VL1-2: Methoden der Molekularbiologie (PDF)

Methoden der Molekularbiologie Maksym Myronovskyi Pharm. Biotechnologie 2022 Inhalt VL1: Nucleinsäuren, Replikation, Transkription, Translation VL2: Polymerasekettenreaktion (PCR), Reverse Transkription-PCR, Echtzeit-PCR,...

Methoden der Molekularbiologie Maksym Myronovskyi Pharm. Biotechnologie 2022 Inhalt VL1: Nucleinsäuren, Replikation, Transkription, Translation VL2: Polymerasekettenreaktion (PCR), Reverse Transkription-PCR, Echtzeit-PCR, Agarosegelelektrophorese, Plasmide VL3: Restriktionsendonucleasen, Ligation der DNA Fragmente, Lac Operon und Blau-weiß-Selektion, Transformation, Konjugation, Transduktion VL4: Präparation der gesamten Zell-DNA, Isolierung der Plasmid-DNA, Restriktionskartierung, DNA Sequenzierung, DNA-DNA Hybridisierung VL5: Northern blot, Protein Exprimierung in E. coli, SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese, Western Blot  Was ist ein Gen? Wie ist ein Gen aufgebaut? Hat Gen eine Richtung? Was sind Bestandteile eines Gens? Wie wird ein Gen exprimiert? Was ist ein Gen?  Was ist ein Gen? - ist ein Abschnitt der DNA oder RNA*, der entweder ein Protein oder ein funktionales RNA-Molekül codiert. * Gene aus RNA nur bei RNA-Viren. Nucleinsäuren Nucleinsäuren sind Polymere, aufgebaut aus Nucleotiden, die untereinander durch Phosphodiesterbindungen verknüpft sind Mononucleotide sind die Bausteine der DNA und RNA. Mononucleotide bestehen aus drei typischen Bestandteilen: Base, Pentose und Phosphat Die stickstoffhaltigen Basen sind Derivate von Pyrimidin oder Purin. Die häufigsten Pyrimidinbasen in Nucleotiden sind: Die häufigsten Purinbasen in Nucleotiden sind:  Die Pentosen sind Ribose oder Desoxyribose Monoribonucleotide und RNA enthalten β-D-Ribose Monodesoxyribonucleotide und DNA enthalten hingegen 2-Desoxy-β-D-Ribose In Nucleosiden sind die Pentosen N-glykosidisch mit den Pyrimidin- oder Purinbasen verknüpft. C1′ der Pentose ist mit N1 der Pyrimidinbasen bzw. N9 der Purine verbunden Nucleotide sind Phosphorsäureester der Nucleoside – Die Esterbindung befindet sich an C3′ oder C5′ der Pentose.  Die DNA ist doppelsträngig und bildet eine Doppelhelix Zwei helicale, antiparallele Polynucleotidstränge winden sich rechtsgängig um eine gemeinsame Achse Hydrophile Phosphat- und Desoxyribosereste befinden sich außen. Die Ringebenen der Basen stehen senkrecht zur Helixachse. Der Helixdurchmesser beträgt 2,0 nm Basen sind auf der Helixachse 0,34 nm voneinander entfernt Nach 10 Basen wiederholt sich die Helixstruktur Die angegebenen Abmessungen beziehen sich auf die in der Natur am häufigsten vorkommende B-Strukturform der DNA. A-Form B-Form Z-Form  Die Basenpaarung ist spezifisch: Adenin ist mit Thymin über zwei H-Bindungen, Guanin mit Cytosin über drei H-Bindungen verbunden Die glykosidischen Bindungen der Purin-Pyrimidin-Basenpaare sind immer gleich weit voneinander entfernt Die Sprossen der Leiter sind immer gleich lang: Ein Purin-Purin-Paar wäre zu lang und ein Pyrimidin-Pyrimidin-Paar zu kurz Replikation Die Replikation der DNA erfolgt semikonservativ  Replikation eukaryontischer DNA mit Hilfe multipler Replikationsblasen Replikation des aus einem Replikon bestehenden ringförmigen bakteriellen Chromosoms Die DNA-Polymerase katalysiert den nucleophilen Angriff der freien 3’-OH- Gruppe des zu verlängernden DNA-Strangs auf die Anhydridbindung zwischen dem α- und β-Phosphat des anzuknüpfenden Desoxyribonucleotids die Kettenverlängerung erfolgt immer vom 5’- zum 3’-Ende Reaktionsmechanismus der DNA-Polymerase Transkription  Prinzip der Transkription durch RNA-Polymerasen Der Strang, der als Matrize für die RNA-Synthese dient, wird auch Matrizenstrang (Minusstrang oder antisense strand) genannt. Prinzip der Transkription durch RNA-Polymerasen  5' A T G A C G A C G A C G T A G 3' DNA 3' T A C T G C T G C T G C A T C 5' RNA Protein Met Thr Thr Thr  5' A T G A C G A C G A C G T A G 3' + Strang DNA 3' T A C T G C T G C T G C A T C 5' - Strang RNA Protein Met Thr Thr Thr  5' A T G A C G A C G A C G T A G 3' + Strang DNA 3' T A C T G C T G C T G C A T C 5' - Strang RNA 5' A U G A C G A C G A C G U A G 3' Protein Met Thr Thr Thr  Prokaryonten besitzen nur eine RNA-Polymerase - Das Enzym von E. coli besteht aus einem Kern (Core-)Enzym mit vier Untereinheiten (α2ββ′) und einer σ (sigma-)Untereinheit - σ Untereinheit (Initiationsfaktor) erkennt bei der Initiation das Startsignal, das Promotorsegment der DNA Eukaryonten besitzen drei verschiedene Typen von RNA-Polymerasen: - RNA-Polymerase I im Nucleolus transkribiert die rRNA-Gene (45S rRNA-Vorlaufer) - RNA-Polymerase II im Nucleoplasma synthetisiert die Vorläufer von mRNA sowie einen Teil der kleinen Kern-RNAs (snRNA, small nuclear RNA und miRNA, micro-RNA) - RNA-Polymerase III im Nucleoplasma synthetisiert die kleinen RNAs wie tRNA, 5S- rRNA und einen Teil der sn-RNA  Die Transkription wird in drei Phasen eingeteilt: Initiation Elongation Termination Initiation Was sind Bestandteile eines Gens?  Was sind Bestandteile eines Gens? 1. Promotor; bei eukaryonten auch noch cis-wirkende Elemente (enhancer / silencer) 2. …. 3. CDS (coding sequence); bei proteincodierenden Genen - offener Leserahmen oder offenes Leseraster 4. Terminator  Prokaryontische und eukaryontische Promotoren im Vergleich Das Signal (Erkennungsstelle) für die Initiation ist ein A- und T-reicher Abschnitt, der Promotor Das erste Nucleotid, welches zu transkribieren ist, wird mit + 1 bezeichnet; das Nachbarnucleotid auf der 5′-Seite (d. h. stromaufwärts) wird mit − 1 nummeriert Der Strang mit den angegebenen Promotorsequenzen entspricht dem + Strang des betreffenden Gens Die Größe des eukaryontischen Promotors ist nicht genau festgelegt Der Buchstabe N in der CAAT-Box bezeichnet irgendeines der Nucleotide A, T, G oder C  Transkription prokaryontischer Gene der Sigmafaktor sorgt für die Anlagerung der RNA-Polymerase an die Promotorregion im Bereich –35 bis –70 und die Initiation der Transkription an der korrekten Stelle der Sigmafaktor hat eine hohe Affinität zu Sequenzelementen im Bereich –10 und im Bereich –35 Unterschiedliche Sigmafaktoren können die Expression verschiedener Gene bewirken und werden ihrerseits z. B. durch Modifikationen aktiviert oder inaktiviert  Transkription eukaryontischer Gene Strukturmerkmale der Promotorregionen der von der RNA-Polymerase II transkribierten Gene Im Gegensatz zu den prokaryontischen RNA-Polymerasen sind eukaryontische RNA- Polymerasen nicht imstande, alleine an DNA zu binden Sie benötigen für die Bindung an die Promotoren allgemeine/basale Transkriptionsfaktoren, mit denen sie den Initiationskomplex bilden, der für die korrekte Bindung der RNA-Polymerase an der Startstelle der Transkription verantwortlich ist. Transkription eukaryontischer Gene TBP – TATA-Box-Bindeprotein BRE – TF II B recognition element CSC – cap synthesizing complex CTD – C-terminale Domäne Inr – Initiatorelement TBP ist eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors TFIID TFIIH-Untereinheit hat Helicaseaktivität TFIID, TFIIB, TFIIA, TFIIF, TFIIE, TFIIH und die Polymerase II können in vitro gereinigte DNA transkribieren Für Transkription in vivo ist Mediatorproteinkomplex notwendig Mediatorproteinkomplex wird dafür benötigt, um die in Nucleosomen kondensierte DNA für die Transkription zugänglich zu machen und ihre Interaktion mit oft weit entfernten aktivierenden oder hemmenden Transkriptionsfaktoren zu ermöglichen  Biosynthese (A) und Struktur (B) der 5’-cap-Gruppe der Prä-mRNA bei Eukaryonten 5’-capping  Mechanismus des Spleißens (bei Eukaryonten) Eine nichtcodierende intervenierende („intra-genische“) Sequenz der DNA und auch der Prä-mRNA wird als Intron bezeichnet Ein proteincodierender (exprimierter) Abschnitt wird als Exon bezeichnet Spleißen – das Herausschneiden der Introns und Zusammenfügen der Exons  Mechanismus des Spleißens (bei Eukaryonten) Von großer Bedeutung für das Spleißen sind die Sequenzen an den Exon/Intron- Übergängen sowie im Intron Vom Intron aus gesehen unterscheidet man eine 5’- und eine 3’-Spleißstelle sowie eine spezifische Sequenz im Inneren des Introns, innerhalb derer ein Adenin (A)-Rest als spätere Verzweigungsstelle von großer Bedeutung ist. Die 5’-Spleißstelle ist durch die Basenfolge AGGUA/GAGU gekennzeichnet Die 3’-Spleißstelle durch eine pyrimidinreiche Sequenz, gefolgt von AGG gekennzeichnet. Mechanismus des Spleißens (bei eukaryonten) Mechanismus der Polyadenylierung der mRNA Das Signal für die Polyadenylierung ist eine spezifische Sequenz in der Prä-mRNA, die aus den sechs Basen AAUAAA besteht und als Polyadenylierungssequenz bezeichnet wird Der Endonucleasekomplex aus CstF und CPSF spaltet die Prä-mRNA 10– 30 Nucleotide downstream von der Polyadenylierungssequenz Die Polyadenylierung am 3’-Ende erfolgt durch Polyadenylatpolymerase (PAP) Anlagerung des Poly(A)- Bindeproteins PABP II CstF (cleavage stimulation factor); CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) Termination Termination bei Prokaryonten Termination bei Prokaryonten der Rho-Faktor (ρ) bindet an eine ca. 70 Nucleotide lange RNA-Sequenz (RUT, Rho utilization sequence), die sich in der Nähe der Terminationsstelle befindet. Rho bildet eine hexamere offene Ringstruktur, die sich um die RNA legen kann und sich dabei schließt. Durch Kontakt mit der RNA wird der Rho- Faktor aktiviert und bewegt sich unter ATP- Verbrauch mithilfe konzertierter Konformationsänderungen in Richtung der RNA-Polymerase. Nach seinem Kontakt mit dem RNA- Polymerase/DNA/RNA-Hybrid kommt es durch eine Helicaseaktivität des ρ-Faktors zum Zerfall dieses Komplexes und damit zur Beendigung der Transkription.  Termination bei Prokaryonten Rho-unabhängiger Terminationsmechanismus beruht auf der Ausbildung von Haarnadelstrukturen in der RNA. Hierzu sind in den Genen Terminationssignale notwendig (Terminatoren), die etwa 40 Basenpaare lang sind Sie enthalten alle auf der DNA eine GC-reiche palindromische repetitive Sequenz (inverted repeat), an die sich eine Serie von AT-Basenpaaren anschließt Die RNA-Polymerase legt bei der Synthese der RNA an diesen Terminationssequenzen eine Pause ein Durch intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen innerhalb der neusynthetisierten RNA bildet sich eine Haarnadelstruktur aus Der Kontakt dieser Struktur mit der RNA-Polymerase führt zu einer Konformationsänderung des Komplexes und zum Zerfall des DNA-RNA-Hybrids und somit zur Termination der Transkription Vorgänge, die zur Termination der Termination bei Eukaryonten Transkription bei Eukaryonten führen, sind noch nicht vollständig verstanden. Nach dem sog. »Torpedomodell« wird trotz der Wirkung der Endonuclease CstF und resultierender Abspaltung der mRNA die RNA-Transkription fortgesetzt (siehe Polyadenylierung) Die Exonuclease Xrn2 baut die nach dem Polyadenylierungssignal abgeschnittene, aber weitertranskribierte RNA in 5’,3’- Richtung ab, und zwar schneller, als die RNA-Polymerase II auf der DNA entlangläuft. Dieser exonucleolytische Abbau ist möglich, da das 5’-Ende der RNA hier keine cap-Gruppe tragt Erreicht die Exonuclease Xrn2 die Transkriptionsblase auf der DNA, kommt es zum Abbruch der Transkription Translation – Synthese von Proteinen  Translation werden benötigt: mRNA Ribosom Aktivierte Aminosäuren tRNAs Initiationsfaktoren Elongationsfaktoren Terminationsfaktoren  Ribosomen sind Ribonucleoproteinpartikel, die zu ca. 60 % ihrer Masse aus RNA bestehen a Svedberg Einheit; gibt das Sedimentationsverhalten in Abhängigkeit von Masse und Form an b Nur bei Vertebraten. c Zahl schwankt geringfügig zwischen Species bzw. Organismen.  Ultrazentrifuge Zentrifugalkräfte erreichen das 400.000 fache der Erdanziehungskraft s= 2 v/ω r V – Sedimentationsgeschwindigkeit ω – Rotationsgeschwindigkeit ω = 2π∙U (U: Umdrehungen/s) r – Abstand von der Rotationsachse Als Maß für die Größe der Molekülmasse benutzt man den Sedimentations- oder Svedberg-Koeffizienten s Die Sedimentationsgeschwindigkeit v ist primär von der Molekulgröße und Dichte abhängig 1 Svedberg entspricht 1∙10–13 s Initiation der Translation bei Prokaryonten  Translationsrichtung T=U RNA 5' 3' DNA 5' 3' 3' 5' als Leseraster wird die Reihenfolge der Codons einer mRNA oder DNA, ausgehend von einem bestimmten Startpunkt, bezeichnet  3 Leseraster auf dem RNA Niveau Forward frames 5' 3' 1 T=U  3 Leseraster auf dem RNA Niveau Forward frames 5' 3' 2 T=U  3 Leseraster auf dem RNA Niveau Forward frames 5' 3' 3 T=U  3 Leseraster auf dem RNA Niveau Forward frames 5' 3' 1 T=U Auf das richtige Leseraster kommt es an blumentopferde  Was sind Bestandteile eines Gens? 1. Promotor; bei eukaryonten auch noch cis-wirkende Elemente (enhancer / silencer) 2. …. 3. CDS (coding sequence); bei proteincodierenden Genen - offener Leserahmen oder offenes Leseraster 4. Terminator  Was sind Bestandteile eines Gens? 1. Promotor; bei eukaryonten auch noch cis-wirkende Elemente (enhancer / silencer) 2. Bei Prokaryonten - Shine-Dalgarno-Sequenz (ribosome binding site) 3. CDS (coding sequence); bei proteincodierenden Genen - offener Leserahmen oder offenes Leseraster 4. Terminator Bei Prokaryonten Prokaryontische mRNAs besitzen eine Konsensussequenz im nicht-translatierten Bereich vor dem Startcodon, die als Shine-Dalgarno-Sequenz bezeichnet wird Shine-Dalgarno-Sequenz = SD Sequenz = ribosome binding site = RBS SD Sequenz bindet an einen komplementären Abschnitt der 16S-rRNA an der Plattform der 30SUntereinheit die prokaryontische Start-tRNA, die mit formyliertem Methionin (Formylmethionyl- tRNAfMet) beladen wird, bindet direkt an die kleine ribosomale Untereinheit Formylmethionin wird als Startaminosäure verwendet Bei Prokaryonten SD Sequenz bindet an einen komplementären Abschnitt der 16S-rRNA an der Plattform der 30SUntereinheit Bei Prokaryonten die prokaryontische Start-tRNA, die mit formyliertem Methionin (Formylmethionyl-tRNAfMet) beladen wird, bindet direkt an die kleine ribosomale Untereinheit Formylmethionin wird als Startaminosäure verwendet Große 50S ribosomale Untereinheit bindet an 30S Untereinheit  Offenes Leseraster (Open reading frame, Orf): Eine aus der Nucleotidsequenz der DNA abgeleitete Abfolge von Codon-Tripletts, welche bei einem bestimmten Leseraster (eine der drei Möglichkeiten, eine Nucleotidsequenz als eine Folge von Tripletts zu lesen) ein 5′-Startcodon, ein 3′-Stoppcodon und dazwischen eine codierende Sequenz (ohne Stoppcodons!) von plausibler Länge aufweist Ein offenes Leseraster entspricht einem proteincodierenden Gen Start- und Stoppcodons legen das offene Leseraster fest T→U mRNA 5' UTR 3' UTR 5' 3' Offenes Leseraster ≠ Leseraster Offenes Leseraster = Gen = eins der sechs (drei bei RNA) möglichen Leseraster, das Proteincodierenden Sinn ergibt Initiation der Translation bei Eukaryonten  Bei Eukaryonten Viele mRNAs enthalten an ihrem 5’-Ende lange, nicht-translatierte Abschnitte (5’-UTRs = untranslated regions) Die kleine (40S) Untereinheit des Ribosoms bindet an die Cap- Region der mRNA und verschiebt sich stromabwärts bis zum ersten AUG-Triplett, wo nach Binden der großen Untereinheit die Translation beginnt Das Startcodon findet sich häufig im Sequenzkontext GCC(A/G)CCAUGG (Kozak- Sequenz) Bei Eukaryonten ist das Start- Methionin nie formyliert Eukaryontische mRNAs sind monocistronisch, d. h. codieren nur für ein Protein Prokaryontische mRNAs sind oft polycistronisch, d. h. codieren nur für mehrere Proteine Elongation der Translation  Bei der Translation eines Proteins wird die codierende Information einer mRNA in Einheiten von jeweils drei aufeinanderfolgenden Nucleotiden, den Tripletts oder Codons, gelesen Da RNA aus vier unterschiedlichen Nucleotiden aufgebaut ist, kann sie 43 = 64 Codons bilden AUG dient als Startcodon UAA, UAG und UGA dienen als Stopcodons  Translation Die dem + Strang der DNA entsprechende mRNA enthält das Programm zur Synthese des Proteins Die Basenpaarung zwischen dem Codon auf der mRNA und dem Anticodon der Aminoacyl- tRNA sorgt für den Einbau der korrekten Aminosäure durch das Ribosom. Startcodon  Struktur einer tRNA A Sequenz und zweidimensionale Kleeblattstruktur. B Dreidimensionale L-Form einer tRNA. Pfeil: H-Brücken zwischen ausgeklappten Basen von Schlaufenregionen, welche die L-Form stabilisieren. Ψ: Pseudouridin; D: Dihydrouridin Aminoacyl-tRNA-Synthetasen aktivieren Aminosäuren für die Proteinsynthese durch covalente Kopplung an tRNAs  Der genetische Code ist degeneriert mit vier Nucleotiden können 43 = 64 verschiedene Tripletts gebildet werden 61 Tripletts codieren je eine einzige von 20 vorhandenen Aminosäuren mehrere Codons entsprechen derselben Aminosäure dritte Position im Triplett ist weniger informationsbelastet als die erste oder die zweite der degenerierte Code minimiert die schädlichen Folgen von Mutationen  Das Wobble-Phänomen 61 verschiedene Tripletts codieren für 20 Aminosäuren Bakterien besitzen 31 tRNAs Der Mensch besitzt 48 tRNAs warum kommen Organismen mit weniger als 61 Anticodons (= tRNAs) aus ?  Das Wobble-Phänomen 61 verschiedene Tripletts codieren für 20 Aminosäuren Bakterien besitzen 31 tRNAs Der Mensch besitzt 48 tRNAs warum kommen Organismen mit weniger als 61 Anticodons (= tRNAs) aus? ein bestimmtes Anticodon kann mit mehreren Codons interagieren, weil zwischen Codon und Anticodon auch Basenpaarungen vorkommen, die von den standardgemäßen G-C- und A-U-Wechselwirkungen abweichen. Abweichende Basenpaarungen kommen vor allem zwischen der 3. Position des Codons und der 1. Position des Anticodons (beide in 5’,3’-Richtung angegeben) vor, die deswegen auch als die Wobble-Positionen bezeichnet werden to wobble aus engl. - wackeln  Das Wobble-Phänomen Standardgemäße und davon abweichende Basenpaarungen in der Wobble-Position Termination der Translation  Unsere Agenda Wir sind in 1970ern Arbeiten bei GENENTECH Unsere Aufgabe – Klonierung und Exprimierung vom menschlichen Insulin-Gen in Escherichia coli Amplifizierung vom Klonierung vom Insulin Gen amplifizierten Fragment + = Produktion von Insulin Transformation in E. coli Amplifizierung vom Klonierung vom Insulin Gen amplifizierten Fragment + = Produktion von Insulin Transformation in E. coli  PCR Polymerasekettenreaktion  Polymerasekettenreaktion eine Methode zur Amplifizierung von Nucleinsäurefragmenten in vitro veröffentlicht in 1984 von Kary Mullis eine der am häufigsten benutzten Standardmethoden der Molekularbiologie beruht auf der Verwendung der thermostabilen DNA-Polymerasen  PCR Maschine (Thermocycler) Zusammensetzung der PCR Reaktion: Puffer Desoxyribonukleosidtriphosphate (ATP, TTP, CTP, GTP) Forward Primer Reverse Primer DNA Probe Polymerase PCR Programm: 95⁰ - 3 min 95⁰ - 1 min 30x 60⁰ - 30 sek 72⁰ - 1 min 72⁰ - 10 min  PCR Primers Oligodesoxyribonukleotide einzelsträngig 18 – 20 bp lang werden chemisch hergestellt  PCR Primers Oligodesoxyribonukleotide einzelsträngig 18 – 20 bp lang werden chemisch hergestellt Primer Design 5' A G C G A C C A G C G A C C T C T G C G C C G A A A G A A C C A G C C C G A A A A C C A G C G A C G A G A 3' 3' T C G C T G G T C G C T G G A G A C G C G G C T T T C T T G G T C G G G C T T T T G G T C G C T G C T C T 5'  PCR Primers Oligodesoxyribonukleotide einzelsträngig 18 – 20 bp lang werden chemisch hergestellt Primer Design 5' A G C G A C C A G C G A C C T C T G C G C C G A A A G A A C C A G C C C G A A A A C C A G C G A C G A G A 3' 3' T C G C T G G T C G C T G G A G A C G C G G C T T T C T T G G T C G G G C T T T T G G T C G C T G C T C T 5'  PCR Primers Oligodesoxyribonukleotide einzelsträngig 18 – 20 bp lang werden chemisch hergestellt Primer Design 3' 5' 5' A G C G A C C A G C G A C C T C T G C G C C G A A A G A A C C A G C C C G A A A A C C A G C G A C G A G A 3' 3' T C G C T G G T C G C T G G A G A C G C G G C T T T C T T G G T C G G G C T T T T G G T C G C T G C T C T 5' 5' 3'  PCR Primers Oligodesoxyribonukleotide einzelsträngig 18 – 20 bp lang werden chemisch hergestellt Primer Design C T T T T GG T C G C T G C T C 3' 5' 5' A G C G A C C A G C G A C C T C T G C G C C G A A A G A A C C A G C C C G A A A A C C A G C G A C G A G A 3' 3' T C G C T G G T C G C T G G A G A C G C G G C T T T C T T G G T C G G G C T T T T G G T C G C T G C T C T 5' 5' 3' C GA C C AG C GA C C T C T  PCR Maschine (Thermocycler) Zusammensetzung der PCR Reaktion: Puffer Desoxyribonukleosidtriphosphate (ATP, TTP, CTP, GTP) Forward Primer Reverse Primer DNA Probe Polymerase PCR Programm: 95⁰ - 3 min 95⁰ - 1 min 30x 60⁰ - 30 sek 72⁰ - 1 min 72⁰ - 10 min  PCR Polymerasen müssen thermostabil sein Taq Polymerase aus Bakterium Thermus aquaticus Thermus aquaticus gehört zu den gramnegativen Bakterien lebt in heißen Quellen und Geysiren Die Umgebungstemperatur in diesen Quellen liegt bei etwa 50 bis 80 °C die Enzym-Halbwertszeit beträgt bei 97,5 °C ca. 9 Minuten besitzt keine 3' → 5'-Exonukleaseaktivität und damit keine proof reading-Funktion Pfu-Polymerase aus dem thermophilen Archaebakterium Pyrococcus furiosus isoliert aus anaeroben, geothermal erhitzten Meeressedimenten optimale Wachstumstemperatur liegt bei 100 °C Das Enzym hat eine Halbwertszeit von über 4 Std bei 95 °C besitzt 3'→5' Exonukleaseaktivität und damit eine Korrekturlesefunktion Das Enzym zeigt sehr geringe Fehlerraten  5' → 3' -Polymeraseaktivität 5' ATGAC GAC GAC G 3' 3' TACTGCTGCTGCATCTACTGCTGCTGCATCTACTGCTGCTGCATC 5'  5' → 3' -Polymeraseaktivität 5' ATGAC GAC GAC GTAG ATGACGACGACG TA 3' 3' TACTGCTGCTGCATCTACTGCTGCTGCATCTACTGCTGCTGCATC 5'  5' → 3' -Polymeraseaktivität 5' ATGAC GAC GAC GTAG ATGACGACGACG TA A 3' 3' TACTGCTGCTGCATCTACTGCTGCTGCATCTACTGCTGCTGCATC 5'  3' → 5'-Exonukleaseaktivität 5' ATGAC GAC GAC GTAG ATGACGACGACG TA A 3' 3' TACTGCTGCTGCATCTACTGCTGCTGCATCTACTGCTGCTGCATC 5'  3' → 5'-Exonukleaseaktivität 5' ATGAC GAC GAC GTAG ATGACGACGACG TA 3' 3' TACTGCTGCTGCATCTACTGCTGCTGCATCTACTGCTGCTGCATC 5'  PCR Polymerasen müssen thermostabil sein Taq Polymerase aus Bakterium Thermus aquaticus Thermus aquaticus gehört zu den gramnegativen Bakterien lebt in heißen Quellen und Geysiren Die Umgebungstemperatur in diesen Quellen liegt bei etwa 50 bis 80 °C die Enzym-Halbwertszeit beträgt bei 97,5 °C ca. 9 Minuten besitzt keine 3' → 5'-Exonukleaseaktivität und damit keine proof reading-Funktion Pfu-Polymerase aus dem thermophilen Archaebakterium Pyrococcus furiosus isoliert aus anaeroben, geothermal erhitzten Meeressedimenten optimale Wachstumstemperatur liegt bei 100 °C Das Enzym hat eine Halbwertszeit von über 4 Std bei 95 °C besitzt 3'→5' Exonukleaseaktivität und damit eine Korrekturlesefunktion Das Enzym zeigt sehr geringe Fehlerraten  PCR Maschine (Thermocycler) Zusammensetzung der PCR Reaktion: Puffer Desoxyribonukleosidtriphosphate (ATP, TTP, CTP, GTP) Forward Primer Reverse Primer DNA Probe Polymerase PCR Programm: 95⁰ - 3 min 95⁰ - 1 min 30x 60⁰ - 30 sek 72⁰ - 1 min 72⁰ - 10 min Anwendungsmöglichkeiten von PCR: Amplifikation spezifischer DNA-Segmente für gentechnische Zwecke Diagnostik Diagnostik von Infektionskrankheiten (Hepatitis B und C, Herpes, HPV, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis...) Detektion von Krebsmutationen (serine-threonine kinase BRAF, epidermal growth factor receptor EGFR, KRAS …) Amplifizierung vom Klonierung vom Insulin Gen amplifizierten Fragment + = Produktion von Insulin Transformation in E. coli Können intakte eukaryotische Gene erfolgreich in prokaryotischen Zellen exprimiert werden? Können intakte eukaryotische Gene erfolgreich in prokaryotischen Zellen exprimiert werden? Nein. Können intakte eukaryotische Gene erfolgreich in prokaryotischen Zellen exprimiert werden? Nein.  RT-PCR (Reverse Transkription-PCR)  Das PCR-Verfahren wurde ursprünglich für die Amplifizierung von DNA-Fragmenten beschrieben Inzwischen sind eine Reihe von Varianten der PCR beschrieben worden Mit Hilfe der RT-PCR (Reverse Transkription-PCR) ist es möglich, auch RNA als Ausgangsmaterial zu verwenden RT-PCR beruht auf der Verwendung von Reversetranskriptasen Vermehrung der Retroviren (Klasse VI). Beispiele: HIV (Human immunodeficiency virus), RSV (Rous sarcoma virus, Sarkomvirus des Huhns), HTLV (Human T-cell lymphotropic virus, T-Zell-Leukamien), MMTV (Mouse mammary tumor virus, Brustkrebsvirus der Maus)  M-MuLV Reverse Transcriptase (Reverse Transkriptase von Murine Leukämievirus (Maus-Leukämie-Virus)) Reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA Polymerase synthetisiert von einer einzelsträngigen RNA einen komplementären DNA-Strang Braucht Primer für die DNA-Synthese besitzt keine 3' → 5'-Exonukleaseaktivität A. Oligo dT-Primer B. Random Priming Hexaoligonukleotide mit zufälliger Sequenz C. Genspezifische Primer 5' 3' Der neu synthetisierte –DNA Strang (cDNA) wird für gewöhnliche PCR verwendet  Bei Eukaryonten Anwendungsmöglichkeiten von RT-PCR: Herstellung der cDNA Bibliotheken Detektion von Spleißing-Produkten Über RT-PCR lässt sich gezielt Genexpression nachweisen Diagnose von RNA-Viren im Blutserum, wie HIV  Die Echtzeit-PCR (RTQ-PCR, real-time-quantitative-PCR)  RTQ-PCR Ist eine Modifizierung der RT-PCR Ermöglicht Quantifizierung der Matrizen-DNA oder –RNA in Proben Bei RTQ-PCR werden meist Fluoreszenzmessungen durchgeführt Fluoreszenzmessungen werden während eines PCR-Zyklus erfasst, daher der Name „real time“ Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu  FRET – Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer Ein Energie-Donor-Fluorochrom D überträgt Energie in nicht strahlender Form auf einen benachbarten Energie-Akzeptor A Die Effizienz nimmt mit der sechsten Potenz des Abstands der Farbmoleküle ab  Zwei verschiedene, jeweils mit einem FRET-Donor bzw. Akzeptor markierte Oligonukleotide werden verwendet Diese zwei Oligonukleotide binden nebeneinander an die Zielsequenz und bringen damit die Fluorochrome in eine für den FRET ausreichende Nähe Die Fluoreszenz Messung findet am Ende der Annealing Phase in jedem Zyklus statt  Zwei verschiedene, jeweils mit einem FRET-Donor bzw. Akzeptor markierte Oligonukleotide werden verwendet Diese zwei Oligonukleotide binden nebeneinander an die Zielsequenz und bringen damit die Fluorochrome in eine für den FRET ausreichende Nähe Die Fluoreszenz Messung findet am Ende der Annealing Phase in jedem Zyklus statt  Funktionsweise eines Lightcyclers RTQ-PCR Versuche werden in einem Lightcycler durchgeführt Lightcycler ist Modifikation einer PCR Maschine, die zusätzlich mit einer Lichtquelle und Photodetektor ausgestattet ist Die Sonde ist an einem Ende mit dem Quencher und an dem anderen Ende mit einem Reporter- Fluoreszenzfarbstoff markiert Hier wird die Fluoreszenz unterdrückt wenn der Quencher (als Wolke dargestellt) und Reporter- Farbstoff räumlich dicht nebeneinander liegen die Energie des angeregten Zustandes des Reporters wird strahlungslos auf den Quencher übertragen. Dadurch verringert sich die Fluoreszenz des Reporter- Fluorophors Taq Polymerase hat zusätzlich zur Polymerase Aktivität eine 5'→3' –Exonukleaseaktivität Taq Polymerase baut die Sonde während der Synthese des Gegenstranges am 5' -Ende ab Reporter und Quencher werden dabei voneinander getrennt und eine steigende Reporter Fluoreszenz kann gemessen werden Die Sonde ist an einem Ende mit dem Quencher und an dem anderen Ende mit einem Reporter- Fluoreszenzfarbstoff markiert Hier wird die Fluoreszenz unterdrückt wenn der Quencher (als Wolke dargestellt) und Reporter- Farbstoff räumlich dicht nebeneinander liegen die Energie des angeregten Zustandes des Reporters wird strahlungslos auf den Quencher übertragen. Dadurch verringert sich die Fluoreszenz des Reporter- Fluorophors Taq Polymerase hat zusätzlich zur Polymerase Aktivität eine 5'→3' –Exonukleaseaktivität Taq Polymerase baut die Sonde während der Synthese des Gegenstranges am 5' -Ende ab Reporter und Quencher werden dabei voneinander getrennt und eine steigende Reporter Fluoreszenz kann gemessen werden Die Sonden bilden eine Haarnadelstruktur An ihrem Ende ist je ein Fluoreszenzmolekül und ein Quencher gebunden Ein ende der Sonde hat neun Basen, die mit komplementären Basen des anderen Endes hybridisieren und eine Haarnadel bilden Durch die Nähe des Quenchers wird das Aussenden eines Fluoreszenzsignals unterbunden (gequencht) Die 15 Basen in der Mitte der Sonde sind komplementär zu einem Strang der PCR-Produkte Durch hohe Temperatur verliert die Sonde ihre Haarnadelform und wird linear Beim Abkühlen fürs Annealing binden sich die Sonden an PCR-Produkte. Quencher blockiert nicht mehr die Fluoreszenz Die nicht gebundenen Sonden fallen in die Haarnadelform zurück und fluoreszieren nicht Amplifizierung vom Klonierung vom Insulin Gen amplifizierten Fragment + = Produktion von Insulin Transformation in E. coli Agarosegelelektrophorese Fürs Nachweisen von PCR-Produkten für Größenbestimmung der DNA Fragmente zur Trennung der DNA Fragmente  Utensilien Netzteil Elektrophoresekammer Gelkammer Agarose Elektrophoresepuffer Ladepuffer: DNA Leiter (TAE Puffer) Bromphenolblau Tris-HCl Glycerol EDTA H2O Essigsäure pH 8.0  Agarose ist ein Polysaccharid aus D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-Galactose, die glycosidisch miteinander verbunden sind wird vor aus den Rotalgengattungen Gelidium und Gracillaria gewonnen Agarose bildet ein Gel, dessen kettenförmige Moleküle über Wasserstoffbrücken quervernetzt sind Vorbereiten vom Gel Aufkochen in Abkühlen bis 50 ⁰C Gel gießen Agarose + TAE Puffer der Mikrowelle  Utensilien Netzteil Elektrophoresekammer Gelkammer Agarose Elektrophoresepuffer Ladepuffer: DNA Leiter (TAE Puffer) Bromphenolblau Tris-HCl Glycerol EDTA H2O Essigsäure pH 8.0 1 – Gelkammer mit dem Gel in die Gelelektrophoresekammer 2 – Gelelektrophoresekammer mit dem TAE-Puffer auffüllen 3 – DNA Probe mit dem Ladepuffer mischen (um Dichte der DNA Lösung zu erhöhen) 4 – DNA Probe und DNA-Leiter (Marker) in jeweils eine Geltasche laden 5 – Den Deckel auf die Gelelektrophoresekammer setzen 6 – Netzteil starten Gelkammer Gelelektrophoresekammer Taschen 1 – Gelkammer mit dem Gel in die Gelelektrophoresekammer 2 – Gelelektrophoresekammer mit dem TAE-Puffer auffüllen 3 – DNA Probe mit dem Ladepuffer mischen (um Dichte der DNA Lösung zu erhöhen) 4 – DNA Probe und DNA-Leiter (Marker) in jeweils eine Geltasche laden 5 – Den Deckel auf die Gelelektrophoresekammer setzen 6 – Netzteil starten Gelkammer Gelelektrophoresekammer DNA-Moleküle sind negativ geladen Im elektrischen Feld wandern sie in Richtung des positiven Pols Elektrophoresepuffer (TAE Puffer): Tris-HCl EDTA Essigsäure pH 8.0 Kathode Anode Je kleiner ein DNA-Fragment ist, desto schneller kann es sich durch das Gel bewegen Zusammenhang zwischen DNA-Größe und Wanderungsgeschwindigkeit bei der Gelelektrophorese Marker DNA- Probe DNA- Grobe Abschätzung der Größe der DNA- Fragmente erfolgt nach Augenmaß durch Vergleichen mit DNA-Fragmenten des Markers, deren Größe bekannt ist  Der Nachweis von DNA-Banden in einem Agarosegel mit EtBr-Färbung und UV Licht Ethidiumbromid Interkalation von Ethidiumbromid in DNA Ethidiumbromid interkaliert in Nukleinsäuren Durch die Interkalation von Ethidiumbromid in Nukleinsäuren nimmt die Intensität der Fluoreszenz- Emission um den Faktor 50–100 zu. Amplifizierung vom Klonierung vom Insulin Gen amplifizierten Fragment + = Produktion von Insulin Transformation in E. coli Das amplifizierte DNA-Fragment muss in ein Plasmid / Vektor kloniert werden. Das amplifizierte DNA-Fragment muss in ein Plasmid / Vektor kloniert werden. Was ist ein Plasmid???  Elektronenmikroskopische Aufnahme vom bakteriellen Chromosom und Plasmiden Plasmide (Pfeile) sind als kleine, ringförmige Strukturen zu erkennen Die Zelle (weiß) wurde sehr sanft aufgeschlossen, sodass DNA intakt geblieben ist  Plasmid – Extrachromosomales, ringförmiges, autonom replizierendes, doppelsträngiges DNA-Molekül Sind kleiner als die Chromosomen Sind meistens in Bakterien zu finden; in Eukarionten sehr selten (z. B. in Backhefe) Plasmide führen eigenständiges Dasein in der Bakterienzelle Enthalten ein oder mehrere Gene, die häufig für eine nützliche Eigenschaft der Bakterienzelle verantwortlich sind Plasmide besitzen einen eigenen Replikationsursprung und replizieren sich unabhängig vom Chromosom Plasmide, die sich sowohl extrachromosomal als auch intrachromosomal, durch Integration in das Chromosom, replizieren können, werden als Episomen bezeichnet in Gentechnologie dienen Plasmide als Vehikel für den Transfer von DNA-Segmenten in eine Zelle und ermöglichen deren molekulare Klonierung Plasmid vs Episom  Klassifikation von Plasmiden (natürlichen Plasmiden) Fertilitäts- oder F-Plasmide enthalten nur tra-Gene (tra von Transfer); codieren die Fähigkeit die Konjugation und die Übertragung des Plasmids in Gang zu setzen. Beispiel ist das F-Plasmid von E. coli Die Plasmidübertragung durch Konjugation zwischen Bakterienzellen  Klassifikation von Plasmiden (natürlichen Plasmiden) Fertilitäts- oder F-Plasmide enthalten nur tra-Gene (tra von Transfer); codieren die Fähigkeit, die Konjugation und die Übertragung des Plasmids in Gang zu setzen. Beispiel ist das F-Plasmid von E. coli Resistenz- oder R-Plasmide tragen Gene, die der Bakterienzelle Resistenz gegen einen oder mehrere antibakterielle Wirkstoffe verleihen. Ein Beispiel ist das Plasmid RP4 von Pseudomonas Stämmen. R-Plasmide tragen zur Resistenz Entwicklung bei Pathogenen bei!!! Col-Plasmide codieren Colicine, Proteine die andere Bakterien töten. Ein Beispiel ist das Plasmid ColE1 von E. coli. Degradative Plasmide ermöglichen dem Wirtsbakterium das Verstoffwechseln ungewöhnlicher Moleküle wie Toluol und Salicylsäure. Ein Beispiel ist das TOL Plasmid von Pseudomonas putida Virulenzplasmide machen das Wirtsbakterium pathogen, wie zum Beispiel die Ti- Plasmide von Agrobakterium tumefaciens, die bei dikotylen Pflanzen die Wurzelhalsgallenkrankheit hervorrufen  Größe und Kopienzahl Die Kopienzahl ist die Zahl der Moleküle eines einzelnen Plasmids in einer Bakterienzelle Manche – insbesondere größere – Plasmide sind stringent, das heißt, sie kommen stets nur in geringer Kopienzahl vor (1 oder 2) Andere Plasmide werden als relaxiert bezeichnet; ihre Kopienzahl je Zelle kann bei 50 oder mehr liegen Plasmid Größe Organismus Länge (kb) molare Masse (106 d) pUC8 2,1 1,8 Escherichia coli ColE1 6,4 4,2 Escherichia coli RP4 54 36 Pseudomonas und andere F 95 63 Escherichia coli TOL 117 78 Pseudomonas putida pTiAch5 213 142 Agrobacterium tumefaciens  Plasmide als Vektoren Alle in der Gentechnik eingesetzten Plasmid-Vektoren enthalten von ursprünglichen natürlichen Plasmiden nur noch die Sequenzen, die für gentechnische Arbeiten absolut notwendig sind Typische Vektoren sind klein – 3 – 10 kbp Bestandteile eines Vektors: Replikationsursprung (ori, origin of replication) selektierbarer Marker in Form von Resistenzgen für Antibiotika (z.B. bla – betalactamase für Ampicillin Resistenz) Bereich für die Aufnahme der zu klonierenden DNA-Fragmente – MCS (multiple cloning site); enthält eine Vielzahl von Erkennungssequenzen für unterschiedliche Restriktions- endonukleasen, die jeweils nur einmal im Plasmid schneiden Oft enthalten ein α-Fragment vom β-galactosidase Gen (lacZ) als „Indikator Gen“  Resistenzgen / Resistenzmarker Plasmidvektoren für gentechnische Arbeiten bieten der Zelle keine nützliche Eigenschaften Replikationsursprünge der Vektoren sind meistens stark mutiert um hohe Kopienzahl der Vektoren zu ermöglichen; Vektoren verhalten sich unstabil Ohne Zugabe der Antibiotika gehen die Plasmidvektoren schnell verloren (Zellen entstehen, die keine Vektoren enthalten) Zugabe der Antibiotika erzeugt Selektionsdruck für den Erhalt der Plasmidvektoren Häufig verwendete Antibiotikum-Resistenzen – z. B. gegen Tetracyclin, Chloramphenicol, Kanamycin, Apramycin β-Lactamase spaltet das Vierringlactam von β-Lactam-Antibiotika (z. B. Ampicillin, Penicillin) MCS – Bereich für die Aufnahme der zu klonierenden DNA-Fragmente (multiple cloning site); enthält eine Vielzahl von Erkennungssequenzen für unterschiedliche Restriktions- endonukleasen, die jeweils nur einmal im Plasmid schneiden MCS – Bereich für die Aufnahme der zu klonierenden DNA-Fragmente (multiple cloning site); enthält eine Vielzahl von Erkennungssequenzen für unterschiedliche Restriktions- endonukleasen, die jeweils nur einmal im Plasmid schneiden Was sind die Restriktionsendonukleasen???  Endonukleasen vs Exonukleasen Exonucleasen bauen die Nucleinsäure von einem Ende des Moleküls her ab. Sie unterscheiden sich in ihrer Spezifität, indem sie die Nucleotide entweder in 5’,3’- oder in 3’,5’-Richtung abspalten. Pro Reaktionszyklus wird jeweils ein Nukleinsäuremonomer vom Ende des Moleküls abgespalten Endonucleasen können durch Spaltung einer inneren Phosphodiesterbindung die Nucleinsäure in kleinere Bruchstücke spalten. Im Gegensatz zu Exonukleasen als Reaktionsprodukte entstehen keine einzelnen Nukleotide, sondern immer Mehrfachnukleotide Endonucleasen Exonucleasen Exonucleasen 5'A G C G A C C T C T G C G C C G A A A G A A C C A G C C C G A A A A C C A G 3' 3' T C G C T G G A G A C G C G G C T T T C T T G G T C G G G C T T T T G G T C 5'