Acid Nucleici - PDF

Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 I nucleotidi che hanno interesse nella formazione degli acidi nucleici sono caratterizzati da questi tipi di basi azotate: tre sono pirimidine (Timina, Citosina, Uracile) e due sono purine (Adeni...

Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 I nucleotidi che hanno interesse nella formazione degli acidi nucleici sono caratterizzati da questi tipi di basi azotate: tre sono pirimidine (Timina, Citosina, Uracile) e due sono purine (Adenina e Guanina). I nucleotidi di cui parleremo saranno composti da una di queste 5 basi azotate, uno zucchero (pentosio o deossipentosio). Base azotata e zucchero costituiscono un nucleoside (a sinistra: Adenosina e Deossiadenosina). Base azotata, zucchero e uno o più gruppi fosfato costituiscono un nucleotide (a destra: Adenilato e Deossiadenilato). Qui trovate il nucleotide monofosfato (a destra); il nucleotide di solito viene specificato per la sua base azotata e lo troviamo sempre descritto utilizzando la lettera iniziale della base azotata corrispondente: A (Adenina), G (Guanina), T (Timina), C (Citosina), U (Uracile). Gli acidi nucleici possono essere visti come polimeri costituiti da unità monomeriche, ovvero i nucleotidi. Sono fondamentali nell espressione genica perché sono i depositari dell’ informazione. La sequenza dei nucleotidi all'interno degli acidi nucleici permette di formare proteine (quindi sequenze aminoacidiche) con caratteristiche assolutamente differenti. Nucleotidi – acidi nucleici DNA e RNA In entrambi i casi si tratta di acidi nucleici, polimeri lineari composti da nucleotidi. I nucleotidi che compongono l’RNA presentano il ribosio (acido ribonucleico), mentre nucleotidi che compongono il DNA presentano il deossiribosio (acido deossiribonucleico).Dal punto di vista del nucleotide, questa è l’unica differenza che distingue l’RNA dal DNA. Dal punto di vista delle basi azotate si ha: Adenina, Guanina, Citosina si trovano in nucleotidi che compongono sia DNA sia RNA; la Timina è caratteristica del DNA; l’Uracile solo dell’RNA. 3 Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 Osservando come è composto un acido nucleico, esso è formato da una sequenza di nucleotidi. Più nel dettaglio si identificano i singoli nucleotidi. Per il DNA la base azotata viene identificata con la lettera (in questo caso la A), è visibile il deossiribosio con l’H in posizione 2’ e il gruppo fosfato. Legato a questo primo nucleotide ci sarà un secondo nucleotide che avrà come base azotata la timina (T), poi c’è la Guanina ecc. È importante osservare il tipo di legame che si crea fra i vari nucleotidi: è un legame fosfodiestere  L'ossigeno è carico negativamente in un ambiente fisiologico: questa carica è importante perché permette a questo tipo di legame di essere meno suscettibile a un attacco nucleofilo (che in ambiente acquoso è principalmente dovuto alla presenza di OH-). Di conseguenza questo tipo di legame è molto meno idrolizzabile rispetto un legame estereo tradizionale. Si osserva quindi che l'utilizzo di questi nucleotidi con gruppo fosfato permette di stabilizzare la catena di nucleotidi, rendendola meno idrolizzabile in ambiente acquoso. Anche la presenza di un gruppo idrogeno invece di un gruppo ossidrilico nel DNA ha la funzione di stabilizzare la catena dell'acido nucleico. È fondamentale che questo legame fosfodiestere sia stabile poiché il DNA e il contenitore all'interno del quale è racchiusa l'informazione su come vanno prodotte le proteine e quindi deve essere conservato “uguale a se stesso”; perciò è importante che in ambiente acquoso i legami che costituiscono il DNA siano stabili. A livello evolutivo si è sviluppato un legame più stabile del legame estereo tradizionale. 4 Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 La posizione dei nucleotidi all'interno della catena è sempre la stessa: si parte dal gruppo fosforico, segue lo zucchero e lateralmente si trova la base azotata. Quando si osserva l'acido nucleico si può identificarne la direzionalità: 3’5’ o 5’3’ (se lo guardiamo dal basso), si riferisce al carbonio relativo allo zucchero (ribosio per l’RNA o deossiribosio per il DNA)Che vediamo per primo osservando da una certa estremità. Quindi partendo dall'alto (come in figura) il primo carbonio che incontro è il C5’ (nel deossiribosio) quindi mi trovo nell’estremità 5’; invece nella posizione opposta il primo carbonio incontrato e il 3’ (che si trova all'interno del deossiribosio). Per quanto riguarda la RNA l'osservazione è identica, con la differenza che lo zucchero è il ribosio e viene legato U invece di A. Accoppiamenti specifici tra le basi Questa caratteristica permette di decodificare l’informazione che si trova all'interno del DNA, caratterizzata da una sequenza di acidi nucleici, verso la traduzione di una sequenza di amminoacidi contenuti in una proteina. È stato possibile scoprirlo grazie a Watson e Crick Che furono i primi ad ipotizzare l'accoppiamento specifico tra le basi. Le basi azotate si accoppiano tra di loro esclusivamente in un certo modo: per il DNA l’adenina si accoppia sempre con la timina e la citosina si accoppia sempre con la guanina. Per quanto riguarda la RNA la timina viene sostituita dall’uracile. Questo specifico accoppiamento è stato ipotizzato perché, a seguito di analisi attraverso diffrazione di raggi X, questi due ricercatori sono stati in grado di ipotizzare la struttura a doppia elica del DNA. Affinché il DNA si possa disporre in questo modo nello spazio è necessario che le basi azotate formino dei legami che hanno una distanza costante tra di loro. All'interno del DNA avremo da un lato la catena principale costituita dagli zuccheri e dai gruppi fosfato, mentre all'interno si posizionano le basi azotate. Ciò che identifica la dimensione principale della struttura a doppia elica sono le basi azotate, cioè ciò che avviene all'interno. L’unico modo affinché la parte centrale avesse la stessa lunghezza era che l’adenina si accoppiasse sempre con la timina e la citosina sempre con la guanina. 5 Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 Le interazioni che si creano fra l’adenina e la timina portano a una struttura che ha circa una dimensione di 11 Armstrong ; lo stesso avviene tra citosina e guanina. la necessità di avere questa struttura dimensionalmente identica ha fatto ipotizzare l'accoppiamento specifico tra le basi, cioè che solo in questa configurazione si potesse ottenere una struttura a doppia elica. Questa ipotesi ha effettivamente trovato un riscontro dal punto di vista sperimentale. Sono stati Analizzati i rapporti tra le diverse basi azotate di alcune specie: ciò che è stato osservato è che per tutte le specie il rapporto tra adenina e timina, citosina e guanina è sempre uno (A/T = 1; C/G = 1). Quindi ogni volta che ho un adenina ho anche una timina e ogni volta che ho una citosina ho anche una guanina; se invece si va a comparare l’adenina con la guanina tutto è molto variabile. Questo accoppiamento specifico costituirà un sistema raffinato per permettere la codifica delle informazioni contenute nel DNA e la formazione delle proteine. 6 Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 DNA Il DNA presenta una struttura a doppia elica dove il filamento esterno è composto dallo zucchero e dai gruppi fosfato, mentre la parte interna è composta dalle basi azotate. L'interazione tra le basi azotate avviene per accompiamento specifico (A-T e G-C). La dimensione, in larghezza, è estremamente limitata (qualche decina di Armstrong- nanometri). È importante osservare che nel doppio filamento che compone il DNA ci sono due orientamenti diversi: un filamento che va nella direzione 3’-5’, l'altro filamento va nella direzione 5’-3’, ricordando che la direzione è data dal primo carbonio che si incontra nel deossiribosio. In figura sono esplicitati i vari acidi che lo compongono (in grigio i gruppi fosfato, il resto degli atomi è esplicitato); nella zona interva troviamo le basi azotate. Spesso, proprio per la presenza di questo avvolgimento doppia elica, vengono identificati due solchi: solco maggiore e solco minore, identificabili per proiezione nel piano (queste sono principalmente convenzioni). Osservando la struttura molecolare è possibile dire che le basi azotate si trovano in posizione perpendicolare rispetto al piano del filamento esterno che contiene i gruppi fosfato e lo zucchero. Si tratta di strutture estremamente complesse e ottimizzate dal punto di vista evolutivo. Impacchettamento nei cromosomi SONDAGGIO: che lunghezza presenta il DNA disteso di ogni singola cellula? RISPOSTA: circa 2 m; SONDAGGIO: quanto è grande lo spazio che IL DNA occupa all'interno della cellula? RISPOSTA: qualche decina di micrometri. 7 Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 Il DNA all'interno delle cellule eucariote si trova nel nucleo. Il nucleo ha una dimensione di qualche micrometro (5 micrometri circa). Si nota che c'è una certa discrepanza a livello numerico tra quanto è la vera lunghezza dell’acido nucleico (2m) e qual è lo spazio che questo occupa nella cellula, 5 micrometri: uno spazio estremamente piccolo. Ciò è dovuto all’impacchettamento del DNA all'interno del nucleo; la struttura formata è estremamente complessa e viene identificata come cromatina. Si identificano queste strutture che sono dei composti di un acido nucleico organizzato in una struttura proteica. Sono schematizzati i vari gradi nell impacchettamento: si noti come l'impacchettamento e la sua gestione siano molto complessi. Serve una grande ottimizzazione del processo. La struttura più nota di questo impacchettamento è l’istone. Gli istoni sono delle strutture proteiche intorno alle quali il DNA si avvolge. Impacchettamenti di 8 istoni formano il nucleosoma, che è l'unità centrale dell’impacchettamento del DNA. Ecco come una struttura così estremamente lunga può essere contenuta all'interno di una struttura così piccola quale è il nucleo cellulare. Per quanto riguarda le cellule procariote, prevalentemente batteri, sono le cellule più antiche e sono caratterizzate da diversi meccanismi che si trovano anche negli organismi eucarioti. Spesso parleremo di meccanismi per quanto riguarda l'espressione genica come se fossero identici per entrambi (se di un meccanismo non verrà specificato, esso varrà per entrambi, diversamente sarà specificato In modo puntuale). Gli eucarioti essendo organismi più sviluppati hanno spesso delle caratteristiche più complesse rispetto ai procarioti. La differenza più grande che hanno i procarioti rispetto agli eucarioti è che non è presente il nucleo e il DNA si trova all'interno del citosol. RNA L’RNA a differenza del DNA è costituito da una singola elica (singolo filamento). È un acido nucleico caratterizzato da nucleotidi che presentano il ribosio come zucchero di formazione. A differenza del DNA, per cui si identifica una molecola singola con una sola funzione, collocato in un solo posto nella cellula, per l’RNA ci si riferisce a una serie di strutture e funzioni differenti. Parlando di RNA bisogna specificare di che tipo di RNA si sta parlando. La caratteristica comune 8 Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 degli RNA è di essere acidi nucleici formati da ribosio e con un unico filamento. Hanno però funzioni diverse. I tre tipi più importanti sono: RNA messaggero, RNA transfer, RNA ribosomiale.  L’RNA messaggero (mRNA) è il responsabile della trascrizione dal DNA verso la produzione di una molecola funzionale ovvero la proteina;  L’RNA transfer (tRNA) è ciò che permette di passare da una sequenza di acidi nucleici ad una sequenza aminoacidica;  L’RNA ribosomiale (rRNA) è una struttura che forma il ribosoma, cioè l'elemento all'interno del citosol dove avviene la traduzione. Esistono altre tipologie di RNA (descritti in maniera più completa solo recentemente):  Il microRNA (miRNA): sono responsabili della regolazione della trascrizione e la traduzione; hanno un effetto di modulazione della trascrizione;  Small/short interfering RNA (siRNA): hanno una funzione simile a quella dei miRNA;  Small nuclear RNA (snRNA): sono importanti per gli organismi eucarioti perché regolano la maturazione dell’RNA messaggero;  Ribozimi: sono sequenze nucleotidiche che hanno anche un'attività enzimatica. E’ importante evidenziare come quando parliamo di RNA parliamo di una famiglia di acidi nucleici mentre quando parliamo di DNA si fa riferimento a un'unica cosa. Per quanto riguarda le basi azotate, per il DNA abbiamo adenina, citosina, guanina, timina, mentre per l’RNA l’uracile sostituisce la timina. 9 Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 Altre funzioni dei nucleotidi Non troviamo i nucleotidi solamente negli acidi nucleici. Anche l’ATP è un nucleotide, cioè è formata anch’esso da una base azotata da zucchero e da un gruppo fosfato. I nucleotici possono avere anche altre funzioni:  Il trasporto di energia: in quanto l’ATP presenta l’adenina come base azotata, il ribosio, tre gruppi fosfato;  Componenti di cofattori enzimatici (NAD+, FAD, CoenzimaA): Si ritrova sempre la solita struttura composta di base azotata zucchero e uno o più gruppi fosfato;  Messaggeri chimici: biomolecole che hanno un effetto messaggero, cioè che inducono una risposta cellulare, come ad esempio quella in figura. Ricordo che quando troviamo questi numeri con l’apice (‘) ci si riferisce alle posizioni dei Carboni all'interno dello zucchero. 10 Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 DOMANDA: qual è il legame fosfoanidridico? RISPOSTA: l’ATP ha la funzione di trasportatore e accumulatore di energia. La rottura del legame fosfato libera un energia molto maggiore rispetto alla rottura di un legame estere. Questa è la ragione per cui viene utilizzato l’ATP che presenta queste fosfoanidridi rispetto a un altro composto che presenterebbe dei legami esterei. DOMANDA: Come si spiega il fatto che nel DNA è presente la timina mentre nell’RNA l’uracile? C'è un motivo? RISPOSTA: Il motivo è principalmente relativo al costo-beneficio associato. La timina richiede uno sforzo maggiore per essere prodotta rispetto all’uracile. La timina viene tenuta quindi solo nel DNA perché la sua presenza riduce il rischio che vi siano degli accoppiamenti aspecifici con la citosina o la guanina, mentre l’uracile, che costa di meno al cellula per essere prodotto, ha una forma particolare che gli permette di legarsi anche alla citosina o alla guanina. Anticipo il concetto che nell’RNA, il rischio che ci sia un errore nella sequenza di nucleotidi, porta alla formazione di una proteina non corretta, ma è meno grave rispetto a una mutazione nel DNA. Quindi nel DNA è usata una base azotata che richiede uno sforzo energetico maggiore per la cellula. Meccanismi alla base del dogma della biologia molecolare: replicazione, trascrizione, traduzione La replicazione è il meccanismo caratteristico del DNA; la trascrizione il meccanismo che permette di passare dalla doppia elica del DNA ad un singolo filamento di RNA; la traduzione è il meccanismo che ci permette di passare da una sequenza di nucleotidi all'interno dell’RNA ad una sequenza di aminoacidi. Quello che ci interessa dal punto di vista della bioingegneria è capire che cosa può andare storto e quindi dove si possono sviluppare le patologie. Il lavoro dell'ingegnere biomedico è spesso quello di andare a riparare un possibile errore all'interno di questi tre processi. Conoscere questi processi ci permette di scoprire nuovi trattamenti o nuove metodologie per curare determinate patologie. Replicazione del DNA Il fine principale della replicazione è la conservazione e la trasmissione dell'informazione genica. Ciò implica che all'interno del DNA ci siano dei segmenti detti geni: questi sono segmenti di 11 Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 acidi nucleici all'interno del DNA che contengono le informazioni necessarie per sviluppare un prodotto biologico funzionale, cioè una proteina. È stato detto che le sequenze DNA all'interno nel corpo umano sono molto lunghe (circa 2 m per ogni cellula). Sono sequenze lunghissime di nucleotidi: 3,2 miliardi di paia di basi di DNA contenenti all'incirca 20 000-30 000 geni. È interessante osservare che solo l’1,5% del DNA è codificante. Quindi sono una frazione estremamente ridotta contiene le informazioni per la produzione di proteine: il restante 98,5% compone il DNA ma sono informazioni aggiuntive di controllo, volte ad evitare modifiche all'interno delle sequenze di DNA. Ciò che avviene durante la divisione cellulare è proprio la replicazione del DNA: dalla cellula madre nascono due cellule figlie che contengono lo stesso DNA della cellula madre. Nella replicazione del DNA si parte da un doppio filamento di DNA e si ottengono due doppi filamenti nelle cellule figlie. La replicazione è di tipo semi conservativo: partendo da una doppia elica di DNA della cellula madre si ottengono due doppie eliche nelle cellule figlie che sono formate da un filamento vecchio (in rosso) e da un filamento nuovo (in blu). È possibile questo tipo di replicazione grazie all’accoppiamento specifico tra le basi azotate. Affinché la replicazione avvenga il primo passo da fare è dividere il doppio filamento in due singoli filamenti. Il processo di replicazione del DNA viene modulato dalla presenza di enzimi. Il primo enzima che interviene durante la replicazione è detto DNA elicasi (a forma di “fetta di formaggio”): ha il compito di separare i due singoli filamenti che formano DNA. Facendo attenzione a che cosa avviene quando si srotola una sola parte in una struttura ad elica, nella parte distale si ha un superavvolgimento (come succede con il filo del telefono). Questo è ciò che avviene nel DNA quando l’elicasi svolge la sua funzione: nella parte distale viene a crearsi un superavvolgimento che è causa di stress meccanico. Per evitare che vi sia questo stress meccanico esiste un enzima detto topoisomerasi che ha il compito di rilassare e srotolare ulteriormente questo filamento di DNA al fine di evitare stress meccanici che potrebbero causare la rottura del filamento. 12 Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 Osserviamo che c'è una differenza tra i due filamenti ovvero il loro orientamento è opposto: un filamento è in direzione 3’-5’ e l'altro in direzione 5’-3’. Questo perché essi sono antiparalleli, infatti l'anello dello zucchero è orientato in maniera opposto. Ciò influenza la replicazione del DNA. Si ha questo perchè l'enzima che catalizza la replicazione del DNA, detto DNA polimerasi, ha caratteristiche peculiari: una di queste è che procede solo in direzione 5’-3’. I meccanismi che caratterizzano la replicazione del DNA sui due filamenti di una singola molecola di DNA sono differenti. La DNA polimerasi è un enzima che catalizza la formazione del legame fosfodiestere e lega ad un nucleotide precedente un altro nucleotide. Lavora esclusivamente sul filamento DNA che va nella direzione 5’-3’ e lega al precedente nucleotide un nucleotide alla volta. Quindi, quando si parla di meccanismo di replicazione del DNA, la prima cosa da considerare è che il meccanismo di replicazione è differente a seconda del filamento che stiamo considerando; in comune c’è solo la DNA-polimerasi. Nel filamento che va nella direzione 3’-5’ (quello antiparallelo) il meccanismo si basa sulla teoria sviluppata da Okazaki, che specifica come su questo filamento la replicazione avvenga, non un nucleotide alla volta, ma addizionando dei frammenti, detti frammenti di Okazaki. Durante la replicazione del DNA si ha un filamento detto filamento veloce, che è quello che va nella direzione in cui lavora la DNA polimerasi (5’-3’), caratterizzato dall'aggiunta di un nucleotide alla volta. Nell'altro filamento ,filamento lento, la replicazione avviene a blocchi grazie ai filamenti di Okazaki. Lavorando in questa condizione frammentaria è possibile avere la DNA polimerasi che lavora nella direzione 5’-3’. Mentre il DNA viene srotolato la catena veloce procede un nucleotide la volta in direzione 5’-3’, mentre la catena lenta procede a frammenti nella direzione opposta. Questi frammenti hanno lunghezze molto variabili a seconda che si tratti di organismi eucarioti o procarioti (sempre circa qualche centinaio di nucleotidi). Sintesi della catena veloce Analizzando il meccanismo più nel dettaglio: prendiamo in considerazione la catena che procede in direzione 5’-3’, dove viene addizionato un singolo nucleotide alla volta. Si parte da un nucleotide in posizione ennesima, il nucleotide successivo si sceglie in base all’accoppiamento specifico tra le basi: quando sul filamento stampo ho una timina, il nucleotide che verrà aggiunto nel filamento in crescita sarà un nucleotide che presenta la base azotata complementare: l’adenina. Nel caso rappresentato in figura il nucleotide che si aggiunge è un nucleotide trifosfato e la formazione del legame fosfodiestere avviene modulata dalla presenza della DNA polimerasi. La DNA polimerasi è in grado di identificare se effettivamente il nucleotide che è stato aggiunto contiene la base azotata 13 Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 complementare. Grazie alla sua struttura è in grado di capire se l'accoppiamento specifico è avvenuto in modo corretto; in caso di errore è in grado di effettuare un certo tipo di correzione delle bozze. La formazione del legame fosfodiestere avviene anche in presenza di due ioni Mg2+. Questi due ioni hanno l'obiettivo di deprotonare il gruppo ossidrilico in posizione 3’ sullo zucchero; inoltre i due ioni Mg2+ si legano ionicamente con i gruppi fosfato e favoriscono la rimozione del pirofosfato. È importante che questa rimozione sia favorita: quando il nucleotide trifosfato si lega e forma un legame fosfodiestere con la catena, si crea un nucleotide monofosfato, con liberazione di un pirofosfato. Un altro aspetto importante: affinché la DNA polimerasi sia in grado di legare un nucleotide, ci deve essere un nucleotide nella posizione precedente. Ciò significa che quando ci troviamo al limite del DNA stampo (sul primo nucleotide) la DNA polimerasi non è in grado di legare il primo nucleotide, poiché ha delle caratteristiche che non glielo permettono. Per questa ragione nella parte iniziale del filamento la replica del DNA avviene ad opera di un enzima in grado di legare nucleotidi senza che ve ne sia uno prima: l’RNA primasi che, come dice il nome, è costituita da RNA. Sul filamento in crescita c'è quindi una breve sequenza si RNA che viene detto primer; esso ha una lunghezza di qualche nucleotide ed è fondamentale per permettere nella fase successiva alla DNA polimerasi di partire con la vera e propria replicazione utilizzando nucleotidi del DNA. Al termine della replicazione il primer non farà più parte della catena: viene rimossa questa porzione e sostituita con dei nucleotidi di DNA; questo verrà però fatto da un altro enzima. Ricordiamo che la DNA polimerasi ha tanti meccanismi di controllo anche piuttosto complessi per evitare che ci siano degli errori nella fase di replicazione, il che significherebbe un errore mantenuto in tutte le fasi di replicazioni successive, generando quindi tutta una serie di cellule che contengono questa “mutazione”. Funzionamento della DNA polimerasi Il processo di replicazione è molto accurato: la DNA polimerasi sbaglia una volta ogni 106 -109 volte. La DNA polimerasi è un enzima che ha una struttura simile alla forma di una mano: le varie aree si chiamano appunto dita, palmo, pollice. Una parte di essa si lega a sintetizzare il nuovo filamento solo dopo che la primasi (o RNA polimerasi) ha terminato il primer di RNA: quindi la DNA polimerasi può partire sul filamento in direzione 5’-3’. 14 Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 La caratteristica fondamentale della DNA polimerasi (che garantisce la sua accuratezza) è la presenza di questo dominio esonucleasico (in rosso), ovvero un dominio in grado di rimuovere un nucleotide che è stato posizionato in modo non corretto sul filamento in crescita. Questo dominio lavora in direzione opposta (3’-5’), poiché rimuove un nucleotide che è gia stato posizionato e legato. Per questo motivo si dice che la DNA polimerasi svolga un processo di “proof-reading” (correzione di bozze), ed è per questo che le serve un nucleotide già legato nella fase zero della catena in crescita; questo è il motivo per cui serve il primer di RNA per poter partire. Il meccanismo è il seguente. Direzione 5’-3’: in questo caso sulla catena stampo c’è una Citosina; sulla catena viene posizionata erroneamente un’Adenina (figura). La DNA polimerasi lega il primo nucleotide che trova: questo potrebbe essere corretto oppure no (non è in grado a priori di sapere se il nuleotide legato è corretto o meno). Solo dopo aver legato il nucleotide è in grado di valutare se la distanza che si forma (quindi la dimensione dell’interazione) è corretta o no. Ciò avviene all’interno del dominio esonucleasico, ed è quindi un controllo di tipo dimensionale. Se l’interazione è corretta continua e attacca il nucleotide successivo; se non lo è stacca il nulceotide sbagliato e ne prova un altro. Grazie al dominio esonucleasico, che lavora in direzione 3’-5’, riesce a idrolizzare il legame fosfodiestere che si era formato e posiziona il nucleotide corretto (in questo caso la Guanina,figura). Notiamo che questa struttura che confina il filamento del DNA al suo interno, è propedeutica a questo aspetto. C'è una zona in cui un nuovo nucleotide entra all'interno dell’enzima (incoming dNTP, insieme al magnesio e al trifosfato). Se è corretto non ci sono problemi. Entrando passa nella zona del dominio esonucleasico che è in grado di identificare se l'accoppiamento tra base azotata è corretto oppure no. Se non lo è torna indietro, aziona la parte del dominio esonucleasico e rimuove la parte non corretta. Per fare tutto ciò serve poter fare un controllo e questo è possibile grazie alla parte di DNA che è già stata prodotta (grazie alla primasi con il primer di RNA). Quindi il motivo per cui la DNA polimerasi lavora solamente in una direzione è perché nella direzione opposta catalizza la reazione di rimozione del nucleotide errato. 15 Furlotti/Di Loreto 18 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 24/11/2020 DOMANDA: è sempre l’esonucleasi che inserisce la base azotata corretta dopo aver rimosso quella errata? RISPOSTA: No. Dopo che è avvenuto il proof-reading è come se il filamento tornasse indietro, quindi riparte dallo stadio precedente: aggancia un nuovo nucleotide che nuovamente potrebbe essere sbagliato. Per questo motivo deve poter passare di nuovo dal controllo di proof-reading. 16 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 Excursus lezione precedente Gli acidi nucleici sono composti da nucleotidi e si è visto il primo meccanismo alla base del dogma centrale della biologia molecolare, vale a dire la replicazione del DNA. Si è quindi introdotto un enzima, la DNA-polimerasi, in grado di catalizzare il legame fosfodiestere tra i vari nucleotidi. La formazione di questo legame fa sì che vi sia la possibilità di creare un nuovo filamento sui filamenti stampo. Si parla di filamenti e filamenti stampo perché si è vista la replicazione del DNA essere un processo semi conservativo, ovvero si parte da una doppia elica di DNA della cellula madre e si ottengono due cellule identiche nelle cellule figlie, caratterizzate dalla presenza di un filamento che deriva direttamente dal DNA della madre (filamento stampo) e un filamento nuovo. Quindi quando si pensa alla replicazione si deve pensare ad una nuova doppia elica caratterizzata da un filamento stampo che appartiene al DNA madre. La presenza di questo filamento è tipica della presenza della DNA polimerasi in quanto si è detto che lavora solo in presenza di uno stampo, ha bisogno di un vecchio filamento. La DNA polimerasi catalizza la reazione del legame fosfodiestere tra i nucleotidi, ciascuno dei quali viene collegato alla catena in crescita. L’aspetto fondamentale affinché i DNA si mantengano uguali tra madre e figlie è l’accoppiamento delle basi azotate. Si è visto che si accoppiano correttamente in un’unica soluzione, in cui si trova adenina-timina, citosina-guanina. Un’altra caratteristica della DNA polimerasi è che non inizia a lavorare se prima del primo nucleotide non ce ne sono altri, ovvero non parte dall’estremità. Questo è un limite che viene superato dalla presenza di primer, che sono sequenze di RNA, quindi ribonucleotidi, che vengono inseriti nella parte iniziale del filamento durante la replicazione. Quindi abbiamo il primer, il filamento stampo e a partire dal nucleotide successivo al primer avremo l’azione della DNA polimerasi che attacca un nucleotide alla volta. Questa altra caratteristica della DNA polimerasi di attaccarne uno alla volta può avvenire lungo un’unica direzione, perché avviene solo dal filamento orientato da 3’ a 5’. Si dice che la DNA polimerasi lavora solo in direzione 5’ e 3’. Per questo motivo ciò che si vede in questa slide si riferisce solo ad una delle due catene (quella chiamata catena veloce) che procede con l’aggiunta di un nucleotide alla volta. Si ricorda che 3’-5’ e 5’-3’ sono le direzioni del filamento di DNA che abbiamo detto essere orientato, perché possiamo identificare la posizione del carbonio sullo zucchero, quindi 3’ e 5’ si riferiscono proprio a come sono orientati i nucleotidi nei filamenti. In ogni catena di DNA abbiamo due filamenti antiparalleli. La DNA polimerasi lavora con tutte queste restrizioni perché quello che dobbiamo garantire è il minor numero di errori possibile. Un errore nella sequenza di DNA significa una modifica all’interno di un gene, che vuol dire modifica all’interno di una molecola funzionale che si andrà a produrre. È fondamentale quindi che questo aspetto venga considerato moltissimo. La DNA polimerasi è per questo un enzima molto sofisticato. 1 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 DNA POLIMERASI Ha una struttura che ricorda una mano, infatti ogni zona è nominata con pezzi della mano. La vera reazione di catalizzazione del legame fosfodiestere avviene nella zona del palmo: il DNA srotolato entra all’interno della cavità della DNA polimerasi e un nuovo nucleotide viene accoppiato. Proprio per l’accoppiamento specifico tra le basi azotate(dato da una caratteristica dimensionale standard), se questo non è corretto la stabilità dei legami idrogeno che si formano tra le basi azotate e la dimensione strutturale di questo complesso va ad avvicinare il filamento in crescita al dominio esonucleatico (zona rossa nell’immagine), il quale catalizza la degradazione/idrolizzazione del legame fosfodiestere, di fatto stacca il nucleotide che è stato appena legato alla catena in crescita. Questo è un controllo della DNA polimerasi, definito come controllo di proof-reading, di correzione delle bozze, proprio perché controlla che il nucleotide legato alla catena in crescita sia quello corretto (accoppiamento tra le basi azotate corretto). Se il nucleotide è corretto si procede con l’aggiunta di un ulteriore nucleotide altrimenti si ha una pausa, viene rimosso il nucleotide non corretto in corrispondenza di questo dominio esonucleatico e si introdurrà il nuovo nucleotide. Come si vede, la direzione della reazione esonucleatica è 3’-5’, quindi opposta rispetto alla direzione di crescita del filamento. Quando nota un errore la DNA polimerasi fa una pausa cinetica per controllare effettivamente che il nucleotide sia corretto e per farlo lo fa con un’analisi dimensionale: quando non vi è accoppiamento corretto tra la basi si ha una sorta di fluttuazione del filamento in una dimensione maggiore rispetto alla standard e la DNA polimerasi attiva il suo dominio esonucleatico, rimuovendo il nucleotide scorretto e appaia quello corretto. È un processo molto costoso dal punto di vista del dispendio energetico, in quanto capita spesso che venga rimosso anche un nucleotide corretto. È un processo che tende talmente 2 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 all’ottimizzazione che talvolta la rimozione nucleasica del nucleotide avviene anche su nucleotidi corretti che per qualche motivo non erano appaiati in modo perfetto, per cui vengono rimpiazzati con un altro nucleotide anch’esso corretto. Questo mostra come può essere un processo dispendioso. È un sistema complesso proprio per garantire la corretta replicazione del DNA. Una volta terminata la polimerizzazione, ci troviamo alla fine della replica del filamento stampo con il primer come nucleotide iniziale, che si è detto essere un primer di RNA catalizzato dalla presenza della primasi o dell’RNA polimerasi, che è anch’esso un enzima ma non richiede la presenza di nucleotidi di partenza, lavora quindi anche all’estremità. Catalizza la formazione di legami tra nucleotidi, in particolare tra quelli che presentano il ribosio, caratteristici dell’RNA. Chiaramente il DNA non presenta frammenti di RNA all’interno, quindi ciò implica che una volta terminata la replica si dovrà avere la rimozione dei nucleotidi di RNA e l’unione di nucleotidi di DNA. Questo avviene ad opera di un altro enzima sempre in grado di catalizzare il legame fosfodiestere e quindi appartiene anch’esso alla famiglia delle DNA polimerasi. Come si vede ha un nome diverso, ma di fatto viene definita così perché solitamente quando si sente parlare di DNA polimerasi ci si riferisce alla DNA polimerasi trattata in precedenza, ossia quella che allunga il filamento in direzione 3’-5’, ma più precisamente la denominazione di queste ultime è DNA polimerasi III (per i procarioti) e DNA polimerasi δ (per gli eucarioti). A sostituire il primer c’è sempre una DNA polimerasi ma in questo caso è una DNA polimerasi I (nei procarioti) e DNA polimerasi α (negli eucarioti). In entrambi i casi la loro caratteristica è catalizzare il legame fosfodiestere ma con due modalità diverse. La III o δ richiede tutte le precauzioni viste prima, mentre la DNA polimerasi I o α non richiede tutte queste attenzioni e semplicemente catalizza il legame. Si utilizza quindi per rimuovere e sostituire il frammento di RNA primer con il DNA. Tramite la DNA polimerasi I si ha la sostituzione dell’RNA primer con dei segmenti di DNA. Questo aspetto richiede l’intervento di un ulteriore enzima: quando viene sostituito RNA con DNA, negli ultimi due nucleotidi che si interfacciano si ha un’interruzione. Per legare questa interruzione c’è un enzima, chiamato ligasi, in grado di catalizzare la formazione del legame fosfodiestere tra due estremità. Quindi mentre le DNA polimerasi formano legami tra nucleotidi di catene in crescita, le ligasi legano due frammenti di DNA.A questo punto viene colmato il buco che si forma e resta il filamento di DNA completo replicato completamente a base di DNA e senza interruzioni. 3 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 In questa tabella sono riportate tutte le DNA polimerasi. Come si vede quando si parla di DNA polimerasi ci si riferisce ad una famiglia di enzimi la cui funzione è quella di catalizzare la formazione di legame fosfodiestere tra nucleotidi. Si vede che per i procarioti e eucarioti sono presenti diversi nomi e diversi ruoli (numeri per i procarioti e lettere greche per gli eucarioti). Quelle citate sono la δ e la III che rispettivamente negli eucarioti e nei procarioti sono l’enzima principale che permette la replicazione. La DNA polimerasi I e α sono le seconde in ordine di importanza e hanno il compito di riempire e sostituire i frammenti di RNA (formati soprattutto da RNA primer) con frammenti di DNA. Anche tutte le altre polimerasi presenti nella tabella hanno la caratteristica di formare questo legame e si vedono le varie funzioni (non sono da sapere); l’aspetto importante è notare che si tratta di una famiglia di DNA polimerasi. Per i procarioti ci sono meno DNA polimerasi rispetto ai procarioti; per fare un discorso generale la DNA polimerasi I e α svolgono la medesima funzione, idem la III e δ che svolgono il proof-reading e sono fondamentali nella replicazione. 4 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 FILAMENTO LENTO Ciò che si è visto finora vale per il filamento veloce, che attacca in direzione 5’- 3’ un nucleotide alla volta; c’è anche il filamento definito lento perché non procede attaccando un nucleotide alla volta in quanto si trova nella condizione di essere nella direzione opposta della polimerasi δ (o III). La DNA polimerasi non potrebbe attaccare i nucleotidi nella direzione 3’-5’. Abbiamo un dominio esonucleatico quindi in questa direzione l’unica azione che compie la DNA polimerasi è di degradare il legame fosfodiestere. Per poter replicare il filamento che va nella direzione 3’- 5’ si hanno i frammenti di Okazaki. Questi frammenti richiedono che vi sia un innesco di RNA (quindi si vede nell’immagine la primasi che sintetizza un innesco) e a partire dalla fine dell’innesco la DNA polimerasi δ (o III) inizia la sintesi nel verso opposto rispetto a quello di apertura del doppio legame e inizia con un nucleotide alla volta a formare quelli che appunto sono definiti frammenti di Okazaki. Alla fine del processo l’innesco viene rimosso e si ritrova la DNA polimerasi α (o I) che rimuove RNA e sostituisce nucleotidi dell’innesco con DNA. A questo punto avremo tanti frammenti ma non più misti di RNA e DNA, bensì solo DNA; a questo punto interverrà la DNA ligasi a formare il legame fosfodiestere tra i frammenti di DNA per completare quindi la catena. Il processo è quindi molto simile rispetto alla catena veloce, entrano in gioco gli stessi enzimi, quello che cambia è il meccanismo di crescita: nella catena veloce si attacca un nucleotide alla volta in direzione 5’-3’, mentre nella lenta prima si legano degli inneschi e poi la crescita avviene in direzione opposta rispetto al verso di srotolamento. Di fatto gli enzimi e le loro funzionalità sono identici. Quando si ha la replicazione del DNA, si ha a destra il DNA madre che viene srotolato ad opera della elicasi, associato alla topoisomerasi che evita vi sia uno stress meccanico dovuto allo srotolamento nelle parti più distali. Si hanno poi le proteine SSB (le palline nell’immagine) che si è visto avere il ruolo di stabilizzare i filamenti quando sono singoli; ci sono 5 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 poi le DNA polimerasi che lavorano su entrambi i filamenti (veloce e lento) attaccando un nucleotide alla volta. La differenza è che nel filamento lento si trovano i primer di RNA che fanno sì che la DNA polimerasi lavori formando dei frammenti; i quali, dopo essere stati sostituiti con frammenti di DNA ad opera della polimerasi alfa (o I), vengono attaccati gli uni con gli altri dalla polimerasi. Si tratta di un processo che avviene contemporaneamente nei due filamenti nonostante avvenga in maniera diversa. Il sistema è particolarmente complesso da questo punto di vista. Se si abbina questa schematizzazione a ciò che avviene a livello biologico, quello che coordina tutto il sistema è un complesso proteico estremamente strutturato (slide sotto) che è un oloenzima (si vede nel caso degli eucarioti). Tutti gli enzimi nominati devono lavorare sotto una supervisione e in modo coordinato, questo complesso ha proprio questa funzione di coordinazione. Dall’immagine: Si ha il filamento grigio che viene srotolato ad opera della DNA elicasi (in arancione); ad entrambi i lati sono legate a questo sistema le due DNA polimerasi, posizionate nel grafico in direzione opposta. Dall’altra parte si vede la DNA polimerasi che lavora nel verso opposto, il primer di RNA (verde) e il DNA in formazione (rosso e arancione). Il sistema è complesso ma grazie alla presenza di un complesso proteico si può coordinare in modo efficace la formazione del DNA, per entrambi i filamenti. Quando la DNA polimerasi nel filamento lento avrà terminato un ‘pezzo’, si attaccherà un nuovo innesco e la DNA polimerasi ricomincerà su questo nuovo filamento. Quello che si vede a sinistra dell’immagine è una bolla di replicazione dove si ha un filamento che cresce veloce e uno lento. 6 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 Domanda: la DNA ligasi è necessaria solo nella catena lenta? Nella catena lenta la DNA ligasi lavora di più perché i frammenti sono in numero maggiore. Viene usata anche in quella veloce perché lega il frammento di DNA ottenuto dalla sostituzione del primer RNA con il resto del filamento prodotto in maniera continua. Quindi si può dire che nel filamento veloce fa un unico intervento mentre in quello lento ha un lavoro continuativo perché lega i frammenti di Okazaki e il sostituto del primer, mentre in quello veloce interviene solo in questo ultimo caso. È fondamentale che il DNA venga replicato tutto e in maniera corretta, perché questo doppio filamento andrà a formare una cellula, quindi da quel momento in poi ciò che è dentro il nucleo della cellula, diventa il corredo genetico della cellula stessa. Se si vuole mantenere intatto il DNA all’interno di un organismo che è un insieme di un numero elevatissimo di cellule si deve fare in modo che la replicazione mantenga i filamenti invariati. L’output di DNA deve rimanere uguale alla cellula madre. Si è parlato finora del meccanismo senza distinguere il caso di eucarioti o procarioti perché è un processo molto simile. C’è qualche differenza sotto alcuni aspetti in merito al processo di replicazione. Innanzitutto, è diversa la caratteristica strutturale del DNA nei due organismi, nel senso che negli organismi procarioti ha una forma circolare e per identificare che si tratta di DNA di una cellula procariote si usa la notazione “Dna”( D in maiuscolo e na in minuscolo); nelle cellule eucariote è allungato, lineare e si scrive “DNA”. La lunghezza è molto diversa, quindi il meccanismo di replicazione varia leggermente nei due casi.  Nelle cellule procariote c’è un unico punto di partenza, il DNA viene replicato a partire da un inizio e un unico sistema di replicazione (un unico oloenzima) replica tutto il filamento. Quindi si ha un’unica origine e si fa tutto il giro.  Nelle eucariote si hanno invece diversi punti di origine, quindi tante zone vengono replicate contemporaneamente per velocizzare il processo replicativo. Tutte queste zone caratterizzate dalla presenza di un’origine sono dette repliconi, e vanno da un’origine all’origine successiva. La presenza di un elevato numero di repliconi causa un problema aggiuntivo, ovvero è molto importante che il sistema sia perfettamente coordinato, altrimenti si ha il rischio di replicare più volte le stesse parti. Nella replicazione del DNA la presenza dei repliconi è vantaggiosa perché ci permette di accelerare il tutto, ma porta con sé il rischio di replicare più volte gli stessi pezzi, quindi sono sistemi sviluppati solo nelle cellule eucariote. 7 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 La seconda differenza tra le cellule eucariote e procariote è una conseguenza del fatto che il DNA degli eucarioti sia lineare: quando si pensa al filamento lento, serve un innesco, un pezzettino di RNA che fa partire la polimerizzazione della DNA polimerasi. Quando ci si trova all’estremità finale del DNA non è detto che l’innesco si posizioni proprio sull’ultimo nucleotide, quindi si rischia, nella replicazione del filamento lento, di perdere alcuni dei nucleotidi finali. Per evitare ciò esiste un enzima chiamato telomerasi che lavora all’interno della cellula per andare ad attaccare sequenze di nucleotidi nella parte terminale del filamento lento ed evitare quindi che un innesco, che effettivamente non parte dalla parte finale del filamento, causi la mancanza della replicazione di un pezzo di DNA finale. Queste telomerasi attaccano le sequenze di nucleotidi definiti telomeri, che vanno a costituire le parti finali dei filamenti di DNA; queste sono caratterizzate da essere sequenze di nucleotidi molto ripetitive (una sequenza telomerica piuttosto nota per gli eucarioti è TTAGGG) e permettono di evitare che ci sia perdita di replicazione tra un ciclo replicativo e un altro. (La telomerasi c’è solo per le cellule eucariote, per evitare che ci sia un accorciamento del filamento dovuto alla struttura lineare del filamento stesso). Si riporta una slide riassuntiva di quanto trattato (con gli enzimi principali, che sono quelli da ricordare). 8 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 Domanda: la telomerasi non era anche responsabile della senescenza cellulare? Questo processo di inserimento dei telomeri in alcuni individui, che sembra essere un aspetto abbastanza frequente, non è efficace. Nel senso che in alcune popolazioni cellulari si osserva nel tempo una riduzione della lunghezza dei frammenti di DNA che è proprio associata alla senescenza cellulare. Di conseguenza un metodo per analizzarla è quello di andare a studiare i telomeri. Il perché esistano queste telomerasi è dovuto ad evitare che vi sia un accorciamento del DNA, ma si osserva che nel tempo questo comunque avviene, si avrà un accorciamento dei telomeri che è sintomo di senescenza cellulare. È un argomento di studio molto trattato. Domanda: la telomerasi interviene sul primer del filamento lento e la DNA polimerasi α sul primer del filamento veloce? No, la telomerasi interviene nella parte opposta rispetto al primer, nella parte terminale, quando il processo di replicazione sta terminando. Questo è particolarmente vero nel filamento lento perché hai il filamento stampo e qua e là si attaccano degli inneschi di RNA, ma il punto dove si attaccano non è guidato, è abbastanza casuale. Quindi non è detto che questo innesco vada a finire sull’ultimo nucleotide; se non dovesse finire sull’ultimo, la DNA polimerasi parte dalla fine dell’innesco, se l’innesco non finisce veramente lì di conseguenza si troverà un pezzo vuoto che sul filamento lento è impossibile da colmare, quindi vengono usati questi telomeri che si inseriscono nella parte finale di questo filamento. L’innesco viene sostituito dalla DNA polimerasi I (o α) e la parte mancante che potrebbe esserci per la posizione sbagliata dell’innesco è controllata dalla telomerasi. TRASCRIZIONE Si può passare al secondo meccanismo fondamentale della biologia molecolare. Con il termine trascrizione si intende quel meccanismo che permette di convertire l’informazione che si ha all’interno del DNA in una catena di rna, che è poi il messaggero che porta l’informazione ad essere convertita in una molecola funzionale, la proteina. Nella fase di trascrizione si passa dalla sequenza di DNA alla sequenza di rna. Di RNA ne abbiamo più di uno, si deve identificare il tipo. In questo caso l’RNA trasposta l’informazione dal DNA verso la formazione di una proteina e viene chiamato RNA messaggero (mRNA), che si forma copiando un filamento di DNA in un filamento di RNA. La prima informazione che dobbiamo esplicitare è che per quanto riguarda l’RNA messaggero è diverso ciò che capita in una cellula eucariote piuttosto che in una procariote. Se finora abbiamo definito simili i meccanismi, in questo caso ci sono delle differenze da descrivere. Se si osserva una cellula procariota la trascrizione che avviene da DNA a RNA, non essendo il DNA dentro una ulteriore struttura (nucleo cellulare per cellule eucariote), tutto ciò che viene trascritto nell’RNA messaggero viene tradotto in molecola funzionale. Negli eucarioti ciò non è vero: la copia di RNA 9 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 che si forma a seguito della lettura di una parte di DNA, subisce modifiche nel nucleo che lo fanno ‘maturare’. Ciò che esce dal nucleo è un RNA ‘maturo’ tradotto poi in proteina. Questo frammento subisce modifiche nella fase di maturazione che non subisce nelle cellule procariote. Questa slide di differenza tra le due cellule è fondamentale. Il trascrittoma è l’insieme di tutti gli RNA prodotti da una cellula in una particolare condizione metabolica. Quando troviamo frammenti di rna messaggero nel citosol della cellula significa che questa si è attivata per ottenere una certa molecola funzionale. Quindi l’analisi del trascrittoma è un metodo per capire cosa sta facendo la cellula, quali cellule sta per produrre o sta producendo. Il primo processo che si vedrà è quello che permette di prendere il filamento di DNA e ottenerne uno di rna messaggero. Questo processo avviene ad opera dell’rna polimerasi, un enzima che ha lo stesso ruolo della DNA polimerasi, ovvero la catalizzazione del legame fosfodiestere, ma a differenza di quest’ultima non ha attività esonucleasi (quindi il proof-reading) e per questo motivo non richiede un primer, quindi non fa il controllo sui nucleotidi e lavora in maniera più snella. All’interno della RNA polimerasi avvengono tutte le fasi: viene srotolato il filamento di DNA (arancione) e via via vengono aggiunti i ribonucleotidi uno alla volta per copiare il filamento. L’unica differenza rispetto al caso del DNA è lo zucchero, ma il meccanismo di formazione del legame fosfodiestere è lo stesso. 10 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 Cambiano le condizioni al contorno: non c’è proof-reading e la RNA polimerasi può iniziare dal primo nucleotide senza richiedere che ve ne sia uno precedente. Per quanto riguarda il legame chimico è tutto analogo. Un aspetto importante da evidenziare è che il DNA è una doppia elica mentre l’RNA è un singolo filamento. Se si pensa di copiare il filamento che va da 3’ a 5’ o viceversa si ottengono rna differenti, quindi il processo di trascrizione da DNA a RNA avviene copiando un solo filamento. Si vede nell’immagine che il trascritto inizia con la direzione 5’, quindi utilizza come stampo il filamento di DNA che va da 3’ a 5’. È una condizione per garantire che il filamento trascritto per uno stesso gene sia sempre lo stesso. Il filamento di DNA copiato è sempre quello 3’-5’. La DNA si forma per accoppiamento specifico tra le basi (adenina-uracile, citosina-guanina). Si è già visto all’inizio, all’interno del DNA sono contenute tantissime informazioni ma per produrre una molecola funzionale si utilizza il gene. Per identificare dove si trova il gene nel DNA, esistono delle sequenze di DNA definite promotori che legano l’RNA polimerasi. Se si vuole produrre una determinata proteina è necessario identificare il gene che la produce, serve quindi un meccanismo che faccia partire la trascrizione dell’rna dal punto giusto. Questo sistema è chiamato promotore, vale a dire una sequenza di nucleotidi interna al DNA che lega in maniera specifica l’RNA polimerasi. Una volta legati, l’RNA polimerasi inizia la trascrizione. Si parte dunque dal filamento stampo, si ha l’innesco e inizia la produzione dell’RNA messaggero che va avanti fino al segnale di terminazione contenuto nel DNA, ovvero una sequenza di DNA che informa l’RNA che il gene è terminato. In questo modo ho codificato solo quel gene che porterà alla produzione di una proteina specifica. L’RNA polimerasi, quindi, non inizia a lavorare dove vuole ma in corrispondenza di zone specifiche chiamate promotor che la fanno legare in modo specifico in quella zona. Allo stesso modo si ha una sequenza di terminazione che informa l’RNA polimerasi che il gene è terminato e deve interrompere la trascrizione. 11 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 Per quanto riguarda i promotori ce ne sono di diversi tipi, sono sequenze simili e molto lunghe. Questi segnali di attacco di fatto occupano un grosso spazio nel DNA; quelle nei procarioti sono più corti, mentre quelli eucarioti sono anche di lunghezze piuttosto elevate. Un promotore piuttosto famoso è il TATABOX, lunghissima sequenza di timina e adenina (l’aspetto importante è solo la lunghezza di questa catena). Domanda: ci sono tante RNA polimerasi quanti geni ci sono o ce n’è solo una? Esiste un’unica RNA polimerasi per la trascrizione, quello che varia è che questi promotori sono tendenzialmente “mascherati”, nel senso che la RNA polimerasi non li vede e di fatto non si attiva. Quando questi vengono resi visibili (attivazione genica) l’RNA inizia a trascriverli. L’attivazione genica è modulata da ulteriori complessi che vanno a rendere disponibili o meno i promotori e a seconda di quali sono disponibili l’RNA inizia la trascrizione. In questa fase di trascrizione ci sono rischi di rottura di DNA nella fase di srotolamento e arrotolamento, ma i rischi maggiori di mutazioni si hanno nella replicazione più che nella trascrizione. In questo ultimo caso si rischia che non sia corretto il trascritto perché ci sono meno controlli; l’utilizzo di un enzima meno efficace nella fase di trascrizione è indicativo del fatto che nel sistema biologico ci sono processi più importanti che necessitano di maggiori attenzioni, infatti la replicazione vuole che il DNA sia mantenuto uguale a se stesso il più possibile e ciò è garantito dai numerosi controlli che vengono eseguiti (il rischio di una patologia sarebbe molto elevato). Avere un trascritto sbagliato di RNA è anche rischioso ma è una fase transitoria, mentre un errore nella replicazione porta a un cambiamento definitivo nel tempo. Domanda: cosa succede se avviene una rottura del DNA? Argomento prossima lezione. 12 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 Per quanto riguarda il processo dei procarioti questo è lineare, mentre negli eucarioti vi è il processo di maturazione degli RNA messaggeri. È un processo che avviene nel nucleo e che causa delle variazioni all’interno del trascritto di RNA messaggero per renderlo traducibile in molecola funzionale. La prima cosa da evidenziare è che nell’RNA esistono delle sequenze di nucleotidi che hanno ruoli diversi: alcune sequenze sono definite esoni, altre introni. Gli esoni sono quelle effettivamente codificanti, gli introni sono sequenze di supporto che servono nella fase di trascrizione e replicazione ma non nella fase di traduzione, quindi contengono informazioni non utili alla formazione della molecola funzionale; di conseguenza, vengono rimosse nella fase di maturazione. Negli organismi eucarioti il primo trascritto di rna è definito primario o pre RNA messaggero. All’interno del nucleo gli introni vengono rimossi e rimangono solo gli esoni. La fase di rimozione degli introni avviene con un meccanismo che si chiama splicing, che può avvenire per autosplicing (gli introni si rimuovono in maniera autonoma) oppure viene utilizzato un complesso sempre di RNA che sono gli small nuclear RNA. La loro funzione e di mediare la maturazione dell’RNA messaggero. Questa rimozione avviene esclusivamente negli eucarioti, perché nelle cellule dei procarioti non esistono gli introni ma solo gli esoni, quindi tutto ciò che viene trascritto sarà direttamente tradotto nella molecola funzionale. Oltre alla rimozione degli introni, nella fase di maturazione al trascritto maturo vengono aggiunte due parti: un cappuccio nella parte 5’ e una coda all’estremità 3’. Il cappuccio è una sequenza di 7- metilguanosina, mentre la coda è poliadenina, quindi una lunga sequenza di adenina. 13 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 Queste due parti vengono aggiunte all’RNA messaggero all’interno del nucleo perché servono per favorire la fuoriuscita del complesso stesso dal nucleo e vengono aggiunte a fine fase di maturazione. Uscendo dal nucleo solo i trascritti con questa coda e cappuccio, si garantisce che ciò che esce sia RNA maturo. Inoltre, la presenza di cappuccio e coda stabilizza la molecola all’interno del citosol, perché abbiamo una serie di enzimi (anche ribonucleasi) che tendono a degradare dei frammenti di RNA, ma la presenza di queste parti garantisce che le ribonucleasi non intervengano nella degradazione del frammento. Hanno quindi (coda e cappuccio) una duplice funzione:  confermare l’effettiva maturazione dell’RNA prima dell’uscita dal nucleo;  proteggere questi rammenti di RNA dalle ribonucleasi. Una volta uscito dal nucleo l’RNA può essere tradotto e si va incontro all’ultima fase del processo, la traduzione. TRADUZIONE Per questo processo è necessario introdurre altri tipi di rna: RNA transfer (tRNA), è il principale, la molecola più affascinante. È un RNA, quindi sequenza di ribonucleotidi, legata però ad un amminoacido. La caratteristica di questi RNA è che presentano nella fase terminale, in basso, quello che viene chiamato anticodone: una tripletta di nucleotidi che si lega in maniera specifica sempre tramite le basi, con una tripletta sull’RNA messaggero. Ciò permette di passare da una codifica nucleotidica a una sequenza di amminoacidi, in quanto quando si ha accoppiamento di una molecola di RNA transfer con il codone corrispondente sul messaggero, si va di fatto a legare un amminoacido. Si vede nell’immagine che a quello specifico RNA transfer con anticodone UCA si ha legata una serina. A destra invece a AUG si ha una tirosina. 14 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 Questo significa che tramite l’utilizzo di questi RNA è possibile tradurre la sequenza di nucleotidi dell’RNA messaggero in una sequenza nucleotidica. L’RNA transfer lo si chiama anche amminoacil- tRNA-transfer quando legato all’amminoacido. Questo è il segreto della traduzione che avviene nei ribosomi che permette il passaggio da una sequenza all’altra. La sequenza è specifica, quindi ciò che si ha scritto nell’rna permette di identificare in maniera specifica il tipo di amminoacido che si va a inserire. Ciò è esplicitato nel codice genetico, un codice che permette di tradurre l’rna messaggero in una sequenza amminoacidica e che lega le triplette dell’rna messaggero con specifici amminoacidi. A livello biologico tutto questo processo viene svolto dall’RNA transfer, ma a noi interessa capire la molecola che si vuole produrre, di conseguenza è necessaria una tabella del codice genetico, come quella dell’immagine. Quello che si vede in tabella è ciò che si trova sull’RNA messaggero, quindi UUU farà legare un anticodone corrispondente quindi CCC e questo RNA transfer sarà legato alla fenilanilina. LA SINTESI PROTEICA: IL CODICE GENETICO Tramite l’analisi del codice genetico si prende una sequenza di RNA messaggero e si capisce qual è l’amminoacido da considerare. Osservando la tabella si vedono 4 nucleotidi per tre posizioni quindi le possibilità sono 64. Perché 64? Gli amminoacidi sono 20, quindi si ha una discrepanza, ci sono più soluzioni delle necessarie. Una risposta al perché non esiste, è un’evoluzione degli organismi viventi. Se si osserva la tabella ci sono 20 amminoacidi quindi ci si aspetta che ci saranno 3 soluzioni per amminoacido, invece alcuni di questi hanno tante sequenze, come anilina e prolina ne hanno 3, altre 2, altre 1 (es. triptofano). Non c’è una relazione molto chiara tra le possibilità e quindi le triplette che codificano per un amminoacido e ciò che avviene nel codice genetico. (Se ne discuterà in seguito durante il corso) Oltre agli amminoacidi si trova la parola STOP, sono le triplette che codificano l’interruzione della traduzione. 15 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 Si notano alcune caratteristiche del codice genetico:  tre basi codificano un amminoacido;  È importante notare che il codice non è sovrapposto, le basi si spostano di tre in tre. Potrei avere due possibilità: quella effettivamente di codice non sovrapposto oppure di avere un codice sovrapposto, cioè mi sposto di un nucleotide alla volta per la tripletta successiva. Questo non avviene essendo non sovrapposto e implica un rna messaggero più lungo;  Non ha punteggiatura: quando inizia la fase di traduzione si va avanti fino alla codifica dello stop, non ci sono intervalli, c’è solo la sequenza di triplette e lo stop;  È degenerato, invece di avere 20 possibilità (21 con lo stop) ne abbiamo molte di più, 61 triplette che codificano gli amminoacidi più tre triplette per lo stop. Dove avviene la traduzione? Tutta la traduzione avviene all’interno dei ribosomi, delle palline che si trovano sul reticolo endoplasmatico. Sono dei complessi formati da RNA ribosomiale. Hanno l’unico ruolo di coordinare il legame tra l’rRNA transfer e l’RNA messaggero, quindi leggere l’RNA messaggero per produrre la sequenza amminoacidica accoppiando RNA transfer corretto con la tripletta corretta. Quando l’RNA transfer è associato alla tripletta corretta sull’RNA messaggero abbiamo la tripletta che si può legare alla catena amminoacidica in crescita e ciò avviene tramite l’enzima a RNA che si trova dentro il ribosoma, che prende il nome di ribozima. Con questo nome identifichiamo le sequenze di rna con funzione enzimatica. 16 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 Domanda: di cosa è fatto il cappuccio? È 7-metilguanosina trifosfato, quindi è un nucleotide diverso per questo metile in posizione 7; la coda è di poliadenina. Entrambi hanno un duplice ruolo:  permettere la fuoriuscita di RNA dal nucleo (solo quelli con cappuccio e coda che garantiscono maturazione completa);  una volta usciti, impedire che siano attaccati dalle ribonucleasi evitando la rottura dei legami fosfodiestere della catena di RNA messaggero. Si vede nell’immagine il processo per i procarioti e per gli eucarioti. Per questi ultimi si ha la maturazione che non avviene nei procarioti, per cui tutto ciò che viene trascritto viene anche tradotto. Negli eucarioti invece si ha la maturazione per cui non tutta la parte contenuta nel gene viene effettivamente tradotta nella proteina ma solo gli esoni (parti codificanti). 17 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 Si è parlato dell’RNA transfer, in particolare dell’amminoacilRNAtransfer, che contiene uno specifico anticodone che si lega all’RNA messaggero per tradurre e inserire diversi amminoacidi nella catena e quindi nella proteina,che è la molecola funzionale che si vuole produrre. Ciò avviene nel ribosoma (vicino al reticolo endoplasmatico): quando incontra un RNA messaggero maturo si lega alla prima estremità e inizia a leggerlo. Ciò implica che l’RNA messaggero non attivi correttamente la traduzione perché quando l’RNA messaggero viene letto dal ribosoma, questo non inizia la sintesi della proteina finché non incontra quella che viene chiamata sequenza di inizio, ovvero la tripletta AUG, associata all’RNA transfer legato alla metionina. Quando il ribosoma si lega all’RNA messaggero inizia a leggerlo, ma non inizia a sintetizzare nulla finché non incontra questa sequenza AUG caratteristica della metionina. Dalla metionina in poi legge tripletta per tripletta abbinando all’RNA transfer complementare a quello che è il codone sull’RNA messaggero. Si va avanti così a leggerlo e nel frattempo la catena aumenta di un’unità per volta. 18 Margaria/Pallotta 19 Biochimica (Tonda Turo) 1/12/2020 Quindi la struttura è fatta a tre canali:  da un lato RNA transfer senza l’amminoacido che viene rimosso;  un canale intermedio deputato all’accoppiamento diretto codone anticodone dove il ribozima porta a catalizzare la formazione del legame peptidico tra due amminoacidi;  infine, un terzo canale dove si ha la prima interazione con l’RNA transfer. Domanda: ogni catena peptidica inizia con la metionina? Si, ma non è detto che ogni proteina che troviamo nell’organismo inizi con la metionina, questo perché dopo la lettura di tutto l’RNA messaggero arriviamo alla terminazione del processo, quando il ribosoma incontra la sequenza di stop, a questo punto nell’RNA transfer non abbiamo amminoacidi ma un comando affinché il ribosoma si stacchi dall’RNA messaggero e rilasci la sequenza amminoacidica. Tutte le sequenze iniziano con la metionina sia negli eucarioti che procarioti, però può essere rimossa. Viene rimossa in modo abbastanza casuale, alcune proteine iniziano con altre senza. In quelle dove non c’è ci si deve ricordare che era presente ed è stata rimossa in una seconda fase. L’accoppiamento amminoacido-RNA transfer avviene per accoppiamento specifico tra le basi, si hanno più possibilità per la presenza degli anticodoni ma si legherà sicuramente quello con codone affine. Domanda: ribozima Il ribozima è RNA con funzione enzimatica che catalizza la formazione del legame peptidico tra gli amminoacidi nella catena in crescita. 19 Lanfranco/Chieffallo 20 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 03/12/2020 Nell’ultima lezione sono state introdotte le due ulteriori fasi del dogma centrale della biologia molecolare oltre alla replicazione del DNA. Si è parlato quindi della trascrizione del DNA in una molecola di RNA e poi della sua traduzione in una molecola funzionale che in questo caso sarà una sequenza di acidi nucleici (una proteina). Si è visto che nelle fasi di trascrizione l’acido nucleico di riferimento è quello a base di ribosio e non di deossiribosio, si parla infatti di ribonucleotidi e cioè di RNA. Le molecole principali di RNA che sono state analizzate sono l'RNA messaggero (mRNA) e l’RNA transfer (tRNA). L’mRNA è la molecola che copia il filamento 3’-5’ di DNA perchè all’interno del filamento sono contenute le “istruzioni” per formare una molecola funzionale. L’unica differenza vista fino ad ora riguardo i meccanismi tra procarioti ed eucarioti è che nei procarioti tutto quello che viene trascritto viene anche tradotto mentre, negli eucarioti, all’interno del nucleo avviene una fase di maturazione dell’RNA durante la quale le parti non codificanti (introni) vengo tagliate e rimangono solo quelle codificanti (esoni). L’RNA transfer è caratterizzato dall’avere un anticodone che è definito da una sequenza di tre nucleotidi e a seconda di questa sequenza si ha uno specifico amminoacido legato a questo RNA transfer. Quando è presente il legame tra tRNA e amminoacido, l’RNA prende il nome di amminoacil-tRNA. Questa molecola è quella che permette la traduzione perchè accoppia a una sequenza di nucleotidi un amminoacido specifico. Ci sono 20 amminoacidi quindi il codice genetico è degenerato (ha molte più possibilità) e c’è anche un’altra codifica che è quella dello stop (tre particolari triplette che costituiscono degli RNA transfer che non portano un amminoacido ma informano che bisogna fermare la codificazione). La sintesi proteica avviene all’interno del ribosoma che è un complesso che contiene sia RNA che proteine. Il ribosoma legge la sequenza di RNA messaggero dall’inizio finché non incontra la sequenza di inizio. La sequenza AUG (tripletta scritta sul cotone dell’mRNA) è la sequenza di inizio e il ribosoma si attiva a partire da qui e traduce fino al raggiungimento della sequenza di stop. AUG codifica la metionina quindi la prima molecola è sempre una metionina. Rispetto a una metionina che si trova all’interno della proteina, la prima metionina è modificata benché sia codificata dalla stessa tripletta AUG. Per i procarioti è una N-formilmetionina (fmetionina), mentre per gli eucarioti può essere di diversi tipi (ma mai quella dei procarioti) e si indica come e-metionina. Le fasi successive della sintesi proteica sono: Fase 3: allungamento. Man mano che l’RNA messaggero viene letto fino ad arrivare allo stop, il ribosoma accoppia l’RNA transfer con la tripletta sull’RNA messaggero. All’interno del ribosoma c’è una zona caratterizzata dalla presenza di un ribozima che è di nuovo una sequenza di RNA ma con una funzione catalitica/enzimatica. Questo ribozima ha la funzione di catalizzare la formazione del legame peptidico tra gli amminoacidi e di allungare la catena polipeptidica. Fase 4: terminazione. Quando il ribosoma incontra la sequenza di stop (schematizzata come una sorta di RNA transfer che non ha nulla di legato, non ha una sequenza amminoacidica) questa informazione fa si che il ribosoma stacchi la sequenza polipeptidica che si era formata fino a quel momento e rilasci la proteina, che ora è una molecola funzionale completamente tradotta. Fase 5: modifica post-traduzionale. É un processo molto variegato, comprende tutti i processi che possono modificare la sequenza polipeptidica che si è formata. La sequenza è una struttura secondaria quindi le modifiche portano alla formazione della struttura terziaria ma allo stesso tempo possono esserci altri cambiamenti (come proteolisi che 1 Lanfranco/Chieffallo 20 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 03/12/2020 porta da un unico polipeptide alla formazione di più proteine, glicosilazione e fosforilazione, ecc..). La sintesi delle proteine, affinché sia efficace, non avviene una alla volta. Da un RNA messaggero si può ottenere un numero infinito di copie della proteina a seconda di quante volte il filamento viene letto dal ribosoma. Per avere una certa attività funzionale è necessario che il numero di molecole funzionali prodotte sia adeguato. Di conseguenza la fase di lettura dell’mRNA non avviene con un ribosoma alla volta ma con più ribosomi che iniziano a leggere l’RNA messaggero in modo scaglionato. La struttura caratterizzata dall’RNA messaggero e i tanti ribosomi che lo stanno leggendo si chiama polisoma (rappresentato in figura). Figura 1 La metionina è sempre il primo amminoacido di una proteina e cambia tra gli eucarioti e procarioti. Questa diversità ha fatto sì che negli organismi eucarioti si è in grado di individuare proteine che derivano da organismi procarioti (come quelle dei batteri). L’organismo eucariota (come l’uomo) ha sviluppato, sulla superficie dei neutrofili, dei recettori in grado di individuare la presenza della f-metionina. Questo è interessante perchè consente di capire come i neutrofili (facenti parte del sistema immunitario umano) abbiano sviluppato un metodo per identificare la presenza di proteine prodotte dai batteri. Questo è un meccanismo sentinella per individuare la presenza di alcune infezioni batteriche. Si vede quindi che piccole diversità tra i diversi organismi ci da l’idea di come, dal punto di vista biologico, ci siano delle ottimizzazioni. Domanda: quindi tutte le proteine iniziano con la metionina? Risposta: No, non c’è una regola però nelle modifiche post-traduzionali alcune sequenze polipeptidiche rimuovono la metionina iniziale. 2 Lanfranco/Chieffallo 20 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 03/12/2020 Riassunto RNA polimerasi: È importante ricordare le differenze tra eucarioti e procarioti, l’RNA polimerasi come enzima (solo uno per l’RNA mentre ce ne sono parecchi per il DNA), la direzionalità dell’RNA messaggero (un filamento specifico), le caratteristiche schematiche dell’RNA transfer e le fasi della sintesi proteica. Lo splicing alternativo Analizzando i sistemi biologici riferiti al dogma centrale della biologia molecolare, nei primi anni del 2000 quando è stato sequenziato il DNA umano c’è stato un grosso stupore perchè prima di farlo l’idea era quella di prendere tutte le proteine presenti nell’uomo e di trascrivere tutti gli RNA messaggeri. Non essendoci relazione 1:1 tra amminoacido e tripletta si fanno degli errori, ma l’idea era di poter identificare in maniera generica il numero di geni che si posso avere, uno per proteina (è chiaro che si possono trovare solo gli esoni comunque). Si pensava così di trovare un numero di geni pari al numero di proteine, quindi si pensava di trovare circa 100.000-150.000 geni mentre quando una volta sequenziato se ne sono trovati solo 24.000. Ci sono molti meno geni rispetto agli RNA messaggeri e quindi rispetto alle proteine che vengono prodotte; questo è molto particolare perchè per produrre una proteina bisogna passare dalla trascrizione in RNA messaggero. Questa discrepanza di valori è stata spiegata con lo “splicing alternativo”. Si è già parlato di splicing quando ci si riferiva al processo che rimuoveva le parti non codificanti all’interno del nucleo (introni). Lo splicing avviene o come “auto-splicing” o a opera di altri frammenti di RNA che sono gli small- nuclear-RNA (snRNA). Per lo splicing si era detto che rimuove gli introni accorpando uno dietro l’altro gli esoni. In realtà lo splicing non è cosi semplice ma viene definito splicing alternativo perchè attraverso di esso è possibile partire dallo stesso gene (stessa sequenza di DNA) e, modificando l’ordine degli esosi, ottenere sequenze di RNA messaggero maturo differenti. 3 Lanfranco/Chieffallo 20 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 03/12/2020 Figura 2 Dalla figura 2 vediamo che se prendiamo in considerazione il DNA, il gene che parte da sinistra avrà un esone alternato a un introne e che ogni esone è rappresentato con un colore differente. Nella fase di trascrizione, il filamento 3’-5’ viene trascritto dal 3-RNA messaggero e si ha una coppia del filamento di DNA solo scritta con dei ribonucleotidi. A questo punto avviene la fase di splicing all’interno del nucleo, che può non essere sempre uguale, con cui non si rimuovono solo gli introni ma anche parti di esoni possono essere rimosse contestualmente alla parte di introne andando a formare proteine diverse. Se togliamo in figura l’esone 3 si forma una certa proteina (A), se invece del 3 rimuoviamo il 2 e il 4 abbiamo comunque una sequenza che porta alla formazione di una proteina diversa (B), nell’ultimo viene rimossa l’esone 2 e si ottiene una terza proteina (C). Questo mostra come da un solo gene si possono ottenere proteine diverse andando a modificare la fase di maturazione dell’RNA messaggero. Questa modifica viene principalmente apportata dagli snRNA che hanno il ruolo di identificare se oltre agli introni ci siano delle parti di esoni da rimuovere. Ciò spiega come sia possibile che a partire da un certo numero di proteine il numero di geni sia molto minore. 4 Lanfranco/Chieffallo 20 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 03/12/2020 Nella figura 3 si analizza questo comportamento sulla sintesi della tropomiosina. La tropomiosina è una proteina coinvolta nella contrazione muscolare che ha un gene specifico che si trova nel DNA e la cui struttura è molto diversa (anche nella sequenza amminoacidica) nei diversi tessuti. Si trova una tropomiosina di un certo tipo nel tessuto muscolo-scheletrico e altre in altri tessuti. Questo è abbastanza ovvio perchè essendo coinvolta nella contrazione del tessuto muscolare, nel cervello e nel fegato avrà un ruolo diverso rispetto al ruolo dei muscoli scheletrici. La possibilità di avere diversi tipi di tropomiosina è dato proprio dallo splicing alternativo perché, come riportato nella figura 3, il trascritto primario della tropomiosina generale è caratterizzata dalla presenza di 11 esoni ma se si analizza il trascritto dell’RNA della tropomiosina in vari tessuti si nota che mancano alcuni esoni (diversi a seconda dei Fig.3 tessuti). L’espressione genica Fino ad ora si sono analizzati i meccanismi per la produzione di una molecola funzionale di una proteina ma, in realtà, all’interno della cellula ci sono dei meccanismi che attivano la produzione di una proteina. Tutte le cellule dell’organismo non fanno contemporaneamente la stessa cosa ma, a seconda della loro necessità, attivano un particolare gene per la produzione di una specifica proteina. L’insieme di eventi che portano alla trascrizione di un gene che successivamente porta alla produzione di una proteina si chiama “espressione genica”. L’espressione genica può essere modulata a diversi livelli: 1. Nel DNA attivando la fase di trascrizione; 2. Una volta attivata la fase di trascrizione si può modificare ciò che avviene nell’RNA messaggero; 3. Nella proteina stessa andando a degradarla direttamente. Partendo dal DNA la modulazione dell’espressione genica si fa andando ad attivare a livello del DNA la trascrizione di un particolare gene. Quando si attiva la trascrizione si attiva il gene specifico che l’RNA polimerasi sta effettivamente trascrivendo per produrre l’RNA messaggero. L’RNA polimerasi ha la capacità di identificare l’inizio del gene legandosi al promotore, ma se si immaginasse che l’RNA polimerasi vaghi nel nucleo alla ricerca di un promotore, ci si dovrebbe aspettare che inizi la trascrizione di qualsiasi promotore che incontra, ma questo va contro la regolazione dell’attività cellulare. Di fatto questi promotori non sono sempre disponibili per l’RNA polimerasi ma si trovano in una condizione di “inibizione”, cioè sono inibiti quando quello specifico gene non deve essere attivato. Nel momento in cui si ha l’attivazione di quel gene tramite il fattore di trascrizione, si rimuovono gli inibitori dal promotore che a questo punto viene riconosciuto dall’RNA polimerasi che parte e 5 Lanfranco/Chieffallo 20 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 03/12/2020 inizia la fase di trascrizione. Non esistono solo meccanismi di inibizione ma anche di attivazione: oltre al mascheramento ad opera dell’inibitore esiste anche il meccanismo opposto che attiva l’RNA polimerasi a riconoscere il promotore. Questi sono i due meccanismi che gestiscono la modulazione genica a livello del DNA. Il meccanismo di attivazione (enhancer) sembra essere più associato ai geni dei tessuti specifici (geni che vengono associati alle caratteristiche funzionali della cellula all’interno di un determinato tessuto). Facendo un passo successivo si vede che l’espressione genica può essere attivata, si produce un trascritto che matura nel nucleo e poi esce nel citosol. A questo punto il trascritto di RNA messaggero può essere tradotto. È possibile regolare l’attività dell’espressione genica anche a livello dell’RNA messaggero perchè quando la sintesi della proteina non deve più essere continuata all’interno della cellula è necessario che queste sequenze di RNA messaggero vengano degradate e rimosse. La degradazione dell’RNA messaggero avviene principalmente per due vie: - Deadenilazione dipendente: si basa sulla rimozione ad opera di un enzima specifico della catena di poliA. Il cappuccio e la coda hanno il ruolo di indicare quando l’RNA è maturo e può uscire dal nucleo ma permettono anche, una volta fuori, che gli enzimi capiscano che quei filamenti non sono da degradare. Qui l’attivazione del processo di degradazione avviene andando a rimuovere la coda e, successivamente, anche il cappuccio così le esonucleasi iniziano a rimuovere dai due lati i nucleotidi uno alla volta; - Deadenilazione indipendente: intervengono delle endonucleasi che rompono la catena partendo dalla zona centrale. Esistono delle zone normalmente mascherate che vengono rese disponibili a un enzima (endonucleasi) quando l’attività di questo RNA messaggero deve essere rimossa. L’enzima taglia in una zona centrale l’RNA messaggero e così le esonucleasi hanno due estremità da cui partire per rimuovere un nucleotide alla volta. Sia il cappuccio che la coda restano attaccate. È detta indipendente perchè la degradazione non è attivata dalla deadenilazione (rimozione cappuccio e coda) ma dalla rottura della catena in una zona centrale. 6 Lanfranco/Chieffallo 20 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 03/12/2020 I meccanismi di deadenilazione indipendente non permettono solo di modulare l’espressione genica ma evitano anche che RNA messaggeri non completi, che sono fuoriusciti dal nucleo, vengano tradotti. Questi meccanismi di rimozione di RNA messaggeri che non presentano entrambe le estremità sono anche sistemi che possono essere considerati nei sistemi di controllo per evitare che vengano tradotti trascritti non completi. L’ultima fase dell’espressione genica è relativa all’ultima molecola, la proteina. La degradazione delle proteine avviene con un meccanismo che è principalmente associato alla ubiquitina (76 amminoacidi) e perciò si dice protolisi-ubiquitina dipendente. Nella figura l’ubiquitina è riportata come una pallina rosa. Fig.4 Quando la proteina deve essere rimossa l’ubiquitina si attiva legandosi alla proteina bersaglio. Quando una molecola di ubiquitina si lega a una proteina, altre molecole si legano formando una catena di ubiquitina. Le proteine che contengono questa catena di ubiquitina vengono riconosciute dal proteosoma, che è quell’entità in grado di degradare la proteina stessa e portarla alla rimozione di tutti gli amminoacidi. Entrano nel proteosoma solo le proteine che contengono la catena di ubiquitina. Il processo di rimozione delle proteine all’interno della cellula è un processo importante dal punto di vista patologico perchè il mal funzionamento della protolisi-ubiquitina dipendente sembra essere alla base di alcune patologie che colpiscono soprattutto il sistema nervoso. Quello che si nota in queste patologie è proprio un accumulo di proteine che non riescono ad essere rimosse con il processo standard (un esempio è la sclerosi laterale amiotrofica o il Parkinson). Sempre associata all’espressione genica, una scoperta degli ultimi decenni sono stati gli RNA interferenti (RNAi). Gli RNA interferenti sono due tipi di RNA che vengono suddivisi in microRNA (miRNA) o small/short interfering RNA (siRNA). Sono caratterizzati da essere RNA di lunghezza limitata, di qualche decina di nucleotidi, e dall’avere una funzione che non è associata alla sintesi proteica ma all’espressione genica. 7 Lanfranco/Chieffallo 20 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 03/12/2020 Differenze tra gli RNA interferenti: -miRNA: caratterizzati da un precursore e quando vengono attivati l’enzima che li attiva produce da tutto il precursore la sequenza finale di miRNA; -siRNA: partono da un altro precursore (dsRNA) che quando viene attivato porta alla creazione di più siRNA tutti uguali. Questi RNA, che si trovano in forma di precursore nella cellula (sempre disponibili in essa), quando vengono attivati vanno a stimolare la degradazione di uno specifico RNA messaggero, cioè: Quando si attivano questi sistemi, cioè quando il precursore va a formare il miRNA o siRNA, i frammenti di RNA che si formano iniziano a vagare nella cellula e si legano a un complesso proteico che si chiama RISC complex con cui vagano per la cellula cercando degli RNA messaggeri complementari al loro frammento. Quando trovano l’RNA complementare si legano e attivano la degradazione dello stesso. In questo modo silenziano il gene agendo sulla trascrizione, se non trovano il complementare non succede nulla perchè continuano a vagare nella cellula. Il fatto che siano molto corti è importante perchè è un metodo che la cellula usa per silenziare più geni molto simili, sembra così che riescano a modulare un comportamento cellulare piuttosto che un singolo gene. Questo grazie alla lunghezza limitata che gli consente di legarsi a diversi RNA messaggeri che magari fanno parte della stessa cascata di eventi. Sono principalmente di tipo endogeno ma attualmente sono molto studiati perchè essendo frammenti piccoli sono facili da veicolare all’interno della cellula dall’esterno. Ciò significa avere uno strumento abbastanza semplice dal punto di vista chimico che può essere inserito nella cellula e silenziare alcuni geni, senza passare dal livello superiore che è il DNA (che sarebbe molto più difficile). Sono sistemi endogeni ma questa potenzialità è associata alla possibilità di avere un operatore esterno che vuole andare a modificare il comportamento della cellula, motivo per cui sono stati definiti come una rivoluzione, hanno aperto un nuovo panorama su come andare a modificare la risposta cellulare in maniera indiretta. Dal punto di vista concettuale è semplice ma implementare realmente questo processo non è per nulla banale. Domanda: come avviene l’attivazione della deadenilazione dipendente? Risposta: L’attivazione è sempre per via enzimatica: non avviene tanto sull’enzima ma sul riconoscimento che l’enzima ha dell’RNA messaggero che deve rimuovere. Questo è fatto principalmente a livello del legame di “qualcosa” sull’RNA messaggero che a questo punto viene fatto riconoscere dall’enzima come “qualcosa” da rimuovere. Sostanzialmente c’è un meccanismo simile al miRNA e al siRNA che si basa però di più sul rendere visibile all’enzima che degrada la coda di poliadenina la coda stessa. Il differenziamento cellulare A noi interessa capire il processo biologico in modo da capire come intervenire, nel campo biomedico è molto interessante la parte relativa alla rigenerazione dei tessuti. In questo caso il primo problema è avere il componente cellulare di interesse (nel caso di un pezzo di tessuto osseo mancante ci serviranno cellule del tessuto osseo). Le cellule più utilizzate sono le staminali perchè sono indifferenziate e, nel campo dell’ingegneria 8 Lanfranco/Chieffallo 20 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 03/12/2020 dei tessuti, è possibile indurre in loro diversi differenziamenti. Tutte le cellule dell’organismo hanno lo stesso identico DNA ma i tessuti hanno caratteristiche completamente differenti perchè hanno fenotipi differenti (le cellule della pelle sono diverse dalle cellule muscolari e da quelle ematopoietiche ma hanno tutte lo stesso DNA). Questo processo avviene tramite il differenziamento cellulare che inizia già a livello embrionale e porta al differenziamento delle cellule per i vari tessuti. Questo differenziamento cellulare che, nell’ambito della bioingegneria interessa per la produzione dei tessuti, si basa sull’attivazione dei fattori della espressione genica. Ciò significa che a seconda della funzione che la cellula deve svolgere si attiveranno o silenzieranno determinati geni per fare in modo che le proteine che fanno svolgere le funzioni, assumere la forma del tessuto e avere rilasci di determinati funzioni siano attivate, mentre nelle cellule che non hanno i processi di interesse vengano silenziati. I modi per indurre il differenziamento cellulare sono molteplici e non vengono approfonditi in questo corso. Per fare un esempio si possono utilizzare dall’esterno dei fattori che vadano a liberare dei promotori che erano inibiti. Tramite il fattore che si fa interagire con un recettore sulla cellula si fa in modo che si attivino una serie di segnali all’interno della cellula che arrivano fino al nucleo e informano l’inibitore di spostarsi. A quel punto iniziano la trascrizione e la traduzione: si avranno proteine diverse che stimoleranno la cellula a svolgere una determinata funzione che sia proliferare o altro. Ci sono una serie di fattori che sono stati testati con elevata affidabilità che svolgono questo tipo di funzioni. Esistono anche altri meccanismi che sono degli stimoli meno chimici ma più ampi: - la composizione e le proprietà meccaniche del substrato che sono in grado di attivare una sequenza di segnali in grado di stimolare una specifica espressione genica; - gli RNA interferenti che possono esser somministrati per inibire e silenziare un gene. Alcune volte silenziare un gene ne attiva un altro indirettamente, potrebbe renderlo più visibile perchè alcuni lavorano in modo oppost, per cui silenziando uno dei due l’altro diventa più evidente. - le strategie associate all’ingegneria dei tessuti per ricreare e rigenerare tessuti mancanti tramite scaffold, supporti tridimensionali e rilascio di fattori, si basa sempre sulla stimolazione di una determinata risposta cellulare che è mediata da una certa espressione genica dai meccanismi principali del dogma centrale della biologia molecolare. Accenno alle ricerche più di frontiera: DNA e RNA circolanti Sempre riguardo gli acidi nucleici ci sono due altri “nomignoli” che si possono dare: i DNA e RNA circolanti. I DNA e RNA circolanti sono dei frammenti di acidi nucleici di DNA e RNA (riportati con il nome di cfDNA e cfRNA) che si trovano all’interno del flusso ematico. Come ci arrivano il DNA e l’RNA all’interno del sangue? L’RNA Ci arriva perchè le cellule e, in generale, tutti i tessuti secernono delle microvescicole che contengono al loro interno dei frammenti di RNA e altro. È come se ogni tanto la cellula rilasciasse una parte di se stessa attraverso queste vescicole che sono uno dei metodi delle cellule per comunicare tra di loro perciò queste raggiungono il sangue. Per quanto riguarda il DNA di solito questi frammenti si hanno nel flusso ematico a seguito della morte cellulare che lascia frammenti del corredo genetico. Questi DNA e RNA circolanti sono molto studiati perchè possono essere sfruttati come metodo diagnostico. Infatti, negli ultimi anni è diventato molto popolare il termine “biopsia liquida” che indica il metodo di andare ad indagare come sta il paziente andando a vedere che cosa si trova nel suo sangue, non solo tramite l’analisi dei componenti del sangue ma anche degli acidi nucleici perchè sono molto indicativi e importanti per verificare se ci sono delle mutazioni. Un’analisi di questo tipo permette di individuare precocemente delle eventuali mutazioni pericolose. 9 Lanfranco/Chieffallo 20 Bioingegneria chimica (Tonda Turo) 03/12/2020 La grossa limitazione è che questi frammenti sani e patologici sono davvero pochi nel sangue per cui questa analisi chiede numerose tecnologie avanzate che per ora possono portare ancora a risultati contrastanti (poco sicura ma con grandi potenzialità per il futuro). Domanda: Differenza tra biopsia liquida e tradizionale. Risposta: La biopsia tradizionale consiste nell’asportazione di un pezzo di tessuto che può essere, ad esempio, la cute ed è più invasiva rispetto a quella liquida che consiste in un prelievo del sangue. C’è una grande differenza che consiste nel fatto che quando si va a fare una biopsia tradizionale deve già essere stata riscontrata un’anomalia mentre con quella liquida si può trovare qualcuno di questi frammenti semplicemente facendo un prelievo del sangue nel momento in cui il paziente ancora non mostra nessuna patologia (è ancora un ambito di ricerca che non viene utilizzato, per ora è solo teoria). Mutazioni Con mutazioni intendiamo mutazioni geniche che sono mutazioni puntiformi, ovvero la modifica di uno o pochi nucleotidi. Queste mutazioni possono avvenire a seguito di due cause: la prima di tipo spontaneo, cioè avviene un errore spontaneo nella sequenza di DNA che causa questa mutazione, oppure ad opera di fattori ambientali che è un aspetto anche più noto anche perchè alcuni fattori sono proprio detti