Altfragen Preiß Landl PDF

Altfragen Preiß-Landl ### Beschreiben Sie in ein paar Sätzen das Prinzip des Polony- Sequencing Polony-Sequenzierung ist eine Methode der DNA-Sequenzierung, die auf der Amplifikation von einzelnen DNA-Molekülen basiert. Dabei werden die DNA-Moleküle in winzige DNA-\"Polonies\" immobilisiert, die d...

Altfragen Preiß-Landl ### Beschreiben Sie in ein paar Sätzen das Prinzip des Polony- Sequencing Polony-Sequenzierung ist eine Methode der DNA-Sequenzierung, die auf der Amplifikation von einzelnen DNA-Molekülen basiert. Dabei werden die DNA-Moleküle in winzige DNA-\"Polonies\" immobilisiert, die durch PCR (Polymerasekettenreaktion) erzeugt werden. Jede Polonie repräsentiert eine einzelne DNA-Vorlage und wird dann mit Fluoreszenzmarkern markiert und sequenziert. Durch Wiederholung dieses Prozesses für viele Polonies können große Mengen von DNA parallel sequenziert werden, was zu schnellen und kostengünstigen Sequenzierungsergebnissen führt. ### Was sind Phylochips? Phylochips sind mikroarraybasierte Technologien, die verwendet werden, um die genetische Vielfalt und Evolution von Organismen zu untersuchen. Sie enthalten spezifische DNA-Sonden, die auf bestimmte genetische Marker abzielen, die für verschiedene Arten charakteristisch sind. Durch Hybridisierung der DNA-Proben eines Organismus mit den Sonden auf dem Phylochip können Forscher die genetische Zusammensetzung eines Organismus identifizieren und mit anderen Arten vergleichen. Phylochips werden häufig in der Phylogenie, der Erforschung von Stammbäumen und der Untersuchung der Evolution verwendet, um Verwandtschaftsbeziehungen zwischen verschiedenen Arten zu untersuchen. ### Beim „pyrosequencing" werden die Reaktionslösungen ständig ausgetauscht. Wie wird sichergestellt, dass die arbeitenden Enzyme nicht aus den „nano-liter-filterchambers" geschwemmt werden? Um sicherzustellen, dass die arbeitenden Enzyme nicht aus den Nano-Liter-Filterkammern geschwemmt werden, werden verschiedene Methoden angewendet: 1\. Verwendung von speziellen Filtern: Die Nano-Liter-Filterkammern enthalten spezielle Filter, die die arbeitenden Enzyme zurückhalten, während die Reaktionslösung ausgetauscht wird. Diese Filter ermöglichen den Durchtritt von Flüssigkeit, halten aber die Enzyme zurück. 2\. Kontrollierter Flüssigkeitsaustausch: Der Flüssigkeitsaustausch wird kontrolliert und langsam durchgeführt, um eine übermäßige Strömung zu vermeiden, die Enzyme aus den Filterkammern schwemmen könnte. 3\. Verwendung von Puffern und Bindemitteln: Pufferlösungen und Bindemittel können verwendet werden, um die Enzyme in den Filterkammern zu stabilisieren und sie vor dem Austreten während des Flüssigkeitsaustauschs zu schützen. Durch diese Methoden wird sichergestellt, dass die arbeitenden Enzyme während des pyrosequencing-Prozesses in den Nano-Liter-Filterkammern verbleiben und die Reaktionslösungen ausgetauscht werden können, ohne die Sequenzierungsreaktion zu beeinträchtigen. ### Nennen Sie zwei strategische Zugänge zur Sequenzierung eines gesamten Genoms? Whole-Genome Shotgun-Sequenzierung (WGSS): Bei diesem Ansatz wird das gesamte Genom zufällig in kleine Überlappungsfragmente zerkleinert, die dann sequenziert werden. Die Sequenzfragmente werden anschließend mithilfe von Computeralgorithmen zu einem zusammenhängenden Genom zusammengesetzt. Diese Methode wurde für die Sequenzierung vieler organischer Genome, einschließlich menschlicher Genome, verwendet. Next-Generation-Sequenzierung (NGS): Diese Technologie umfasst eine Reihe von Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden, die es ermöglichen, große Mengen an DNA schneller und kostengünstiger zu sequenzieren als die Sanger-Sequenzierung. Dazu gehören Methoden wie Illumina-Sequenzierung, Ion Torrent-Sequenzierung, und Oxford Nanopore-Sequenzierung. NGS-Technologien haben die Sequenzierung großer Genome revolutioniert und sind heute die am häufigsten verwendeten Ansätze für genomweite Sequenzierungsprojekte. ### Welche Methoden gibt es, um falsch positive Ergebnisse in der PCR hintanzuhalten? (7 Punkte) getrennte post- und prä PCR-Räume wattegestopfte Pipettenspitzen sterile Plastikware Mitführen von Negativ-Kontrollen sauberes Arbeiten UTP statt TTp und UTPase zur Zerstörung UV als Dekontamination Es gibt mehrere Methoden, um falsch positive Ergebnisse in der PCR (Polymerasekettenreaktion) zu verhindern: 1\. Kontrollexperimente: Durch die Einbeziehung von Negativkontrollen, die keine Ziel-DNA enthalten, und Positivkontrollen, die bekannte Ziel-DNA enthalten, können Verunreinigungen und falsch positive Ergebnisse identifiziert werden. 2\. Verwendung von spezifischen Primern: Die Auswahl spezifischer Primer, die nur an die gewünschte Ziel-DNA binden, reduziert die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation und falsch positiver Ergebnisse. 3\. Optimierung der PCR-Bedingungen: Die Optimierung von Temperaturzyklen, Primerkonzentrationen und anderen Reaktionsbedingungen kann dazu beitragen, unspezifische Amplifikationen zu minimieren und die Spezifität der Reaktion zu erhöhen. 4\. Verwendung von Hot-Start-PCR: Bei der Hot-Start-PCR wird die Reaktion bei niedriger Temperatur gestartet, um die Aktivität der Polymerase zu blockieren, bis die optimale Reaktionstemperatur erreicht ist. Dadurch werden unspezifische Amplifikationen reduziert und die Spezifität verbessert. 5\. DNA-Reinigung und -Aufbereitung: Eine sorgfältige Reinigung und Aufbereitung der DNA-Proben vor der PCR kann Verunreinigungen reduzieren und die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Ergebnisse verringern. ### Geben Sie 2 Arten von Sonden in der quantitavien PCR an und erklären Sie diese Sonden Taq-Sonde Oligonukleotid 5´Ende Flourophor 3´Ende Quencher Hydrolyse-Sonde Taq-Polymerase hat 5\'-3\' Exonukleaseaktivität und entfernt Fluorophor bei Gegenstrangsynthese dann flouresziert es erst da Quencher weit genug weg TaqMan-Sonden: TaqMan-Sonden sind spezifische Oligonukleotid-Sonden, die mit einem fluoreszierenden Reporterfarbstoff und einem quencher-Bereich markiert sind. Während der PCR bindet die Sonde an ihre komplementäre Sequenz innerhalb des Amplifikationsprodukts. Die Taq-Polymerase, die während der Amplifikation die DNA synthetisiert, spaltet die Sonde, wodurch der Reporter vom Quencher getrennt wird. Dies führt zu einer Zunahme des Fluoreszenzsignals, das während der PCR detektiert wird. TaqMan-Sonden bieten eine hohe Spezifität, da sie nur bei spezifischer Hybridisierung mit dem Amplifikationsprodukt ein Signal erzeugen. Sie sind weniger anfällig für unspezifische Bindungen und Verunreinigungen als SYBR Green-Sonden. SYBR Green-Sonden: SYBR Green ist ein DNA-Farbstoff, der während der PCR an die doppelsträngige DNA bindet. Es wird als interkalierender Farbstoff verwendet, der während der Amplifikation an die entstehenden PCR-Produkte bindet. Die Intensität des fluoreszierenden Signals nimmt mit zunehmender Anzahl der Amplifikationsprodukte zu. SYBR Green-Sonden erfordern keine spezifischen Sonden für das Amplifikationsziel und können daher für die Detektion einer Vielzahl von DNA-Sequenzen verwendet werden. Sie sind jedoch anfälliger für unspezifische Bindungen und können zu falsch positiven Ergebnissen führen, wenn Verunreinigungen oder unspezifische Amplifikationsprodukte vorhanden sind. ### Was sind DNA-microarrays? Oligonukleotide, cDNA oder Fragmente von PCR-Produkten auf Trägermaterial gedruckt (gibt es auch syntethisch) dienen als Sonden an definierten Positionen mRNA vorher zu cDNA und z.B. fluoreszeznmarkiert cDNA hybridisiert an komplementären Gegenpart auf Micro Array große Anzahl an Informationen auf kleinem Raum (kann man ev. besser formulieren) Position, Farbe und Intensität jedes Punktes gibt Aufschluss über Expressionsrate Anwendung: Pflanzen und transgene Pflanzen, Genexpressionsmuster (Verlauf einer Krankheit) ### Nennen Sie 2 alternative Sequenzierungsmethoden Polony Sequencing, molecular resonance sequencing Zwei alternative Sequenzierungsmethoden neben der geläufigen Next-Generation-Sequenzierung (NGS) sind: 1\. Einzelstrang-Sequenzierung: Diese Methode basiert auf der Sequenzierung einzelner Stränge von DNA oder RNA. Sie ermöglicht die Sequenzierung von langen DNA- oder RNA-Molekülen, indem sie sie in einzelne Stränge aufteilt und jeden Strang nacheinander sequenziert. Ein Beispiel für eine Einzelstrang-Sequenzierungstechnologie ist die Nanopore-Sequenzierung. 2\. Einzelmolekül-Sequenzierung: Im Gegensatz zu traditionellen Methoden, bei denen eine Population von DNA-Molekülen sequenziert wird, ermöglicht die Einzelmolekül-Sequenzierung die Sequenzierung eines einzelnen DNA- oder RNA-Moleküls. Diese Methode bietet eine höhere Auflösung und kann Informationen über individuelle molekulare Variationen liefern. Eine bekannte Einzelmolekül-Sequenzierungstechnologie ist die Einzelmolekül-Real-Time-Sequenzierung (SMRT) von PacBio. ### Beschreiben Sie in ein paar Sätzen das Prinzip des Polony- Sequencing! (5) Vorteil: Library kann man nur durch PCR erzeugen, also rein in vitro - Zellfreie Methode bis auf Sample DNA. A. Generierung einer Mate Pair Library z.B. genomische DNA von einem MO wird zu 1 kb Fragmente gesheared. B. end repair der Fragmente; Erzeugung von blutned ends wodurch blunt end Ligation möglich mit Adaptoren (dadurch wird Koppelung mit Linker ermöglicht). DNA mit ca. 1kb wird durch PAGE selektiert und die 1 kbp Fragmente werden mit einem Linker (T30) zirkularisiert. Im Linker sind 2 Recognition sites für Mme1(Type II RE) der aber ca. 30 bp entfernt von der recognition site schneidet. Als Resultat erhält man ca. 70 bp große paired end Fragmente. C. Amplifikation der zirkularisierten DNA mittels Emulsions-PCR. An jedes Bead bindet jeweils 1 Sample Molekül (mittels universial Sequences) und wird stark amplifiziert. D. Enrichment jener Beads an denen Amplifikation stattgefunden hat - isolieren von Beads wo Amplifikation stattgefunden hat E. Monolayer: Mischung der Beads mit Polyacrylamid. F. Sequencing durch Ligation - Solid Durch identifizierung der Enden der Fragmente, können Primer designed werden die die gesamten 1 kB Fragmente ermöglichen. Durch allignment der Fragmente kann die gesamte Genomsequenz rekonstruiert werden. Man hat einen Haufen DNA Fragmente die zum Teil aus universellen Bereichen bestehen. Diese können spezifisch mit Primern angesteuert werden. Man kennt Schnittstellen. Die gelben Bereiche kennt man nicht. Polymerase colony - ist eine kostengünstige aber sehr genaue multiplex Sequenzierungstechnik die verwendet werden kann um Millionen von immobilisierten DNA sequenzen paralell lesen kann. 3 wesentliche Schritte: A. Paired end-tag library construction B. Template Amplification C. DNA Sequencing ### Was sind Phylochips? (6) Phylochips sind Mikroarrays, die speziell für die Analyse von genetischen Variationen in verschiedenen Organismen entwickelt wurden, insbesondere für phylogenetische Studien. Diese Chips enthalten spezifische Sonden oder Oligonukleotide, die sich an bekannte DNA-Sequenzen bestimmter Organismen oder Taxa binden können. Durch Hybridisierung mit DNA-Proben können Phylochips verwendet werden, um genetische Informationen über die Evolution und Verwandtschaft zwischen verschiedenen Arten oder Populationen zu untersuchen. Typischerweise werden Phylochips in der Genomik und Phylogenie eingesetzt, um genetische Unterschiede zwischen Organismen aufzudecken, Verwandtschaftsbeziehungen zu rekonstruieren und evolutionäre Veränderungen zu analysieren. Sie können auch dabei helfen, phylogenetische Bäume zu konstruieren und evolutionäre Abstammungslinien zu rekonstruieren, indem sie genetische Variationen über verschiedene Taxa hinweg identifizieren. Phylochips sind ein nützliches Werkzeug für die Erforschung der Biodiversität und der Evolutionsgeschichte verschiedener Organismen. 16s rRNA von 1000 von Spezies ist auf einem Chip gespottet und dadurch kann man phylogenetische Ähnlichkeiten herausfinden. Die 16s rRNA von MO wird durch RT auf cDNA umgeschrieben und diese sind auf dem Phylochip gespottet. Durch Hybridisierung mit der 16s rRNA einer neuen Spezies können Ähnlichkeiten und Unterschiede zu den bekannten Spezies festgestellt werden Kollektion an 16srRNA \"signature sequences\" 1000 Stämme mit Kollektion von je 100 Fragmenten. z.B:: zur Identifizierung von einem Organismus Wird verwendet für: SNP Detektions Arrays Mutation Array Analyse Vergleichende genomische Hybridisierung ### Beschreiben Sie 2 alternative Sonden FRET - fluorescence resonance energy transfer: Man regt immer mit einem Absorptionsspektrum an. Wenn Reporter und Quencher in der Nähe erhält man E2. Wenn beide getrennt sind, dann hat man entweder nur E1 oder beide wenn man mit A1 und A2 anregt. Der Förster-Resonanzenergietransfer, ist ein physikalischer Prozess der Energieübertragung. Im Rahmen des FRET wird die Energie eines angeregten Farbstoffs (Donor) auf einen zweiten Farbstoff (Akzeptor) übertragen. Die Energie wird dabei strahlungsfrei und somit nicht über eine Abgabe (Emission) und Aufnahme (Absorption) von Lichtteilchen (Photonen) ausgetauscht. Auf dem FRET basiert beispielsweise der Lichtsammelkomplex Photosynthese betreibender Organismen. In der Biochemie und der Zellbiologie findet der FRET insbesondere unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen als „optisches Nanometermaß" Anwendung, da die Intensität unter anderem vom Abstand von Donor und Akzeptor abhängt und im Bereich von bis zu 10 nm beobachtet werden kann. Im Rahmen der auf der Messung des FRET basierenden Protein-Protein- Interaktionsstudien werden die zu untersuchenden Proteinpaare mit Hilfe von Paaren fluoreszierender oder sonstiger lumineszierender Farbstoffe markiert, sodass bei einer Interaktion der zu untersuchenden Proteine eine Zunahme des FRET zwischen den gekoppelten Farbstoffen beobachtet werden kann. Diese auf dem FRET basierenden Protein-Protein-Interaktionsstudien werden beispielsweise zur Aufklärung von Signalweiterleitungswegen in der Zelle und bei der Suche nach neuen Wirkstoffen mit Hilfe des Hochdurchsatz-Screenings eingesetzt. (Messung Abnahme der Donorfluoreszenz oder Zunahme der Akzeptorluoreszenz) A. Molecular Beacons: man hat eine Sonde die einen Loop - in Stem loop form zeigt zeigt der Reporter kein Signal. Durch die Anlagerung an die komplementäre DNA wird die Sonde gestreckt und die Reporterfluoreszenz wird detektierbar B. Scorpion Primer: Kombination zwischen 5\' Primer und molecular beacon: der 5\' primer ist mit Reporter und Quencher ausgestattet. Durch komplementäre Basenpaare bildet dieser eine Sekundärstruktur aus. Wenn der Primer annealt, dann werden Reporter und Quencher getrennt. C. Lux-Primer: (Oligonukleotide mit spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen markiert). Die Intensität der Fluoreszenz hängt von der jeweiligen chemischen Umgebung ab. Bei Einbau ins Amplifikationspordukt kommt es zu einer Zunahme an Fluoreszent. ### Nennen Sie 2 Methoden, um ein Genom zu sequenzieren (2) Zur Sequenzierung eines Genoms stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Hier sind zwei häufig verwendete Methoden: 1\. \*\*Next-Generation-Sequenzierung (NGS)\*\*: Diese Methode, auch als Hochdurchsatz-Sequenzierung bezeichnet, umfasst eine Reihe von Technologien, die es ermöglichen, große Mengen an DNA schnell und kostengünstig zu sequenzieren. NGS-Plattformen wie Illumina, Ion Torrent und Oxford Nanopore verwenden verschiedene Ansätze, um DNA in Fragmente zu schneiden, diese Fragmente zu amplifizieren und dann die Basenabfolge in den Fragmenten zu bestimmen. Durch die parallele Sequenzierung vieler Fragmente können NGS-Technologien große Genome effizient sequenzieren. 2\. \*\*Sanger-Sequenzierung\*\*: Die Sanger-Sequenzierung ist eine klassische Sequenzierungsmethode, die auch als Kettenabbruch-Methode bekannt ist. Sie basiert auf der enzymatischen Synthese von DNA in vitro, bei der dideoxynukleotid-Terminatoren die DNA-Synthese anhalten, sobald sie in die wachsende DNA-Kette eingebaut werden. Durch Zugabe von markierten dideoxynukleotiden und Gel-Elektrophorese können die terminierten Fragmente nach ihrer Länge getrennt und die Sequenz abgelesen werden. Sanger-Sequenzierung wird immer noch häufig für die Sequenzierung kleinerer DNA-Fragmente und für die Validierung von 13. Vorteile von Nested PCR. Was ist es? ### ### Was ist eine Multiplex PCR (3) ### ### Was ist Schmelzpunktanalyse, wozu und wann wird sie eingesetzt? (7) 1. Bei der qPCR kann man das Problem der Spezifität lösen. Durch eine Schmelzpunktanalyse. Nach abgelaufender PCR macht man eine Schmelzpunktanalyse und wenn sie normal abgelaufen ist erhält man 1 Amplifikationsprodukt. Durch Aufschmelzen der Fragmente denaturiert man den DNA ds und das SYBR Green wird frei. Den Schmelzkurve kann durch den Signalverlust bestimmt werden Man bekommt eine eindeutige Schmelzkurve - Zusammenhang zw. Temperatur und Abnahme der Fluoreszenz. Wenn man 1 Amplifikationsprodukt hat bekommt man nur eine Schmelzkurve. Wenn man mehrere Produkte hat bekommt man mehrere Kurven. In der Schmelzpunktanalyse sieht man ob PCR spezifisch oder unspezifisch war. 2. Die Schmelzpunktanalyse, auch als Schmelzkurvenanalyse oder Schmelzkurven-Monitoring bezeichnet, ist eine Technik, die verwendet wird, um die Schmelzkurven von Nukleinsäuren zu untersuchen. Sie basiert auf der Veränderung der Absorptionseigenschaften von DNA oder RNA in Abhängigkeit von ihrer Schmelztemperatur. 3. 4. Bei der Schmelzpunktanalyse wird die Temperatur langsam erhöht, und dabei wird die Absorption oder Fluoreszenz der Nukleinsäure-Moleküle gemessen. Wenn die Temperatur steigt, trennen sich die Basenpaare der Doppelhelix, und die Nukleinsäure-Moleküle denaturieren oder schmelzen. Der Punkt, an dem die Hälfte der Moleküle denaturiert ist, wird als Schmelzpunkt bezeichnet. 5. 6. Die Schmelzpunktanalyse wird für verschiedene Zwecke eingesetzt: 7. 8. 1\. \*\*Bestimmung der Schmelztemperatur (Tm)\*\*: Die Schmelzpunktanalyse ermöglicht die Bestimmung der Schmelztemperatur von DNA- oder RNA-Fragmenten. Die Tm ist die Temperatur, bei der die Hälfte der DNA-Doppelstränge in einer Lösung denaturiert ist. Die Tm hängt von der Basenzusammensetzung, der Länge der Nukleinsäure und den Lösungsbedingungen ab. 9. 10. 2\. \*\*Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen\*\*: Die Schmelzpunktanalyse kann verwendet werden, um die Identität und Homogenität von Nukleinsäuresequenzen zu bestätigen. Unterschiedliche Sequenzen haben unterschiedliche Schmelztemperaturen, daher kann die Schmelzkurvenanalyse verwendet werden, um verschiedene Sequenzen zu unterscheiden. 11. 12. 3\. \*\*Mutationserkennung und Genotypisierung\*\*: Die Schmelzpunktanalyse wird auch zur Detektion von Mutationen oder genetischen Varianten verwendet. Durch die Untersuchung von Schmelzkurven können Unterschiede in der Schmelztemperatur zwischen Wildtyp- und mutierten Sequenzen erkannt werden. 13. 14. 4\. \*\*Quantitative PCR (qPCR)\*\*: In der quantitativen PCR wird die Schmelzkurvenanalyse oft als zusätzlicher Schritt nach der Amplifikation verwendet, um die Spezifität der Amplifikationsprodukte zu bestätigen und unspezifische Produkte zu identifizieren. 15. 16. Die Schmelzpunktanalyse ist daher eine vielseitige Technik, die in der molekularen Biologie und Diagnostik weit verbreitet ist und eine schnelle und sensitive Methode zur Charakterisierung von Nukleinsäuren ermöglicht. 17. 18. 10\. Was ist Shotgun-Sequenzing? Gehen Sie auf je einen Vor und Nachteil ein! (5) Strategie um große Mengen an DNA zu sequenzieren z.B.: whole genome wobei die sample DNA in viele kleine Fragmente gespalten wird. Diese Fragmente werden paralell amplifiziert und sequenziert und mittels Bioinformatik werden überlappende Bereiche rekunstruiert. Man kann dadurch die Gesamtsequenz feststellen. Vorteil: Günstigere und schnellere Sequenzierung großer DNA Mengen Heutzutage kann man fast nur in vitro arbeiten - kein Subklonieren mehr nötig Gute Coverage weil überlappende Bereiche mehrfach sequenziert werden Hohe Anzahl an Polymorphismen kann festgestellt werden Nachteil: Man erhält GAPs die sich manchmal nicht allignen lassen Manche Inserts lassen sich nicht in allen Vektoren konieren - daher Verwendung mehrerer Vektoren nötig Repeated sequences erschweren die Erlappung der Gesamtsequenz 19. 11\. Nested Deletions ? (5) 20. 12\. Was sind DNA Microarrays? (6) Microarrays sind Hochdurchsatzverfahren der Molekularbiologie mit einem breiten Einsatzgebiet mit dem man viele einzigartige Moleküle in einem biologischen System paralell analysieren kann. Ein Microarray ist eine solide Platte auf der Proben von DNA fixiert sind. Diese sind in einer hohen Dichte im Grid-Format angeordnet. z.B.: Expressionsanalyse von MO zu unterschiedlichen Bedingungen ; man kann feststellen zu welchen Zeitpunkten welche Gene exprimiert werden ; qualitative und quantitative Analyse ist möglich ; mittels Bioinformatischen Methoden wird Wenn man sich auf die mRNA bezieht meint man das Expressionsprofil. Transkriptionsaktivität der Zelle sieht man. Durch die Entwicklung von cDNA Libraries begann man Genom Analysen der Genexpression durchzuführen. DNA Microarrays sind eine Kollektion von DNA spots die an eine solide Oberfläche f ixiert sind. Multiplex hybridisierungen werden angewand um große Zahlen von genspezifischen DNA Proben simultan zu analysieren ; DNA Variationen / Profiling of gene expression Jeder DNA spot enthält eine spezifische DNA sequenz die auch Probe (Reporter oder oligos) genannt werden - kann eine kurze Sequenz von einem Gen sein und wird verwendet um dies mit cDNA (Probe) zu hybridisieren z.B.: von mRNA die in der Zelle ist. Durch RT auf cDNA umgeschrieben. Die Probe wird mit einem Fluoreszenzmarker markiert. Die hybridisierung kann via fluorophor oder chemiluminescenc gelabelten Targets detektiert werden. Durch Hybridisierung der Probe mit dem Sample erhält man ein spezifisches Signal welches mit einem CCT Detektor erfasst wird. Da bekannt ist welcher Spot welches Gen repräsentiert kann das Expressionsmuster des z.B.: MO genau bestimmt werden. ANwendung von Microarrays: Expressionsanalyse - Messung des mRNA leves eines Gens relativ zu einer Referenz Untersuchung von Splicevarianten SNP Analyse microRNA Profiling Methylierungsanalyse Phylochips - 16s rRNA von 1000 von Spezies ist auf einem Chip gespottet und dadurch kann man phylogenetische Ähnlichkeiten herausfinden. Die 16s rRNA von MO wird durch RT auf cDNA umgeschrieben und diese sind auf dem Phylochip gespottet. Durch Hybridisierung mit der 16s rRNA einer neuen Spezies können Ähnlichkeiten und Unterschiede zu den bekannten Spezies festgestellt werden 21. 13\. Nennen Sie 2 alternative Sequenzierungsmethoden (2) A. Polony Sequenzierung B. Molecular Resonance Sequencing 22. 14\. Geben Sie 2 Arten von Sonden in der quantitativen PCR an und erklären Sie diese Sonden! (5) A. TaqMan Sonde Wird in dem zu amplifizierenden Bewreich zentral positioniert. Hat am 5\' und 3\' Ende des Oligos den Fluoreszenzfarbstoff also Reporter und Quencher. Wenn die DNA Pol (5\'3\' Exonucleaseaktivität) während des Synthesevorgangs auf die Sonde trifft wird diese abgebaut und der Reporter und Qencher werden getrennt, die Reporter Fluoreszenz kann gemessen werden. Die Messung findet am Ende der Elongation in jedem Zyklus statt. B. Hybridization probes oder Light Cycler Sonden Es sind 2 Oligos. Reporter und quencher am 3\' und 5\' Ende. Die beiden Oligos binden benachbart an der target Sequenz und bringen damit Reporter und Quencher in ausreichende Nähe. Die Messung findet am Ende der Annealing Phase statt. Zuerst hat man E1 und E2 und bei richtigem Annealing hat man dann beide Zusammen und nur E2. Sonde enthält 2 Fluoreszenzfarbstoffe: Reporter und Quencher Fluoreszenzfarbstoff. Das Tempalte wird denaturiert. Die Primer und die Sonde wird dazugegeben. Die Primer und die Sonden binden. Erhöhte Spezifität, denn 3 Nukleotide müssen den richtigen Platz finden, dass die rxn ablaufen kann. Man Amplifiziert und kommt zur Sonde hin. Die DNA Pol hat auch eine 5\'-3\' Nuklease aktivität und baut die Sonde ab und amplifiziert weiter. Dadurch, dass die Sonde abgebaut wird, wird ein Signal ausgelöst von Fluoreszenzfarbstoff. Dies wird über CCT Kamera detektiert. Je mehr von den Amplifikationsprodukten vorhanden sind, desto stärker das Signal. Prinzip von Sonden Sonden mit 2 unterschiedlichen Fluoreszierenden Farbstoffen um ein optisches System auszunutzen: FRET. Man trennt Sonden voneinander und dann hat man die Möglichkeit, schaut man auf E1 oder E2 und in welcher Phase \"Elongation\" oder \"Annealing\" man auf die Emission schaut. Wird bei einer spezifischen PCR mithilfe von Sonden eingesetzt. 2 unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe. Jeder hat ein Anregung und Emmisionsspektrum Das Emmissionsspektrum vom 1. ist gleich das Anregungsspektrum vom 2. d.h.: wenn die in unmittelbarer Nähe sind, dann quencht der Quencher Farbstoff den REporter Farbstoff. Wenn man den 1. Reporterfarbstoff mit dem Licht des Anregungsspektrums anregt, dann wird das Emissionsspektrum dazu benötigt den 2. Farbstoff anzuregen und man sieht nur das Emissionsspektrum vom Quencher. Dies ist nur der Fall wenn beide Farbstoffe in unmittelbarer Nähe sind. Wenn beide getrennt sind, dann sieht man alle. Sowohl E1 als auch E2. Dies Nutzt man aus. Wenn Primer annealed und Sonde annealed, dann sind die beiden in Nachbarschaft. Der Quencher quencht den Reporter und man hat nur das Emissionsspektrum vom Quencher. Wenn die DNA Pol dort hinkommt und die SOnde abbaut, dann setzt sie den Reporterfarbstoff frei und damit wird die räumliche Nachbarschaft aufgelöst und man sieht das Emmissionsspektrum vom Reporterfarbstoff. Genau das Detektieren wird. Mit diesem Signal weis man, dass man das richtige Signal hat. Also man ist an der richtigen Stelle. 23. 15\. Wofür wird die DNA Urazil Glykosylase in der PCR verwendet? Wird bei der enzymatischen Dekontamination verwendet. Zur Verhinderung einer ungewollten Amplifikation von DNA-Kontaminationen können wir statt dTTP - dUTPs als Nukleotidsubstrat einsetzten. Neusynthetisierte DNA die dUTPs beinhaltet kann so spezifisch entsorgt werden indem das Enzym Uracil-N-Glycosylase mit in den PCR Ansatz gegeben wird. Dieses Enzym zerstört alle, aus anderen Reaktionen stammende DNA. 24. 16\. AFLP. Erlaubt eine repräsentative Visualisierung des Genoms und ist eine Weiterentwicklung der RAPD. Man braucht eine vernünftige und aussagekräftige Anzahl an AFLPs. AFLP - amplified fragment length polymorphism Prinzip: z.B.: Bestimmung der genetischen Diversität von Salix Arten. Von den Pflanzenproben wurde die gesamte DNA isoliert und diese dann mit RE geschnitten worden. Adaptoren binden am Ende und werden an Restriktionsfragmente fusioniert (rot & bla) Man hat selektive Phasen an den Adaptoren 2 PCRs mit unterschiedlichen Primer Anteilen. (1. PCR erfasst der Primer nur die allgemeine Adaptersequenz und in der 2. PCR nimmt man die selektaven mit) Der Experimentator kann auf 3 Arten die Anzahl an Fragmenten steuern (2 x PCR ;. Je nach Komplexität des Organismus kann der Experimentator die Anzahl der Fragmente steuern. In einem Ansatz müssen die Experimente aber gleich sein. Polyacrylamidgel eines genetischen Profils Genetic Fingerprinting Resultat: Unterschiede wie natürliche Deletionen oder Insertionen können festgestellt werden. Kann Individuen in einer Population unterscheiden. Dadurch können Schlüsse auf die Artenähnlichkeit gegeben werden. Verwendung: Gene flow experiments, Populationsgenetik, Phylogenetische Anlysen, Verwantschaftsgradbestimmung, Outcrossing 25. 17\. Was ist qPCR ?! Vor und Nachteile rasche Methode, hoher Durchsatz, vereinfachung des Prozesses - realtime mit f luoreszenzfarbstoffen man benötigt nur Röhrchen und PCR Maschine - Zahl der Produkte steigt exponentiell man kann Genexpression unter variablen Bedingungen beobachten z.B.: wie Effektiv wird ein Gen abgeschrieben. Ausmaß einer viralen Infektion : z.B.: wie gut spricht der Patient auf eine Therapie bei Virusinfektion an Einfachste Möglichkeit der Quantifizierung durch Nutzung von Farbstoffen wie interkalierender SYBR Green1. Die zunahme an Amplifikationsprodukt korreliert mit der Zunahme der Fluoreszenz. Vorteil: hohe Reproduzierbarkeit über weiten Messbereich , geringes Risiko einer Kontamination , erfolgt rasch Nachteil: geringe Spezifität & keine Multiplexmessungen möglich: Lösung : Schmelzpunktanalyse nach abgelaufender PCR. Wen PCR spezifisch abgelaufen ist bekommt man 1 Amplifikationsprodukt.Sonden Kernprobleme: 1. Spezifität ; Lösung: Schmelzpunktanalyse sowie Sonden \# 2. Orientierungspunkg ; Lösung: externer Standard, interner STandard Bei einer normalen PCR hat man nur 2 Primer. Man kann auch eine qPCR nur mit 2 Primer machen. Bei einer qPCR mit hoher Spezifität hat man 3. Man hat auch eine Sonde. Zur Detektion: Sonde enthält 2 Fluoreszenzfarbstoffe 26. 27. 18\. Nenne Sie 2 alternative Sequenzierungsmethoden! Molecular resonance sequencing : template and DNA-Pol with donor fluophore and each type of Nt with distinguishable acceptor fluorphore Polony Sequencing (Polymerase colony) - rund 10 % der Kosten von Sanger 19