Biologie cellulaire - Fiche de cours n°1 PDF

# Biologie cellulaire ## ACTUALISATION ### Fiche de cours n°1 ### Introduction à la biologie cellulaire ### Méthodes d'études en biologie cellulaire > Notion tombée 1 fois au concours > Notion tombée 2 fois au concours > Notion tombée 3 fois ou plus au concours Médical Tours - 47 Rue de la Par...

# Biologie cellulaire ## ACTUALISATION ### Fiche de cours n°1 ### Introduction à la biologie cellulaire ### Méthodes d'études en biologie cellulaire > Notion tombée 1 fois au concours > Notion tombée 2 fois au concours > Notion tombée 3 fois ou plus au concours Médical Tours - 47 Rue de la Parmentière - 37520 LA RICHE - Tél : 02 21 76 45 37 # La vie sur terre ## Espèces vivantes * Entre 10 et 100 millions d'espèces vivantes * On considère avoir découvert seulement 10% des espèces: chaque année, environ 10 000 à 20 000 espèces sont découvertes. * Disparition naturelle des espèces * accélérée par l'activité humaine * Impact sur les écosystèmes car toutes les espèces ont des relations entres elles, vivent ensemble * L'homme fait partie de ces écosystèmes et la perturbation de ceux-ci pourrait provoquer le fait que l'homme ne puisse plus vivre sur Terre ## Origine de la vie * Estimée à environ -3,5 et 4 milliards d'années : estimation d'après des fossiles de cellules primitives. * Différentes hypothèses mais aucune certitude. ## Notion d'hérédité * Tous les organismes se reproduisent à partir d'un parent. * L'hérédité est la transmission de caractères à la descendance lors de la multiplication d'un organisme ## Organisation commune des êtres vivants * Sur Terre, on trouve des êtres : * Unicellulaires : la plus grande partie des organismes ; * Pluricellulaires. * Tous ces organismes ont une organisation commune : la cellule. # Support de l'hérédité : ADN ## ADN = molécule universelle * Toutes les formes de vie sans exception utilisent le même code héréditaire : l'ADN ou le génome. * Code à 4 lettres A, T, G et C. * Chaque triplet code le même acide aminé quel que soit l'être vivant : * Il est ainsi possible d'interpréter l'ADN d'une autre cellule. ## Réplication de l'ADN * Lors de la réplication, le génome complet est recréé dans la cellule fille via un mécanisme très fidèle: * Réplication semi-conservative de l'ADN extrêmement précise et fidèle : * Peu de mutations: l'ADN est une molécule stable. * Rôle de conservation. * 1 seul brin transmis à la cellule fille puis néosynthèse du brin complémentaire ## Expression de l'information contenue dans l'ADN * Synthèse des protéines à partir de l'ADN de la cellule par l'intermédiaire de l'ARN messager. * L'hérédité s'exprime par un complexe abordé par Jacob, Monod et Lwoff en 1965 (prix Nobel): * $ADN \longrightarrow ARN messager \longrightarrow Protéine$ * Transcription * Traduction # Complexité et diversité d'une cellule: Support de l'hérédité: ADN ## Echange de l'ADN entre les espèces ### Naturellement grâce à des virus * Infection d'une cellule par un virus à ADN : * Insertion de l'ADN viral dans l'ADN cellulaire * Traduction des protéines virales, * Synthèse de particules virales allant infecter d'autres cellules. * Les virus ont permis un échange d'ADN entre espèces contribuant à notre évolution : * Génome humain constitué à 10% de génome viral. * Utilisation de virus modifiés en thérapie génique dans le cadre de certaines maladies génétiques. ### Artificiellement grâce à des bactéries * Transfection cellulaire : introduction artificielle d'ADN plasmidique bactérien codant pour un gène d'intérêt. * Naturellement l'ADN plasmidique contient souvent un gène de résistance aux antibiotiques. # Complexité et diversité d'une cellule ## Diversité des formes de vie * Toutes les cellules utilisent les mêmes constituants: * Sucres, * Nucléotides, * Acides aminés, * Lipides, * Eau * Ions.... * Complexité d'une cellule dépend du nombre de gènes * Bactérie simple : * 480 gènes * 600.000 nucléotides * Cellule humaine : * 20.000-30.000 gènes * ≈ 3,2 milliards de nucléotides * Classée en 3 domaines * Bactéries * Archébactéries * Eucaryotes: * Protistes : unicellulaires eucaryotes, * Exemple des levures. * On considère qu'ils ont pour origine la cellule universelle = 1ère cellule apparue sur Terre = LUCA * Procaryotes toujours unicellulaires * Evolution accompagnée d'une complexification # Complexité et diversité d'une cellule ## Être vivants / Eléments du vivant * A partir du moment où l'organisme peut s'auto-répliquer = développement autonome: * Procaryotes : * Information génétique: ADN; * Eucaryotes : * Information génétique: ADN; * Sont incapables d'autoreproduction: * Virus : * Information génétique: ADN ou ARN; * Prions: * Information génétique: 1 seule protéine; * A l'origine de la vache folle. * A l'origine de la maladie de Creutzfeldt-Jakob découverte chez les aborigènes # Complexité et diversité d'une cellule ## Petit rappel de taille * Eucaryotes : 10 μm = 10^-5 m * Procaryotes : 1 µm = 10^-6 m * Virus: 100 nm = 10^-7 m * Molécules / Prions: 1 nm = 10^-9 m * Atome: 10^-10 m ### Visualisation * Microscopie optique : * Observation jusqu'à la bactérie. * Observation des virus impossible. * Microscopie électronique : * Observation depuis l'échelle cellulaire jusqu'aux protéines. * Approche par rayons x: * Visualisation des structures des éléments. * Détermination de la structure de protéines voire de structures plus petites jusqu'à l'atome. * Cellule végétale animale * Bactérie * Virus * Protéine * Molécule * Atome # Complexité et diversité d'une cellule ## Différence entre procaryotes et eucaryotes ### Les procaryotes * Cellule primitive ressemblant à un gros sac : absence de compartimentation. * Unique chromosome composé d'ADN circulaire. ### Les eucaryotes * Composés d'une ou plusieurs cellules. * Noyau séparé du reste de la cellule par une enveloppe nucléaire : * Présence d'un nucléole, * Mécanisme d'épissage de l'ARN, * Présence de plusieurs chromosomes différents, * Présence des histones au sein de l'ADN. * Présence de cytomembranes : système de membranes internes, * Présence d'un cytosquelette * Présence du cholestérol : cellule animale. # Eucaryotes: système de membranes internes * Noyau: renferme l'ADN. * Mitochondries : énergie. * Chloroplastes: photosynthèse, cellule végétale. * Réticulum endoplasmique: synthèse des lipides et de protéines. * Appareil de Golgi: modification des protéines. * Lysosomes: compartiment de dégradation. * Peroxysomes: dégradation d'acides gras et production de chaleur. * Délimitation des organites: * Microtubule * Centrosome avec paire de centrioles * Chromatine (ADN) * Pore nucléaire * Nucléole * Matrice extracellulaire * Enveloppe nucléaire * Vésicules * Lysosome * Filaments d'actine * Peroxysome * Ribosomes libres dans cytosol * Appareil de Golgi * Filaments intermédiaires * Membrane plasmique * Noyau * Réticulum endoplasmique * Mitochondrie * Fonctions: * Isolement des différentes fonctions de la cellule : * Compartimentalisation structure/fonction. * Isoler nent/ séparation des réactions biochimiques de la cellule : * ex: synthèse protéique <> dégradation protéique * Augmentation de la surface de membrane : * De nombreuses enzymes cellulaires ont besoin d'un ancrage sur une membrane * Création de gradients électrochimiques au sein des membranes : * Mitochondries assurent par ce mécanisme une production d'énergie. * Nécessité d'une communication entre compartiments: * Intervention du cytosquelette. * Développement des systèrnes de transports complexes entre compartiments cellulaires : # 3,5 milliard d'années d'évolution des génomes ## Modifications de l'ADN * Modifications accidentelles apportant de nouvelles propriétés (ou non), conservées dans le temps si elles confèrent un avantage. * Neutre: sans effet. * Effet positif : * Sélectionnées. * Très rares * Effet négatif : * Non sélectionnées. * Les plus fréquentes: plus de 99% des cas. * Effets variables. * Dans un gène ## Mutations * Exemple de mutations dans les séquences répétées, des décalages, dans des séquences de régulation... * En dehors d'un gène * Peu d'évolution : * Gènes conservés au cours de l'évolution = gènes essentiels * Exemple des gènes des histones quasi identiques entre celui de nos cellules et celui d'une cellule primitive de levure. * Fortes évolutions : * Gènes tolérants aux mutations. * Différence importante entre le gène humaine et le gène de la levure. * Conséquences de l'évolution * Famille de gènes * Famille de plusieurs gènes identiques créée à partir d'un gene ancestral. ## Duplication * Evoluti on indépendante de chaque copie de gene. * Aboutissement à plusieurs gènes apparentés ayant des fonctions similaires. * Exemple de la famille de l'actine: actine, Arp2, Arp3... * Conséquences de l'évolution # Méthodes d'étude en biologie cellulaire ## Histoire des découvertes * 1600 * Premier microscope optique: observation d'insectes et de tissus. * Fin du 18ème * Naissance de la biochimie * 1930 * Premier microscope électronique à transmission. * 1960-70 * Essor de la biologie moléculaire: compréhension du fonctionnement de la cellule à l'échelles des molécules # Méthodes d'étude en biologie cellulaire ## Introduction à la biologie moléculaire * Etude des constituants de la cellule et de son fonctionnement * ADN * Génome = ensemble des gènes. * Recherche des mutations par séquençage. * ARN * Transcriptome = Ensemble des ARNs messagers. * Protéine * Protéome = ensemble des protéines : * Etude du protéome plus difficile. # Méthodes d'étude en biologie cellulaire : Introduction à la biologie moléculaire ## Etudes de l'ADN : Polymérase chain réaction = PCR * Amplification exponentielle de l'ADN: * PCR permet d'isoler et d'amplifier des petites séquences que l'on a choisies au sein du génome. * Le principe est de recopier de nombreuses fois la petite séquence d'intérêt pour une étude ultérieure. * << Photocopieuse >> = ADN polymérase Taq. * Encre = bases: A, T, G, C. # Introduction à la biologie moléculaire : Etudes de l'ADN ## Analyse qualitative de l'ADN : S équençage de l'ADN * Fait suite à l'amplification de la séquence d'intérêt par PCR. * Marquage de chaque base avec une molécule fluorescente qui lui est spécifique. * Lecture de cette fluorescence avec un séquenceur : * Détermination de la séquence. * Analyses bio-informatiques. * Détection d'une mutation: * exemple du cancer * L'analyse de la mutation mise en cause dans le cancer donne des informations sur le pronostic mais également la résistance à certains traitements. * Exemple de l'analyse d'une cellule tumorale: séquençage d'un proto-oncogène. # Analyse qualitative de l'ADN : Séquençage de l'ADN ## Le code génétique * Sens de lecture du codon : 1 * Codons spécifiques: * 1 codon d'initiation: ATG codant la méthionine * 3 codons STOP: TAA, TAGO et TGA # Analyse qualitative de l'ADN : Séquençage de l'ADN ## Différents types de mutations * Silencieuses: Pas de changement dans la composition des acides aminés: * Faux sens: Remplacement par un mauvais acide aminé: * Changement dans la composition de la protéine. * Non-sens: Introduction prématurée d'un codon stop: * Synthèse d'une protéine plus courte. * Effets toujours délétères. # Méthodes d'étude en biologie cellulaire : Introduction à la biologie moléculaire ## Etudes de l'ADN : Analyse quantitative de l'ADN = Q-PCR * Objectif: * Quantification de l'ADN présent avant la PCR par différentes formules mathématiques : * A chaque réaction de PCR, on double la quantité d'ADN: 2^nombre de cycles de copies. * Détection d'une fluorescence: * Après chaque cycle, ajout d'un agent fluorescent comme le bromure qui ne fluoresce qu'une fois complexé à un double brin d'ADN : * Proportionnalité directe entre le nombre de copies de la séquence étudiée et le niveau de fluorescence. # Etudes de l'ADN: Analyse quantitative de l'ADN ## Exemple de Q-PCR * Nécessité d'une prise de sang mensuelle chez le patient chronique pour le suivi du traitement. * Réalisation d'une Q-PCR sur le génome viral : détermination du nombre de particules virales/mL de sang chez le patient en fonction de la quantité d'ADNO. * 1 copie = 1 virus infectieux. * Détermination de la charge virale. * Evaluation de l'efficacité du traitement lors de sa mise en place : * Réponse efficace: charge virale quasi-nulle * Réponse nulle ou partielle: baisse de la charge virale faible voire nulle * Nécessité d'un changement du traitement * Visualisation de l'augmentation de la charge virale lors d'une rechute : * Soit le virus a muté et résiste : * Nécessité d'un changement du traitement. * Soit le patient a arrêté le traitement. * Suivi de traitement d'un patient chroniquement infecté avec le virus de l'hépatite B (VHB, virus à ADN). # Méthodes d'étude en biologie cellulaire : Introduction à la biologie moléculaire ## Quantification de l'expression des gènes * Etude de l'ARN * Transcription inverse * Extraction des ARNS: * ARN non purifiable: il est très fragile. * PCR impossible sur l'ARN. * Utilisation d'une reverse transcriptase afin d'obtenir des ADNC (complémentaires) plus stables et manipulables que l'ARN : * Réalisation de techniques relatives à l'ADN comme si c'était de l'ADN normal. * Transcriptase inverse: enzyme présente chez les rétrovirus (HIV). * RT-PCR quantitative * Transcription inverse + PCR = RT-PCR & Transcription inverse + Q-PCR = RT-Q-PCR * Mesure le niveau d'expression des gènes : * L'étude des ARNs messagers reflète l'activité cellulaire. * Cas des cancers: * Mesure du niveau d'expression de proto-oncogènes : révélation de la duplication de certains gènes impliqués dans les cancers. * Connaissance de la surexpression de protéines et gènes permet d'ajuster le traitement et de suivre l'évolution du cancer. * Cas du COVID * Dépistage de l'infection au Sars Cov-2 * Etude du taux d'ARN viral dans le sang du patient grâce à la RT-PCR quantitative: * Diagnostic sensible grâce à l'amplification de l'ADNc viral. * Détection des antigènes viraux grâce à un test antigénique: * Diagnostic peu sensible car pas d'amplification. * Dosage des immunoglobulines par un test sérologique: * Témoin de l'infection. * Non utilisable en diagnostic. * Vérification du statut immunitaire du patient séropositifs ou vaccinés. * Outil épidémiologique: taux de personnes immunisées. # Méthodes d'étude en biologie cellulaire : Introduction à la biologie moléculaire ## Séquençage haut débit = Séquençage nouvelle génération = NGS * Avantages : * C'est le séquenceur, la "machine" qui travaille: très rapide et efficace. * Fonctionne pour l'ADN et l'ARN * Permet en une seule fois de séquencer l'ensemble des gènes d'un organisme : * un génome (ADN), * un transcriptome (ARN). * Etudes possibles: * Etudes qualitatives * Séquenceage. * Mutations. * Altérations génomiques et transcriptomiques. * Etudes quantitatives * Niveaux d'expression d'un panel de gènes : sous-expression ou sur-expression en fonction du type cellulaire. * Principe: * Extraction de l'ADN de plusieurs cellules * Fragmentation de l'ADN * Séquençage de chaque fragment * Bio-informatique : reconstruction du génome séquencé * Comparaison avec une séquence de référence : génome connu * Recherche de mutation(s) impliquée(s) dans un cancer * Absence de séquence de référence : génome inconnu * Reconstruction de novo d'un nouveau génome * Caractérisation d'un nouvel organisme # Méthodes d'étude en biologie cellulaire : Les différentes techniques de microscopie ## Microscopie optique * Début de la microscopie: * 17ème siècle : * Premières observations par Hooke : * Coupes de liège: observation de petits espaces délimités qu'il a nommé "cellules", * Reproduction de puce. * Amélioration de la performance des microscopes par Van Leeuwenhoek * Description des spermatozoïdes * Microscopie à l'origine de l'émergence de la théorie cellulaire de Schleiden et Schwann en 1839: * "Tous les êtres vivants sont constitués de cellules" * Un peu de théorie: * Nature ondulatoire de la lumière: * La longueur d'onde λ s'exprime en nm et permet différentes couleurs : * UV < 400nm * 400nm < visible < 760nm * 760nm < IR * Diffraction: * Génération d'ondes de diffraction lorsque la lumière rencontre un obstacle : * Entraine l'apparition de tâches de diffraction qui empêche de voir correctement certaines structures. * Définit une limite de résolution ou pouvoir séparateur = distance minimale par laquelle on distingue 2 points distant : * 0.2 µm en microscopie optique. * Permet la détection des bactéries mais pas des virus. * Avantages: * Obtention d'images en couleurs. * Préparation plus simple et plus rapide. * Pouvoir de pénétration important. * Observations possibles de cellules : * Vivantes ou mortes * En déplacement : déplacement de bactéries ou de spermatozoïdes grâce à la vidéomicroscopie. # Les différentes techniques de microscopie: Microscopie optique ## Différents types de microscopie optique * Classique: * Etude prépondérante des tissus (histologie): * Observation de l'organisation des tissus, * Observation des différents types cellulaires. * Préparation: * Biopsie chirurgicale. * Obtention de coupes semi-fines de 2 à 6 microns grâce à un microtome. * Coloration: utilisation de colorants spécifiques de structures. * Confocale: * Microscope à fluorescence le plus développé et le plus puissant. * Observation de cellules mortes ou vivantes. * Contraste de phase: * Basée sur le décalage de phase: création de contraste au sein des structures. * Observation directe de cellules vivantes : * Etat le plus proche possible du vivant, * Observation SANS modification de la cellule. # Les différentes techniques de microscopie : Microscopie optique ## Immunomarquage * Principe: * Reconnaisssance spécifique d'une protéine grâce à des anticorps. * Reconnaissance de la protéine cible par un anticorps primaire. * Liaision d'une multitude d'anticorps secondaires: * Spécifiques du domaine Fc du premier anticorps, * Couplés à un marqueur observable au microscope. * Méthode indirecte: * Permet l'amplification de la reconnaissance de la protéine par augmentation de la concentration de marqueur. * Perméabilisation des membranes cellulaires: * Pour permettre l'entrée des anticorps. * Cellules généralement mortes. # Les différentes techniques de microscopie : Microscopie optique ## Immunomarquage : La molécule "marqueur" * Immuno-peroxydase: * Révélation de la réaction enzyme-substrat par ajout de substrat incolore qui sera transformé en produit coloré. * Utilisation en microscopie optique classique. * Immunofluorescence: * Marqueur fluorescent excité à une longueur d'onde spécifique et réémet à une autre longueur d'onde spécifique. * L'excitation se fait toujours par une longueur d'onde plus petite que la lumière qui est réémise par la molécule fluorescente. * Immunogold: * Utilisation de billes d'or opaques aux électrons. * Utilisation en Microscopie Electronique # Les différentes techniques de microscopie : Microscopie optique ## Immunomarquage: Observation d'un co-marquage en immunofluorescence * Marquage de l'ADN au DAPI : * Agent intercalant fluorescent. * Excitation sous lumière UV et émission en bleu. * Marquage d'une protéine cytosolique par la fluorescéine (FITC) : * Excitation en lumière Bleu et émission en vert. * Marquage d'une protéine membranaire par la rhodamine : * Excitation en lumière Verte et émission en rouge. * Localisation des composants cellulaires les uns par rapport aux autres: * Aucune protéine étudiée n'est nucléaire : pas d'implication dans l'expression des gènes * Les 2 protéines ont 2 localisations bien distincts: absence d'interaction. # Les différentes techniques de microscopie : Microscopie optique ## Microscopie confocale * Summum de la microscopie à fluorescence: * Combinaison de co-marquage en immunofluorescence avec la réalisation de tranches optiques. * Utilisation de lasers et de lentilles très performants. * Reconstitution d'une image 3D: * Réalisation d'image dans toute l'épaisseur de la cellule. * Empilement d'images qui sont ensuite associée en 3 dimensions. * Exemple de gouttelettes lipidiques infectées par le virus de l'hépatite C: * Quand une gouttelette lipidique fluoresce en rouge, on a une protéine de capside de l'hépatite C en vert qui vient littéralement tapisser la gouttelette : induit l'accumulation de lipides au sein de l'hépatocyte. # Méthodes d'étude en biologie cellulaire : Les différentes techniques de microscopie ## Microscopie électronique * Source: faisceau d'électrosn incidents: * Observation des électrons transmis ayant traversé l'échantillon: * Microscopie électronique à transmission (MET). * Observation des électrons secondaires: Microscopie électronique à balayage (MEB) * Nécessite une colonne vide d'air: observation de cellules mortes. * Génération de rayons X: analyse chimique sur l'échantillon * Images obtenues monochromes: * Les électrons n'ont pas de couleur: images en niveau de gris. * Plus haute résolution qu'en MO * Contrôle des mécanismes de diffraction. # Méthodes d'étude en biologie cellulaire: Les différentes techniques de microscopie ## Microscopie électronique à transmission : MET * Observation des électrons transmis: * Enregistrement des électrons qui sont passés au travers de l'échantillon: * Les électrons issus de la diffraction ne sont pas enregistrés. * Réalisation de coupes ultrafines: * Coupes ultrafines de 100 à 200 nm d'épaisseur obtenues grâce à un ultramicrotome. * Augmentation des contrastes: * Utilisation d'agents de contrastes : * Sels de métaux lourds: le tétraoxyde d'osmium; l'acétate d'uranyle, citrate de plomb... # Méthodes d'étude en biologie cellulaire: Les différentes techniques de microscopie ## Microscopie électronique à transmission : Observations * Ultrastructure cellulaire d'une cellule lymphoïde * Capillaire sanguin * Particules virales : cellule infectée par virus d'Epstein-Barr (EBV) * Coloration négative adaptée à l'observation des virus # Méthodes d'étude en biologie cellulaire : Les différentes techniques de microscopie ## Microscopie électronique à balayage : MEB * Balayage régulier de l'échantillon et récupération des électrons secondaires pour obtenir des images en 3 dimensions. * Observation de la structure externe de l'objet étudié. * Images obtenues en 3 dimensions: * Résolution plus faible de la MEB: absence de l'observation de l'ultrastructure. * Utilisation de la MEB plus aisée : pas nécessité de réaliser des coupes ultra-fines. * Comparaison MEB/MET: * Bourgeonnement du VIH * Cils