Cours de Microbiologie Moléculaire (2024-2025) - PDF

# Master 1 de Génétique fondamentale et appliquée ## COURS de Microbiologie moléculaire (2024-2025) ### Éléments génétiques mobiles et recombinaison spécifique de site (partie 1) #### LBCM-FSB-USTHB ## La recombinaison spécifique de site - La recombinaison spécifique de site est utilisée par l...

# Master 1 de Génétique fondamentale et appliquée ## COURS de Microbiologie moléculaire (2024-2025) ### Éléments génétiques mobiles et recombinaison spécifique de site (partie 1) #### LBCM-FSB-USTHB ## La recombinaison spécifique de site - La recombinaison spécifique de site est utilisée par les bactéries dans de nombreux processus biologiques : - l'intégration/excision d'éléments génétiques mobiles (les phages, les plasmides, les cassettes de gènes de résistance) - la résolution de dimères de réplicons (plasmides ou chromosomes) pour permettre leur ségrégation équitable au cours des divisions cellulaires - la résolution des co-intégrats (lors de la transposition réplicative) - l'inversion de segments d'ADN pour la modification de l'expression de certains gènes de virulence ## La séquence "core" - La recombinaison spécifique de site est un échange d'ADN qui intervient entre deux sites ADN qui ont une courte région d'homologie (la séquence "core"). - La séquence core est composée de : - séquences spécifiques en orientation inverse : - sites de fixation pour les recombinases site spécifique - séparées par une courte séquence d'ADN appelée "spacer" : - site de coupure, les recombinases coupent l'ADN de part et d'autre du spacer. ## Les recombinases spécifiques de sites - Les recombinases spécifiques de sites sont regroupées en deux sous-familles qui diffèrent par l'acide aminé catalytique : - les recombinases à sérine - et les recombinases à tyrosine - Ces recombinases catalysent le clivage de l'ADN via une attaque nucléophile (groupement hydroxyle de la sérine ou de la tyrosine) sur un groupement phosphate : - il se forme un intermédiaire covalent recombinase-ADN est formé entre l'acide aminé catalytique (sérine ou tyrosine) de la recombinase et le groupement phosphate scissile de l'ADN. - L'autre extrémité du brin coupé est libérée sous forme hydroxylée. - Les recombinases à sérine - forment un intermédiaire 5'-phospho-sérine et libèrent une extrémité 3'-OH. - Elles coupent les quatre brins simultanément. - Dans la réaction de recombinaison: - étape de clivage (double-brins) - échange de brins entre les deux sites cœurs - étape de religation de l'ADN - recyclage des recombinases - L'intermédiaire covalent (recombinase-ADN) va permettre de conserver l'énergie de la liaison phosphodiester coupée et de la réutiliser lors de l'étape de religation de l'ADN. - Lors de l'échange de brin, c'est l'extrémité hydroxylée qui attaque la liaison phosphoprotéine du partenaire d'échange, permettant de régénérer un brin intact d'ADN et de recycler la protéine. - Les recombinases à tyrosine - forment un intermédiaire 3'-phospho-tyrosine et libèrent une extrémité 5'-OH. - Elles coupent et échangent les quatre brins séquentiellement. - chaque partenaire de recombinaison est coupé à la même position - L'échange de brins est réciproque dans la région d'homologie. - La coupure et l'échange de brin interviennent sans qu'il y ait de perte ou de gain d'ADN ni de néo-synthèse d'ADN. ## Types de recombinaison - Les événements de recombinaison peuvent être intermoléculaires ou intramoléculaires. - Ils génèrent différents types de produits. ## Recombinaison intermoléculaire - La recombinaison intermoléculaire conduit à l'intégration. - cela concerne l'intégration : - des bacteriophages, des plasmides intégratifs, des cassettes de gènes de résistance ## Recombinaison intramoléculaire - Dans la recombinaison intramoléculaire, le produit dépend de l'orientation relative des 2 sites de recombinaison. - en orientation directe : - excision/résolution du fragment d'ADN qu'ils encadrent sous forme circulaire. - cela concerne l'excision : - des bacteriophages, des plasmides intégratifs, des dimères de réplicons (plasmides ou chromosomes) en monomères pour permettre leur ségrégation dans les cellules filles - en orientation inverse: inversion du fragment d'ADN qu'ils encadrent. - cela concerne : - le contrôle de l'expression de certains gènes, ## Table 1. Site-Specific Recombination Systems | Function | Element or Recombinase | Host or Context | Recombinase Superfamily | |---------------------------------|-----------------------|-------------------------|--------------------------| | Diversity/gene expression | hin | *S. typhimurium* | Resolvase/invertase | | | gin | Bacteriophage Mu | Resolvase/invertase | | | pin | *E. coli* | Resolvase/invertase | | | SpoIV cisA | *Bacillus* | Resolvase/invertase | | | flm | *E. coli* | Integrase | | Dimer reduction | res | Transposon Tn3 | Resolvase/invertase | | | res | Transposon Tn21 | Resolvase/invertase | | | cre | Bacteriophage P1 | Integrase | | | xer | *E. coli* | Integrase | | | flp | *S. cerevisiae* | Integrase | | Integration/excision | λint | Bacteriophage λ | Integrase | | | Tn916 | *Enterococcus* | Integrase | | | Tn1545 | *Streptococcus* | Integrase | ## Des exemples de modification de l'expression génique impliquant une recombinaison site spécifique - Phénomène de variation de phase chez - Salmonella (expression des flagelles H1 ou H2) - et chez *E. coli* (expression ou non des pili de type 1) ## 2- La résolution de cointégrats de transposon, une étape essentielle à la transposition ## 3- La résolution des dimères de plasmides: importante pour le maintien des plasmides ## 4- Mobilité (intégration et l'excision) d'éléments génétiques mobiles (phages, cassettes de gènes de résistance aux antibiotiques, transposons conjugatifs, îlots de pathogénicité) ## Le génome du phage λ : intégration au chromosome bactérien et excision - En plus des deux principaux acteurs (les sites core et la recombinase, constituant le minimum nécessaire pour la réaction de recombinaison), - la recombinaison spécifique de site implique l'utilisation de protéines accessoires supplémentaires. ## L'intégration du génome du phage lambda - Elle est médiée par une recombinase spécifique de site (l'intégrase) codée par le bacteriophage, en présence de facteurs d'hôte. - Deux séquences sont impliquées (sur 2 molécules d'ADN différentes): - une séquence d'ADN portée par le génome du bacteriophage: le site attP (<< phage attachment site») - et une séquence d'ADN située sur le chromosome bactérien: le site attB (« bacterial attachment site») - le produit de la réaction de recombinaison: intégration du génome du phage au chromosome (avec la formation de de deux sites hybrides en orientation directe encadrant le prophage) ## Les sites attB et attP - Les deux sites d'attachement, attB et attP, ont en commun le site cœur: - attB: se limite au site cœur (de taille 21 pb) - B et B': deux séquences inversées imparfaitement répétées (sites de fixation de faible affinité de l'intégrase - << O >>: la région centrale << O >> (site de coupure) ## Le site attP : plus complexe (taille d'environ 240 pb) - un site cœur (COC): Cet C, des sites de liaison de faible affinité pour l'intégrase - 2 bras P (environ 150pb) et P' (90 pb): en amont et en aval, respectivement - (P): sites de liaison de forte affinité pour l'intégrase - IHF (H), XIS et FIS: des sites de liaison pour des facteurs accessoires ## Dans le complexe intégratif: - Les intégrases et les protéines IHF (liées aux bras Pet P') forment un complexe sur le site attP - Dans ce complexe, les protéines IHF fixées à leurs sites induisent des courbures au niveau des bras Pet P - ces courbures permettent aux intégrases fixées aux bras Pet P' de i) se fixer aux sites cœur Cet C' et ii) se positionner pour la capture des sites cœur B et B' ## L'excision du génome du phage lambda - résulte d'une réaction de recombinaison entre les sites attL et attR en orientation directe - Les substrats des réactions d'intégration et d'excision étant différents, les protéines qui en sont impliquées sont aussi différentes - L'excision nécessite non seulement l'intégrase et la protéine IHF mais aussi une autre protéine, l'excisionase, codée par le gène xis du phage, ayant un site de liaison au niveau de attR. ## Le phage régule l'expression des gènes codant les protéines int et Xis : - synthèse exclusive de Int quand le phage doit s'intégrer au chromosome - synthèse des deux protéines Int et Xis quand le phage a besoin de s'exciser du chromosome. - Comment le phage perçoit que son ADN est intégré ou non au chromosome? comment les gènes int et xis sont transcrits ? ## NOT INTEGRATED - 2-P₁:localisation dans la séquence codante du gène xis: transcrit int - RNaselll recognition & cleavage - rapid degradation ## INTEGRATED - Le site sib n'est plus en aval de PL: il est éliminé du transcrit PL - Le transcrit PL n'est donc pas dégradé (expression des protéines Int et Xis: excision du génome A du chromosome bactérien)