Molekulare Genetik: Polony-Sequenzierung & Phylochips

Polony-Sequenzierung

• Die DNA-Moleküle werden in winzige DNA-"Polonies" immobilisiert, die durch PCR (Polymerasekettenreaktion) erzeugt werden.
• Jede Polonie repräsentiert eine einzelne DNA-Vorlage und wird dann mit Fluoreszenzmarkern markiert und sequenziert.
• Durch die Wiederholung dieses Prozesses für viele Polonies können große Mengen von DNA parallel sequenziert werden, was zu schnellen und kostengünstigen Sequenzierungsergebnissen führt.

Phylochips

• Phylochips sind mikroarraybasierte Technologien, die die genetische Vielfalt und Evolution von Organismen untersuchen.
• Sie beinhalten spezifische DNA-Sonden, die auf bestimmte genetische Marker abzielen, die für verschiedene Arten charakteristisch sind.
• Durch Hybridisierung der DNA-Proben eines Organismus mit den Sonden auf dem Phylochip können Forscher die genetische Zusammensetzung eines Organismus identifizieren und mit anderen Arten vergleichen.
• Phylochips werden häufig in der Phylogenie, der Erforschung von Stammbäumen und der Untersuchung der Evolution verwendet.

Pyrosequenzierung

• Um sicherzustellen, dass die arbeitenden Enzyme nicht aus den Nano-Liter-Filterkammern geschwemmt werden, werden verschiedene Methoden angewendet.
• Spezielle Filter in den Kammern halten die Enzyme zurück, während die Reaktionslösung ausgetauscht wird.
• Der Flüssigkeitsaustausch erfolgt kontrolliert und langsam, um eine übermäßige Strömung zu vermeiden.
• Pufferlösungen und Bindemittel stabilisieren Enzyme in den Filterkammern.
• Hot-Start-PCR blockiert die Aktivität der Polymerase bis zur optimalen Reaktionstemperatur und reduziert unspezifische Amplifikationen.
• Sorgfältige DNA-Reinigung reduziert Verunreinigungen und die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Ergebnisse.

Sonden in der quantitativen PCR

• TaqMan-Sonden sind Oligonukleotid-Sonden, die mit einem fluoreszierenden Reporterfarbstoff und einem Quencher-Bereich markiert sind.
• Während der PCR bindet die Sonde an ihre komplementäre Sequenz innerhalb des Amplifikationsprodukts.
• Die Taq-Polymerase spaltet die Sonde während der Amplifikation, wodurch der Reporter vom Quencher getrennt wird und ein Fluoreszenzsignal entsteht.
• TaqMan-Sonden bieten eine hohe Spezifität und sind weniger anfällig für unspezifische Bindungen und Verunreinigungen als SYBR Green-Sonden.
• SYBR Green ist ein DNA-Farbstoff, der während der PCR an doppelsträngige DNA bindet und als interkalierender Farbstoff fungiert.
• Die Intensität des fluoreszierenden Signals nimmt mit zunehmender Anzahl der Amplifikationsprodukte zu.
• SYBR Green-Sonden sind anfälliger für unspezifische Bindungen und können zu falsch positiven Ergebnissen führen, wenn Verunreinigungen vorhanden sind.

DNA-Microarrays

• Oligonukleotide, cDNA oder Fragmente von PCR-Produkten werden auf Trägermaterial gedruckt und dienen als Sonden an definierten Positionen.
• mRNA wird vorher zu cDNA umgeschrieben und zum Beispiel fluoreszenzmarkiert.
• cDNA hybridisiert an komplementären Gegenpart auf der Micro-Array.
• Eine große Anzahl an Informationen wird auf kleinem Raum dargestellt.
• Position, Farbe und Intensität jedes Punktes geben Aufschluss über die Expressionsrate.
• Anwendungen: Pflanzen und transgene Pflanzen, Genexpressionsmuster (Verlauf einer Krankheit).

Alternative Sequenzierungsmethoden

• Einzelstrang-Sequenzierung: Diese Methode basiert auf der Sequenzierung einzelner Stränge von DNA oder RNA und ermöglicht die Sequenzierung von langen DNA- oder RNA-Molekülen.
• Einzelmolekül-Sequenzierung: Im Gegensatz zu traditionellen Methoden, bei denen eine Population von DNA-Molekülen sequenziert wird, ermöglicht die Einzelmolekül-Sequenzierung die Sequenzierung eines einzelnen DNA- oder RNA-Moleküls.

Prinzip des Polony-Sequencing (detaillierte Beschreibung)

• Mate Pair Library: genomische DNA von einem Organismus wird zu 1kb Fragmenten gesheared.
• End repair der Fragmente, Erzeugung von blunted ends ermöglicht blunt end Ligation mit Adaptoren.
• DNA mit ca. 1kb wird durch PAGE selektiert und die 1kbp Fragmente werden mit einem Linker (T30) zirkularisiert.
• Linker enthält 2 Recognition sites für Mme1(Type II RE), der ca. 30 bp entfernt von der recognition site schneidet.
• Resultat: ca. 70 bp große paired end Fragmente.
• Amplifikation der zirkularisierten DNA mittels Emulsions-PCR: An jedes Bead bindet jeweils 1 Sample Molekül und wird stark amplifiziert.
• Enrichment jener Beads an denen Amplifikation stattgefunden hat - Isolieren von Beads wo Amplifikation stattgefunden hat.
• Monolayer: Mischung der Beads mit Polyacrylamid.
• Die Intensität der Fluoreszenz hängt von der jeweiligen chemischen Umgebung ab.
• Bei Einbau ins Amplifikationspordukt kommt es zu einer Zunahme der Fluoreszenz.

Methoden zur Genomsequenzierung

• Next-Generation-Sequenzierung (NGS): Diese Methode ermöglicht schnelle und kostengünstige Sequenzierung großer Mengen an DNA.
• Sanger-Sequenzierung: Diese klassische Methode basiert auf der enzymatischen Synthese von DNA in vitro, bei der dideoxynukleotid-Terminatoren die DNA-Synthese anhalten.

Vorteile von Nested PCR

• Erhöhte Spezifität: Nested PCR verwendet zwei Sätze von Primern, wobei der zweite Satz innerhalb des Produkts des ersten Satzes liegt. Dies erhöht die Spezifität der Amplifikation und reduziert das Risiko unspezifischer Produkte.
• Verbesserte Sensitivität: Nested PCR erhöht die Sensitivität der Reaktion, da nur das gewünschte Amplifikat des ersten PCR-Zyklus mit den zweiten Primern hybridisiert und amplifiziert wird, was zu einer höheren Konzentration des Zielprodukts führt.
• Reduzierung von Kontamination: Nested PCR minimiert das Risiko von Kontamination, da die zweite PCR nur das Produkt der ersten PCR verwendet, wodurch das Vorhandensein anderer DNA-Moleküle in der Reaktion ausgeschlossen wird.
• Anwendungen: Nested PCR findet Anwendung bei der Untersuchung von seltenen Mutationen, in der forensischen Genetik, bei der Diagnose von Krankheiten, der Klonierung von DNA und der Untersuchung von Umweltsampel.

Multiplex PCR

• Multiplex PCR ermöglicht die gleichzeitige Amplifikation mehrerer DNA-Sequenzen in einer einzigen Reaktion.
• Ermöglicht die Untersuchung mehrerer Gene oder DNA-Regionen in einer einzigen Reaktion und spart Zeit und Ressourcen.
• Anwendungen: Diagnose verschiedener genetischer Erkrankungen, molekulare Diagnostik, Genotypisierung und Forensik.

Schmelzpunktanalyse

• Die Schmelzpunktanalyse wird eingesetzt, um die Spezifität von PCR-Produkten zu überprüfen und unspezifische Produkte zu identifizieren.
• Man verfolgt den Verlust der Fluoreszenz von SYBR Green während der langsamen Temperaturerhöhung.
• Eine einzelne Schmelzkurve zeigt ein spezifisches Amplifikationsprodukt, während mehrere Kurven auf mehrere Amplifikationsprodukte hindeuten.
• Die Schmelzpunktanalyse kann auch zur Bestimmung der Schmelztemperatur (Tm) von DNA- oder RNA-Fragmenten, zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen und zur Mutationserkennung verwendet werden.

Shotgun-Sequenzierung

• Shotgun-Sequenzierung ist eine Methode, die auf dem Zufallsprinzip basiert.
• Das Genom wird in viele kleine Fragmente geschnitten.
• Diese Fragmente werden mit einer bekannten Methode (z.B. Sanger-Sequenzierung) sequenziert.
• Die resultierenden Sequenzdaten werden mit einem Computerprogramm zusammengesetzt.
• Vorteil: Shotgun-Sequenzierung ist schnell und kostengünstig.
• Nachteil: Die Methode ist fehleranfällig und es ist schwierig, große Genome mit langen, repetitiven Abschnitten zu sequenzieren.