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Applications I. Banques d’ADN Définition : Les banques sont des « collections » de fragments d’ADN insérés dans des vecteurs de clonage, ces derniers étant introduits dans des bactéries qui assureront le maintien et la réplication du fragment d’ADN (« clone bactérien » : un fragment d’ADN par clone)...

Applications I. Banques d’ADN Définition : Les banques sont des « collections » de fragments d’ADN insérés dans des vecteurs de clonage, ces derniers étant introduits dans des bactéries qui assureront le maintien et la réplication du fragment d’ADN (« clone bactérien » : un fragment d’ADN par clone). L’objectif de la banque est donc de conserver une collection de fragments d’ADN (dans des clones cellulaires…) - Bien identifiés - Facilement manipulables - Que l’on peut produire en grande quantité Ici, l’ADN à cloner et le vecteur seront digérés par la même enzyme de restriction (clonage non orienté). Après ligation, on observe des vecteurs recombinants qui ont tous des inserts différents. Après transformation, chaque colonie est un « clone » de la banque. 1 1. Banques d’ADN génomique Définition : = collection de clones cellulaires qui, pris dans leur ensemble, contiennent la totalité de l’ADN génomique de l’organisme étudié. Chaque clone est une colonie de bactéries contenant un vecteur recombinant constitué d’un fragment de l’ADN génomique inséré dans un vecteur de clonage. Construction d’une banque d’ADN génomique - Isolation et purification de l’ADN génomique - Digestion enzymatique ménagée (fragmentation de l’ADN) - Digestion enzymatique du vecteur de clonage (site unique dans MCS) - Incorporation de chaque fragment dans un vecteur à obtention de vecteurs recombinants et non recombinants Digestion ménagée/partielle d’un fragment d’ADN - Transformation de bactéries compétentes à obtention de cellules transformées et non transformées - Sélection des bactéries transformées (ici, résistance à l’ampicilline) - Criblage des bactéries transformées par un vecteur recombinant (ici, crible « blanc-bleu » - Culture des clones cellulaires sélectionnés 2 2. Banques d’ADNc Définition : = collection de clones cellulaires qui, pris dans leur ensemble, contiennent la totalité des ADN complémentaires (ADNc) de l’organisme étudié. Qu’est-ce qu’un ADNc ? Un ADNc, ou ADN complémentaire, est un ADN qui « correspond » à un ARN. L’ADNc est artificiellement synthétisé à partir d’un ARNm mature extrait d’une cellule donnée à un moment donné, il représente donc la partie codante du génome. à Excellent outil pour étudier les gènes exprimés dans certains types de cellules/tissus/organes/modèles à un moment donné mais également dans le temps (cinétique) ou en fonction de variations environnementales… L’ADNc est obtenu après 2 étapes - Réaction de transcription inverse (reverse transcription) d’un ARNm qui conduit à la synthèse d’un ADNc simple brin Copie du premier brin par une ADN polymérase pour donner un ADNc double brin - La reverse transcriptase utilise une matrice ARN pour synthétiser de l’ADN (ADN polymérase ARN dépendante). L’ADN polymérase utilise une matrice d’ADN pour synthétiser de l’ADN (ADN polymérase ADN dépendante). Un ADNc est donc une molécule d’ADN (simple ou double brin) qui n’existe pas in vivo : il s’agit d’une molécule obligatoirement synthétisée in vitro. 1) étape 1 : transcription inverse 1- Purification des ARNm : beaucoup des ARN ne nous intéressent pas, les ARNm sont 3-5% des ARN totaux. Les ARNm ont une queue polyA qui sert d’étiquette. On utilise des billes recouvertes d’oligo dT, qui vont interagir avec la queue polyA des ARNm. Des rinçages permettront d’éliminer les ARN non ARNm qui ne seront pas fixés aux billes. La récupération des ARNm se fait par élution. 3 Réaction de reverse transcription Les ARN sont fragiles, ils se dégradent facilement, donc pour freiner les RNases (présentes partout) on ajoute des inhibiteurs chimiques de RNases. L’élongation se fait à 42°C, les oligodT interagissent avec la queue polyA, la reverse transcriptase se fixe sur le 3’OH du dernier T et commence à produire l’ADNc à duplex ARN/ADN. 2) étape 2 : synthèse du 2e brin Méthode 1 - Dégradation de l’ARN à la soude, ajout d’une extension polyG - Hybridation avec une amorce oligo dC - Synthèse du brin complémentaire par l’ADN polymérase Méthode 2 - Digestion ménagée à la RNase H : elle digère uniquement l’ARN lorsqu’il est complexé à de l’ADN. La digestion ménagée permet de conserver des fragments d’ARN antiparallèles au brin d’ADNc - On ajoute l’ADN polymérase I, qui va synthétiser l’ADN et dégrader les « amorces » à on obtient le brin complémentaire au premier. 4 Clonage d’une banque d’ADNc On va pouvoir avoir une ligation de part et d’autre de l’ADNc double brin par une ligation d’adaptateur : on ajoute un site de restriction à chaque extrémité (ici pour ECOR1). Ensuite, on digère le fragment par une enzyme de restriction (ici ECOR1), puis on effectue la transformation. Ø Cribler une banque d’ADN Hybridation sur colonies Le criblage vient après le clonage. L’hybridation sur colonies nécessite une réplique des colonies, on ne peut rien faire sur la boîte de Pétri elle-même. On prend une membrane de nitrocellulose (forte affinité pour les acides nucléiques) que l’on pose sur la boîte de Pétri, on fait des marquages pour s’y repérer. Une fois la réplique faite, on effectue une lyse des bactéries et une dénaturation de l’ADN (double étape) ; puis on incube avec une sonde dénaturée radioactive spécifique de la séquence que l’on cherche. Une hybridation spécifique va se faire entre la sonde et les colonies bactériennes contenant une partie du gène ou le gène. On visualise les colonies qui se sont hybridées avec la sonde par autoradiographie. On repère ensuite les colonies d’intérêt dans la boîte de Pétri (en comparant avec la membrane). 5 Construction d’une banque d’ADNg La sélection des bactéries transformée se fait sur un milieu avec antibiotique (comme dans un clonage classique) à élimine le bactéries non transformées Le criblage blanc-bleu (interruption de gène) à discrimine les bactéries non recombinantes. L’hybridation sur colonies permet d’identifier les colonies qui ont la séquence du gène d’intérêt. Origine de l’ADN Type de vecteur de clonage utilisé / taille des fragments d’ADN Pour quelle utilisation ? Banque d’ADNc Banque d’ADNg ADNc obtenus par réverse-transcription d’ARNm : or la présence d’un messager ADNg de n’importe quelle cellule donné dépend du tissu étudié. Digestion partielle, clones Tissu et stade du développement à « chevauchants » spécifier ! Cosmides : insert