Apuntes de Patología Molecular 2023-2024 PDF

Ge 1  Patología Molecular 2023-2024 son importantes porque si no se produce bien el reconocimiento entonces no se produce bien el corte y empalme de los exones y se puede producir un splicing aberrante, provocando la perdida de uno o más exones, produciendo una proteína afuncional. Por ejemplo, s...

Ge 1  Patología Molecular 2023-2024 son importantes porque si no se produce bien el reconocimiento entonces no se produce bien el corte y empalme de los exones y se puede producir un splicing aberrante, provocando la perdida de uno o más exones, produciendo una proteína afuncional. Por ejemplo, si tenemos un exón de 300 pb no solo se tiene que secuenciar el exón sino también las regiones intrónicas flanqueantes, al menos aproximadamente +/- 10 pb. Para llevar a cabo la clasificación de las variantes génicas a nivel clínico tenemos diferentes herramientas:  Plataformas bioinformáticas, bases de datos, etc.  Estudios de cosegregación familiar: Se usa para saber cuándo la variante significado clínico incierto (VUS) es o no patogénica. Por ejemplo, hay dos personas afectadas en la misma familia y hacemos un estudio genético y detectamos un VUS. Al hacer el estudio vemos que una de las personas si lo tiene presente, pero la otra no, nos puede dar un indicio de que se trata de una variante benigna o probablemente benigna y muy pocas se convierten en patogénicas.  Estudios funcionales: que pueden ser en línea celulares o modelos animales ya que entra en la parte de investigación.  Co-ocurrencia en cis-trans: se usa cuando ya hay una mutación patogénica y aparece una variante que en principio decimos que es VUS. Por ejemplo, en el cáncer que suele tener una herencia autosómica dominante y mutaciones bialelicas son difíciles que sean viables porque suelen ser letales y si no muchas veces está asociada con fenotipos muy severos. Si está en trans (distinto alelo) podemos decir que no es patogénico ya que como genotipo es raro que sea bialelico. Sin embargo, si esta es cis al estar en el mismo alelo no vamos a poder saberlo. Sabemos si está en cis o trans estudiando a los progenitores. Para que se realice un estudio genético se necesitan unos criterios de inclusión que son dictados por la SEOM (sociedad española oncología médica). Caso índice/ probando (importante) Es el primer individuo en mostrar una enfermedad genética en una familia. Por ejemplo, tenemos el caso de una familia en la que la madre e hija están enfermas de cáncer de mama, a la madre se lo han diagnosticado a los 78 años y a la hija a los 30. ¿Quién es el caso índice la madre o la hija? La hija ya que la madre por la edad es más probable que sea de tipo adquirido. En el árbol genealogico donde se pone la flecha es quien es el caso índice. 4. Asesoramiento genético pre-análisis, como ejemplo consulta cáncer hereditario En la consulta de asesoramiento genético pre-análisis, se debe realizar un estudio de la historia personal y familiar de los pacientes mediante la elaboración de arboles genealógicos para identificar aquellas familias de alto riesgo de cáncer hereditario a las que se ofrece la posibilidad de realizar un estudio genético en base a los criterios establecidos por las diferentes sociedades científicas y a las predicciones aportadas por los modelos computacionales de riesgo. 2  Patología Molecular 2023-2024 Los especialistas deben proporcionar información sobre la utilidad clínica del análisis genético y las limitaciones asociadas al mismo, además de explicar los posibles resultados esperados incluyendo los hallazgos incidentales y las implicaciones relevantes ligadas a la realización de pruebas genéticas. Es indispensable que el paciente firme un consentimiento informado autorizando la realización del estudio genético que asegure la comprensión de la información recibida. 5. Posibles resultados del estudio genético (importante, va a preguntar) &  Estudio genético diagnóstico del CASO INDICE de la familia:  INFORME NO INFORMATIVO: Cuando no se detecta ninguna variable patogénica o probablemente patogénica o también si detectamos una o más VUS.  INFORME INFORMATIVO: cuando en el estudio genético se detecta una variable patogénica o probablemente patogénica que puede ser considerada causante de la enfermedad. Dicha mutación puede ser utilizada en los familiares directos como marcador predictivo de alto riesgo.  Estudio genético predictivo en FAMILIARES a riesgo:  VERDADERO NEGATIVO: cuando en un estudio predictivo la mutación patogénica previamente caracterizada en el caso índice de la familia no es detectada. Los individuos con un resultado verdadero negativo son considerados como individuos que no presentan riesgo genético.  VERDADERO POSITIVO cuando en un estudio predictivo se detecta la mutación patogénica previamente caracterizada en la familia. Los individuos presentan un alto riesgo de padecer la patología y han de ser informados de las recomendaciones de seguimiento para esta situación. 6. Consideraciones La VUS no se informan, ya que son resultados no deseados y añaden un alto grado de incertidumbre diagnóstica y complicaciones adicionales en el asesoramiento genético. Sin embargo, hay criterios de priorización para identificar aquellas variantes que presenten mayor probabilidad de estar asociadas a un riesgo incrementado de padecer una enfermedad hereditaria (aunque siguen siendo informe no informativo). En consecuencia, se ha acuñado el concepto de VUS priorizada, que hace referencia a aquellas variantes susceptibles de patogenicidad en las que sería recomendable realizar un estudio más completo para determinar su efecto clínico y posible implicación en la patología en cuestión. La priorización de VUS debe realizarse en base a la accionabilidad clinica de los genes y a la estimación ↳ Capaerded derivada de la aplicación de algoritmos de predicción de patogenicidad. contribuir favorablerate a la atención médica 3 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8866708 4  Patología Molecular 2023-2024 Es importante que la concentración de dNTPs sea proporcional al tamaño del fragmento que se quiere amplificar, ya que proporciones mucho mayores pueden provocar incluso que inhiba a la PCR. El tampón (generalmente comercial: 10X; 5X) se usa para preservar el pH de la reacción que debe de ser óptimo para el funcionamiento de la polimerasa y constante a lo largo de toda la reacción. 4. Ión Magnesio (factor iónico más importante) A concentraciones adecuadas el ion magnesio actúa como cofactor de la ADN polimerasa en la reacción de síntesis (0.5-5 mM). Es un factor muy importante a la hora de optimizar la PCR, ya que afecta a la hibridación de los cebadores con la secuencia diana y la actividad de la polimerasa. Su concentración tiene gran influencia en la eficiencia y especificidad de la PCR, Et por ejemplo, con una concentración insuficiente de MgCl2 no se produce la amplificación y cuando hay concentraciones excesivas se producen bandas extras. (MUY IMPORTANTE) 5. Primers; cebadores; oligos Los cebadores son secuencias de DNA complementarias de las regiones inmediatamente adyacentes a la secuencia diana. Son cadenas sencillas de oligonucleótidos que sirven de moléculas de comienzo para la síntesis novo del DNA. Cuando se diseñan los oligos hay que tener en cuenta ciertos parámetros como: La longitud, que tiene una especificidad optima de 18-24 nucleótidos. Contenido equilibrado GC /AT. Que tenga similar temperatura de melting (temperatura a la cual el 50% de los cebadores están apareados con el ADN molde) o fusión de los primers similar (forward/reverse). Concentraciones equimolares de ambos cebadores. Secuencia: la región más importante para la especificidad del cebador es la 3 (́ G o C en el extremo 3 )́ , además se debe evitar que un mismo cebador pueda doblarse e hibridarse consigo mismo y también evitar la complementariedad entre los cebadores porque pueden emparejarse entre ellos y polimerizar, y se verán en el gel como fragmentos de muy bajo peso molecular. Que ocurra esto no significa que no se pueda trabajar con el fragmento solo que será menos eficiente. Los oligos tienen que estar en las regiones intronicas flanqueantes al menos aproximadamente +/- 10 pb y mediante el uso de software se pueden diseñar oligos específicos a la secuencia diana que queremos. La optimización de la temperatura de hibridación/ annealing se realiza por tanteo, de manera experimental. La fórmula de Wallace sirve para calcular aproximadamente Tm, en la si el contenido de GC es menor del 50% se empieza por una temperatura de 5ºC menos a la esperada y si es mayor de 50% se empieza a la calculada. 5 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8896758  Patología Molecular 2023-2024 6. Etapas proceso PCR Lo primero que se realiza es una desnaturalización previa de unos 3-10 min a 94ºC. 1. Desnaturalización (94ºC/30-60 s) para separar la doble cadena de DNA y obtener dos cadenas sencillas. 2. Hibridación/ anillamiento (Tª hibridación/30s) que consiste en la unión de los primeros cebadores a las secuencias complementarias en el DNA. 3. Extensión/elongación (72ºC/30s → 300pb) en la que la ADN polimerasa va a añadir los dNTPs libres en el medio y sintetiza la cadena complementaria a partir del cebador con su secuencia diana. Las condiciones son aproximadas. Y según los cálculos al final del proceso el numero de copias seria de 2 36 en 2 horas, pero este dato puede variar ya que la eficacia no es siempre del 100%. Se deben usar el numero de muestras que se quieran amplificar, el control negativo (agua) y luego una de más porque como son volúmenes muy pequeños siempre hay una pequeña imprecisión y pueden ocurrir errores. 7. Aumento especificidad Touchdown: permite que solamente se amplifiquen regiones del DNA que presenten el máximo de homología con los cebadores utilizados. Se programa en el termociclador, consiste en que, por ejemplo, la temperatura a la que se unen los primers son 60ºC, en un primer paso aumentamos la temperatura a 65ºC para que sea más especifica y los primers se unan a su secuencia diana, por lo que al subir la temperatura estamos evitando que los primers se unan a cualquier secuencia. Se va a conseguir menos producto amplificado, pero nos aseguramos de lo que hemos amplificado es especifico. Después en cada ciclo se va disminuyendo e pe progresivamente la temperatura en 1ºC y cuando llega a los 55ºC se hacen el resto de los ciclos. Hot Start: Se basa en que la reacción de la PCR no empiece hasta que la Taq polimerasa esté a una temperatura de unos 72ºC, esto se hace para evitar polimerizaciones inespecíficas que se producen cuando la polimerasa está a temperatura ambiente. 8. Electroforesis en geles de agarosa E Cuando no hay bandas se aumenta la concentración de MgCl2 y se disminuye la temperatura de hibridación Cuando hay bandas inespecíficas se disminuye la concentración de MgCl2 y se aumentar la temperatura de hibridación. (IMPORTANTE) Para la preparación del del se utiliza el gel red que tiñe el ADN para revelar su posición en el gel. 6 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8896758 ↳ Adición diferentes pares catadores. - Tierpo parate m 7  · Patología Molecular 2023-2024 Durante la fase de hibridación las dos sondas se sitúan muy próximas. Una fuente externa de luz (LED) va a excitar al donador que transfiere su energía al aceptor. Después, tras la actuación de la Taq polimerasa y al subir la temperatura de la reacción, las dos sondas se desprenden y se distancian, y se impide la transferencia de energía de la una a la otra. Curvas de fusión/ melting Las curvas melting permiten identificar variantes génicas en el ADN diana. Tiene lugar cuando se ha completado la termociclación. En ese momento se baja la temperatura del proceso hasta un punto que permite la unión de las sondas FRET con sus secuencias complementarias, y aquí la fluorescencia será máxima. Entonces se aumenta progresivamente y de forma muy controlada la temperatura hasta que las sondas comienzan a separarse de su DNA complementario y disminuye la fluorescencia. Discriminación alélica mediante sondas FRET (HybProbes) La Tm se define como aquella a la que la mitad de las moléculas de ADN complementarias se encuentra unidas en forma de doble cadena simple y depende de la longitud del fragmento de ADN de doble cadena, del contenido GC y del grado de complementariedad entre las dos. Si la sonda es totalmente complementaria al alelo presenta una Tm concreta, si la sonda presenta algún mal apareamiento (mismatch) con el alelo modificado, presenta una Tm que normalmente es más baja, debido a la falta de total complementariedad entre ambas moléculas. Estas diferencias de Tm permiten diferenciar los alelos (Wildtype/mutant), ya que se separan a una menor temperatura los mutantes, y por tanto, la fluorescencia disminuye a menor temperatura que una wildtype. Si solo se ve un pico a la derecha (se alcanza a más temperatura) seria wildtype homocigótico. Si solo se ve un pico a la izquierda (el pico se alcanza a menos temperatura) es homocigotico mutante. Si se ven dos picos es heterocigótico. 8 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8896758  solo Dice que pre se ve a 9  Patología Molecular 2023-2024 2. Amplificación por PCR (se obtienen diferentes amplicones), siempre se tiene que hacer un gel de agarosa para ver si la amplificación ha ido bien. Si no viéramos banda no se puede seguir el proceso. 3. Purificación del producto de PCR para eliminar los dNTPs y los primers para que no interfiera en la secuenciación. Para ello se usa el reactivo Exosap, que se mezcla con los amplicones. Esto se pone en un termociclador a la temperatura adecuada y hace que actúe la exonucleasa y después la fosfatasa alcalina para inactivar los grupos fosfatos. Por lo que al final tendremos el producto de PCR intacto, los nucleósidos y los grupos fosfato. 4. Reacción de secuenciación, que necesita muy poco DNA. 5. Purificación (columna, placa…) 6. Desnaturalización del producto. 7. Secuenciación del material desnaturalizado. Existen diversos software que permitirán la identificación del material genético. Análisis electroferogramas & Cuando aparecen dos picos es una mutación en heterocigosis con respecto a esa variante. Cuando aparece un pico, puede ser una mutación en homocigosis o wildtype. Para distinguirlo cuando no se tiene la secuencia de referencia, se usa otro software (SeqScape). En él se carga una secuencia de referencia y se compara. 3. NGS (Next Generation Sequencing) Los NGS marcan un antes y un después en la secuenciación, ya es necesaria una menor cantidad de material genético, es más rápido y se abaratan los costes. Los NGS engloban todas las tecnologías destinadas a la secuenciación masiva a gran escala de cualquier ácido nucleico. Gracias a este tipo de tecnología se pueden analizar numerosos genes al mismo tiempo, e incluso un genoma en un tiempo reducido. 3.1. Flujo de trabajo Se utiliza la secuenciación por síntesis. Tiene 4 pasos (puede salir en el examen): 1. Preparación de la librería (fuera del secuenciador). · 2. 3. 4. Generación del cluster (dentro del secuenciador). Secuenciación propiamente dicha (dentro del secuenciador). Análisis de datos (fuera del secuenciador). 10 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8932927  Patología Molecular 2023-2024 Preparación de librería Es la parte más crítica en todo este proceso. Es un trabajo muy laborioso y se realiza de manera automatizada, lo realiza un robot. En el extremo de los fragmentos de interés se les deben añadir unos adaptadores y unos identificadores. Para la preparación de la librería: 1. Preparación de la muestra. Se diluye y se cuantifica la muestra y se realiza una fragmentación enzimática (aunque también podría ser mecánica). Es lo único que se hace manual, los demás pasos los realiza el robot. 2. Se reparan los extremos y se produce la ligación de los adaptadores, una vez unidos se deben purificar los fragmentos y se hace una amplificación universal. 3. Después ocurre la hibridación (muy importante) en la que las sondas que se unen tienen biotina para después poder capturarlas con bolitas de estreptavidina. Y después purificamos para quedarnos con las sondas de interés. 4. Una vez hemos purificado los fragmentos hay que enriquecerlos, mediante PCR. Y se realiza el control de calidad para ver que se han formado todos los fragmentos. 5. Secuenciación 6. Análisis bioinformático, que es la parte vital en la que trabaja el facultativo. Generación de Cluster Un cluster (importante) es una amplificación clonal de cada una de las cadenas sencillas de la librería (puede ser la sentido o la antisentido). Tendremos la representación de miles de copias de una cadena sencilla de una región de interés. Ocurre en las “flow cells” que se mete en el secuencia dor. 1. Se une una cadena sencilla a los oligos y se produce la polimerización gracias a las polimerasas. 2. A continuación, nos quedamos con la cadena de nueva síntesis y la original se descarta. La de nueva síntesis está unida covalentemente a la superficie de la flow cell. 3. Después esa cadena se voltea y se une a otro oligo complementario y se forma un puente y de nuevo se produce polimerización, formándose dos cadenas una sentido y otra anti-sentido. 4. Este proceso se repite durante muchos ciclos y se obtienen muchos puentes de amplificación, teniendo cadenas sentido y anti-sentido sobre la superficie de la Flow cells. 5. Vamos a eliminar las cadenas anti-sentido, quedándonos con las cadenas en sentido (forward) y se bloquean los extremos para que no se produzca otra vez el puente y se secuencian. 6. Se hace la secuenciación por síntesis. Se mete los cuatro dNTPs con sus fluoroforos correspondientes. Se pasan por un haz de luz y se puede detectar que base es. Una vez que se sabe la base se debe cortar y se desbloquea el extremo 0’ para que se pueda introducir otro nucleótido. 7. Se repite el proceso, pero ahora se eliminan las cadenas sentido y nos quedamos con las anti- sentido. Esto se hace porque queremos una mayor profundidad y cobertura. Así habrá un mayor número de copias para que haya suficiente para garantizar que si detectamos una mutación, se haga muchas veces. 11 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8932927 12 Sanger nodeniat sodes & ↓ MupA - 13  Patología Molecular 2023-2024 diferente al del cebador para poder distinguirlos. 5. Tras la electroforesis se mide el área del pico de PCR de cada producto amplificado, mediante el programa GeneMapper (Applied Biosystems) y los datos se pueden exportar para su posterior procesamiento. Para poder analizar los resultados, los ensayos de MLPA siempre deben realizarse con varios ADN controles negativos. Los kits comerciales que existen en el mercado contienen además de las sondas específicas para los exones del gen que se quiere estudiar, sondas para otras regiones cromosómicas que se utilizan como secuencias de referencia en el análisis de los datos, y sondas control que proporcionan información acerca de la calidad de la reacción. 2. Sondas de control de calidad Tienen una secuencia stuffer pequeña y aparecen al principio de la electroforesis.  Fragmentos Benchmark. Tienen un tamaño de 92 nucleótidos y nos sirve de referencia para comparar con otros fragmentos.  Fragmentos Q: valoran si la cantidad de ADN utilizado es suficiente o no. Es alta cuando la cantidad de DNA es muy baja o ha ocurrido un error en la ligación.  Fragmentos D: informan de si ha habido problemas en la desnaturalización de la muestra. Cuando son picos con altura suficiente significa que el proceso de desnaturalización ha ido bien. Si hay una señal muy baja significa que hay desnaturalización pobre y eso es suficiente para que no podamos distinguir si ha ocurrido el reordenamiento génico.  Fragmentos X e Y: indica el sexo del paciente. En muchas ocasiones ayuda a valorar que no ha habido confusión en el análisis de la muestra. 3. Interpretación de resultados Las deleciones en homocigosis se ponen en evidencia fácilmente por la ausencia de picos específicos para la secuencia diana. Sin embargo, las deleciones o duplicaciones en heterocigosis producen una reducción de la señal del 35-50% de la esperada para cada sonda y, en ocasiones, su interpretación puede resultar más complicada y obliga a la repetición del ensayo. 4. Variantes de la técnica de MLPA MS-MLPA (MLPA específico de metilación) Permite detectar alteraciones epigenéticas, es decir, cambios en el patrón de metilación del ADN de genes concretos. Algunas veces la hipermetilación en secuencias promotoras provoca que el gen sea silenciado del gen producido y ese es el motivo de que no haya una proteína funcional. La única diferencia con respecto a la anterior es que hay una enzima de restricción para una endonucleasa capaz de reconocer las secuencias no metiladas. Después de la hibridación de las sondas, la muestra se trata con esta 14 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-9033990  Patología Molecular 2023-2024 endonucleasa que digiere aquellas sondas que se han unido al ADN no metilado, dejando sin digerir las sondas que se han hibridado con el ADN metilado, y por tanto solo estas sondas van a ser amplificadas por PCR. La comparación del tamaño del pico de las sondas específicas de las regiones metiladas entre la muestra y los controles proporciona información sobre los niveles de metilación de las regiones de ADN complementarias a las sondas. MLPA transcriptasa reversa (RT-MLPA) Sirve para estudios de la expresión génica, es decir, cuando queremos saber si en la muestra problema la proteína se expresa más o se expresa menos. Para ello se debe partir del RNAm que es muy inestable por lo que para trabajar hay que convertirlo en DNA complementario mediante una retrotranscriptasa. La retrotranscripcion se realiza antes de llevar a cabo la hibridación de la muestra con las sondas. Después todo el proceso es igual a lo anterior. 5. Principales indicaciones clínicas del MLPA Además de los reordenamientos génicos también sirve para:  Detección de aneuploidías, que se puede hacer mediante MLPA, cariotipo o FISH.  Análisis de regiones subteloméricas, cuando los cromosomas entre ellos interaccionan y hay intercambio génico entre ellos. Se puede hacer con FISH o MLPA.  Detección de duplicaciones/deleciones en un gen concreto.  Detección de duplicaciones/deleciones en regiones cromosómicas.  Detección de microdeleciones en regiones cromosomas. 6. Limitaciones de la técnica El MLPA es simple de realizar, tiene bajo coste y es posible de realizar la técnica en cualquier laboratorio, ya que solo se necesita un termociclador y un secuenciador capilar. Sin embargo, también presenta limitaciones:  Los resultados del MLPA dependen de la calidad de la muestra que se analiza. La muestra tiene que ser reciente y que sea una extracción buena del DNA. Además, las sales pueden interferir en la hibridación.  Cuando hay una mutación puntual también puede ser motivo de que la sonda no se una y hay que descartarlo porque lo que buscamos son reordenamientos.  Siempre hay que comprobar los fragmentos D ya que una desnaturalización inadecuada puede dar lugar a falsas deleciones.  No detecta deleciones o duplicaciones fuera del sitio de unión de las sondas. 7. Flujo de trabajo cáncer hereditario-LDG Aunque la mayoría de las enfermedades hereditarias (incluyendo el cáncer hereditario) se producen por alteraciones en la secuencia de ADN (mutaciones puntuales), las grandes deleciones y duplicaciones representan una proporción relevante (alrededor del 5 %) de las mutaciones causantes de enfermedad, siendo en algunos casos la causa más frecuente. 15 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-9033990 16 17  Patología Molecular 2023-2024  Mutación Gln188Arg: elevada frecuencia en países occidentales, no se detecta actividad enzimática, por lo que la sintomatología es más grave.  Variante Duarte: se produce una deleción del promotor. En homocigotos duarte la actividad enzimática es del 50% y no presenta síntomas clínicos, los heterocigotos duarte/galactosemia presentan una reducción de actividad enzimática entre un 25-50% de lo normal (1/4000 nacimientos). Tratamiento Como tratamiento se debe eliminar la galactosa de la dieta de forma rápida y estricta, es decir, la toma de leche. Es una enfermedad que tiene buen pronóstico si se diagnostica y se trata antes de que aparezcan los daños orgánicos irreversibles (fallo renal, hepático, cataratas, etc.), aunque es frecuente que los niños tengan deficiencia intelectual a largo plazo. Para controlar la galactosemia se cuantifican las concentraciones de galactosa-1-P en hematíes y galactitol plasmático. Estos metabolitos disminuyen mucho con la dieta, pero solo alcanzan valores de referencia en las variantes con suficiente actividad enzimática residual. 2. Metabolismo de la fructosa La fructosa se encuentra en el azúcar de mesa (sacarosa = fructosa + glucosa), aunque también aparecen en otros alimentos como la miel o la fruta. Además, se puede obtener fructosa a partir del sorbitol mediante la sorbitol deshidrogenasa. El metabolismo de la fructosa es fundamentalmente hepático, aunque puede ocurrir en menor medida en riñón e intestino. Entre las alteraciones del metabolismo de la fructosa se encuentran: 1. Deficiencia de fructoquinasa va a provocar la fructosuria esencial. 2. Deficiencia de aldolasa B que causa la intolerancia hereditaria a la fructosa. 3. Deficiencia de fructosa-1,6-bifosfatasa 2.1. Deficiencia de la aldolasa B/ intolerancia hereditaria a la fructosa Se conoce como intolerancia hereditaria a la fructosa. Es de herencia autosómica recesiva y se ve elevada la concentración de fructosa en sangre y orina. La causa de la enfermedad es la deficiencia de la aldolasa B, pero no se ven afectadas las aldolasas A y C. Los síntomas se dan tras la introducción de alimentos con fructosa en la dieta del niño (a los 4-6 meses). Estos síntomas son inespecíficos y son náuseas, vómitos, sudoración, hipoglucemia, dolores abdominales, alteración hepática. El problema es que, si continua la ingestión de fructosa van a aparecer los síntomas más graves como convulsiones, lesión tubular renal (van a aparecer en orina 18 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8932928  Patología Molecular 2023-2024 aminoácidos e hipopotasemia), lesión hepática (elevación transaminasas, hiperbilirrubinemia, alargamiento PT) y la muerte a una edad muy temprana si continua sin tratar. La acumulación de fructosa no metabolizada causa aumento de la fructosa en sangre y orina (fructosemia, fructosuria) y acumulación de fructosa-1-P. El diagnostico se basa en la sospecha clínica, hipoglucemias. En los estudios bioquímicos se observan (glucosa elevada en sangre, fructosa elevada en sangre y orina). Además, se pueden realizar estudios genéticos en las que se observan mutaciones en el gen ALDOB. Hay tres tipos de mutaciones: dos afectan a la estabilidad de la proteína 65% de los casos (Ala149Pro en el 65% casos, Ala174Asp) y una que afecta al extremo carboxiterminal (Asn334Lys). Tratamiento Como tratamiento se debe producir la eliminación de alimentos de la dieta que contengan fructosa (sacarosa o sorbitol). Una dieta estricta va a significar buen pronóstico. 3. Disacaridasas intestinales Las disacaridasas son hidrolasas que catalizan el desdoblamiento de los disacáridos en monosacáridos. Son enzimas ubicadas en la parte más apical de las células del epitelio absortivo intestinal. Una deficiencia en estas enzimas va a provocar problemas de mala absorción y malestar intestinal, gases o diarrea debido a que los disacáridos pasan sin digerir al intestino grueso y fermentan. Las principales disacaridasas intestinales y las que tienen importancia clínica son:  Lactasa: situada en el ápice de las microvellosidades de la célula epitelial intestinal y que cataliza la hidrólisis de la lactosa.  Sucrasa o sacarasa: enzima que se encarga de la hidrólisis de sacarosa y de parte de la maltosa de la dieta.  Isomaltasa: tiene como sustratos la isomaltasa, maltosa y algunas dextrinas limites (oligosacáridos).  Maltasa: hidroliza la maltosa. 3.1. Metabolismo de la lactosa La lactosa es un disacárido formado por la unión β1-4 de la β-D-galactopiranosa y la α-D-glucopiranosa. Es el único azúcar presente en la leche de todos los mamíferos, que es el nutriente principal consumido durante los primeros meses de vida. La presencia de altos niveles de lactasa es esencial para que los recién nacidos sean capaces de hidrolizar las grandes cantidades de lactosa ingeridas con la leche. La alta expresión de la lactasa continúa hasta el periodo del destete. La lactasa se localiza en la superficie apical de la membrana en cepillo de los eritrocitos y se encuentra anclada a la membrana por su extremo carboxiterminal, con la mayor parte de la molécula proyectándose hacia la luz intestinal. Es la encargada de catalizar la hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa y, una vez obtenidos, dichos monosacáridos son absorbidos mediante transporte activo. Está codificada por un solo gen (LCT) de aproximadamente 50kb, localizado en el cromosoma 2q21 y compuesto por 17 exones. El gen codifica una pre-pro-proteína, que contiene 1927 aminoácidos y consta de 5 dominios: 19 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8932928  Patología Molecular 2023-2024  Dos dominios no aparecen en la proteína madura. Uno de ellos es un péptido señal de 19 aminoácidos localizado en el extremo amino terminal y el otro es una porción de 849 aminoácidos que parece ejercer una función de chaperona intramolecular.  Los tres dominios restantes corresponden con la proteína madura, compuesta por una cadena polipeptídica con las actividades lactasa y fluorizin hidrolasa por separado, un dominio hidrofóbico de anclaje a la membrana cerca del extremo C-terminal y un pequeño segmento citoplasmático en el extremo C-terminal. 3.1.1. Alteraciones del metabolismo de la lactosa Hipolactasia Los niveles de enzima son insuficientes para llevar a cabo la digestión normal de la lactosa, y se acumulará en grandes cantidades en la luz del intestino. La lactosa que no se ha digerido va a pasar al intestino grueso donde la flora intestinal va a producir la fermentación (glucolisis anaerobia) que va a formar ácidos orgánicos (láctico, acético, propiónico) y gases (H2, CO2, metano). Sólo una pequeña parte de la lactosa será absorbida intacta a nivel del intestino mediante mecanismos de difusión pasiva y finalmente excretada por la orina. Además de esos síntomas la persistencia de lactosa sin digerir produce un incremento de la osmolaridad y salida de líquidos y electrolitos hacia el interior del tubo digestivo (diarrea). La dilatación del intestino estimula el peristaltismo y produce un aumento del tránsito intestinal, dando lugar a la aparición de la diarrea. Debido al hiperperistaltismo, el tiempo de tránsito intestinal está acortado y ello cursa con dolor abdominal y ruidos intestinales aumentados. Malabsorción de la lactosa Es una condición muy extendida que está determinada genéticamente y se hereda como un rasgo autosómico recesivo. Y se caracteriza por tener niveles disminuidos de la actividad enzimática lactasa. Se puede manifestar clínicamente como intolerancia a la lactosa, apareciendo síntomas como la flatulencia, distensión y dolor abdominal y diarrea. Tiene una prevalencia muy elevada e influye mucho la dieta, por ejemplo, en personas asiáticas y personas de raza negra que la leche no está incluida en su dieta suele manifestarse durante la infancia, mientras que en personas de raza blanca lo suele hacer más tarde, ya incluso durante la adolescencia. La causa es el polimorfismo de nucleótido simple (SNP) C/T-13910 del gen lactasa, localizado a 13910 pb del codón de inicio del gen LCT, en el intrón 13 del gen adyacente MCM6. Para el diagnóstico el método de referencia es la medida de la actividad lactasa en biopsia intestinal, pero es una técnica dolorosa que requiere personal especializado, por lo que se realizan otras medidas como:  Test de hidrógeno en el aliento. Se realiza en personas con sospecha de intolerancia y consite en dar una solución saturada en lactosa. Si hay un déficit la lactosa ingerida no se va a metabolizar y llegará intacta hasta el colon donde será degradada mediante fermentación por la flora, por lo que se liberan grandes cantidades de ácidos grasos de cadena corta o ácidos volátiles responsable de la acidificación de la materia fecal, y gases como el CO2, metano e 20 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8932928 21  Patología Molecular 2023-2024 3.2.2. Alteraciones del metabolismo del glucógeno Son un grupo de enfermedades de carácter autosómico recesivo, a excepción de la deficiencia de fosforilasa-cinasa ligada al cromosoma X. Tiene una prevalencia de 1/40.000 nacimientos. Presenta afectación fundamentalmente hepática y muscular porque es donde se almacena el glucógeno. Se clasifican en función de los tejidos afectados:  Glucogenosis con afección hepática: va a ocurrir hipoglucemia y hepatomegalia (aumento del tamaño del hígado) ya que como no se puede fijar la glucosa se concentra ahí.  Glucogenosis con afección muscular: habrá debilidad muscular e intolerancia al ejercicio.  Glucogenosis generalizada: habrá una acumulación generalizada de glucógeno. Para el diagnostico se realiza una biopsia hepática o muscular, o midiendo la actividad enzimática. 3.2.2.1 Glucogenosis hepáticas: hepatomegalia e hipoglucemia m Enfermedad de von Gierke (tipo I) Se trata de una enfermedad metabólica, rara y hereditaria de carácter autosómico recesivo provocada por deficiencias en el sistema de la glucosa-6-fosfatasa y hay dos tipos: -  Glucogenosis tipo Ia, que es provocada por la deficiencia de glucosa-6-fosfatasa (80%), debido a mutaciones Arg83Cys, Gln347X, G727T.  Glucogenosis tipo Ib: provocada por la deficiencia de proteínas transportadoras, traslocasa G6PT1 (20%). El defecto básico es la deficiencia de glucosa-6-fosfatasa, por lo que no se puede convertir la glucosa 6-P en glucosa libre y por tanto se producen: 1. Hipoglucemias graves, ya que el hígado no puede mantener homeostasis de la glucosa durante el ayuno. 2. La glucosa-6-P no puede salir del hepatocito y se degrada por glucólisis. Los síntomas son convulsiones hipoglucémicas y/o acidosis grave, pero en la actualidad la mortalidad es rara con control metabólico adecuado. Estos síntomas se manifiestan en los primeros meses de vida o hacia finales del primer año.  En neonatos: Hepatomegalia, distrés respiratorio, acidosis, convulsiones hipoglucémicas.  Niñez: Hipoglucemia, hepatomegalia, intolerancia al ayuno (porque se necesita esa glucosa), niveles elevados de colesterol, triglicéridos y ácido láctico, retraso en el crecimiento, trombopenia, neutropenia, aspecto de muñeca (mejillas hinchadas, vientre protuberante, extremidades y tórax delgados).  Pubertad: desarrollo insuficiente, episodios de gota, adenomas hepáticos, insuficiencia renal, osteoporosis, proteinuria.  Y en caso de que sea déficit proteínas transportadoras (G6PT1) habrá neutropenia e infecciones bacterianas recurrentes. El diagnostico se puede realizar por análisis bioquímica y diagnóstico prenatal y genético:  Análisis bioquímico  Hipoglucemia en ayunas con hiperlipidemia y acidosis láctica. 22 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8932928  Patología Molecular 2023-2024  Sobrecarga oral de glucosa.  Test del glucagón: permite que la glucosa salga de la célula, pero al ser glucosa-6- P no va a salir y la respuesta nula o disminuida.  Biopsia hepática: podemos determinar la actividad de glucosa-6-fosfatasa y observación microscópica de los depósitos de glucógeno.  Diagnóstico prenatal y análisis genético  Biopsia del hígado fetal.  Gen responsable de la síntesis de la G-6-Fosfatasa, localizado en el cromosoma diecisiete (17q21).  Posible diagnóstico genético preimplantacional. Tratamiento No hay tratamiento curativo, sino que se usan terapias paliativas como pautas nutricionales para evitar la hipoglucemia. Se están investigando algunas terapias como:  Terapia enzimática para reponer la glucosa-6-fosfatasa en el hígado, el problema es hacer llegar la enzima a la membrana del retículo endoplasmático.  Terapia génica. Consiste en preparar el gen en el laboratorio y colocarlo en el lugar adecuado para que sintetice la enzima.  Terapia celular, trasplante de hepatocitos. * Enfermedad de Cori (tipo III) Se debe a una deficiencia de la enzima desramificante, amilo-alfa-(1-6)-glucosidasa. Como no podemos - romper las ramificaciones se acumula glucógeno con estructura anormal (ramas muy cortas porque sólo se rompen los residuos de glucosa con enlace α(1-4)). Es una enfermedad de herencia autosómica recesiva que se debe a mutaciones en la banda 1p21 del cromosoma 1. Pueden ser:  Tipo IIIa. 85% pacientes: deficiencia enzimática en hígado y músculo. Se caracteriza por hepatomegalia, debilidad muscular, aumento CK. Se debe a mutaciones diferentes en el gen desramificante.  Tipo IIIb. 15% pacientes: deficiencia enzimática sólo hepática (en musculo tiene actividad normal), se debe a dos mutaciones diferentes en el exón 3, codón 6.  Hay también casos raros en los que la pérdida selectiva es solamente de una de las dos actividades desramificantes: glucosidasa (tipo IIIc) o transferasa (tipo IIId) Los síntomas desde las primeras etapas de la infancia varían de unos subtipos a otros:  Neonatos: temblores, sudoración, irritabilidad, apnea, coma, hipotonía, letargia, alteraciones nutricionales, dificultad respiratoria, bradicardia, muerte súbita.  Lactantes: malestar después de dormir, muy buen apetito, pero con retraso en el crecimiento. Pueden ocurrir complicaciones de la hipoglucemia a largo plazo como cirrosis, fallo hepático, adenomas, intolerancia al ejercicio, debilidad muscular, cardiomegalia y cardiopatía hipertrófica, pérdida de masa ósea. El diagnostico se basa en el análisis de laboratorio, histológico y diagnóstico prenatal. Análisis de laboratorio:  Glucemia, función hepática y perfil lipídico. 23 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8932928  Patología Molecular 2023-2024  Cuerpos cetónicos, lactato y ácido úrico tras ayuno leve.  Creatin quinasa sérica.  Test del glucagón.  Administración oral de galactosa o fructosa.  Actividad amilo-α(1-6)-glucosidasa en hígado, músculo o eritrocitos. Análisis histológico: Biopsia hepática o muscular en la que se ve la acumulación de glucógeno. Diagnóstico prenatal y consejo genético (en estudio)  Cultivo de amniocitos para análisis de enzima desramificante.  Diagnóstico genético preimplantacional. Tratamiento Se debe realizar un control dietético para evitar la hipoglucemia. Se hace una alimentación frecuente mediante sonda cada dos horas. En niños más mayores se les da almidón de maíz o glycosade (sustituto almidón de maiz). Además, se debe realizar un control por los diferentes servicios clínicos como gastroenterología (cirrosis), neurología (neuropatías) y cardiología (miocardiopatía hipertrófica). - Enfermedad de Andersen (tipo IV) La causa es la deficiencia de la enzima ramificante, es al contrario que el anterior, habrá un glucógeno - anormal con forma de amilopectina que hace que sea muy poco soluble y se va a acumular en todos los tejidos (hígado, músculo, corazón, sistema nervioso e intestino). Para el diagnostico se puede ver una acumulación de glucógeno con estructura anormal en biopsia hepática. Así mismo, se puede medir la actividad enzimática en biopsia de fibroblastos del músculo o leucocitos. Los síntomas son variables, dependen del tejido afectado. La forma clásica se manifiesta durante la lactancia y produce una lesión hepática grave (aumento AST y ALT). Hay tres formas: infantil neuromuscular, muscular del adulto y forma juvenil muscular y hepática. Gierke Cori Andersen -y + -I RESUMEN DE LAS GLUCOGENOSIS HEPATICAS 24 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8932928 - - - - 25  Patología Molecular 2023-2024 Se han descrito más de 200 mutaciones en el gen GAA (glucosidase-acid-alpha), localizado en el brazo largo del cromosoma diecisiete (17q). Hay varios subtipos clínicos definidos según la edad de aparición de los síntomas y la velocidad de progresión de la enfermedad: infantil, juvenil y adulta. Cuanto antes aparezcan más graves son. 1. Infantil: la actividad enzimática es prácticamente ausente. Se manifiesta durante el primer mes del nacimiento. Los bebes tendrán hipotonía grave, aspecto flácido, cardiomegalia, macroglosia, enfermedad respiratoria, hepatomegalia, dificultad para ingerir alimento, fragilidad ósea. Sin tratamiento, se produce el fallecimiento antes de los 2 años 2. Juvenil: presentan cierta actividad enzimática residual (entre 1-10%) por eso aparece más tarde. La manifestación se produce durante los 10 primeros años de vida. Tienen dificultad para alcanzar a tiempo las habilidades motoras propias de la edad. Además, entre los síntomas se encuentran debilidad muscular, insuficiencia respiratoria, neumonías recurrentes. Sin tratamiento, fallecen en la segunda década de la vida. 3. Adulto: es la más suave ya que la actividad enzimática está entre un 10-20%. La manifestación clínica aparece entre los 30 y 60 años, y se caracterizan por hipotonía muscular progresiva que afecta a músculos respiratorios y dificultad o imposibilidad para caminar. Es fundamental el diagnóstico precoz antes de que se desarrollen secuelas irreversibles. Para el diagnostico se puede realizar:  Análisis de Laboratorio: Niveles elevados de CK, GOT, GPT, GGT, LDH.  Pruebas cardiacas.  Electromiograma.  Biopsia muscular que se ve miopatía vacuolar por acumulación de glucógeno, característica únicamente de la enfermedad de Pompe.  Actividad enzimática α-glucosidasa ácida en leucocitos o muestra seca de sangre total. En el diagnóstico prenatal se puede ver la actividad enzimática en líquido amniótico o vellosidades coriónicas. No está incluida en la prueba del talón. Tratamiento Se basa en terapias paliativas que atenúan los síntomas, pero no curan la enfermedad, son:  El uso de diuréticos, beta-bloqueantes, bifosfonatos.  Se debe seguir una dieta hiperproteica pobre en hidratos de carbono.  Respiración asistida, ejercicios aeróbicos, fisioterapia. 26 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8932928  Patología Molecular 2023-2024  Prevención de infecciones respiratorias.  Monitorización de parámetros respiratorios. Además, hay algunas terapias en investigación como la terapia génica o terapias de regeneración muscular mediante el uso de células madre. Terapia de sustitución enzimática: Myozyme Retrasa de forma significativa la progresión de la enfermedad, pero los daños que ya han ocurrido. Se administra de forma endovenosa una forma precursora de la enzima capaz de penetrar en los lisosomas. Se obtiene mediante técnicas de ingeniería genética, y se conoce como alfa 1,4 glucosidasa humana recombinante. Se produce un aumento muy notable en las expectativas de vida (13 años en subtipo infantil) y una mejora generalizada de la afectación cardiaca y hepática. Se ha logrado detener de forma notable la acumulación de glucógeno en el diafragma y en el músculo esquelético. Es esencial el diagnóstico temprano y la edad de intervención. 27 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8932928 28  Patología Molecular 2023-2024  Hiperlipemias mixtas primarias: en las que aumenta tanto el nivel de triglicéridos, como de colesterol. Son: Hiperlipidemia familiar combinada (15%) y disbetalipoproteinemia familiar, esta última es prevalente.  Hipolipoproteinemias primarias: cursan con la disminución de alguna lipoproteína. Son la abetalipoproteinemia e hipoalfalipoproteinemias, que van a llevar a déficit de vitaminas, ya que las vitaminas liposolubles van disueltas en el interior de las partículas de LDL, QM.  Hiperlipoproteinemias secundarias (80%): La mayoría de las proteinemias son secundarias a otro proceso y se cura tratando el proceso primario. Por ejemplo, la dieta, alcohol, obesidad, hipotiroidismo, diabetes, enfermedades renales o hepáticas 3. Hipercolesterolemias primarias 3.1. Hipercolesterolemia familiar (5%) Es una enfermedad muy aterogenica. Tiene una transmisión autosómica dominante y es debida a más de 1600 mutaciones (dependiendo de la zonas geográfica se ven diferentes mutaciones) del gen rLDL que codifica para el receptor en el hígado principalmente de las LDL que se localiza en el cromosoma 19p13.2. Como consecuencia se produce un catabolismo retardado de las LDLc y la acumulación plasmática de la misma. Hay un importante efecto de la dosis génica:  Las formas heterocigotas presentan una alta prevalencia (1/500) y expresan aproximadamente el 50% de los receptores de LDL (catabolismo LDL 20%), además 1/20 supervivientes de un infarto agudo de miocardio antes de los 55 años padece HCF.  Las formas homocigotas, no lo son como tal ya que son heterocigotas compuestas, es decir, acumulan muchas mutación, son menos frecuentes y su prevalencia se estima en 1/1 millón de nacimientos y prácticamente no expresan receptores de LDL (catabolismo LDL 460 ms en las mujeres). Esto produce síncope, parada cardíaca y muerte súbita. Para el tratamiento se usan antiadrenérgico (bloqueadores beta) y el empleo de desfibrilador automático implantable (DAI). Los tres genes más representativos son (hay que saberlos): Para el diagnostico se realiza un panel que puede ser básico o ampliado. El rendimiento del test básico es de aproximadamente 75-80%. El valor clínico predictivo positivo (posibilidad de desarrollar la enfermedad a lo largo de la vida en portadores), dependerá de la variante identificada, siendo en promedio del 60%. Cerca del 5% de los casos pueden ser portadores de más de una variante en el mismo o distintos genes. La herencia es autosómica dominante, aunque también se puede encontrar la forma recesiva pero mucho más rara (síndrome de Jervell y Lange-Nielsen que produce sordera neurosensorial). Síndrome de Brugada (SB) Es una enfermedad arrítmica hereditaria. La mayoría de los pacientes con diagnóstico clínico son varones. Las manifestaciones clínicas más frecuentes son el síncope o la muerte subida durante el sueño o reposo. Tiene una prevalencia muy baja, de 0,1%. Es crucial la estratificación del riesgo para seleccionar a los pacientes de alto riesgo en quienes es probable que se obtenga un beneficio con un DAI ya que el corazón morfológicamente es normal. Tiene una herencia autosómica dominante. El diagnóstico se realiza mediante un panel de 28 genes que incluye el principal gen asociado al síndrome de Brugada (SCN5A) y un grupo de genes con evidencia clínica y funcional de asociación con estos síndromes. La probabilidad de detectar una mutación es del 30%. TVPC (taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica) Es un trastorno con una prevalencia de 1/10000. Está producido por mutaciones en los genes RyR2 (65%- AD) o CASQ2 (3-5%- AR) que dan lugar a un aumento de la liberación de calcio, produciendo arritmias. El rendimiento genético es de un 70-80% y la mayoría son mutaciones en el receptor de la rianodina (RyR2) y en la calsecuestrina cardiaca (CASQ2). Es una condición genética rara caracterizada por el desarrollo de arritmias ventriculares típicas desencadenadas por estrés físico o emocional. El desarrollo de arritmias ventriculares puede determinar síncope, parada cardíaca o muerte súbita, ocurriendo especialmente en niños o adultos jóvenes sin antecedentes. 90 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-9250024 91 92  Patología Molecular 2023-2024 se cree la proteína funcional. Se requeriría una tasa relativamente alta de mutagénesis somática para explicar la gran cantidad de quistes que se encuentran en los riñones poliquísticos. Resumen: Naces con una mutación germinal y a lo largo de tu vida se da una mutación puntual en esa ? misma sección que provoca la deleción completa de la proteína y provoca la enfermedad. No todas las mutaciones patogénicas que se producen alteran de la misma manera el funcionamiento de la proteína. Hay variantes patogénicas en las que la proteína está totalmente inactiva, pero otras son hipomorfas, es decir, que se crea la proteína, pero no tiene su función total, por lo que no todas las variantes son igual de agresivas y dependiendo la variante que presente tendrá diferente expresión. Además, parece ser que el sexo también afecta al desarrollo de la enfermedad. Las mujeres presentan la enfermedad de manera más severa, por lo que se cree que hay un papel hormonal (aún no se conoce). El mecanismo molecular no está del todo claro. Las proteínas implicadas son las policistina 1 y 2 (la 2 se encuentra en la membrana del RE) que se encuentran en la membrana y están unidas. Están implicadas en la regulación del transporte iónico a través de las células tubulares, en concreto en el transporte de Ca2+(importante señalizador molecular). Va a disminuir el calcio celular y aumentar el AMPc y esto va a hacer que se produzcan numerosos cambios celulares en las células que recubren los quistes, incluidas alteraciones en la polaridad apical-basal, la polaridad celular plana, un aumento de la producción de matriz extracelular y del metabolismo celular, que involucran funciones celulares esenciales como el transporte de líquidos, la proliferación, la apoptosis, adhesión celular y diferenciación. Cambios histopatológicos Pasos de formación de quiste: a) Túbulo normal e) Se llena de líquido extracelular y se forma el quiste. La proliferación de células epiteliales, la secreción anormal de líquido y el depósito excesivo de matriz extracelular son las principales características de las células epiteliales quísticas. Estos cambios van acompañados de alteraciones en la microvasculatura sanguínea periquística y linfática. La mayoría de los quistes se desprenden de los túbulos a partir de los cuales se forman y se llenan de líquido mediante secreción transepitelial. El agrandamiento del quiste comprime las nefronas circundantes, el intersticio y la vasculatura. Las nefronas obstruidas eventualmente forman glomérulos atubulares y túbulos proximales apoptóticos. Las citoquinas entre las células epiteliales e inflamatorias promueven más inflamación y fibrosis, formación de nuevos quistes y enfermedades progresión, que resulta en riñones masivamente fibróticos en enfermedades en etapa terminal. Al principio las nefronas no afectadas intentan compensar, pero al final se ve comprometido todo el riñón. 93 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50  Patología Molecular 2023-2024 Metodología en ADPKD: NGS Los genes son bastante grandes. El PKD1 es el que produce una enfermedad más agresiva y es el que vamos a encontrar frecuentemente mutado. Por el contrario, PKD2 es menos frecuente y severo. Además, un 5-10% de los casos no se resuelven con la genética o que encontremos mutaciones patogénicas en otro loci. Y un 10-15% de las familias presentan mutaciones de novo. Terapia Para tratar la presión elevada se utiliza antagonistas de la vasopresina (Receptor selectivo de arginina vasopresina V2), que pueden ser beneficiosos para pacientes con disfunción renal temprana. Estos bloquean el sistema renina-angiotensina-aldosterona. En fases más agudas hay que realizar diálisis o un trasplante renal. Para el resto de los pacientes el tratamiento es paliativo:  Se utilizan medicamentos antiinflamatorios y narcóticos para controlar el dolor abdominal o de espalda intenso.  Antibióticos de amplio espectro, para el tratamiento de infecciones del sistema urinario y de quistes renales.  Embolización de arterias renales para el tratamiento de la hematuria macroscópica. 2. Síndrome Alport Es un síndrome raro, de hecho, pertenece a las enfermedades raras. Al ser un síndrome no todos tienen la misma patología, es decir, hay un espectro de fenotipo. Puede ir desde enfermedad renal progresiva con anomalías extrarrenales, a hematuria aislada con un curso no progresivo o se observa un curso progresivo muy lento. Lo que nos hace sugerir que el paciente presenta esta enfermedad es:  Hematuria, proteinuria, hipertensión, insuficiencia renal que se desarrolla con la edad.  A nivel coclear puede haber perdida sensorial a sonidos de alta frecuencia.  A nivel ocular en la macula se ve como unos flecos y presentan lenticono anterior.  Por la historia familiar, no es tan sencilla como la anterior, hacemos historia de hematuria, sordera y enfermedad renal terminal. Además, también podemos ver mutaciones de novo. El diagnóstico a nivel genético es de los genes COL4A3, COL4A4 y COL4A5 que intervienen en la síntesis del colágeno, lo que provoca colágeno anormal IV α345 en la red de membranas basales. 94 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-9033967 95  Patología Molecular 2023-2024 Tratamiento No hay cura, pero mediante fármacos se bloquea el sistema renina-angiotensina-aldosterona, al igual que en la poliquistosis, disminuyendo la presión para disminuir la progresión de la enfermedad renal. En pacientes con sospecha se necesita una muestra de orina (normal o 24 horas) y en el laboratorio se mira la microalbuminuria, ya que la alteración de la membrana glomerular produce que se pase la albumina a la orina. Además, también se ve si hay hematuria. 96 97  Patología Molecular 2023-2024 Distrofina Xp21 ~ Se codifica por un gen en el cromosoma X. Se trata de un gen muy grande en el que solo hay 86 exones, y que tarda mucho (24 horas) en codificarse. Hay diferentes promotores en otros tejidos. Es una proteína tiene forma de bastón. Es intracitoplasmática y estabiliza el sarcolema y el citoesqueleto. Tiene 4 dominios: Dominio I. N-Terminal. Dominio II. Central. Tiene una triple hélice con los que se une a actina. Dominio III. Es rico en cisteína y se une a B-distroglucano. Dominio IV. C-Terminal. Se une a sintrofinas y distrobrevina. Se unen a la actina por el dominio I y II, por lo que son los dominios más importantes. Existen otras isoformas de menor peso molecular en otros tejidos con diferentes funciones. La naturaleza de las mutaciones es muy variada. Pueden ser: Delecciones: es la más común (65%). Mutaciones (30%). Duplicaciones (5%). No existe relación entre el tamaño y los síntomas. 3.1.2. Distrofia Duchenne Es la más grave, ya que no se sintetiza distrofina. Se debe a una delección que origina un triplete de parada. Un tercio de las mutaciones son de novo. Los síntomas no aparecen al nacer, sino que aparecen entre los 2-3 años, de forma simétrica de abajo a arriba. A los 12 años los pacientes necesitan una silla de ruedas. Además, van a presentar alteraciones cardiacas y tienen una esper