Molekulare Genetik: Polony-Sequenzierung & Phylochips
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Questions and Answers

Was ist das Hauptprinzip der Polony-Sequenzierung?

  • Die Sequenzierung wird nur in einzelnen Schritten durchgeführt.
  • Die Sequenzierung basiert auf der direkten Analyse von RNA.
  • Es handelt sich um eine Technik zur Herstellung von Proteinen.
  • Es erfolgt eine Amplifikation von DNA-Molekülen in Polonies. (correct)

    • Wofür werden Phylochips hauptsächlich verwendet?

  • Zur Herstellung von geografischen Karten von Organismen.
  • Zur Analyse von Proteinen in verschiedenen Proben.
  • Zur Untersuchung der genetischen Vielfalt und Evolution. (correct)
  • Zur Diagnostik von Krankheiten bei Individuen.

    • Wie wird bei der Pyrosequenzierung sichergestellt, dass Enzyme nicht aus den Filterkammern geschwemmt werden?

  • Durch Verwendung von großen Filtern, die alle Substanzen zurückhalten.
  • Durch Erhitzung der Enzyme während des Prozesses.
  • Durch ständige Zirkulation der Reaktionslösung.
  • Durch kontrollierten und langsamen Flüssigkeitsaustausch. (correct)

    • Welche Rolle spielen die speziellen Filter in den Nano-Liter-Filterkammern?

    <p>Sie halten die arbeitenden Enzyme zurück.</p> Signup and view all the answers

    Was ermöglicht die Hybridisierung der DNA-Proben auf Phylochips?

    <p>Die Identifizierung der genetischen Zusammensetzung eines Organismus.</p> Signup and view all the answers

    Wie tragen Pufferlösungen zur Stabilisierung der Enzyme in den Filterkammern bei?

    <p>Sie stabilisieren die Enzyme vor dem Austreten.</p> Signup and view all the answers

    Welches Ziel hat die PCR in der Polony-Sequenzierung?

    <p>Die Amplifikation von einzelnen DNA-Molekülen.</p> Signup and view all the answers

    Was ist eine der Vorteile der Polony-Sequenzierung?

    <p>Sie führt zu schnellen und kostengünstigen Ergebnissen.</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt das Prinzip der cDNA-Hybridisierung auf einem Micro Array?

    <p>cDNA hybridisiert an komplementären Gegenpart.</p> Signup and view all the answers

    Welches der folgenden Sequenzierungsverfahren gilt als Einzelstrang-Sequenzierung?

    <p>Nanopore-Sequenzierung</p> Signup and view all the answers

    Welcher Aspekt ist bei der cDNA-Hybridisierung auf einem Micro Array entscheidend für die Analyse der Genexpression?

    <p>Die Position, Farbe und Intensität jedes Punkts.</p> Signup and view all the answers

    Was ist ein Vorteil der Polony-Sequenzierung?

    <p>Library kann nur durch PCR erzeugt werden.</p> Signup and view all the answers

    Welche Eigenschaft hat die Einzelmolekül-Sequenzierung?

    <p>Sie bietet hohe Auflösung und individuelle molekulare Variationen.</p> Signup and view all the answers

    Was geschieht im Schritt der Endreparatur in der Polony-Sequenzierung?

    <p>Es werden blunt end Ligationen möglich gemacht.</p> Signup and view all the answers

    Was geschieht während der Amplifikation in der Polony-Sequenzierung?

    <p>An jedes Bead bindet jeweils ein Sample Molekül.</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Aussagen über die Einzelmolekül-Real-Time-Sequenzierung (SMRT) ist korrekt?

    <p>Sie bietet Informationen über einzelne DNA-Moleküle.</p> Signup and view all the answers

    Was ist der Hauptvorteil der Hot-Start-PCR?

    <p>Verbesserung der Spezifität durch Reduzierung unspezifischer Amplifikationen.</p> Signup and view all the answers

    Welche Eigenschaften haben TaqMan-Sonden?

    <p>Sie erzeugen ein Fluoreszenzsignal bei spezifischer Hybridisierung.</p> Signup and view all the answers

    Warum sind SYBR Green-Sonden anfälliger für falsch positive Ergebnisse?

    <p>Sie sind weniger spezifisch, da sie an alle doppelsträngigen DNA binden.</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt DNA-Microarrays?

    <p>Ein Trägermaterial, auf dem Oligonukleotide oder cDNA gedruckt sind.</p> Signup and view all the answers

    Wie funktioniert die Hydrolyse-Sonde bei der Taq-PCR?

    <p>Die Taq-Polymerase spaltet die Sonde, wodurch der Reporter vom Quencher getrennt wird.</p> Signup and view all the answers

    Welches Argument unterstützt die Verwendung von hochwertiger DNA-Reinigung vor der PCR?

    <p>Sie reduziert die Möglichkeit von falsch positiven Ergebnissen.</p> Signup and view all the answers

    Welche Funktion hat die Quencher-Marke in TaqMan-Sonden?

    <p>Sie blockiert das Fluoreszenzsignal, solange die Sonde intakt ist.</p> Signup and view all the answers

    Was ist ein Nachteil von SYBR Green-Sonden im Vergleich zu TaqMan-Sonden?

    <p>SYBR Green-Sonden binden auch an unspezifische Amplifikationsprodukte.</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt die Next-Generation-Sequenzierung (NGS)?

    <p>Es ist eine Technologie für die sequenzielle Analyse großer DNA-Mengen.</p> Signup and view all the answers

    Welches der folgenden Merkmale charakterisiert die Sanger-Sequenzierung?

    <p>Sie verwendet Kettenabbruch durch dideoxynukleotide.</p> Signup and view all the answers

    Welche Aussage über die Schmelzpunktanalyse bei qPCR ist korrekt?

    <p>Sie kann mehrere Amplifikationsprodukte identifizieren.</p> Signup and view all the answers

    Was sind dideoxynukleotide in der Sanger-Sequenzierung?

    <p>Sie stoppen die DNA-Synthese, wenn sie eingebaut werden.</p> Signup and view all the answers

    Eines der folgenden Merkmale zeigt, dass die Amplifikation bei der qPCR erfolgreich war.

    <p>Der Erhalt einer eindeutigen Schmelzkurve.</p> Signup and view all the answers

    Was ist ein Vorteil der Nested PCR?

    <p>Sie erhöht die Spezifität der Amplifikation.</p> Signup and view all the answers

    In welchem Fall ist eine Multiplex-PCR vorteilhaft?

    <p>Wenn mehrere DNA-Fragmente in einer Reaktion nachgewiesen werden müssen.</p> Signup and view all the answers

    Wie beeinflusst der Schmelzpunkt die Analyse in der qPCR?

    <p>Er hilft bei der Differenzierung zwischen spezifischen und unspezifischen Produkten.</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt der Schmelzpunkt (Tm) bei der Schmelzpunktanalyse?

    <p>Die Temperatur, bei der die Hälfte der DNA-Doppelstränge denaturiert ist.</p> Signup and view all the answers

    Welcher Faktor hat keinen Einfluss auf die Schmelztemperatur (Tm)?

    <p>Die Temperatur während der PCR-Amplifikation.</p> Signup and view all the answers

    Wie wird die Schmelzpunktanalyse hauptsächlich durchgeführt?

    <p>Durch die Messung der Absorption oder Fluoreszenz bei steigender Temperatur.</p> Signup and view all the answers

    Welcher dieser Zwecke ist NICHT mit der Schmelzpunktanalyse verbunden?

    <p>Quantitative Bestimmung von DNA-Mengen.</p> Signup and view all the answers

    Welche Technik nutzt die Schmelzpunktanalyse häufig als zusätzlichen Schritt?

    <p>Quantitative PCR (qPCR).</p> Signup and view all the answers

    Was geschieht während der Schmelzpunktanalyse mit den Nukleinsäuren bei steigender Temperatur?

    <p>Die Basenpaare der Doppelhelix trennen sich.</p> Signup and view all the answers

    Welche Aussage über die Schmelzkurvenanalyse ist korrekt?

    <p>Die Schmelzpunktanalyse kann Unterschiede in Schmelztemperaturen erkennen.</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Aussagen ist über die Anwendung der Schmelzpunktanalyse korrekt?

    <p>Sie ermöglicht die Identifikation von Mutationen in genetischen Sequenzen.</p> Signup and view all the answers

    Study Notes

    Polony-Sequenzierung

    • Die DNA-Moleküle werden in winzige DNA-"Polonies" immobilisiert, die durch PCR (Polymerasekettenreaktion) erzeugt werden.
    • Jede Polonie repräsentiert eine einzelne DNA-Vorlage und wird dann mit Fluoreszenzmarkern markiert und sequenziert.
    • Durch die Wiederholung dieses Prozesses für viele Polonies können große Mengen von DNA parallel sequenziert werden, was zu schnellen und kostengünstigen Sequenzierungsergebnissen führt.

    Phylochips

    • Phylochips sind mikroarraybasierte Technologien, die die genetische Vielfalt und Evolution von Organismen untersuchen.
    • Sie beinhalten spezifische DNA-Sonden, die auf bestimmte genetische Marker abzielen, die für verschiedene Arten charakteristisch sind.
    • Durch Hybridisierung der DNA-Proben eines Organismus mit den Sonden auf dem Phylochip können Forscher die genetische Zusammensetzung eines Organismus identifizieren und mit anderen Arten vergleichen.
    • Phylochips werden häufig in der Phylogenie, der Erforschung von Stammbäumen und der Untersuchung der Evolution verwendet.

    Pyrosequenzierung

    • Um sicherzustellen, dass die arbeitenden Enzyme nicht aus den Nano-Liter-Filterkammern geschwemmt werden, werden verschiedene Methoden angewendet.
    • Spezielle Filter in den Kammern halten die Enzyme zurück, während die Reaktionslösung ausgetauscht wird.
    • Der Flüssigkeitsaustausch erfolgt kontrolliert und langsam, um eine übermäßige Strömung zu vermeiden.
    • Pufferlösungen und Bindemittel stabilisieren Enzyme in den Filterkammern.
    • Hot-Start-PCR blockiert die Aktivität der Polymerase bis zur optimalen Reaktionstemperatur und reduziert unspezifische Amplifikationen.
    • Sorgfältige DNA-Reinigung reduziert Verunreinigungen und die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Ergebnisse.

    Sonden in der quantitativen PCR

    • TaqMan-Sonden sind Oligonukleotid-Sonden, die mit einem fluoreszierenden Reporterfarbstoff und einem Quencher-Bereich markiert sind.
    • Während der PCR bindet die Sonde an ihre komplementäre Sequenz innerhalb des Amplifikationsprodukts.
    • Die Taq-Polymerase spaltet die Sonde während der Amplifikation, wodurch der Reporter vom Quencher getrennt wird und ein Fluoreszenzsignal entsteht.
    • TaqMan-Sonden bieten eine hohe Spezifität und sind weniger anfällig für unspezifische Bindungen und Verunreinigungen als SYBR Green-Sonden.
    • SYBR Green ist ein DNA-Farbstoff, der während der PCR an doppelsträngige DNA bindet und als interkalierender Farbstoff fungiert.
    • Die Intensität des fluoreszierenden Signals nimmt mit zunehmender Anzahl der Amplifikationsprodukte zu.
    • SYBR Green-Sonden sind anfälliger für unspezifische Bindungen und können zu falsch positiven Ergebnissen führen, wenn Verunreinigungen vorhanden sind.

    DNA-Microarrays

    • Oligonukleotide, cDNA oder Fragmente von PCR-Produkten werden auf Trägermaterial gedruckt und dienen als Sonden an definierten Positionen.
    • mRNA wird vorher zu cDNA umgeschrieben und zum Beispiel fluoreszenzmarkiert.
    • cDNA hybridisiert an komplementären Gegenpart auf der Micro-Array.
    • Eine große Anzahl an Informationen wird auf kleinem Raum dargestellt.
    • Position, Farbe und Intensität jedes Punktes geben Aufschluss über die Expressionsrate.
    • Anwendungen: Pflanzen und transgene Pflanzen, Genexpressionsmuster (Verlauf einer Krankheit).

    Alternative Sequenzierungsmethoden

    • Einzelstrang-Sequenzierung: Diese Methode basiert auf der Sequenzierung einzelner Stränge von DNA oder RNA und ermöglicht die Sequenzierung von langen DNA- oder RNA-Molekülen.
    • Einzelmolekül-Sequenzierung: Im Gegensatz zu traditionellen Methoden, bei denen eine Population von DNA-Molekülen sequenziert wird, ermöglicht die Einzelmolekül-Sequenzierung die Sequenzierung eines einzelnen DNA- oder RNA-Moleküls.

    Prinzip des Polony-Sequencing (detaillierte Beschreibung)

    • Mate Pair Library: genomische DNA von einem Organismus wird zu 1kb Fragmenten gesheared.
    • End repair der Fragmente, Erzeugung von blunted ends ermöglicht blunt end Ligation mit Adaptoren.
    • DNA mit ca. 1kb wird durch PAGE selektiert und die 1kbp Fragmente werden mit einem Linker (T30) zirkularisiert.
    • Linker enthält 2 Recognition sites für Mme1(Type II RE), der ca. 30 bp entfernt von der recognition site schneidet.
    • Resultat: ca. 70 bp große paired end Fragmente.
    • Amplifikation der zirkularisierten DNA mittels Emulsions-PCR: An jedes Bead bindet jeweils 1 Sample Molekül und wird stark amplifiziert.
    • Enrichment jener Beads an denen Amplifikation stattgefunden hat - Isolieren von Beads wo Amplifikation stattgefunden hat.
    • Monolayer: Mischung der Beads mit Polyacrylamid.
    • Die Intensität der Fluoreszenz hängt von der jeweiligen chemischen Umgebung ab.
    • Bei Einbau ins Amplifikationspordukt kommt es zu einer Zunahme der Fluoreszenz.

    Methoden zur Genomsequenzierung

    • Next-Generation-Sequenzierung (NGS): Diese Methode ermöglicht schnelle und kostengünstige Sequenzierung großer Mengen an DNA.
    • Sanger-Sequenzierung: Diese klassische Methode basiert auf der enzymatischen Synthese von DNA in vitro, bei der dideoxynukleotid-Terminatoren die DNA-Synthese anhalten.

    Vorteile von Nested PCR

    • Erhöhte Spezifität: Nested PCR verwendet zwei Sätze von Primern, wobei der zweite Satz innerhalb des Produkts des ersten Satzes liegt. Dies erhöht die Spezifität der Amplifikation und reduziert das Risiko unspezifischer Produkte.
    • Verbesserte Sensitivität: Nested PCR erhöht die Sensitivität der Reaktion, da nur das gewünschte Amplifikat des ersten PCR-Zyklus mit den zweiten Primern hybridisiert und amplifiziert wird, was zu einer höheren Konzentration des Zielprodukts führt.
    • Reduzierung von Kontamination: Nested PCR minimiert das Risiko von Kontamination, da die zweite PCR nur das Produkt der ersten PCR verwendet, wodurch das Vorhandensein anderer DNA-Moleküle in der Reaktion ausgeschlossen wird.
    • Anwendungen: Nested PCR findet Anwendung bei der Untersuchung von seltenen Mutationen, in der forensischen Genetik, bei der Diagnose von Krankheiten, der Klonierung von DNA und der Untersuchung von Umweltsampel.

    Multiplex PCR

    • Multiplex PCR ermöglicht die gleichzeitige Amplifikation mehrerer DNA-Sequenzen in einer einzigen Reaktion.
    • Ermöglicht die Untersuchung mehrerer Gene oder DNA-Regionen in einer einzigen Reaktion und spart Zeit und Ressourcen.
    • Anwendungen: Diagnose verschiedener genetischer Erkrankungen, molekulare Diagnostik, Genotypisierung und Forensik.

    Schmelzpunktanalyse

    • Die Schmelzpunktanalyse wird eingesetzt, um die Spezifität von PCR-Produkten zu überprüfen und unspezifische Produkte zu identifizieren.
    • Man verfolgt den Verlust der Fluoreszenz von SYBR Green während der langsamen Temperaturerhöhung.
    • Eine einzelne Schmelzkurve zeigt ein spezifisches Amplifikationsprodukt, während mehrere Kurven auf mehrere Amplifikationsprodukte hindeuten.
    • Die Schmelzpunktanalyse kann auch zur Bestimmung der Schmelztemperatur (Tm) von DNA- oder RNA-Fragmenten, zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen und zur Mutationserkennung verwendet werden.

    Shotgun-Sequenzierung

    • Shotgun-Sequenzierung ist eine Methode, die auf dem Zufallsprinzip basiert.
    • Das Genom wird in viele kleine Fragmente geschnitten.
    • Diese Fragmente werden mit einer bekannten Methode (z.B. Sanger-Sequenzierung) sequenziert.
    • Die resultierenden Sequenzdaten werden mit einem Computerprogramm zusammengesetzt.
    • Vorteil: Shotgun-Sequenzierung ist schnell und kostengünstig.
    • Nachteil: Die Methode ist fehleranfällig und es ist schwierig, große Genome mit langen, repetitiven Abschnitten zu sequenzieren.

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