Aula 1 - Princípios Gerais sobre Exames e Diagnósticos Laboratoriais PDF

Princípios gerais sobre exames e diagnósticos laboratoriais Análises clínicas em veterinária Professora: Alice Fonte Basso Lima 1 Questão Já teve alguma experiência nessa área? Qual foi sua experiência com a área de Análises Clínicas? Quais suas expectativas? O qu...

Princípios gerais sobre exames e diagnósticos laboratoriais Análises clínicas em veterinária Professora: Alice Fonte Basso Lima 1 Questão Já teve alguma experiência nessa área? Qual foi sua experiência com a área de Análises Clínicas? Quais suas expectativas? O que você espera aprender na disciplina? Materiais Analisados Sangue Fezes Soro Tecidos Plasma Citologias (ex.CAAF; Swab) Sangue total Biópsias Raspados Líquidos corporais Pleural Articular Líquido cefalorraquidiano Ascites Jalecos, luvas e sapatos fechados Urina  Realizar exames  propiciar suporte ao diagnóstico clínico Finalidade de confirmar, estabelecer e complementar o diagnóstico clínico veterinário, ou verificação da sanidade dos animais e para as ações da defesa sanitária animal; Exames: Hematologia Bioquímica Urinálise Parasitologia Hormonais Citologia Bacteriologia Biologia molecular Micologia Virologia Imunologia Profissionais que podem trabalhar com essas análises: Somente Médicos Veterinários sob registro no CRMV.  O CONSELHO FEDERAL DE MEDICINA VETERINÁRIA - CFMV - no uso das atribuições que lhe confere a alínea 'f' do artigo 16 da Lei nº 5.517, de 23 de outubro de 1968; considerando que a realização de exames laboratoriais de amostras animais é modalidade clínica e forma de assistência técnica e sanitária aos animais, caracterizadas como atividades privativas do médico- veterinário, conforme alíneas "a" e "c" do artigo 5º da Lei 5517, de 1968; considerando que a realização de exames laboratoriais de amostras animais é atividade essencial para o planejamento e execução da defesa sanitária animal, atividade privativa do médico- veterinário conforme alínea "d" do artigo 5º da Lei 5517, de 1968; considerando o disposto na Resolução CFMV 831, de 14 de julho de 2006, que "dispõe sobre o Exercício da Responsabilidade Técnica pelos laboratórios, exames laboratoriais e emissão de laudos essenciais ao exercício da Medicina Veterinária"; resolve: Exames mais requisitados Hemograma Creatinina e Ureia - Renal Fa e ALT – Hepático Outros bioquímicos Urinálise Coproparasitológico Hormonais e eletrolíticos (Na, K, P, Ca..) Hematologia: Princípios gerais Hemograma HEMOGRAMA Dividido em: ▸ ERITROGRAMA ▸ LEUCOGRAMA ▸ TROMBOGRAMA HEMOGRAMA Hemograma ▸ INFORMAÇÕES QUANTITATIVAS ▹ Contagem total de células ▹ Contagem diferencial de células ▹ Índices hematimétricos (HCM,VCM,CHCM) ▸ INFORMAÇÕES QUALITATIVAS ▹ Análise da morfologia celular no esfregaço INTERPRETAÇÃO ADEQUADA DEPENDE DA INTEGRAÇÃO DE AMBAS AS INFORMAÇÕES!  Hemograma MEDIÇÕES DIRETAS: Volume globular ou hematócrito; Teor de HB; Contagem de hemácias; Volume corpuscular médio (VCM) – Tamanho médio das hemácias; Contagem de leucócitos; Teor plasmático de proteínas (Por refratometria); Contagem de plaquetas; Volume plaquetário médio; EXAMES MICROSCÓPICOS: Contagem diferencial de leucócitos (Neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos); Morfologia das hemácias; Morfologia das plaquetas e avaliação da proporcionalidade; Contagem de reticulócitos em pacientes com anemia; CÁLCULOS: Índices hematimétricos (Ex: Concentração da Hb corpuscular média, Hb celular média, extensão da distribuição de hemácias); Contagens absoluta e diferencial de leucócitos; Contagem absoluta de reticulócitos.  Outros parâmetros: Por espectrofometria ou cálculo: Teor de hemoglobina (g/dL); Hemoglobina celular média (HCM) (pg/dL); Concentração de Hb corpuscular média (CHCM) (g/dL); Pelo tamanho e pela contagem de células (Partículas): Tecnologia para avaliação do tamanho e da contagem de células (x106 células/µL); Concentração de hemácias (Semelhante ao hematócrito); Volume corpuscular médio (VCM) (Tamanho da hemácia – Ex: Utilizada para identificar anemia por deficiência de ferro), histograma e extensão da distribuição de hemácias (Curva de distribuição do tamanho) (fL); Hematócrito ou volume globular (%); Concentração de plaquetas (Células/µL); pg: Picogramas; Concentrações absoluta e diferencial de leucócitos (Células/µL). fL: fentolitro.  Técnicas hematológicas Procedimentos hematológicos básicos: Homogeneização da amostra de sangue; Volume globular ou hematócrito por centrifugação (% de hemácias no sangue); Determinação do teor plasmático de proteína por refratometria; Contagem de leucócitos e hemocitometria por microscopia; Preparação de esfregaços sanguíneos; Contagem diferencial de leucócitos e exame do esfregaço sanguíneo.  A: Sedimentação de sangue por gravidade; B: Técnica da inversão repetida do tubo para homogeneizar a amostra, antes da remoção de alíquotas para exames hematológicos. Técnica para preencher tubo de micro- hematócrito. O tubo deve ser posicionado no sentido horizontal para facilitar o preenchimento por ação capilar. Um tubo de micro- hematócrito é fechado Aparato mecânico para pressionando 2 ou 3 homogeneização de amostra de vezes na massa selante. sangue.  Tubos de hematócritos após centrifugação. Tubo à esquerda é normal (Hemácias na base, camada de plasma na parte superior e creme leucocitário no meio (Seta); Segundo tubo: Lipemia; Aumento considerável do creme leucocitário; Grave anemia; Terceiro tubo: Hemólise; Quarto tubo: Icterícia (Hematócrito diminuído); Ponta da seta: Separação de hemácias e leucócitos não é nítida; A coloração do creme Centrífuga de micro-hematócrito. leucocitário pode decorrer de aumento da quantidade de hemácias nucleadas. Determinação do hematócrito em um cartão de leitura. Tubos de micro-hematócrito na Permite que a leitura do tubo seja feita centrífuga. em diferentes níveis de preenchimento. ETAPAS DO EXAME DE SANGUE EM UM APARELHO AUTOMATIZADO: VCM: Volume corpuscular médio; VPM: Volume plaquetário médio; CHCM: Concentração de hb corpuscular média. Determinação da concentração plasmática de proteínas por refratometria Após o hematócrito – A coluna de plasma pode ser utilizada para medir a concentração de proteína plasmática; Técnica - Refratometria: O soluto desvia a luz que passa pelo fluido em grau proporcional à concentração dele; Refratometria utilizada também na densidade específica da urina; A medição da proteína é uma estimativa baseada na calibração, assumindo-se que há outros solutos no soro; Ex: A lipemia pode elevar artificialmente o teor proteico em até 2g/dL; Ureia e glicose também influenciam a estimativa proteica, mas em grau menor.  Transferência do plasma Refratômeros. do tubo de micro- É possível calibrá-lo hematócrito para o para diferenças entre refratômetro. espécies. Preparação do tubo de micro- hematócrito para medição da concentração plasmática de proteína. O tubo é quebrado acima da camada de creme leucocitário, obtendo-se a coluna de plasma (Seta). Escala típica de refratômetro. A refração cria uma área de interface sombreada clara, permitindo a leitura em escala apropriada.  Contagem total de leucócitos Dois métodos: Diluição em Unopette® (Kit) com hemocitometria; Uso de instrumentos projetados com tecnologia de contagem de partículas ou de análise do creme leucocitário expandido; Manipulação do sistema capilar Unopette®. A: O tubo é preenchido com sangue; B: Transfere-se o conteúdo do capilar ao reservatório do fluido diluente. Componentes do sistema de contagem de leucócitos Unopette®.  Aspecto de um quadrado Hemocitômetro. principal do hemocitômetro. A: Porção central do Setas: Margens do quadrado. hemocitômetro; Cabeça da seta: Partículas de B: Técnica de leucócitos. transferência do fluido do sistema Unopette® para o hemocitômetro. Exemplo de contagem na grade de quadrados do hemocitômetro. Nove quadrados – 0,9 µL. Setas: Partículas de leucócitos. *30 células contadas, acrescentam 10% das células contadas (3). (Para obter a contagem em 1 µL). Leucócitos típicos (Setas). Multiplica pelo fator diluição (100).  Preparação de esfregaços sanguíneos É fundamental para contagens dos tipos de leucócitos individuais (Contagem diferencial) e para avaliar alterações patológicas das células sanguíneas; Técnica: De cunha ou de deslizamento; Esfregaço deve ser uniforme, que se Ângulo de 30° afina progressivamente.  Material para preparação de esfregaço sanguíneo e coloração citológica. Corante Diff-Quick ® A: Coloração manual; B: Aparelho de coloração automatizado. Esfregaço do meio: Homogêneo, mas muito fino na cauda; Esquerda: É muito pálido (Anemia grave); Direita: Lâmina deslizadora muito lenta, esfregaço fino e com estrias. Visualização da cauda do esfregaço. Notar padrão reticulado da distribuição das hemácias. Cauda (Seta fina) e corpo da lâmina (Seta grossa). Relembrando:  Notar pouca sobreposição de hemácias, facilitando o exame da morfologia eritrocitária (Cabeça da seta). Leucócitos (Seta) estão achatados. A: Microfilária (Seta); B: Grande aglomerado de plaquetas com leucócitos aprisionados. Muita sobreposição de hemácias, dificultando o exame da sua morfologia. Identificação de leucócitos (Setas) é difícil. Distribuição uniforme das células e facilidade em verificar palidez das hemácias. Quantidade de leucócitos (Seta) é esperada para contagem leucocitária normal. Área de contagem com diminuição evidente da quantidade de leucócitos (Raro leucócito no campo – Seta). Leucócitos na contagem diferencial. A: Neutrófilos; Área de contagem com B: Monócito (Formatos: Arredondado, aumento acentuado de formato de feijão, bastonete – Nesse ex) leucócitos. (Presença de vacúolos); C: Dois linfócitos; D: Eosinófilo (Com grânulos); E: Basófilo; Cabeça da seta: Neutrófilo (São menores, com grânulos poucos corados; Menor quantidade do que aquela verificada em eosinófilos e basófilos). Concentração de reticulócitos  Concentração de reticulócitos Utilizado para avaliação de regeneração das anemias Contagem: corante para hemácias causando agregação dessas organelas residuais; Cálculo de reticulócitos: Multiplica a contagem de hemácias pela porcentagem de reticulócitos; É mais útil para cães e gatos pouca aplicação em vacas; Não é um exame utilizado para equinos, a maturação de reticulócitos se restringe ao espaço medular (As células não são liberadas na circulação).  Concentração de reticulócitos Contagens esperadas de reticulócitos quando o hematócrito é normal (dentro do valor de referência): Cães e gatos: 0 a 60.000 células/µL Vacas: 0 célula/µL Equinos: Não liberam reticulócitos Anemia não regenerativa com baixíssimo grau de regeneração: 0 a 10.000 células/µL Anemia não regenerativa com grau mínimo de regeneração: 10.000 a 60.000 células/µL Anemia regenerativa com liberação discreta a moderada: 60.000 a 200.000 células/µL Regeneração máxima: 200.000 a 500.000 células/µL Reticulócitos; A: Reticulócito típico com novo azul de metileno; Corantes de reticulócitos; B: Células policromatofílicas (Cabeças de seta) assemelham- A: Novo azul de metileno; se aos reticulócitos. B: Preparação comercial de azul cresil brilhante. Maturação eritroide sequencial, evidenciada pelos corantes de reticulócitos e interpretada em cães. Ocorre desnucleação do metarrubrícito com surgimento dos restos nucleares do reticulócito. Há a desnucleação progressiva do reticulócito ao logo de 24 a 48 horas, resultando em hemácias maduras. Morfologia do reticulócito felino corado Maturação de reticulócitos felinos. com novo azul de metileno. A: Corante: Azul de metileno. Após desnucleação do * Reticulócito típico –Agregado (Seta); metarrubrícito, forma-se um agregado de reticulócitos. *Restante das células são reticulócitos Essa células se transforma na forma pontilhada em 12 pontilhados (Cabeças das setas). horas. Células maduras à direita; B: Corante: Wright-Giemsa. Células policromatofílicas representam o agregado de reticulócitos. Células maduras e pontilhadas são indistinguíveis. Técnicas bioquímicas  Técnicas bioquímicas Várias técnicas têm sido incorporadas a diversos aparelhos; Os veterinários enviam amostras de bioquímica clínica a um laboratório de referência; Há um crescente número de aparelhos bioquímicos comercializados; É importante entender as vantagens e desvantagens dos equipamentos. Coleta e processamento de amostras e análise  Recipientes para coleta Tubo de coleta de soro ou de tampa vermelha: Destinado à obtenção de amostra de soro, não contém anticoagulante; O sangue deve coagular para obtenção do soro (Necessário às análises bioquímicas comuns – De perfil bioquímico); Tubo de tampa lavanda: Contém EDTA (Ácido etilenodiaminotetracético); Utilizado para coleta de sangue destinado aos exames hematológicos; EDTA: Preserva melhor o volume celular e as características morfológicas das células nos esfregaços corados; Tubo com heparina ou de tampa verde: Anticoagulante utilizado para testes bioquímicos especiais (Principalmente aqueles que requerem sangue total e pode ser influenciados por outros anticoagulantes químicos).  Recipientes para coleta Tubo com citrato ou de tampa azul: É utilizado para determinação bioquímica de substâncias ou fatores relacionados aos mecanismos de coagulação; Tubo Sure-Sep ®: Variação do tubo de tampa vermelha que não contém anticoagulante; A tampa é vermelha com manchas pretas; Contém um gel que separa fisicamente as células e o soro, quando a amostra é centrifugada; Indicado em situações em que se deseja fazer a centrifugação no local de coleta e transporte para o laboratório sem a transferência do soro para outro tubo; Tubo com fluoreto ou de tampa cinza: Fluoreto não é anticoagulante, ele inibe enzimas que participam da via glicolítica, impedindo a metabolização da glicose pelos eritrócitos durante o transporte até o laboratório; Não é muito utilizado. Tubo com tampa de lavanda com EDTA; Tubo com tampa vermelha sem anticoagulante; Tubo para separação de soro; Tubo com tampa azul com citrato.  Recomendações para o preenchimento dos tubos à vácuo Proporção de volume:anticoagulante deve ser fixada (Seguir recomendações específicas do tubo); Ao coletar sangue para vários procedimentos, inicialmente preencher o tubo que contenha anticoagulante, e por último os tubos sem coagulantes (Evitar o risco de formação de coágulo); Tubos à vácuo devem ser preenchidos com mínima força positiva (A passagem forçada do sangue pela agulha pode provocar hemólise); É importante que a venipuntura seja asséptica e sem contaminação tecidual; Selecionar o local de venipuntura que forneça o volume de sangue desejado; Locais: Veia jugular (Cães, gatos, equinos e vacas); Veia cefálica ou jugular (Cães de médio a grande porte); Exames geralmente requerem 5 a 12 mL de sangue.  Procedimentos gerais para manuseio da amostra PROCEDIMENTOS HEMATOLÓGICOS: A amostra destinada para hemograma deve ser analisada em uma hora ou preparada para análise posterior; Caso o sangue não seja analisado nesse período, deve-se preparar o esfregaço e manter o tubo refrigerado; As características morfológicas das células podem se deteriorar rapidamente quando o sangue é armazenado em EDTA; PROCEDIMENTOS PARA BIOQUÍMICA CLÍNICA: O sangue coletado em tampa vermelha deve ser mantido em repouso durante 15 a 30 min, e em seguida centrifugado para separar os componentes celulares e soro. Preparação de soro para exames laboratoriais. Aguardou-se a formação do coágulo no tubo à esquerda que, em seguida, foi centrifugado para compactar as hemácias abaixo da camada de soro. Utiliza-se uma pipeta para transferir o soro da amostra centrifugada para o tubo à direita.  Análise das opções para instalação de laboratório de diagnóstico Categorias: Laboratório da própria clínica veterinária; Cuidado!!! Vantagens: Rapidez dos exames e controle do tempo; Desvantagens: Necessidade de técnico em tecnologia laboratorial; Investimento dos aparelhos; Laboratório veterinário comercial; Vantagens: Diluição do custo dos equipamentos; Disponibilidade de extensa lista de exames; Supervisão profissional do desempenho técnico; Suporte do patologista; Desvantagens: Turno de trabalho menos flexível; Laboratório humano ???? Única Possibilidade?  única opção em áreas menos populosas; Desvantagens: Equipamentos não ajustados; apoio patologista veterinário inexistente; Sem prioridade adequada;  Considerações sobre interpretação de resultados de exames laboratoriais  Valores de referência Valores anormais É necessário ter conhecimento da faixa de variação dos valores em animais sadios; Valores de referência devem ser estabelecidos para cada espécie e em grupos dessa espécie; Grupos: Idade, raça, sexo, fase de prenhez ou tipo de criação;  Valores de referência Precisão aceitável na definição dos valores de referência: Pelo menos 120 animais devem ser examinados; Há vários métodos estatísticos para determinação desses valores; Métodos paramétricos e não paramétricos.  Interpretação dos resultados de exames laboratoriais Exames laboratoriais são interpretados após o histórico completo do paciente e exame físico; A maior parte das anormalidades laboratoriais tem múltiplas causas; Exames laboratoriais pode ser utilizados para definir ou excluir diagnósticos diferenciais; Interpretação dos exames laboratoriais, é necessário considerar: Sensibilidade: É uma medida da frequência na qual o teste indica resultado positivo ou anormal em animais com determinada doença; Especificidade: É uma medida na qual o teste indica resultado negativo ou normal em animais com doença pesquisada; Os resultados positivos (Anormais) e negativos (Normais) têm valor preditivo – Estima a probabilidade do resultado anormal ou normal de o exame ser indicador confiável da doença.  Efeitos de lipemia, hemólise e hiperbilirrubinemia Afetam os resultados de exames bioquímicos!!!! Hemólise: In vivo ou mais comumente durante ou após a coleta de sangue (In vitro); Ocorre diluição dos compostos normais do soro, resultando em teor falsamente diluído; Ou interferência na leitura espectrofotométrica;  Efeitos de lipemia, hemólise e hiperbilirrubinemia Lipemia: Causa turvação visível do soro; Causa diluição de substâncias normais no componente aquoso do soro, provocando falsamente diluída; Ou interferir na leitura do espectrofotômetro; Aumento da concentração sérica de bilirrubina; Interferência nos resultados de exames obtidos por espectrofotometria;  Efeitos de lipemia, hemólise e hiperbilirrubinemia Geralmente os laboratórios fornecem informação específica quanto aos efeitos de hemólise, lipemia ou hiperbilirrubinemia nos resultados. Ler as observações nos laudos!!!  Diagnóstico de doenças infecciosas Demonstração do microrganismo por meio de identificação morfológica ou de cultura microbiana; No entanto, esses procedimentos não são úteis devido à dificuldade da técnica e /ou tempo necessário para obtenção dos resultados; Assim, advento de EXAMES DE IMUNODIAGNÓSTICO; Pesquisas de anticorpos ou diretamente pela detecção de antígenos no sangue associados à presença do microrganismo; VANTAGENS DO IMUNODIAGNÓSTICO: Simplicidade e rapidez na obtenção de resultados; LIMITAÇÃO: A detecção de um anticorpo não necessariamente indica existência de uma infecção ativa.  Anticorpos utilizados em imunoensaios Anticorpos são glicoproteínas secretadas pelos linfócitos B e representam o principal componente da resposta imune humoral; Cinco isótopos principais pertencem a esse grupo: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE; A diferença está no tamanho, na carga, na composição de aminoácidos e conteúdo de carboidrato; A área de diagnóstico veterinário é uma atividade em crescimento, principalmente para cães, gatos e equinos.