Cromatografía de Interacción Hidrofílica (HILIC) PDF

solo CL, combinación de 3 tipos se usan fases estacionarias como en NP, analitos pequeños y la fase movil sera de las que se usen en fase inversa(agua y dte org) permitira separa analitos pequeños, cargados y polares normalmente...

solo CL, combinación de 3 tipos se usan fases estacionarias como en NP, analitos pequeños y la fase movil sera de las que se usen en fase inversa(agua y dte org) permitira separa analitos pequeños, cargados y polares normalmente José Bernal del Nozal  ESQUEMA Introducción ¿Cómo funciona? Desarrollo de métodos Aplicaciones  INTRODUCCIÓN Combinación de tres mecanismos de HPLC cosas a optimizar Tipo de disolvente orgánico Tipo de tampón, concentración y pH si no estan cargados por hilic no podemos separar Compuestos Tipo de fase cargados estacionaria puntos que no podemos cambiar: v La fase estacionaria suele ser polar v La fase móvil contiene un alto porcentaje de disolventes orgánicos (ACN) v El agua tiene la mayor fuerza de elución  INTRODUCCIÓN ¿Porqué se usa HILIC? Retención de compuestos polares Funcionamiento similar a NPLC pero empleando una fase móvil acuosa (elución de los compuesto siguiendo generalmente un orden inverso a RPLC) Diversas fases estacionarias disponibles comercialmente Compatible con MS muy importante Puede simplificar el tratamiento de muestra a veces podemos saltarnosla  INTRODUCCIÓN Ventajas Mejor retención de analitos polares e hidrofílicos Mayor sensibilidad cuando se emplean MS (mejor desolvatación de fase móvil) El uso de ACN (disolvente de baja viscosidad) permite el empleo de mayores flujos de fase móvil y mejor ionización La menor contrapresión (back-pressure) de la columna proporciona cromatogramas más rápidos con mejores resoluciones Mejores curvas de Van Deemter  INTRODUCCIÓN Desventajas Tiempos mayores de equilibración que en RPLC Peor simetría de pico cuando hay diferencia en la fuerza de la fase móvil y el disolvente de la muestra. Peor retención de aniones cuando se usa sílice de fase estacionaria Todavía no se comprende el mecanismo en su totalidad dtes fuertes no, estropean la muestra INTRODUCCIÓN Instrumentación misma instr que HPLC a diferencia de la columna  INTRODUCCIÓN BIOANÁLISIS QUÍMICA MEDIOAMBIENTAL QUÍMICA DE LOS ALIMENTOS QUÍMICA CLÍNICA QUÍMICA FARMACÉUTICA HILIC-MS/MS va muy bien para analisis farmaceutrica, se usa mucho  ¿Cómo funciona? Mecanismo de separación complejo (adsorción, partición, puentes de H, cambio iónico) DIFICULTAD PARA DESAROLLAR Y OPTIMIZAR MÉTODOS ¿Cómo funciona?  ¿Cómo funciona? Importancia del enlace por puentes de H (H-bonding) la misma molecula puede ser donador o aceptor por lo que cambiando el pH en la misma fase movil puede cambiar todo  ¿Cómo funciona? FASES ESTACIONARIAS las que mas se usan ¿Cómo funciona? FASES ESTACIONARIAS iguales que HPLC (tam particulo, longitud, poro, etc) ¿Cómo funciona? FASES ESTACIONARIAS  ¿Cómo funciona? lo que hay que tener en cuenta para elegir fase estacionaria FASES ESTACIONARIAS Las fases estacionarias en HILIC se deben caracterizar por: Grado de hidrofilidad Selectividad frente a grupos hidrofílicos-hidrofóbicos Selectividad frente a isómeros de posición y conformacionales Evaluación de interacciones electrostáticas Evaluación de la naturaleza ácido-base de las fases estacionarias ¿Cómo funciona? FASES ESTACIONARIAS el de abajo no porque puede ser los conformeros. nos quedamos conla primera por tiempo y señal ¿Cómo funciona? FASES ESTACIONARIAS  ¿Cómo funciona? FASES MÓVILES es al reves que en RP acn y meoh como los mas usados en porcentaje de fase mmovil vEl ACN es el disolvente más utilizado vEl MeOH es un disolvente muy prótico y por lo tanto no se produce partición vUna poca cantidad de MeOH interrumpe la formación de puentes de hidrógeno vUna poca cantidad de agua disminuye los tiempos de análisis vLa fuerza de elución suele ser la inversa que la observada en RPLC  ¿Cómo funciona? FASES MÓVILES deoendiendo del porcentaje de acn varian las interac hidrofilicas e hidrofobicas (queremos hidrof)Ç  ¿Cómo funciona? acn el debil FASES MÓVILES ¿Cómo funciona? FASES MÓVILES  ¿Cómo funciona? FASES MÓVILES (efecto del tampón) v Afecta al pH Modifica la carga y polaridad de los analitos (afecta a las interacciones de adsorción y partición) Se carga la superficie de la fase estacionaria v El uso de sales de amonio mejora la forma de pico y permite van bien para controlar el ph para no se que y son compatibles con MS controlar la retención de analitos cargados. v Si se trabaja con gradiente de elución, los componentes de la fase móvil han de tener el mismo tampón. (FI y pH) v Si aumenta la concentración de la sal disminuyen los tR de analitos cargados en fases estacionarios de carga opuesta (cambio iónico) o analitos que forman enlaces fuertes de puentes de hidrógeno (adsorción) v Si aumenta la concentración de la sal aumentan los tR de analitos polares (salting-out) o de analitos con la misma carga que la fase estacionaria  ¿Cómo funciona? FASES MÓVILES (efecto del tampón)  ¿Cómo funciona? FASES MÓVILES (efecto del tampón)  ¿Cómo funciona? EFECTO DE LA TEMPERATURA v En algunos casos afecta positivamente a la eficacia de la separación ya que disminuye la viscosidad y favorece la difusión (disminución de la presión) v Afecta a la ecuación Van´t Hoff: La relación entre lnk´y (1/T) es linear cuando predomina la partición La pendiente (+/-) muestra si la retención es debida a un proceso exotérmico (disminuye tR al aumentar la temperatura) o endotérmico (aumenta tR al aumentar la temperatura)  ¿Cómo funciona? RPLC vs HILIC RPLC v Fase estacionaria no polar (C18) v Fase móvil polar (Agua/ACN, Agua/MeOH,…) v Se disminuye la retención a medida que disminuye la polaridad de la fase móvil (Un aumento de ACN en la fase móvil disminuye la retención). HILIC v Fase estacionaria polar (Sílice) v Fase móvil polar (ACN/Agua) v Se disminuye la retención a medida que aumenta la polaridad de la fase móvil (Un aumento de agua en la fase móvil disminuye la retención). ¿Cómo funciona? RPLC vs HILIC ¿Cómo funciona? RPLC vs HILIC ¿Cómo funciona? RPLC vs HILIC Desarrollo de métodos APLICACIONES APLICACIONES APLICACIONES APLICACIONES APLICACIONES APLICACIONES APLICACIONES APLICACIONES José Bernal del Nozal