e di deformarsi in maniera reversibile quando sono sottoposti ad una tensione elettrica (utilizzato per lʼSTM). La punta è connessa ad un trasduttore piezoelettrico a tubo cavo e può quindi essere mossa nelle tre dimensioni applicando le opportune tensioni. AFM (microscopia a forza atomica): questa tecnica si utilizza quando la superficie del campione è isolante, non si studia più la corrente ma le forze attrattive e repulsive che si istaurano tra gli elettroni della superficie del campione e del tip. La misura avviene puntando sul tip una luce laser che viene riflessa e incide un fotodetector, le variazioni che vengono misurate sono le variazioni che coincidono con il movimento del tip, vengono poi studiate con strumenti ottici e conseguentemente viene ricreata un immagine della superficie. Si usano comunemente tre modalità di misure AFM: 1. a contatto: il tip è a contatto costante con la superficie del campione -> possibili danni alla punta o al campione. 2. a picchettamento (tapping): il cantilever è posizionato in modo tale che la punta tocchi la superficie solo quando si trova nella parte più bassa di ogni ciclo di oscillazione. 3. senza contatto: le forze di attrazione di van der Waals tra la punta ed il campione sono messe in evidenza man mano che la punta si muove lungo la superficie. Queste forze sono sostanzialmente più deboli di quelle che vengono rivelate nella modalità a contatto, di conseguenza la punta viene fatta oscillare e si utilizzano tecniche di rivelazione a corrente alternata per cogliere i bassi segnali. La superficie del tip può essere modificata chimicamente con gruppi funzionali in modo da renderla selettiva per alcune zone. Queste tecniche hanno consentito non solo lo studio della materia ma anche la sua manipolazione. LEZIONE 3: Il carbonio è un elemento chiave per la vita, è nel DNA, nelle proteine, in grassi e nei carboidrati, circa il 20% del corpo umano è costituito da carbonio. Fino agli anni ʻ80 si conoscevano solo 2 forme allotropiche del carbonio: il diamante e la grafite, hanno proprietà completamente diverse e questo deriva dalla diversa ibridazione che conferisce le loro caratteristiche chimico-fisiche. Le proprietà fisiche, chimiche ed elettroniche dei nanomateriali a base di carbonio sono fortemente dipendenti dalla conformazione strutturale del carbonio e, quindi, dal suo stato di ibridazione, a seconda dei legami con gli atomi vicini il carbonio può ibridarsi in una configurazione sp, sp2 o sp3. Vediamo ora alcuni nanomateriali a base di carbonio: i fullereni sono aggregati di atomi di C, ogni atomo di carbonio nel C60 è circondato da altri 3 ibridizzato sp2. La curvatura tipica della struttura C60 porta a delle bridazioni che sono simili a quelle sp3, si parla di una parziale ibridazione sp3 rispetto alla dominante sp2. La struttura elettronica dei fullereni determina le loro proprietà chimiche, ottiche e strutturali uniche. i nanotubi di carbonio sono un formati da un foglio di grafene arrotolato su se stesso, hanno il diametro nella nanoscala e a seconda di come il sistema si arrotola si hanno ibridazioni e caratteristiche diverse, possono essere molto lunghi. Gli atomi di carbonio hanno unʼibridazione sp2 deformata e ciò conferisce ai nanotubi maggiore resistenza meccanica, conducibilità termica ed elettrica, oltre alla capacità di essere chimicamente attivi. I nanotubi possono essere a parete singola o anche a mare te multipla: ◦Single Wall CNT (SWCNT) sono costituiti da un singolo foglio di grafite cilindrico, sono una singola grande molecola. ◦Multi Wall CNT (MWCNT) sono costituiti da una serie di fogli arrotolati su se stessi comprendono diverse decine di cilindri concentrici di strati grafiti, i diametri hanno dimensione compresa tra 2 e 100 nm, sono un sistema granitico alla mesoscala. il grafene è un foglio bidimensionale dello spessore di un atomo di carbonio composto da atomi di carbonio legati con ibridazione sp2 che sono densamente impilati in un reticolo cristallino a nido d'ape. La sua struttura a nido d'ape è l'elemento costitutivo di base di altri importanti allotropi del carbonio, un foglio di grafene può essere avvolto per formare fullereni e nanotubi di carbonio e grafite tridimensionale (se impilato). Il grafene è un conduttore e interagisce con la luce. Per la produzione di materiali nanostrutturati si possono utilizzare due tecniche: Top-Down: approccio fisico basato sul miniaturizzare i materiali “bulk” fino alla nanoscala, un esempio sono le tecniche litografiche. Botton-Up: approccio chimico in cui si cerca di agire sulle caratteristiche chimiche di atomi e molecole, usando sintesi chimiche. Alcuni dei materiali ingegnerizzati più impiegati per varie applicazioni inculse applicazioni biomedicali, diagnostiche e in nanomedicina sono: fullereni, CNT, grafene, carbon black, SiO2, TiO2, ZnO, quantum dots, Au, Ag, SPION, polimeri, polisaccaridi e liposomi. SiO2 mesoporosa (silice) è una classe di setacci molecolari porosi ordinati caratterizzati da disposizione periodiche di mesopori di dimensioni uniformi (diametro da 2 a 50 nm) allʼinterno di una matrice di silice amorfa, è utilizzata nellʼindustria petrolifera, in cosmetiche e in medicina perchè è in grado di intrappolare i farmaci o altro allʼinterno dei pori che permettono il loro rilascio in risposta a degli stimoli. i quantum dots sono nanoparticelle di materiali semiconduttori, come ad esempio il silicio, possono differire nella radiazione assorbita ed emessa a seconda delle loro dimensioni. Le loro proprietà ottiche dipendono fortemente dalla dimensione e dalla forma delle particelle, questi effetti sono il risultato di cambiamenti nella cosiddetta risonanza plasmonica di superficie. gli ossidi di ferro sono composti naturali comuni e possono anche essere facilmente sintetizzati in laboratorio, sono il risultato di reazioni acquose in varie condizioni redox e di pH. Un importante proprietà che hanno è quella di essere superparamagnetiche. In ambiente biomedico, cosmetico e alimentare sono impiegati molteplici nanomateriali a base di materia organica come lipidi, polimeri e polisaccaridi, ne vediamo alcuni: i dendrimeri sono strutture polimeriche iper-ramificate, sono molecole grandi e complesse con strutture molto ben definite. La struttura è sempre costruita attorno ad una molecola centrale multifunzionale e questa struttura estremamente regolare contribuisce alla sua forma, sono utilizzati come vettori di un principio attivo. i liposomi sono piccole vescicole sferiche a base di fosfolipidi, grazie alle loro dimensioni, al carattere idrofilo e idrofobo e alla biocompatibilità sono impiegati per il trasporto di principi attivi al loro interno. Le loro proprietà dipendono dalla composizione lipidica, dalla carica superficiale, dalle dimensioni e dal metodo di preparazione. DNA e NANOTECNOLOGIE Tutti i materiali organici e inorganici visti fino ad ora derivano da processi sintetici ben definiti, a partire dagli anni 2000 questa tipologia di materiali si è associata ad un altra che parte dellʼimpiego di molecole naturali (biomolecole) come acidi nucleici e proteine, vengono utilizzate le biotecnologie per ottenere nanomateriali. Vediamo intanto cosa sono le molecole naturali utilizzate: DNA è la molecola informazionale delle cellule, essa contiene e trasmette le informazioni necessarie al corretto funzionamento della cellula e dellʼintero organismo. Il DNA è una doppia elica ed ha due filamenti antiparalleli, uno in direzione 5ʼ-3ʼ, ʼaltro dalla direzione 3ʼ a 5ʼ. I nucleotidi in ciascun filamento sono connessi lʼun lʼaltro attraverso legami esterni. Il pentoso nel DNA è il desossiribosio a cui manca un ossigeno nela posizione C-2ʼ rispetto al ribosio. Le due catene sono legate tra loro tramite legami a H2 tra le basi azotate (adenina con timina e guanina con citosina).  RNA differisce dal DNA per una base azotata (al posto della timina cʼè lʼuracile) e per lo zucchero ovvero il ribosio, inoltre ha una struttura a singolo filamento che si arrotola su se stessa formando strutture più complesse a doppia elica (ripiegamento a forcina, gemma ed ansa). Esistono diversi tipi di RNA, tutti a singolo filamento, che hanno funzioni differenti: ◦RNA messaggero (mRNA) che porta il messaggio genetico ◦RNA transfer (tRNA) adattatore fra i codoni dellʼmRNA e amminoacidi ◦RNA ribosomiale (rRNA) componente strutturale dei ribosomi ◦Ribozimi: molecole di RNA capaci di generare strutture 3D che hanno funzione catalitica La capacità dellʼRNA (e anche del DNA) di riavvolgerai su se stesso può essere sfruttata da un punto di vista sintetico, in laboratorio si possono sintetizzare molecole di RNA di una certa lunghezza con una certa sequenza o a sequenza casuale, fra questʼultime è possibile selezionare alcune sequenze che presentano particolari proprietà come ad esempio sono in grado di assumere particolari strutture 3D capaci di legare substrati ed avere attività catalitica, simile a quella degli enzimi proteici. Per questo motivo, recentemente, gli acidi nucleici (NA) e in particolare il DNA (poichè, rispetto al RNA, le molecole di DNA sono meno suscettibili allʼidrolisi e quindi sono più stabili) hanno trovato un nuovo ruolo nel campo della scienza dei materiali, delle nanotecnologie e delle biotecnologie. Tecnologie che sfruttano le caratteristiche funzionali degli acidi nucleici Tecnologie che sfruttano le caratteristiche strutturali degli acidi nucleici → Caratteristiche funzionali degli acidi nucleici In laboratorio si possono sintetizzare filamenti di DNA e RNA di diverse lunghezze che portano a strutture secondarie e terziarie conferendo particolari funzioni aptameri: sono oligonucleotidi di DNA o RNA a filamento singolo che adottano strutture tridimensionali stabili dipendenti dalla sequenza. Tramite dei processi di biologia molecolare evolutiva si possono selezionare dei frammenti di DNA che riavvolgedosi formano delle strutture che hanno maggiore affinità per alcune molecole come proteine o altro, quei filamenti che interagiscono vengono raccolti e amplificati e successivamente rimessi a contatto con la molecola con cui hanno affinità, nuovamente vengono selezionati quelli che interagiscono maggiormente, questa tecnica è chiamata SELEX. Gli aptameri possono essere considerati degli anticorpi sintetici, è molto più conveniente sintetizzare gli aptameri invece che produrre anticorpi perchè la loro sintesi non richiede lʼutilizzo di animali, si ha unʼalta resa di sintesi, si ottengono aptameri molto stabili. DNA zyme e RNAzyme: sono delle sequenze di DNA che hanno attività catalitiche simili ai ribozimi. → Caratteristiche strutturali degli acidi nucleici I parametri più importanti per sfruttare la struttura degli acidi nucleici sono i legami a idrogeno, la stereochimica della molecola di DNA e la termodinamica, con queste tecniche le molecole di DNA vengono viste come mattoni con cui costruire delle strutture, una di queste tecniche è la DNA origami con cui sono stati sintetizzati nanotubi a DNA DNA origami: è una tecnica di autoassemblaggio del DNA mediante la quale strutture complcate del DNA vengono facilmente e accuratamente assemblate. LEZIONE 4: I nanomateriali possono essere descritti in base alle loro caratteristiche che si possono suddividere in caratteristiche chimico-fisiche e caratteristiche strutturali. CARATTERISTICHE CHIMICO-FISICHE I materiali nanostrutturati hanno proprietà uniche che sono molto diverse sia da quelle dello stesso materiale “bulk” sia da quelle degli atomi isolati, si definiscono effetti di dimensione (size effects) ed effetti di superficie (surface effects). La meccanica classica non è adeguata per descrivere oggetti molto piccoli nella nanoscala ed oggetto molto veloci vicino alla velocità della luce, per questo motivo vengono descritti dalla meccanica quantistica. Effetti di dimensione: Un solido Bulk si può suddividere in conduttore, semiconduttore ed isolante, quello che differenzia i tre è il band gap ovvero lʼenergia necessaria da fornire per poter far passare un elettrone dalla banda di valenza alla banda di conduzione, nei conduttori il “gap” non cʼè, nei semiconduttori è molto piccolo quindi fornendo energia possono diventare conduttori mentre negli isolanti è molto grande. Quando si passa a materiali semiconduttori nella nanoscala valgono le leggi della fisica quantistica e quindi ci sono dei livelli energetici discreti e non è più presente un continuo di energia come nella nanoscala. Questi livelli energetici sono proporzionali alla dimensione del materiale, variando le dimensioni del materiale si ha un ampia possibilità di interazione con la radiazione elettromagnetica. Lʼenergia di band gap aumenta al diminuire delle dimensioni del materiale semiconduttore. Il fatto che nella nanoscala i livelli energetici siano discreti influenza anche i conduttori che a livello nanometrico diventano semiconduttori perchè il band gap aumenta. Il band gap dei quantum dots (nanomateriali a base di semiconduttori) varia in base alle loro dimensioni, da questo dipendono le loro proprietà ottiche perchè variando le dimensioni si ottengono emissioni di onde elettromagnetiche a lunghezze dʼonda diverse e quindi con colori diversi. Anche le nanoparticelle metalliche hanno delle proprietà ottiche e sono dovute allʼoscillazione collettiva degli elettroni nella banda di conduzione nota come oscillazione plasmonica superficiale, la frequenza di oscillazione è solitamente nella regione visibile per oro e argento. Possiamo pensare ai solidi metallici come un reticolo di ioni positivi immersi in una nube di elettroni liberi che si comportano come un fluido sotto lʼinfluenza di un campo elettrico, se il campo elettrico è oscillante (come i fotoni) oscillerà anche la “nube di elettroni” generando un dipolo indotto, queste oscillazioni sono quantizzate e risuonano a delle frequenze specifiche e sono chiamate plasmoni. Il movimento degli elettroni e lʼenergia assorbita dipendono dalle dimensioni e dalla geometria e quindi anche la frequenza di risonanza plasmonica, le proprietà ottiche delle nanoparticelle metalliche sono dominate dallʼinterazione dei plasmoni di superficie con i fotoni incidenti. Quando la luce bianca colpisce le nanoparticelle metalliche viene assorbita la lunghezza dʼonda corrispondente alla frequenza plasmonica e sarà visibile il colore complementare. Per le particelle non sferiche come i nanoroads sono possibili due oscillazioni, trasversale e longitudinale. Grazie alla sua struttura bidimensionale il grafene possiede molte proprietà chimico-fisiche straordinarie come lʼalta conducibilità elettrica e termica, è sfruttato per lo stato di ibridazione sp2 del C che presenta gli orbitali p perpendicolari al foglio che sono localizzati, queso fa si che si possa avere un continuo di energia tra gli orbitali π di legame e gli orbitali π di antilegame, di conseguenza anche i fullereni e i nanotubi di carbonio hanno le stesse proprietà. Effetti di superficie: Le prprietà dovute ad effetti di superficie sono molto importanti nei nanomateriali, le nanoparticelle hanno un elevato rapporto superficie/volume, inoltre sulla superficie possono essere legate delle molecole sfruttando i nanomateriali come vettori di farmaci o altro. Hanno un elevato numero di particelle per unità di massa e un maggior numero di atomi alla superficie e questo si traduce in maggior energia superficiale che influenza: Temperatura di fusione Temperatura di evaporazione Mobilità, infatti le particelle si muovono più velocemente più sono piccole Reattività, possono catalizzare delle reazioni che non catalizzavano nella macroscala (esempio lʼoro con il CO) CARATTERISTICHE STRUTTURALI Un nanomateriale può essere suddiviso in 3 strati, in nanotossicologia è importante considerarli tutti: la superficie: è ciò con cui il nanomateriale entra in contatto con lʼorganismo vivente, definisce la tossicità del nanomateriale, lʼelevata area superficiale significa che la superficie è una componente molto importante, ha una chimica superficiale molto diversa dalla composizione del nucleo. In nanomedicina i nanomateriali sono disegnati per interagire con il sistema biologico, la superficie de nanomateriali può essere funzionalizzata con piccole molecole, polimeri, ioni metallici, peptidi, anticorpi, aptameri o acidi nucleici. La superficie è ricoperta di peptidi per renderla idrofilica e renderla invisibile agli agenti dellʼorganismo, inoltre questi peptidi servono per far riconoscere i nanomateriali dai recettori della cellula per farli entrare allʼinterno attraverso vescicole chiamate endosomi, successivamente viene rotto lʼendosoma da delle proteine che si trovano sulla superficie in modo da liberare la nanoparticella allʼinterno della cellula. Un nanomateriale inoltre ha sulla superficie un “coating” che aiuta a migliorare la dispersione delle particelle e impedisce che si aggreghino tra loro, accade grazie ad na carica superficiale o ad ingombro sterico. il guscio (shell): è uno strato chimicamente diverso dal materiale del core, viene utilizzato per regola le proprietà del nucleo e quindi per modulare le caratteristiche chimico-fisiche, un esempio sono le nanoparticelle di silice rivestite di oro. il nucleo (core): è ciò che impartisce le caratteristiche cimici-fisiche del nanomateriale LEZIONE 5: La nanomedicina è un area della medicina che applica le conoscienze e gli strumenti delle nanotecnologie alla prevenzione e al trattamento dell malattie, prevede lʼuso di materiali su scala nanometrica come nanoparticelle biocompatibili e nanorobot per scopi di drug delivery, di diagnosi, di imaging e sensing di un organismo vivente. I nanomateriali si suddividono in SOFT, ovvero realizzati a base organica polimerica, e HARD, ovvero che hanno un superficie rigida con composizione metallica o a base di C con struttura cristallina.  La nanomedicina prevede il trasporto di farmaci e di agenti diagnostici attraverso i nanomateriali per colpire specifiche cellule bersaglio (malate) dellʼorganismo umano, i nanomateriali hanno le dimensioni adatte per essere trasportati nei vasi sanguigni fino alla zona tumorale. Le nanoparticelle grazie alla loro superficie possono essere funzionalizzate, la nanomedicina consente la progettazione di piattaforme terapeutiche con più elementi funzionali, quindi oltre al farmaco possono essere inclusi altri componenti di supporto che possono aiutare nellʼaumentare la stabilità dei farmaci, nellʼattivazione sito-specifica, nellʼuptake cellulare e nellʼimaging. La nanomedicina utilizza le nanotecnologie per lo sviluppo di sistemi analitici per la diagnosi, la prognosi e il monitoraggio terapeutico di stati patologici. la nanomedicina include lʼimpiego di nanomateriali per la rigenerazione di tessuti, la realizzazione di protesi e di altri dispositivi biomedicali uno dei primissimi esempi di nanomedicina è stato lʼimpiego di liposomi per il trasporto di farmaci, questo nanomateriale riduce la tossicità dei farmaci. I nanomateriali sono utilizzati anche per il trasporto di vaccini allʼinterno delle cellule, aiuta lʼintroduzione dellʼmRNA allʼinterno delle cellule perchè le nanoparticelle utilizzate sono vescicole che rendono non attaccabile lʼmRNA, lʼintera nanoparticella poi viene inglobata dalla cellula formando un endosoma. Quello che accade dopo è che la cellula utilizza lʼmRNA introdotto per produrre proteine specifiche che servono a combattere il virus. I nanomateriali inoltre hanno un ruolo fondamentale nella cura del cancro, esistono più di 10 diversi tipi di cancro che colpiscono oltre 60 organi umani che hanno però caratteristiche di formazione uguali tra loro ovvero: proliferazione illimitata e incontrollata di cellule, insensibilità ai segnali di apoptosi che inducono la morte programmata delle cellule, angiogenesi sostenuta ovvero formazione di tantissimi vasi sanguigni. Quello che accade inoltre è che le cellule che compongono i vasi sanguigni sono molto meno adesi tra di loro e possono formare delle finestrature dalle quali possono passare le cellule tumorali andando via dal esisto primario formando metastasi. Il microambiente tumorale determina molteplici barriere al trasporto dei farmaci a causa del denso stroma tumorale composto da componenti della matrice extracellulare, collagene e altro. I chemioterapici convenzionali hanno un effetto maggiore sulle cellule tumorali rispetto alle cellule normali però possono causare gravi danni collaterali anche ale cellule normali legati alla loro incapacità di colpire esclusivamente le cellule tumorali. Questo invece è possibile farlo grazie allʼutilizzo di nanomateriali con una terapia del cancro personalizzata, i nanomateriali possono portare i farmaci direttamente nella zona dove serve. È possibile sfruttare la multifunzionalità dei nanomateriali: solubilizzazione e rilascio prolungato del farmaco: diversi agenti chemioterapici sono scarsamente solubili in acqua , lʼutilizzo di nanomateriali consente la solubilizzazione dei farmaci, inoltre il farmaco ha elevata capacità di carico, in quanto modo si può ridurre lʼesposizione a materiali in eccesso che non hanno efficacia terapeutica. Protezione dalla degradazione: le nanoparticelle forniscono protezione dalla degradazione enzimatica e meccanica dei farmaci. Immunoevasione: la superficie delle nanoparticelle può essere funzionalizzata in modo da ridurre lʼassorbimento delle nanoparticelle da parte del sistema immunitario in modo da renderle “invisibili”. Terapie combinate: per la cura della maggior parte dei tipi di cancro vengono utilizzate terapie combinate che possono aumentare la profondità di penetrazione dei farmaci nei tumori per evitare che sottopopolazioni di cellule tumorali sopravvivono e causino recidive tumorali. Inoltre le nanoparticelle teranostiche che contengono sia agenti terapeutici che di imaging potrebbero facilitare la stadiazione della malattia, la selezion del trattamento, la valutazione della risposta e il rilevamento delle recidive. Triggered activation: la nanomedicina consente anche l'attivazione dei nanomateriali o il rilascio di agenti terapeutici nel tumore, ci sono diversi stimoli nel microambiente tumorale che possono essere usati come fattori scatenanti come un pH basso, alti livelli di glutatione e quantità elevate di enzimi, inoltre, stimoli esogeni, come calore, ultrasuoni e campi magnetici/elettrici, possono essere applicati a tumori accessibili dallʼesterno per indurre il rilascio dei farmaci dai nanomateriali che rispondono a specifiche fonti di energia. Targeting: si basa sulla funzionalizzazione della superficie delle nanoparticelle con ligandi molecolari consentendo la progettazione di piattaforme per il drug delivery che riconoscono le biomolecole associate a condizioni patologiche specifiche. Le nanoparticelle sono progettate per legarsi a molecole sulla superficie del sistema tumorale o cellule tumorali, esistono due tipi di targeting: ◦Target attivo: consiste nel legare chimicamente sulla superficie dei nanovettori diversi gruppi funzionali come agenti diagnostici, terapeutici e direzionanti che sono in grado di riconoscere il sito bersaglio dove sono presenti cellule tumorali e contemporaneamente possono visualizzare, curare e monitorare la risposta del trattamento patologico. Vengono sfruttate le caratteristiche del nanomateriale. ◦Target passivo: in questo caso vengono sfruttate le caratteristiche del sistema tumorale che è altamente vascolarizzato con scarso drenaggio linfatico, aumenta la perneazione e ritenzione con presenza di finestrature attraverso le quali possono passare i nanomateriali, questo porta ad un accumulo dei nanomateriali nelle zone tumorali, effetto EPR. Lʼapproccio ottimale è unire il target attivo con il target passivo, hanno però raggiunto un successo moderato dovuto al microambiente tumorale e al fenomeno della protein corona ovvero le proteine possono adsorbirsi sulla superficie dei vettori nanomerici accumulandosi facendo perdere lʼefficacia al nanomateriale e facendogli aumentare le dimensioni. La teranostica è un concetto innovativo in medicina, basato sulʼaccoppiamento di diagnosi e terapia attraverso lʼimpiego di nanomateriali e delle nanotecnologie. Un esempio è con nanoparticelle di silice rivestite con uno strato di oro, variando lo spessore del rivestimento e il diametro del core si può regolare lʼassorbimento e la diffusione degli spettri dallʼultravioletto allʼinfrarosso, può essere sfruttato a livello diagnostico. LEZIONE 6: NANOMATERIALI APPLICATI IN NANOMEDICINA I NANOMATERIALI DʼORO sono molto utilizzati i nanomedicina per le loro proprietà chimico-fisiche, vengono utilizzate per: sensing, imaging, terapie, drug delivery e teranostica. Le nanoparticelle dʼoro hanno due tipi di interazioni luce-materia: diffusione in cui la luce incidente viene irradiata in tutte le direzioni, e assorbimento in cui la luce viene convertita in calore (o vibrazioni del reticolo cristallino). Un aspetto importante degli esperimenti in vivo è legato allo scattering e allʼassorbimento dei tessuti che riducono la capacità della luce incidente di raggiungere il nanomateriale e possono cambiare la forma spettrale della luminescenza. Lʼassorbimento dipende dai componenti delle cellule e dalla matrice extra cellulare che possono interagire con la luce, da un punto di vista dello scattering i tessuti possono indurre cambiamenti nel cammino ottico. Lʼassorbanza è causata da componenti solubili presenti allʼinterno della cellula e negli ambienti extracellulari, mentre lo scattering è dovuto allʼorganizzazione fisica del tessuto che determina variazioni nellʼindice di rifrazione. Questo grafico mostra quali sono gli spettri di assorbimento di alcune componenti dei tessuti come proteine, acqua, emoglobina.. si vuole individuare delle finestre di assorbimento biologico dove lʼassorbimento è minimo e corrisponde a 650-900 nm vicino allʼinfrarosso, è importante avere dei materiali come le nanoparticelle dʼoro che riescono ad avere assorbimento in questa finestra. Lʼassorbimento da parte dei tessuti è importante perchè lʼenergia ottica che gli viene fornita attraverso radiazione elettromagnetica viene riemessa sottoforma di calore producendo un riscaldamento localizzato, oppure rimettendo energia luminosa. Lo scattering dei tessuti dipende dalla dimensione delle fibre tessutali, delle cellule o di altri ostacoli alla luce rispetto alla lunghezza dʼonda incidente. I nanomateriali dʼoro possono essere facilmente sintetizzati con geometrie diverse, hanno un picco di scattering nellʼinfrarosso. I nanorods, i nanoshell e i nanocages a differenza delle nanoparticelle sferiche dʼoro hanno il picco intorno a 900nm nella prima finestra biologica. Modificando le dimensioni e la forma sipuò modificare anche il picco di assorbimento e scattering. La sintesi di nanoparticelle dʼoro è una sintesi colloidale facile da realizzare che utilizza un sale dʼoro con un agente riducente, viene scelto il reagente per formare il coating che può essere di tipo elettrostatico per impedire alle particelle di aggregarsi, variando le tipologie di reagenti e le loro proporzioni molari è possibile e avere nanomateriali di diverse geometrie e dimensioni facilmente sintetizzabili. La superficie dei nanomateriali è sempre funzionalizzata serve a garantire che il materiale arrivi allʼorgano bersaglio, che le particelle non si aggreghino e da le proprietà chimico-fisiche. Si possono sfruttare le molecole che utilizzano come gruppi terminali dei tioli perchè il legame Au-S è un legame molto forte e stabile. La densità di impiccamento è maggiore rispetto a quelle dei liposomi, si riesce a impacchettare le molecole in maniera più efficiente. Sfruttando il primo layer è possibile funzionalizzare ulteriormente le catene introducendo molteplici molecole e gruppi funzionali. I farmaci a base dʼoro sono stati utilizzati già nel corso della storia per curare malattie complesse e usati come antitumorali, ma oltre ai tanti benefici portati dal farmaco sono stati riscontrati anche effetti indesiderati di non poca importanza, causati dalla tossicità di questi complessi: lʼoro tende infatti ad accumularsi nel timo, nel fegato, nella milza, nellʼipotalamo e nei reni, provocando danni spesso irreversibili. Le nanoparticelle dʼoro sono utilizzate in nanomedicina in diversi campi: THERAPY ◦Terapia fototermica: i nanomateriali assorbono nel vicino infrarosso e riemettono energia sottoforma di calore, questo può essere sfruttato per aumentare la temperatura localizzata provocando la morte cellulare delle telline tumorali. I nanomateriali si accumulano nei tessuti tumorali grazie al target passivo EPR, una volta li vengono irraggiati. ◦Terapia fotodinamica: questa tecnica utilizza sempre una luce nel vicino infrarosso e nanoparticelle di oro, queste molecole quando vengono illuminate producono ROS (specie reattive contenenti ossigeno) che danno luogo ad una serie di reazioni che che hanno la funzione di ossidare i materiali vicini, queste reazioni sono naturali nelle cellule dato che esistono una serie di enzimi che hanno la funzione di controllare la presenza dei ROS disattivandoli quando sono prodotti in eccesso, la cellula naturalmente produce i ROS ma sono controllati.  Quando i ROS sono in eccesso si possono avere effetti negativi perchè portano alla morte cellulare e alla diversificazione del materiale genetico. Ci sono dei farmaci che catalizzano la formazione di ROS con lʼobbiettivo di colpire le cellule tumorali, le nanoparticelle dʼoro vengono studiate perchè possono produrre ROS quando irraggiate. ◦Radioterapia: quando le nanoparticelle dʼoro vengono irraggiate con radiazioni ionizzanti portano ad una denaturazione del DNA e delle proteine portando alla morte cellulare. I nanomateriali dʼoro interagendo con le radiazioni ionizzanti possono intensificare lʼenergia delle radiazioni grazie allo scattering, inoltre producono ROS che potenziamo lʼeffetto localizzato, questo permette di utilizzare radiazioni meno forti. DRUG DELIVERY La superficie delle nanoparticelle di oro può essere funzionalizzata ottenendo unʼelevata densità, questo fa si che queste particelle possano essere utilizzate come nanovettori di farmaci aumentando notevolmente lʼeffetto del farmaco dando maggior selettività. ◦a) e b) È possibile immobilizzare sulla superficie dellʼoro molecole con caratteristiche idrofiliche che formano delle tasche, la maggior parte dei farmaci hanno caratteristiche idrofobiche e si inseriscono allʼinterno di queste tasche. Quando la nanoparticella arriva nel luogo il farmaco viene rilasciato perchè si ha una ripartizione del farmaco, il vantaggio è che il nanomateriale non deve entrare nella cellula. ◦c) d) e e) il farmaco può essere direttamente legato sulla superficie dellʼoro, vengono sfruttati i tioli e il glutatione che sono naturalmente presenti nella cellula che formano legami con lʼoro al posto del legame che cʼera con il farmaco. ◦f) il farmaco è legato alla parte terminale del braccio spaziatore, si può fare in modo he una zona del braccio sia fotosensibile e irraggiandolo si induce la rottura e il rilascio del farmaco in una certa zona. Si può anche rendere sensibile alla variazione di pH tipica delle zone tumorali. ◦g) è possibile realizzare legami sfruttando lʼelettrosstatica legando molecole cariche, la terapia genica sfrutta questa modalità dato che i frammenti di dna sono carichi negativamente. ◦h) possono essere impiegate le nanocages che sono delle “gabbiette” che contengono il farmaco che sono formate da polimeri fotosensibili e termosensibili, lo stimolo luminoso fa collassare il polimero facendo diffondere il farmaco. Si può avere un rilascio controllato nel tempo. I nanomateriali sono sfruttati anche perchè per riscaldamento possono indurre la diffusione e il richiamo di altri materiali terapeutici.  IMAGING ◦Microscopia ottica: viene sfruttata la risonanza plasmonica dei nanomateriali a scopi di imaging, un esempio è attraverso la microscopia ottica che permettere di raccogliere la luce diffusa, i nanomateriali dʼoro riescono ad entrare allʼinterno della cellula e le immagini vengono catturate dal microscopio ottico. ◦Tomografia a coerenza ottica: i nanomateriali possono incrementare il segnale in delle tecniche già usati, viene inviata una radiazione elettromagnetica che provoca scattering quando incontra i tessuti, lo scattering viene studiato e in base a quello è possibile individuare la massa tumorale che diffonde la luce in modo diverso rispetto alle cellul sane. In presenza di nanomateriali dʼoro la diffusione della luce è molto maggiore e molto più visibile. La tecnica funziona anche con PBS ma si visualizza meno. ◦Fotoluminescenza: possono essere sfruttate le capacità di luminescenza e fluorescenza delle nanoparticelle dʼoro, vengono irraggiati con una radiazione elettromagnetica che viene riemessa come luminescenza ◦Fototermica e fotoacustica: i nanomateriali dʼoro hanno la capacità di riemettere lʼenergia associata allʼassorbimento della radiazione elettromagnetica sottoforma di calore. La fototermica si basa sul recupero del calore dovuto allʼaccumulo di nanomateriali nella zona di interesse. La fotoacustica è una tecnica complementare e misura le onde acustiche rilasciate dal calore dovute allʼespansione dellʼaria che circonda il materiale. Non tutti nanomateriali sono ingegnerizzati e quindi possono essere tossici, devono essere analizzati con test di tossicità, citotossicità e genotossicità. Abbiamo molte informazioni sulla tossicità acuta e poche informazioni sull tossicità cronica. Le uniche informazioni che abbiamo sulla tossicità acuta è che in nanomateriali possono sviluppare specie ROS, inoltre quando le dimensioni sono inferiori a 2 nm i nanomateriali hanno attività catalitica molto alta. Tutti i nanomateriali possono essere tossici. LEZIONE 7: Gli SPION sono nanomateriali a base di ossidi di ferro con proprietà superparamagnetiche, vengono ampiamente sfruttati in nanomedicina nella diagnostica, come agenti di contrasto nellʼanalisi NMR, hanno la capacità di rispondere ad un campo magnetico esterno applicato rimettendo anche lʼenergia in eccesso sottoforma di calore. Le dimensioni, la forma e lʼingegerizzazione superficiale degli spion fa si che una volta che si trovano nel circolo sanguigno vengono riconosciuti dalle cellule leucocitiche del sistema immunitario, un esempio sono i macrofagi che sono delle cellule che hanno la capacità di interiorizzare il materiale in circolo che loro riconoscono come esogeno, poi lo sottopongono a lisi. I macrofagi inglobano il nanomateriale allʼinterno formando endosomi, allʼinterno del citoplasma vengono sfaldati e viene rilasciato il ferro che viene poi presentato sulla superficie esterna e dato alle proteine che trasfportano il ferro. Il modo in cui è incapsulato il core di ferro facilita il riconoscimento da parte dei leucociti. Lʼaccumulo dei nanomateriali di ferro avviene attraverso target attivo e target passivo, le particelle vengono ingegnerizzate e sfruttate per il drug delivery. Le particelle superparamagnetiche possono essere sfruttate per la capacità di essere responsivi ad un campo magnetico esterno, possono avere una risposta termica, inoltre lʼapplicazione del campo magnetico in zone bersaglio può servire a richiamare le particelle superparamagnetiche in quelle zone, questo porta ad un delivery più localizzato. Gli SPION vengono utilizzati in tecniche di imaging come agenti di contrasto per le risonanze magnetiche, interagiscono con il campo magnetico e si può esservare come lʼorganismo risponde allʼapplicazione del campo magnetico. Gli SPION diminuiscono i tempi di rilassamento rendendo più visibile la risposta, questi tempi dipendono dallʼintorno e dal campo applicato. Sli SPION possono essere tossici quindi si deve valutare la tossicità, però nellʼimmaginario sono considerati non tossici o poco tossici. I NANOMATRIALI A BASE DI CARBONIO (CNT) possono essere utilizzati in nanomedicina a scopi di imaging, drug delivery e funzionalizzati, ma uno degli ambiti più importanti in cui vengono usati è per la rigenerazione tessutale specialmente per il tessuto nervoso grazie alla conducibilità termica e elettrica e anche per la superficie. Unʼaltra caratteristica è quella di assorbire nel vicino infrarosso producendo un effetto fototermico.  I neuroni sono le cellule del tessuto nervoso, sono formate da un assone, ricoperto da una guina mielinica, che ha una parte terminale ramificata che presenta delle funzioni chiamate sinapsi che sono in grado di trasmettere i segnali tra le cellule. Lʼimpulso nervoso si propaga lungo lʼassone, può accadere una perdita della guaina mielinica che porta dalla degenerazione dellʼassone, in questo caso possono intervenire delle cellule, cellule Schwann, che hanno il compito di ripulire e stimolare i fattori di crescita interni che portano alla rigenerazione delle cellule. È stato visto che è molto importante avere uno scafford che abbia una forma tubolare che dia la possibilità alle cellule di attaccarsi bene, i nanotubi di carbonio sono adatti a questo tipo di rigenerazione tessutale, inoltre essendo materiali conduttori aiutano la conducibilità. Generalmente si inducono degli stimoli elettrici per facilitare la crescita del tessuto nervoso, questo avviene con degli elettrodi in vitro. Anche il grafene viene utilizzato a questi scopi. Il campo in cui vengono maggiormente studiati i nanotubi di carbonio è in medicina, questo nasce dal fatto che non sono biodegradabili ma lo possono diventare funzionalizando la superficie, inoltre possono avere lunghezze differenti. Un motivo per cui non vengono molto sfruttati è perchè ricordano la struttura delle fibre di amianto che causano tumori, nonostante i nanotubi di carbonio abbiano moltissime proprietà benefiche. Unʼaltro motivo per cui è stato limitato lʼimpiego dei nanotubi di carbonio come nanovettori è perchè per durante la sintesi dei nanotubi di carbonio spesso vengono inglobati allʼinterno delle impurezze come residui metallici che possono diventare tossici perchè possono produrre ROS. LEZIONE 8: STRATEGIA DI DRUG DELIVERY: La nanomedicina implica lʼutilizzo di nanomateriali tra cui nnorobot, nanosensori e nanovettori per la diagnosi, la somministrazione di agenti terapeutici, lʼimaging e la medicina rigenerativa. Quando si progetta un nanovettore come agente terapeutico di devono studiare delle strategie per il drug delivery, ovvero si deve studiare come il farmaco viene portato e viene rilasciato dal nanovettore. Nel caso di nanomateriali di tipo hard i meccanismi con cui vengono rilasciati possono essere classificati in: diffusione Ripartizione Reazioni chimiche: dovute al pH, idrolisi, enzimatiche Rilascio per applicazione di stimoli esterni: come stimoli magnetici, di forza ionica, luce, calore e ultrasuoni. Nella somministrazione di farmaci impiegando i nanomateriali il farmaco può essere immobilizzato sulla superficie come avviene nei nanomateriali hard, o per incapsulamento allʼinterno del nanomateriale come avviene di solito nei nanomateriali soft. Lʼimmobilizzazione può essere di due tipi: covalente o non covalente. Drug delivery non covalente include ogni tipo di trasporto che non implica un legame chimico, questa modalità trasporta il farmaco incapsulandolo allʼinterno oppure immobilizzandolo sulla superficie fino a quando non viene rilasciato. In questo modo il farmaco non viene modificato e mantiene la sua efficacia, inoltre non richiedono stimoli esterni aggiuntivi per far liberare il farmaco ma vengono rilasciati sulla base di cambiamenti dellʼambiente, dʼaltra parte può avvenire un rilascio del farmaco in una zona diversa da quella bersaglio data la vastità dei microambiente biologici. ◦I liposomi sono stati utilizzati per il trasporto dei farmaci già dagli anni ʻ90, sono vescicole chiuse costituire da uno o più strati fosfolipidici separati da compartimenti acquosi. Il loro meccanismo di formazione si spiega in base alle caratteristiche strutturali delle molecole di fosfolipidi, che disperse in acqua assumono spontaneamente una disposizione a doppio strato, formando dei foglietti che poi tendono a chiudersi in formazioni vescicolari con un core acquoso centrale. Nelle soluzioni acquose, i fosfolipidi sono guidati da interazioni idrofobiche, che provocano lʼaggregazione delle code degli acidi grassi per ridurre al minimo le interazioni con le molecole dʼacqua. I liposomi possono essere classificati in base a: Composizione chimica Parametri strutturali COMPOSIZIONE CHIMICA: i liposomi possono essere costituiti da lipidi sia naturali che sintetici, la composizione lipidica influenza fortemente le caratteristiche come dimensione delle particelle, rigidità, fluidità, stabilità e carica elettrica. Lʼincorporazione di sfingolipidi, come la sfingomielina (SM), nelle formulazioni liposomiali mostra una maggiore stabilità in vivo, una circolazione sanguigna più lunga e una maggiore efficacia terapeutica. La presenza di carica superficiale porta alla reciproca repulsione tra i liposomi, evitando la loro aggregazione. Spesso sulla superficie dei liposomi vengono immobilizzati i PEG (polietilenglicole) ovvero dei polimeri idrofili che migliorano la biodistribuzione del farmaco che circola meglio dato che i PEG modulano il fenomeno della opsolizzazione, ovvero impediscono di legarsi alle opsoline che sono responsabili di richiamare i macrofagi. Incorporati nel doppio strato fosfolipidico sono presenti anche steroidi tra cui il principale è il colesterolo, la sua presenza influenza la rigidità della membrana plasmatica e la stabilità del liposomi. Nei liposomi sono anche presenti dei tensioattivi che aggiungono una carica alla molecola, agiscono sulla rigidità delle vescicole e sulla capacità di deformarsi, facilitano lʼadesione del liposomi alla membrana cutanea. I polisaccaridi possono ingegnerizzare il materiale e renderlo meno disponibile allʼattacco dei macrofagi, migliorano le caratteristiche cinetiche. PARAMETRI STRUTTURALI: i liposomi possono essere classificati in base alle dimensioni e alla struttura fisica (numero di lamelle). Ci sono sette categorie di liposomi basati sulla loro struttura e dimensione: quelli che interessano maggiormente la nanotossicologia sono i LUV, i MUV e i SUV. Cʼè una vasta possibilità di sintesi di liposomi, la più impiegata prevede lʼidratazione di un film sottile di lipidi, viene idratata con una soluzione che contiene il farmaco che si vuole incapsulare. Cʼè anche una possibilità di incapsulare il farmaco dopo che il liposoma si è formato, per guidare le molecole del farmaco nelle vescicole vuote si può utilizzare un gradiente di pH. È stato perfezionato lʼuso di LNP, ovvero liposomi contenenti aminolipidi inonizzabili che si autoassemblano che vengono utilizzati per la somministrazione di terapie geniche e di vaccini. Questi amminolipidi possono formare dei cationi che interagiscono con gli acidi nucleici. Vengono utilizzate delle piattaforme lipidiche per poter ottenere vescicole che si aggregano inglobando il materiale genico. Quando i LNP raggiungono la cellula vengono inglobati dalla membrana cellulare e formano un endosoma, quando le teste dei fosfolipidi dellʼ endosoma sono a contatto con le teste dei lipidi cationi i del LNP si ha una ddestabilizzazione, si formano delle micelle inverse che buttano fuori il farmaco. Drug delivery covalente è completamente diverso da quello non covalente, richiede la rottura diretta attraverso stimoli esterni per il rilascio del farmaco come uno stimolo termico o indotto dal pH. Un esempio di drug delivery covalente sfrutta i glutationi che sono normalmente presenti nelle cellule che hanno il ruolo di mantenere la normale concentrazione di ROS, queste molecole si legano alle nano particelle di oro al posto del farmaco che trasportano con un legame tiolico. Un altro esempio sfrutta lʼeffetto Warburg, ovvero che nelle cellule tumorali è presente una variazione del metabolismo del glucosio dove invece che avvenire una glicolisi aerobia che porta a piruvato avviene una glicolisi anaerobia che porta alla produzione di lattato e H+ con la conseguente diminuizione del pH. Questa variazione di pH viene sfruttato come segnale per il rilascio del farmaco in quelle zone tramite reazioni tipo idrolisi. Un altro esempio sfrutta la silice mesoporosa come contenitore del farmaco, i pori vengono chiusi tramite una sorta di tappo che si stacca quando la nanoparticella si trova in condizioni di pH inferiori a quelle fisiologiche liberando il farmaco. Un altro esempio sfrutta il rilascio del farmaco indotto termicamente, ad esempio vengono utilizzate nanocages di oro funzionalizzate con polimeri che portano allʼinterno il farmaco, quando vengono esposte al laser vicino allʼinfrarosso il polimero collassas rilasciando il farmaco, quando poi il laser viene spento le catene polimeriche ritornano alla conformazione iniziale terminando il rilascio. LEZIONE 9: NANOFARMACOLOGIA: La nanofarmacologia è una disciplina estremamente composita, si interessa di quello che è il destino del farmaco allʼinterno dellʼorganismo umano. Studia quella che è la farmacocinetica e la biodistribuzione dei farmaci, viene studiato lʼassorbimento, la distribuzione, il metabolismo e lʼescrezione dei farmaci, nanovettori e nanomateriali. Lʼassorbimento nel sistema ospite è generalmente il primo ostacolo da superare e dipende dalla via di somministrazione, per ciascun metodo di somministrazione o ingresso i nanosistemi devono superare barriere biologiche specifiche. Una volta scelta la via di somministrazione è importante studiare la farmacocinetica, ovvero lʼassorbimento, la distribuzione, il metabolismo e lʼeccezione del farmaco. Quello che si prevede è che il farmaco raggiunge la circolazione sanguigna e da li viene distribuito nei vari organi dai quelli può essere ridistribuito ulteriormente. Alla fine il suo destino è quello di essere escreto con le urine e con le feci. La dimensione, la forma e la chimica di superficie regolano lʼassorbimento dei nanomateriali nei siti tumorali. Le particelle inferiori a 100 nm mostrano una ridotta interazione con le proteine e quindi riescono a stare di più nellʼorganismo. Ad esempio un potenziale superficiale leggermente negativo è utile per arrivare alle cellule epatiche, mentre superfici idrofobiche delle particelle aumentano le interazioni con le proteine con eliminazione prematura. In generale, 10-100 nm è un intervallo di dimensioni generalmente accettato per lo sviluppo di nanosistemi per applicazioni in vivo, mentre particelle di dimensioni maggiori a 100 nm sono facilmente riconoscibili dai macrofagi. I nanovettori per arrivare allʼinterno della cellula devono attraversare molte barriere, se non rientrano in quel range di 1-100 nm non riescono a raggiungere il sito di interesse. Il nanomateriale per arrivare al luogo bersaglio deve superare diverse barriere biologiche che possono essere suddivise in: Barriere esterne Barriera ematica Barriera cellulare Queste barriere possono essere un ostacolo per il farmaco, può dipendere però da come viene somministrato. Sapere come sono organizzati gli organi è importante per sapere come deve essere ingegnerizzato il nanomateriale in modo che arrivi allʼorgano bersaglio dove poi avviene lo scambio con la parte circolatoria. BARRIERE ESTERNE via di somministrazione per inalazione e per via nasale Le vie aeree superiori sono rivestite da uno spesso film di muco che funge da strato protettivo per intrappolare ed eliminare le particelle, i movimenti mucociliari eliminano le particelle estranee immediatamente prima che possano spostarsi nelle aree inferiori del polmone tossendo o deglutendo, la clearance in questa regione dipende dal numero di ciglia e dalla frequenza del battito ciliare. Nella regione alveolare il rivestimento è costituito da una varietà di proteine e lipidi, che fungono da barriera per il trasporto delle molecole, inoltre un aspetto da tenere in considerazione è la clearance delle molecole da parte dei macrofagi alveolari. Le particelle in grado di attraversare la barriera vengono assorbite dalle cellule e ulteriormente assorbite nella circolazione sistemica o fagocitate dai macrofagi alveolari. via di somministrazione orale La somministrazione orale dei farmaci deve superare numerosi ostacoli, tra cui l'ambiente acido e la continua secrezione di muco che protegge il tratto gastrointestinale. I nanovettori possono proteggere le molecole di farmaco dalla degradazione e possono consentire una somministrazione del farmaco più efficiente. Via di somministrazione cutanea e transdermica La pelle è costituita da diversi strati di diversi spessori e strutture che presentano cellule molto adese tra di loro, un modo in cui i nanomateriali possono penetrare attraverso la pelle è attraverso i follicoli piliferi dei peli. BARRIERA EMATICA Il trasporto e la distribuzione dei nanomateriali nei vasi sanguigni sono processi influenzati dalle interazioni fisiche tra i nanomateriali e i componenti del sangue ovvero i globuli rossi e i globuli bianchi. Il flusso è di tipo laminare ovvero prevede che il fluido abbia una zona centrale che si muove con velocità maggiore rispetto alle zone adese alle pareti. I nanomateriali vengono trasportati vicino alle pareti e questo è positivo perchè per lʼeffetto EPR possono parlare attraverso le cellule del vaso sanguigno quando incontrano delle finestrature dovute al tumore. Una strategia complementare all'utilizzo dell'effetto EPR per una migliore somministrazione del farmaco tumorale consiste nello sfruttare l'emodinamica. In particolare, i nanomateriali per il drug delivery possono essere progettati per attaccarsi preferenzialmente al sistema vascolare in condizioni di flusso sanguigno con basse velocità di taglio, ad esempio i materiali di forma discoidale tendono ad essere più adesi alle pareti dei vasi rispetto a quelli sferici che seguono il flusso. Alcune cellule del sangue, come i globuli bianchi, che incontrano i nanomateriali se li riconoscono come non endogeni (esogeni) attivano la risposta immunitarie e quindi la fagocitosi. I nanomateriali vengono riconosciuti come esogeni perchè alcune proteine del sangue tendono ad interagire con i nanomateriali adsorbendosi, questo fa attivare lʼopsolinazione che attivano i macrofagi, solo alcune cellule hanno la proprietà di fagocitare e sono i leucociti. Lʼopsolizzazione è un fenomeno importante di cui tener conto. Il nanomateriale ha adsorbite delle componenti sulla superficie, fenomeno del protein corona, che produce vari effetti tra cui lopsolizzazionne. Studiando le proteine adsorbite si è visto che non tutte hanno questo effetto, alcune non attivano la fagocitosi e sono chiamate disopsoline, questi fattori possono essere sfruttati per ingegnerizzare il nanomateriale. Una volta che si trova nel corrente circolatorio e dopo aver svolto la sua funzione il farmaco viene eliminato, uno dei modi è attraverso la clearance renale che consente a specie più piccole di 10-5 nm di lasciare il flusso sanguigno ed essere espulse attraverso lʼurina. BARRIERA CELLULARE Una volta che il nanomateriale raggiunge la cellula deve riuscire ad oltrepassare la membrana plasmatica e successivamente le membrane degli organuli cellulari. La membrana plasmatica è formata da fosfolipidi, colesterolo e proteine, queste ultime possono essere recettori di membrana, enzimi o canali. Ci sono varie modalità di trasposto delle molecole attraverso la membrana plasmatica: Trasporto passivo Il trasporto passivo non utilizza ATP e può avvenire per diffusione semplice direttamente attraverso la membrana cellulare, oppure per diffusione facilitata mediata da canali ionici e proteine carrier per molecole idrofile o ioni che non possono attraversare da sole il doppio strato fosfolipidico. Trasporto attivo Il trasporto attivo utilizza ATP e trasporta le molecole controgradiente utilizzando proteine di membrana come canali. Del trasporto attivo fanno parte anche lʼendocitosi, ovvero la formazione di vescicole per portare del materiale allʼinterno della cellula, e la fagocitosi, per portare materiale fuori dalla cellula. La fagocitosi la possono fare solamente alcune cellule come i macrofagi. Esempio di endocitosi: le membrane contengono dei recettori che si legano a delle proteine del nanomateriale che portano allʼattivazione di una serie di reazioni a cascata di alcune proteine (clatrina e adaptina) che si riorganizzano introno al recettore formando una vescicola che ingloba il nanomateriale e lo porta nel citoplasma.  In figura sono rappresentati i principali meccanismi di endocitosi insieme al destino dei materiali interiorizzati, questi meccanismi condividono 4 passaggi fondamentali: 1. Evento di legame specifico sulla superficie cellulare 2. La membrana plasmatica si deforma 3. Formazione della vescicola 4. Movimento della vescicola verso uno specifico organello subcellulare. La fagocitosi è un tipo di endocitosi eseguita solo da poche cellule specializzate. Sebbene sia anche coinvolta nell'assorbimento dei nutrienti, il suo ruolo principale è l'assorbimento di agenti patogeni, cellule morte e detriti cellulari. Le cellule immunitarie come le cellule dendritiche, i mastociti, i macrofagi, i monociti e i neutrofili sono tutte cellule fagocitiche. La fagocitosi è specificamente innescata nelle cellule immunitarie nell'opsonizzazione. I nanomateriali possono essere progettati, ingegnerizzati, per sfruttare l'endocitosi e ottimizzare il loro ingresso nelle cellule. I parametri che influenzano il processo di nudo itosi dei nanomateriali sono: la dimensione e forma: sono cruciali per la biodistribuzione in vivo, la biocompatibilità e il targeting selettivo la chimica di superficie: può essere modificata lʼidrofilia e la carica superficiale modificando i gruppi funzionali, inoltre possono essere legate molecole che interagiscono con i farmaci incorporandoli, un esempio è immobilizzanando PEG viene aumentato il tempo di circolazione nel sangue perchè le opsoline si legano con più difficoltà. Il fenomeno della protein corona avviene sempre quando il nanomateriale entra in contatto con lʼambiente, questo può portare un aumento delle dimensioni del nanomateriale cambiandone le proprietà e facendoli aggregare tra di loro. Negli ultimi anni però si è potuto sfruttare questo fenomeno per migliorare la biodistribuzione, questo perchè le proteine che si assorbono possono essere conosciute e studiate.