Ayudantía Clase 18: CRISPR Y Edición Genómica PDF

Ayudantía Clase 18: MUTAGÉNESIS, RASTREOS GENÉTICOS. CRISPR Y EDICIÓN GENÓMICA. Josefa Vallejos Aravena Curso de Biología Molecular 2024 Facultad de Ciencias, Universidad de Chile  Origen y función del CRISPR...

Ayudantía Clase 18: MUTAGÉNESIS, RASTREOS GENÉTICOS. CRISPR Y EDICIÓN GENÓMICA. Josefa Vallejos Aravena Curso de Biología Molecular 2024 Facultad de Ciencias, Universidad de Chile  Origen y función del CRISPR Cas utiliza a un RNA como guía para la degradación de material En procariontes la ‘librería’ de sistemas genético, llamado crRNA (Corresponde al transcrito de un solo CRISPR es una matriz de ADN que alterna entre regiones de repetición corta y secuencias de espaciador). ‘espaciador’ que provienen de invasiones previas. El proceso comienza cuando los espaciadores de la matriz CRISPR se transcriben a ARN. Durante esta etapa, cada secuencia de espaciador se convierte en una pequeña molécula de ARN llamada "ARNcr" o "crRNA" El locus CRISPR se expresa de forma constitutiva por lo que en una nueva entrada de ese DNA foráneo la proteína CAS con el espaciador podrá hacer match Cada espaciador con el y activar la maquinaria corresponde a un degradativa fragmento de DNA viral insertado en el genoma.  Tipos de sistemas CRISPR-Cas Tipo I: crRNA se asocia a complejo Cascade sin actividad nucleasa, se una a región complementaria a crRNA con secuencia PAM. Se aparea el crRNA con la hebra complementaria del DNA viral. Cas3 reconoce a la hebra libre del DNA viral y lo degrada. Tipo II: Cas9 se asocia a un crRNA y a un tracrRNA, complementario a la parte constante del crRNA. Cas9 escanea secuencias PAM y se une cuando esta colinda con una secuencia complementaria al crRNA (protoespaciador). El crRNA se aparea con el protoespaciador, y Cas9 cliva ambas hebras del DNA Tipo III: Complejo tipo III con crRNA reconocen al transcrito del genoma viral complementario al crRNA. Se activan proteínas Csm6 que degradan al RNA viral, al ssDNA viral, y a todo el RNA presente en la célula  Mecanismo Fusión tracrRNA Cas 9 reconoce el scaffold con el crRNA: (tracrRNA) ya que tu sgRNA o gRNA estructura encaja este es complementario a la región constante del cr RNA. La condiciones son para evitar el corte del Dos condiciones para DNA propio del procarionte. reconocimiento: Cuando Cas 9 reconoce PAM separa la PAM (5´NGG) hebra de DNA adyacente de forma Secuencia del progresiva para permitir unión por protoespaciador complementariedad de crRNA Se activa la nucleasa (Cas 9), ocurre el corte de doble hebra 3 bases río arriba de la secuencia PAM, luego el complejo se libera.  Mecanismo: Edición genética Daño en el DNA gatilla la maquinaria que genera la reparación por Daño en el DNA gatilla la maquinaria que genera la reparación utilizando un templado homólogo, lo “normal” seria utilizar el por extremos no homólogos, que agrega o quita bases al azar. cromosoma homologo pero es mas probable que se utilice un templado que agreguemos Perturba el gen Imperfecta Sin errores Mutación INDEL (66% Utiliza un templado de probabilidad de para copiarlo romper el marco de Es menos probable lectura) La proteína probablemente quede inactiva Problemáticas asociadas: Es mas común la recombinación no homologa Se puede llegar a reconocer una secuencia del genoma no del todo homologa Se habla de que el proceso de la reparación ya no es controlado ya que puede o no generar mutaciones que afecten o no el marco de lectura, por eso la importancia de analizar el resultado obtenido y elegir el mejor.  Aplicaciones del sistema Sistema nos permite modificar el genoma a nivel celular, para llevar esta modificación a nivel organismo se deben modificar genéticamente, las células que tempranamente formaran el organismo, o bien podemos modificar directamente las células somáticas de un organismo adulto. Para la modificación genética de una célula, existen 3 formar de incorporar el sistema CRISPR: 1. Tranfección de un vector de DNA que contenga codificado el sgRNA, la Cas9 y el gen a insertar de ser el IMPORTANTE caso. No es algo transitorio. Enhancer inducible permite corte en cierta condición. La ventaja de estos es que si o si 2. Transfectar directamente el RNA que codifica para la Cas9 y la presencia del sistema CRISPR va a el sgRNA. ser transitoria en las células y no 3. Introducir la proteína Cas9 y el sgRNA directamente a la se insertará este en el genoma. célula mediante microinyección. OJO, al ser una transfección involucra TODOS las problemáticas asociadas a la transfección en sí, como el control de la forma en que se inserta el fragmento.  Aplicaciones del sistema Podemos generar organismos modificados genéticamente mediante sistema CRISPR, mediante dos formas: 1. Modificando las células que darán origen al organismo en desarrollo temprano: se puede hacer transfectando el sistema en el pronúcleo masculino del oocito fecundado o bien en las células troncales embrionarias que luego serán introducidas en otro blastocito (podemos seleccionar las células que se modificaron). En caso de que se transfecte el RNA que codifica al sistema o la proteína Cas9 + sgRNA, se generaría un organismo mutante NO TRANSGÉNICO, porque sistema generaría el corte pero este luego sería degradado y no se mantendría en el genoma (no se transmitiría en generaciones). 2. Modificando las células somáticas de individuo adulto, esto se puede hacer por ejemplo usando vectores virales. El problema de esto es que no podemos controlar que modificaciones ocurren en todas las células blanco. En cualquier caso antes de modificar organismo, se suele probar el sistema en cultivo celular para evaluar si funciona y es eficiente (se puede hacer con las células que daran origen al organismo pero no con células somáticas en el organismo adulto). Para ver que efectivamente se generó la modificación deseada se comprueba con PCR + secuenciación de los amplificados.  Aplicaciones del sistema La generación de un corte puede permitir la reparación por extremos no homologos (generando mutaciones Indel) o bien reparación por extremos homólogos. Para el caso de un solo corte, esta reparación homologa utiliza generalmente un templado, que generalmente es el cromosoma homologo, pero en caso del sistema se usa un DNA templado para generar cierta modificación en esta región. Esta suele ser una modificación de un tamaño reducido. Podría usarse por ejemplo para corregir cierta mutación en un gen de interés, que implique agregar el templado sin la mutación, y de esta formar modificar un número reducido de bases. A diferencia de lo que se ve cuando se realizan dos cortes diferentes que involucran gRNAs diferentes, donde se puede permitir la inserción de un fragmento grande de DNA, que requiere por lo tanto que ocurran dos recombinaciones homólogas. Por lo mismo que involucra este sistema es sumamente improbable y requiere análisis posterior.  Aplicaciones del sistema El sistema CRISPR permite modificar la expresión génica en diferentes niveles, no solo modificando el genoma. Podemos usar ciertas proteínas Cas que unan un RNA guía y con este interaccionen con mRNA, generando el corte de estos (knockdown, disminuye expresión sin hacer knock-out) aplicando el sistema tipo III. O bien que modifiquen el RNA con enzimas acopladas a la Cas (dCas). Usar una Cas9 con su dominio nucleasa inactivo, permite la unión específica del sistema al DNA/RNA sin generar el corte de esto. Permitiendo así acoplar factores transcripcionales o modificadores de histonas que modifiquen la expresión génica y la estructura de la cromatina (edición epigenómica). Nuevamente así logramos la modificación de la expresión genética sin causar cambios a nivel genoma. Ayudantía Clase 18: MUTAGÉNESIS, RASTREOS GENÉTICOS. CRISPR Y EDICIÓN GENÓMICA. Josefa Vallejos Aravena Curso de Biología Molecular 2024 Facultad de Ciencias, Universidad de Chile