Protein Glicosilazione PDF

La denaturazione in sé ha anche delle possibilità buone: quando abbiamo una proteina misfolded nei batteri prima di buttarla possiamo denaturarla ancora di più in modo tale che perda la conformazione sbagliata; dopo di che possiamo provare rinaturarla! NB: un’altra caratteristica dell’ospite che es...

La denaturazione in sé ha anche delle possibilità buone: quando abbiamo una proteina misfolded nei batteri prima di buttarla possiamo denaturarla ancora di più in modo tale che perda la conformazione sbagliata; dopo di che possiamo provare rinaturarla! NB: un’altra caratteristica dell’ospite che esprime la proteina è la presenza di agenti contaminanti che dipendono dall’ospite che utilizziamo: ad esempio i virus possono essere presenti nella cellula di mammifero e sono quindi possibili contaminant; i pirogeni, endotossine batteriche, possono essere presenti in sistemi di espressione procarioti. 26/11 We have to be careful with the sugar that is chosen for glycosylation, because they might provoke immunogenicity. Protein expression in E. coli Esistono tante review sulla produzione di proteine ricombinanti all’interno di cellule batteriche: la produzione industriale è essenziale per la scoperta e sviluppo di farmaci ma può avere dei problemi. Glicosilazione La glicosilazione è un processo post- traduzionale fondamentale. I batteri non riescono a fare questa modifica —> non creano glicoproteine, mentre gli eucarioti si. With one protein with different glycan attached to it we can have many different variations of the protein. Dal punto di vista della produzione dobbiamo tenere conto di questa cosa. Da un segmento di DNA genomico, la natura riesce a diversificare la proteina creata in molte varianti dove la differenza sta nella catena zuccherina: potendo attaccare catene zuccherine anche complesse in determinati siti delle proteine, aumenta l’eterogeneità e cambia la funzionalità della proteina stessa (regolazione più fine dell’attività della proteina) NB: l’errore in questa figura sta nel fatto che il messenger non è DNA ma RNA! 31 Glycans are not linear, they have branches. All glycans have an attachment of the first sugar, usually they’re coming out from a serine or a threonine. Tutte le glicoproteine hanno la stessa sequenza amminoacidica e stesso folding, ma all’esterno esposti al solvente acquoso possiamo avere cene zuccherine diverse. Esempio: nella membrana della cellula eucariota abbiamo ancorata la proteina alla quale sono legate, in posizioni opportune, delle catene zuccherine diverse: - O-glicani: più corti; legati all’OH in catena laterale di una serina o treonina - N-glicani: più lunghi e ramificati; legati all’N in catena laterale di un’asparagina. I colori diversi qui utilizzati indicano zuccheri diversi: - Amminozucchero acetilato a destra in blu dopo l’asparagina; - Amminozucchero a sx in alto rosa: questo zucchero ha un carbossilato e un glicerolo e lo troveremo spesso come ultimo pezzettino della catena zuccherina. https://youtu.be/RorGifz6C2Y --> da guardare Review - Increasing the Sialylation of therapeutic glycoproteins: the potential of the sialic acid biosynthetic pathway —> quando iniettiamo la proteina nel paziente dobbiamo tenere conto degli effetti avversi. —> le biotech non si limitano a prendere sistemi viventi ed utilizzarli, ma possono essere anche ingegnerizzati. Negli ultimi anni sono stati ingegnerizzati i pathway di glicosilazione delle proteine —> aumento del valore delle proteine terapeutiche. 32  —> è possibile cambiare l’attività degli enzimi cambiando poi il pattern di glicosilazione. —> più esposto al solvente Acido Sialico Può avere diversi nomi: ha un gruppo amminico spesso acetilato, un gruppo carbossilico e glicerolo —> tutte queste caratteristiche lo rendono più polare: aumenta l’acidità delle glicoproteine e anche la solubilità. Viruses uses sialic acid; their mimic can be found in many antiviruses. Is a physiological important sugar. Questo zucchero ha 9 atomi di C e la posizione 5 è quella dell’amino gruppo che può essere o un acetile (COCH3) o un glicolile (COCH2OH) —> NGNA. La forma preferita dal sistema post-traduzionale per gli umani adulti è la NANA ma non è sempre così: nell’ambito delle proteine ricombinanti ottenute in cellule di mammifero, se utilizziamo cellule di roditori esse possono glicosilare anche con NGNA —> proteine prodotte in cellule non umane possono glicosilare bene ma in determinate condizioni possono inserire questa forma dell’acido sialico non umana —> antigenico! Questo problema non è insormontabile: - Si possono usare cellule umane: soluzione non facile perchè le piattaforme di cellule ospite devono avere dei requisiti che non necessariamente le cellule umane hanno; - Si può lavorare con cellule di mammifero ma tenendo controllate le condizioni del processo di produzione —> induciamo le cellule a produrre NANA. 33 A. Representative structures of the three classes of N-linked glycans showing both monosaccharide composition and bond linkage information (note: the number of potential structures is too large to represent symbolically, and the glycans shown are merely representative of the types of structures within each category). B. Representative structures of the eight core classes of O-linked glycans. C. Symbolic representation of the monosaccharides commonly observed on N- and O-glycans N-Glycolylneuraminic acid (NGNA) is a derivative of NANA that is not typically found in adult humans because it is an oncofetal antigen but is present in CHO and NS0 cultures. —> The choice of mammalian expression host is thus very important toward determining the final glycoform profile! Schematic view of the glycosylation pathway in a CHO cell line Per una 34 cellula CHO, le più utilizzate, è conosciuto il pathway di glicosilazione: comincia nel reticolo plasmatico, poi si sposta nel golgi, ecc. Avviene tutta una serie di reazioni enzimatiche che portano all’attacco di un core glicosidico ad una certa proteina; dopo di che si ha la rimodulazione con l’aggiunta di altri zuccheri ecc. Tutti gli enzimi sono noti e hanno un’attività che dipende anche dalle condizioni in cui si trovano —> i vari processi possono portare a gligoproteine che hanno rapporti NANA-NGNA variabile! La forma finale della glicoproteina è variabile e dipende dal livello di glicosilazione e di zuccheri terminali. Questi livelli dipendono dalle condizioni di produzione, le quali controllano l’attività degli enzimi stessi. Schema che definisce i metodi di controllo del pathway di glicosilazione in CHO. I parametri di controllo del pathway possono essere: controlli molecolari (presenza di mutanti, ecc), parametri di coltura cellulare ecc. I numeri riportati sono dei parametri osservati, studiati e riportati di produttori di proteine (sono tutti tabulati): 35  —> l’acido sialico corretto ha un’importanza particolare per qualità, stabilità e altre caratteristiche delle glicoproteine terapeutiche —> la presenza del galattosio è un fattore importante per la determinazione dell’emivita plasmatica delle glicoproteine: ci sono dei recettori nel fegato per glicoproteine che riconoscono il galattosio libero (asialo glicoprotien receptor)—> legano le proteine non sialilate e le rimuovono dal siero. Quindi glicoproteine non corrette (non sialilate) hanno emivita plasmatica breve; di conseguenza, l’espressione dell’acido sialico terminale previene la degradazione e rimozione delle glicoproteine dal siero, aumentandone l’emivita plasmatica. —> l’acido sialico è importante per mascherare determinanti antigienici nella proteina stessa (zuccheri particolari magari carichi). Il corretto acido sialico diminuisce l’immunogenicità della proteina. —> dal punto di vista della biochimica strutturale, la presenza delle cariche negative ha influenza su parametri tipici della proteina (pI diminuisce, solubilità aumenta, resistenza alla degradazione). —> gli acidi sialici sono cruciali per la produzione e l’approvazione di glicoproteine terapeutiche ed è importante che esse siano omogenee in ogni batch di produzione. You can control the quality of your protein by controlling very well the conditions of production of the protein. ADCC: Antibody Dependent Cellular Toxicity By changing the identity of the sugar part, you can have another effect of the protein. By changing the conditions, you can influence the drug. 36 INDUSTRIAL BIOPROCESSING OF BIOLOGICS Come si producono, quali sono le caratteristiche di produzione e purificazione industriale delle proteine ricombinanti? Culture and harvest Coltura e raccolta (farmacopea europea) —> in-process controls: controlli dei livelli di replicazione della popolazione, la densità ottica (concentrazione), il pH, i tempi e le temperature di coltivazione ecc. Tutto ciò va stabilito perché ogni volta che facciamo il processo industriale di coltura delle cellule per ottenere un farmaco, è necessario che ci sia consistenza e performance. —> definizione dei criteri di raccolta e fine della produzione con test per assicurare l’assenza di contaminazioni. —> quando utilizziamo sistemi procarioti dobbiamo assicurare la purezza microbica; quando usiamo cellule di mammifero dobbiamo assicurare assenza di agenti estranei come ad esempio i virus. 02/12/2024 A typical cell culture production of biologics 37 In the end our goal is to have the biggest amount of protein possible. Every cell culture, big or small, is putted under agitation, otherwise you risk that bacteria precipitate. For mammalian cells also, but you don’t agitate them too much or you might risk that they break their membrane. Si parte dal vial della WCB e si fa la semina delle cellule in una fiasca (inizio del lotto di produzione) —> serve per adattare le cellule che passano dalle celle fredde delle WCB al liquido di coltura. Quando le cellule crescono e si moltiplicano si passa alla diluizione e aumento di volume in una spinner-flask con un agitatore (per tenere le cellule in sospensione), inlet per i gas importanti per crescita cellulare e outlet per rimuovere quelli in eccesso. Si passa a mano a mano all’aumentare della densità delle cellule, a bioreattori di acciaio inox con volumi maggiori, ma sempre in condizioni controllate. NB: l’agitazione non è eccessiva per evitare la rottura delle cellule; per lieviti e batteri può anche essere molto vigorosa perché sono più resistenti, nel caso delle cellule di mammifero l’agitazione va tarata in base a quello che possono sopportare ma deve essere sufficiente affinché esse rimangano in sospensione (in quanto tenderebbero a crescere adesso alla superficie). CIPà cleaning in place SIPà sterilizing in place Fermentation system I sistemi di fermentazione possono essere distinti in 3 tipi: 1. Batch fermentation: eseguiamo la coltivazione e fermentazione in un sistema chiuso e solo alla fine raccogliamo le cellule e le purifichiamo. Vantaggio: metodo più sicuro perchè possiamo controllare bene la presenza di contaminanti ecc. Svantaggio: rese basse. Allows the control of contamination during the growth of the cells, but it allows lower yields. Yields aren’t that low, but they could be better. You can extend the time of fermentation by feeding the cellsàfed fermentation. 2. Fed batch fermentation : allungamento dei tempi di fermentazione in un sistema chiuso ma che permette l’alimentazione (fed) delle cellule durante questi periodi estesi di fermentazione (settimane o mesi). In questo caso, nel bioreattore abbiamo modo di aggiungere i nutrienti. Anche qui il prodotto si raccoglie alla fine della fermentazione. Vantaggio: le rese sono maggiori; viene utilizzato da molte industrie. With mammalian cells this is the favorite kind of fermentation. This kind of fermentation allows to extend the time of fermentation, it’s some weeks long. 3. Continuous fermentation : sistema aperto dove i tempi sono ancora più lunghi; il sistema continua ad aggiungere substrati per l’alimentazione delle cellule e in linea si raccolgono anche i prodotti (anche durante la fermentazione, non solo alla fine). Svantaggio: il rischio di contaminazione è maggiore; non viene fatto a meno che non si abbia bisogno di tempi più lunghi, rese maggiori o quando si ha un prodotto particolarmente fragile. It’s more complicated, but it can be done in some cases. You continuously feed the system, and the harvest is also made in the system. It can be done with some particular type of cells. 38 Culture media and other materials Nel fermentatore noi mettiamo: acqua, pellet e nutrienti necessari alle cellule. La qualità del mezzo di coltura e dei materiali grezzi che si utilizzano sono importanti e vanno controllati e riportati nella documentazione necessaria del prodotto. Va documentata anche la tracciabilità dei materiali che si utilizzano perché la presenza di contaminanti può derivare anche da una errata formulazione dei mezzi di coltura e materiali grezzi. Extraction and purification are problems that are very correlated to the type of cells and proteins. Companies making biologics might have tiny amount also of organic solvents, but always less that companies that are making small molecules. The origin of the material should be known and tracible. It’s also important to guarantee the reproducibility of the processes. PROCESS CHARACTERISATION The goal of this stage is to design a process suitable for routine commercial manufacturing that can consistently deliver an active substance that meets its quality attributes. Process characterisation includes 1. process development: studies to reach a potential design of a future manufacturing process; 2. process evaluation: studies performed at small and/or commercial scale, to provide evidence that the complete manufacturing process and each step/operating unit have been appropriately designed Process verification Studies to confirm that the final manufacturing process performs effectively in routine manufacture is able to produce an active substance or intermediate of the desired quality on an appropriate number of consecutive batches produced with the commercial process and scale Process validation should not be viewed as a one-time event but continue through the lifecycle of the product 39 Culture Modes Animal cell cultures are normally grown in stainless steel, stirred tank bioreactors. Un’altra cosa importante nella coltura delle cellule è il tipo di reattori che si utilizzano: stirred tank bioreactors : sono sistemi in acciaio con un agitatore all’interno; Sterilization Parte importante di questi sistemi. Ci sono due tipi di metodi che vanno utilizzati nel momento più adatto e non devono danneggiare la proteina prodotta. When you use chemical methods you have to consider what could harm your protein. Process characterization The goal of this stage is to design a process suitable for routine commercial manufacturing thet can consistently deliver an active substance that meets its quality attributes. Process characterizaziont includes: - Process development - Process evaluation The process verification is also very important - Studies to confirm that the final manufacturing process performs effectively in routine manufacture - Is able to produce an active substance Points to consider in process characterization and verification Upstream processes Downstream processes Multifacility production The row materials that are used in the production can be different and this has an effect in the final characterization Bioprocesing Descrizione delle 3 parti classiche del bioprocessing di biologici: 40  - Upstream processing; - Cell harvesting (raccolta); - Downstream processing (quello che succede dopo la raccolta delle cellule). NB: questi termini sono validi per ogni cellula e fermentazione che utilizziamo. This scheme could be used for all cells in the fermentation. But actually is more specific for some type of cells, which kind? Mammalian cellsà the virus removal is typical of the mammalian cells, because they could be already infected or can become infected so there’s almost always this passage where we remove the viruses. Also, another suggestion that it’s a scheme mainly for mammalian cells is that there’s a capture chromatography which is actually affinity chromatography. In the downstream part you usually have to characterize the physical and chemical characteritics of the protein. In questo esempio si vogliono produrre anticorpi: si ha la presenza di cellule di mammifero nel bioreattore e di particolari passaggi durante la filtrazione (per eliminare i virus). Il resto del processo rimane quasi uguale per tutte le cellule: - Cellule mammifero: basta una centrifugazione e filtrazione per separare la massa (cellule) dal surnatante che contiene la proteina. - Cellule batteriche: recuperiamo la biomassa, scartiamo il surnatante e lavoriamo sulle cellule per lisarle e raccogliere la proteina. 1. Upstream Processing à definisce tutti i processi: messa a punto del sistema di banche cellulari, formazione del seed-lot, fermentazione fino alla raccolta (cioè tutto ciò che accade nel bioreattore). Parametri importanti da considerare: - Sistemi di espressione; - Mezzi di coltura cellulare (adattato al sistema di espressione); - Disegno del processo di coltura cellulare; - Ottimizzazione del processo di coltura cellulare; - Raccolta. Le cellule di espressione di mammiferi che si utilizzano maggiormente per mAb e fattori di crescita sono: 41  à cellule di roditori, non sono umane. Cellule ampiamente ingegnerizzate: sono stati inseriti degli elementi genetici modificati per ottenere migliori rese (sono rese più adatte alla produzione industriale senza siero animale). à i lieviti, pur essendo cellule eucariotiche, a meno che non siano ingegnerizzate non sono utilizzate per la produzione di glicoproteine perché possono avere un utilizzo di catene zuccherine non tipiche dei mammiferi: otteniamo glicosilazioni non corrette! Cell culture process design Cell culture process design (Mammalian cells): robust and reproducible cell culture process - anchorage dependent (roller bottles) - suspension (bioreactor, usually scalable continuous stirred tank reactors or CSTR (preferred industrial format): allows easy cleaning in place (CIP) and sterilization in place (SIP) procedures - batch process: standard procedure - fed-batch: concentrated solutions of cell culture additives are added (fed) during the cultivation: higher product yield Manufacturing Platform Considerando i tempi di espressione, possiamo notare due istogrammi relativi alle piattaforme di cellule (manufacturing platform): sono stati analizzati quali sono i sistemi di espressione più utilizzati a livello industriale in anni diversi. Altri istogrammi di anni precisi o cumulativi dove viene mostrato quali sono stati i sistemi di espressione più utilizzati: uno di quelli più usati sono le CHO. All’inizio delle biotech i sistemi preferiti erano quelli di non mammifero; con l’evoluzione delle biotecnologie ci si è interessati sempre più alle cellule di mammifero fino a superare batteri e lieviti. This reflects the fact that the proteins made were simple proteins non-glycosilated. Mammalian cells have different advantages, they have lower yields, but many other advatages. They can be used to make new design proteins, not substitution-proteins. 42 Cell line transfection and selection —> le CHO sono diventate lo standard di cellule di mammifero per la produzione di proteine ricombinanti. Ne esistono altre come NS0, BHK ecc, che sono alternative interessanti che permettono un pattern di glicosilazione umano. —> tutte queste cellule devono essere in grado di rimanere in sospensione per crescere. Le differenti linee cellulari chiamate CHO derivano tutte da una cellula iniziale che nel 1956 è stata immortalizzata. Da quel momento in poi sono state isolate linee diverse, anche dal punto di vista genomico. What is very adact to grow in culture are tumor cells, some types of cells are very difficult to grow in culture. Alla fine si sono ottenute delle linee cellulari, in qualche caso ulteriormente modificate, che sono delle vere e proprie piattaforme cellulari per ottenere delle proteine ad alto valore. Le caratteristiche principali stanno nella diversificazione genetica, per permettere una buona coltura cellulare. DBX11 e BG44 (evidenziati con frecce viola) sono due ceppi volutamente privati del gene che codifica per l’idrofolato reduttasi (DHFR). They were adapted to grow: - In suspension culture - Sereum-free and chemically defined (animal-free) media 43  - DHFR strains and MTX induced gene amplification: DHFR is in the vector. Only the cell that have incorporated the plasmid will have the gene. You use only the cells which are the host vector system. The serum is particularly important because it boost the growth of the cells. Why is this absolutely banned in mammalian cell culture whit proteins that have to be injected into the patient? The serums are purified but they might contain viruses that can be harmful. The animals can be source of viruses, possible pathogenic contaminants. Another reason is about reproducibility. If we put serum it’s not highly reproducibleàthis cause the serums might have different characteristics and the contents of the supplementations can be very different from batch to batch. Vedi infographic of the CHO CHO allows glycosylation, they’re not the fastest cell line. CHO-S cells are adapted for suspension culture. They’re able to grow even without serum. 03/12 L’inibizione della DHFR da parte del metotressato blocca la produzione dell’acido folico e questo blocca la produzione di basi azotate à la cellula non può replicarsi e quindi funziona da antitumorale. Il blocco rende impossibile la produzione di timidina. The idea is to couple the codifying the gene coding for your protein with the gene codifying for DHFR. The goal was to take out the gene and have something that can be transfected. Gene amplification is another context: you can exploit the DHFR complementing system with methotrexate with gene amplification. They’re different, one is selection, and one is gene amplification. You need to know which of the clones will be able to express the protein. Then you extract the protein, and you measure it, for each and every one of them. Here come the MTX and the gene amplification. Instead of looking how much of protein is made by every single clone, you look at how much DHFR is made by the clones. You can establish a system of analysis that is related to DHFR. I take each of the clones and I put them to grow in a liquid media and each one of them will grow. What happens to them? Blocking DHFR cells cannot grow, but some cells might have more DHFR in them, so the little concentration of methotrexate still make them to grow. It’s a way to amplify those genes in a low concentration of MTX. Then you take the cells, and you put them in a media with even more MTX. By doing that you select cells which have more amplification of DHFR and therefor of your gene of interest. 1986 is a milestone, because it markers the entrance of a life-saving protein in the marketàActivase. Amplifiable genes: how to exploit them in biotech Ci sono altri sistemi che vengono ingegnerizzati con l’ablazione di altri geni. Questa tabella, inoltre, riporta gli inibitori specifici di quegli enzimi: l’inibitore del DHFR è il metotressato. 44  —> enzima importante in un ciclo biochimico e necessario per la sintesi di mediatori della sintesi del DNA e proteica. Co-amplification Il gene è stato tolto dalle cellule che vengono transfettate con il plasmide, quindi non possono crescere a meno che non riusciamo a donare il gene mancante alla cellula dall’esterno. Esempio: la cellula non ha il DHFR (DHFR-) ma noi possiamo inserire il gene all’interno del plasmide che introduciamo all’interno della cellula, la qulae crescerà e diventerà DHFR+. A questo punto selezioniamo le cellule contenenti il gene e le facciamo crescere anche a concentrazioni via via crescenti di metotressato. —> selezione delle cellule che crescono in presenza dell’inibitore (solo quelle che esprimono grandi quantità della proteina che deriva dal gene). Questa selezione si chiama anche co-amplificazione. Questo è importante perchè quando trasfettiamo una popolazione di cellule con un gene, i cloni che otteniamo non sono tutti uguali! Alcuni avranno il gene posizionato in maniera tale da essere trascritti attivamente —> producono più proteina —> clone di nostro interesse! Come facciamo? Nel plasmide ricombinante inseriamo il gene DHFR (mancante nell’ospite) e lo posizioniamo molto vicino al gene YFG (your favourite gene) che codifica per la proteina che vogliamo. Questo è il motivo per cui sono state create le piattaforme cellulari mancanti di alcuni geni. Gene Amplification Tecnica utilizzata in biologia molecolare. —> amplifichiamo le cellule che hanno un vantaggio rispetto ad altre. —> quelle che hanno un numero di copie maggiore di DHFR hanno anche livelli maggiori della proteina che volevamo produrre. 45  Il sistema DHFR non è l’unico! à tutto questo serve ad ottenere cloni che abbiano livelli di produzione della proteina più alti. UPSTREAM PROCESSING —> in tutti i casi i sistemi di espressione vanno ottimizzati. 46  —> più complessa è la cellula più lo sono i mezzi di coltura. —> elemento caratteristico nella formulazione dei mezzi di coltura con cellule di mammifero è il siero, che deriva soprattuto da bovini. A livello industriale il problema del siero è che possono essere presenti dei contaminati virali (deriva da animali che posso essere infettati da virus); inoltre si ha una variabilità ogni volta che viene comprato: essendo raccolto da animali diversi in tempi diversi, i sieri non sono uguali! Questo è un problema enorme dal punto di visto industriale perchè viene a mancare la consistenza! Per questo motivo il siero è stato rimpiazzato da serum-free-chemically defined media, ovvero mezzi di coltura privi di siero e definiti chimicamente. Un altro vantaggio di questi mezzi è la riduzione del contenuto di proteine nel mezzo di coltura, che facilita quindi la purificazione una volta ottenuta la proteina di nostro interesse. —> bioreattori che permettono procedure di pulitura e sterilizzazione facili del bioreattore stesso. Disposable technologies in upstream production: Single-use bioreactors Negli ultimi anni sono state inventate delle tecnologie usa e getta nella produzione di proteine terapeutiche: i single-use bioreactors (SB). Questi reattori sono più piccoli di quelli normali e hanno avuto successo perché permettevano una serie di vantaggi economici mantenendo ottime produzioni. —> inizialmente si utilizzavano per niche application: veniva usato per un preciso passaggio (qui si parla di seed vessel); 47 Vantaggi: non vanno puliti e sterilizzati (evitiamo tutti i problemi di contaminazione e i costi di pulizia); è un sistema molto flessibile; ecc. Si ha una piastra dove viene messo il SB (camera di coltura) caricato con le cellule e i mezzi di coltura e gonfiato con gas controllati —> iniziamo con l’agitazione. Il movimento è molto lento per consentire alle cellule di rimanere in agitazione e di crescere. Come si può sviluppare questa idea in scala industriale? La cosa disposable è il sacco di plastica: un contenitore fatto di un materiale molto raffinato è la parte single use. Tutto il resto rimane fisso. Si ha quindi un bidone di acciaio con un sacco di plastica gonfiato all’interno —> contatto delle cellule del liquido con il sacco e non con l’acciaio. BPC: sono i sacchi di plastica utilizzati per questi bioreattori. 2. Cell Harvesting I sistemi che si usano per separare le cellule dalla coltura sono i classici filtrazione, centrifugazione, o una colonna cromatografia espansa di size exclusion. 48  Tutte queste tecniche vanno adattate a volumi imponenti (industriali). Dopo l’harvest di ottiene il microfiltrato e si inizia il processo di purificazione, il downstream processing. 3. Downstream processing Le tecniche che si utilizzano sono le classiche tecniche di purificazione delle proteine, quindi cromatografie, alternate da passaggi di filtrazione, concentrazione, cambio del tampone ecc. Sono tecniche adattate alla proteina e ai tipi contaminanti. Four main section: 1. Primary recovery: purificazione della proteina grezza da contaminanti principiali; you take everything after the harvest, and you make a rough initial purification. 2. Viral clearance: questo passaggio si ha quando stiamo purificando una proteina espressa in cellule di mammifero (animali) —> dobbiamo eliminare i virus; only in mammalian cells. This is a low pH step, you obtain a condition that inactivates the virus by lowering the pH to 3-4. 3. Purification and polishing: purificazione più fine della proteina per arrivare a percentuali dettate da agenzie regolatorie e farmacopee. This means you make a lot of steps by purification and chromatography depending on the contaminants that you have. Polishing gives the idea of something that is pure enough. 4. Formulation of drug: spesso viene fatto in altri dipartimenti fisici. Come possiamo applicare le tecniche che consociamo alla purificazione della nostra proteina ricombinante che diventa un biologico. Il tipico protocollo di recovery e purificazione (questo riguarda mAbs, ma può essere adattato anche ad altri tipi di proteine) è il seguente: à capture step: la cattura della proteina (in questo caso Ab) si fa con la proteina A: proteina batterica che lega la parte costante Fab degli anticorpi IgG. Abbiamo quindi la resina funzionalizzata con la proteina A. Oltre a questo, la proteina A serve anche per ridurre il volume: facciamo passare tutta la miscela da purificare e dopo di che eludiamo l’anticorpo con il volume desiderato. Questa cromatografia può essere quindi adattata in base al tipo di proteina che dobbiamo andare a purificare! NB: spesso le proteine utilizzate nell’industria di produzione dei biologici sono ricombinanti a loro volta, per evitare l’estrazione da organismi viventi che può portare alla presenza di contaminanti pericolosi. —> inattivazione virale: perché è una purificazione di proteine derivanti da cellule di mammifero. Questo passaggio è abbastanza semplice: serve solo abbassare il pH del tampone, a cui segue poi un passaggio di filtrazione e neutralizzazione. NB: con il cambio di pH può essere che la proteina che stiamo purificando si denaturi e se la denaturazione è irreversibile e neutralizzando non ritorna al suo corretto folding, va buttata. 49 Why do people do this step even if there are no proofs that there are viruses? Maybe cause the test might fail. They can be latent or hidden. The viral clearance step is mandatory. Usually after this step there are two steps of ion exchange chromatography to remove aggregates of the protein that are a big concern on the manufacturing of the protein. The changing pH might alter the conformation of the protein. When the pH is low and the protein is slightly denaturized. Also, proteins are not always that soluble so they might aggregate, aggregations are immunogenic. —> la cromatografia a scambio ionico serve a purificare dai contaminati come aggregati (se la proteina si denatura con il pH si possono formare aggregati), DNA dell’ospite (alcune cellule possono essere lisate, rilasciando componente cellulare, tra cui il genoma. RNA non viene citato perché in queste condizioni probabilmente si frammenta), HCP (proteine dell’ospite: utilizzando cellule viventi esse hanno i loro sistemi, e alcune proteine possono riversarsi nella miscela, soprattutto se sono batteri e vengono lisati). —> rimozione di DNA, HCP, endotossine (possibili pirogeni; posso essere presenti sia in batteri che in altri tipi di cellule) e proteina A (i componenti della resina, in questo caso proteina A, possono essere rilasciati e trovarsi nel sistema, dobbiamo budini prevedere la purificazione anche di essi che potrebbero essere immunogeni come in questo caso). The anion exchange chromatography is used to remove something that still can be immunogenic. What is that? Could be part of a membrane if you’re not gentle during the process or whole cell proteins. It could be HCPà Host Cell Proteins. Also there could be DNA residues. —> in qualche caso ci può essere più di un passaggio di questo tipo, a seconda che il virus sia envelope o non envelope, dobbiamo quindi adattarlo al tipo di virus. —> ultra/diafiltrazione: passaggi utili per rimuovere eventuali virus o per cambiare tamponi per eliminare i sali, concentrare la filtrazione (cose che possono essere fatte anche prima) e permettono di portare la soluzione di proteina alla formulazione. Alla fine del downstream e prima della formulazione otteniamo quindi la proteina ricombinante pura, pronta per diventare farmaco. During the process of purification you always loose some of your product. 04/12/24 Contract services in bioprocessing Industrie che lavorano come terzi per altre industrie in vari aspetti del bioprocessing. They manufacture for other companies. The name of the drug will be the beigger company’s one, the one that own the patent. Esistono vari tipi di organizzazioni: CRO: contract research organization —> organizzazioni che fanno ricerca a contratto; CMO: contract manufacturing organization —> organizzazioni di servizio che producono una certa sostanza (nel nostrocaso biologici) secondo tutte le norme richieste e le GMP correnti; 50 CDMO: contract development and manufacturing organization —> nate più di recente, sono aziende che per altri oltre a produrre un certo PA lo sviluppano! In qualche caso partono dallo sviluppo del gene che produrrà una certa proteina, che poi verrà licenziata ad altri produttori. CDO: contract development organization: —> dal 2000 in poi la necessità di avere CMO è cresciuta molto velocemente. —> il motivo di questa crescita è dovuta a molti fattori tra cui: la crescita del mercato dei biologici, l’aumento di progetti di sviluppo dei biologici (pipeline), ecc. questo ha portato ad un aumentato utilizzo di CMO da parte delle industrie. For example, Evotek does CDMO. Outsourcing: other people outside that make them something, they do tasks that the company doesn’t want to do or can’t do. CMO —> contractors (CRO, CMO), outsource production (produzione da parte di altre industrie farmaceutiche: solitamente si fa per limitare il rischio e ridurre l’investimento —> motivi economici). —> in house (fanno tutti da soli) e outsource (fanno fare da altri). Passaggio da CMO a CDMO Tutto ciò ha portato ad avere delle industrie farmaceutiche “virtuali” che esistono solo dal punto di vista fiscale e i cui prodotti sono fatti tutti da industrie CDMO. 51  —> a volteanche le industrie capaci di fare ricerca e sviluppo preferiscono in alcuni casi fare outsourcing per alcuni progetti specifici. La conseguenza di tutto questo (conseguenza di un mercato vivave) è l’esistenza di moltissime CMO e CDMO, come ad esempio samsung biologics: questa azienda ha servizi di sviluppo, di produzione e analitici (3 aree di interesse per avere una corretta ricerca e sviluppo di nuove entità molecolari con fini terapeutici). Questa azienda sviluppa anche linee cellulari per la produzione di biologici. Esistono mezzi di coltura basali, cioè dove la cellula si riproduce, e i feed, quelli aggiunti mano a mano (messi a punto e sviluppati nel process development della produzione). Samsung biologics ha una sua proprietary cell line che hanno chiamato S-CHOice e CHZON —> investono sulle CHO per lo sviluppo di biologici. Manufacturing services: overview, drug substance, mammalian cell culture; sono in grado di offrire un processo di produzione industriale della sostanza in grandi scale; fanno anche downstream, ecc. Fanno anche small scale se qualcuno è interessato —> grande flessibilità! Fanno tutti i servizi analitici e hanno tutta la parte di qualità. NB: quando le proteine non sono solubili nel citoplasma batterico si chiamano inclusion bodies. 09/12 Downstream (purification) processing Importance In bacteria you have to extract your protein, in mammalian cells you have your protein secreted out in the supernatant. 52  La purificazione deve garantire che il prodotto desiderato abbia una certa purezza, per questo motivo è necessario analizzare tutti i passaggi necessari per controllare la presenza di impurezze, catalogate dalla farmacopea in product related (correlate alla proteina) o process related. Oltre alla farmacopea anche l’EMA ha tutta una serie di linee guida per il controllo della qualità del prodotto: documenti precisi dove vengono indicate tutte le linee guida ecc. Tutto ciò lo troviamo anche su Eudralex (annex 2 vol. 4): Process analytical technology PAT describes a system for: - Designin and controlling manufacturing through timely mesurmeents - For raw and in process material - AGGIUNGO SLIDE Offline you can also store it for future reference. At-line is like the tlc, you take it out and the you do it right there. On-line is something that comes out, but you don’t collect it, it just goes into a stream and then the analysis is made outside, but in a very automatic system, you don’t need sample preparation. In some cases, the sample can return into the container, but in some cases it’s Not a good thig for it to come back. You also have a monitor that permits to check in real-time. Remember the difference from in line and on-line! Tirer & Yield - Definizioni —> titolo della proteina: quantità in massa di un certo agente espresso (proteina nel nostro caso) rispetto al volume totale (volume del liquido che deriva dall’upstream, non quello del bireattore perché essi hanno sempre un volume vuoto in testa per i gas) —> concentrazione g/L. 53  —> la concentrazione caratterizza l’efficienza dell’upstream: maggiore è il titolo migliore è il processo. —> resa della proteina: si riferisce all’efficienza downstream e non ha unità di misura: è un rapporto tra la massa ottenuta alla fine del downstream rispetto alla massa prima della purificazione * Outsourcing: terzi pagati per svolgere qualcosa che può essere utile a qualcuno (ad esempio le industrie biofarmaceutiche possono produrre cose utili per altre industrie). Manufacture of biological medicinal products for human use Siccome utilizziamo organismi viventi per la produzione della proteina possiamo avere una variabilità nei sotto prodotti —> il controllo è fondamentale per evitare la contaminazione. Contaminants of biotech drugs 1. Host related: l’ospite ha un effetto importante sui contaminanti. I contaminanti sono: - Virus: dovuti all’utilizzo di cellule di mammifero; - Host related proteins and DNA: altre proteine chiamate anche HCP (host cell proteins); sono più o meno presenti a seconda del sistema che utilizziamo ma sono quasi sempre presenti; - Glycosilation variants: effetto che poi viene trasferito nel prodotto stesso; i batteri non glicosilano, i lieviti possono dare glicosilazioni non corrette. - N- and C- terminal variants: variazioni della proteina dovuta al fatto che i plasmidi devono essere ingegnerizzati a seconda dell’ospite per permettere tutta una serie di attività (problema risolto ad oggi) e questo potrebbe riflettersi in variazioni al N o C terminale; - Endotoxins (from Gram- bacteria): presenza di pirogeni se si utilizzano cellule batteriche. Sia nel caso in cui il prodotto sia nel brodo di coltura o recuperato dal citoplasma della cellula, ci possono essere contaminanti macromolecolari che appartengono all’ospite. VIRAL SAFETY in ogni caso la sicurezza virale dei prodotti medicinali ottenuti con materiali di origine animale o umana è una preoccupazione di ogni farmacopea, agenzie regolatorie e industrie hanno ben chiara. 54 —> ogni produttore deve fare un risk assestment prima di iniziare il processo di produzione, tenendo presente la necessità di prestare grande attenzione alla sicurezza virale del prodotto. Ci sono molti modi con cui un virus undetected può entrare dei processi di produzione, per questo motivo il risk assestment è basato su diversi aspetti: —> selezione di materiali e test virus free —> si ha anche la necessità di eseguire test analitici durante la produzione, adatti a capire se possibili virus sono presenti e se sono stati rimossi o inattivati (prima, durante e dopo la produzione). Tutte queste informazioni sono dettagliate in alcune linee guida: una delle principali è la ICH Q5A. * ICH = conferenza di più persone che cercano di armonizzare a livello globale tutto ciò che è richiesto dal punto di vista tecnico prima di registrare un qualunque farmaco per uso umano (non è specifico per i biologici). È unico ed è stato messo appunto negli anni 90 per far lavorare insieme le industrie farmaceutiche e gli enti regolatori. Discutono gli aspetti scientifici e tecnici che riguardano i farmaci —> sviluppano ICH guidelines che devono essere armonizzate in tutto il mondo. Linee guida: suddivise in 4 categorie qualità, sicurezza, efficacia e multidisciplinari. - Qualità: sono per i farmaci di sintesi, studi di stabilità, definisce soglie rilevanti ad esempio sulle impurezze ecc. Linee basate sulla qualità farmaceutica secondo l’approccio GMP. Sono molte: le prime sono quelle di stabilità, poi abbiamo validazione analitica, ecc. Quello che ci interessa sono le parti Q5A e Q5E, dedicate ai biotech. - Efficacia (come disegnare e condurre i trial clinici di sicurezza, ecc). Tutte queste linee guida, se necessario, vengono riviste e aggiornate; nel caso dei biotech ci sono sempre aggiornamenti molto importanti. ICH Q5A: Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell ines of human or animal origin. 55 Qui vengono descritti anche quali sono gli IMPs (investigation medicinal products) ovvero prodotti che derivano da linee cellulari di roditori come CHO, NS0, SP2/0 o altre piattaforme cellulari. Review: Viral contamination in biologic manufacture and implications for emerging therapies Articolo dedicato alla contaminazione virale durante la produzione di biologici. È stato messo a punto da un consorzio + MIT per capire meglio come sono avvengono queste contaminazioni. —> nel caso dovesse esserci una contaminazione virale l’industria deve fermare la produzione finché non si capisce da dove è partita la contaminazione. Se l’industria è l’unica che produce quel biologico, si hanno ripercussione anche a livello dei pazienti. Viral contamination of the manufacturing doesn’t happen every time, it’s a rare thing. 56 In questa tabella sono riportate quali sono e quando sono successe contaminazioni virali in cellule di mammifero per la produzione di proteine o vaccini. I numeri non sono altissimi, soprattutto se pensiamo che negli ultimi anni le biotecnologie sono esplose. I virus contaminanti a volte sono conosciuti (herpes, influenza, ecc) a volte no. Quasi sempre sono presenti nelle cellule CHO ma perché queste sono le più utilizzate per la produzione di proteine ricombinanti; ce ne sono altre, come ad esempio cellule umane primarie renali. Il più comune e conosciuto è l’herpes virus. One thing that we want to know is how the virus went in, this table tells also if a particular virus is pathogenic for the human or not. Serum with use chemical media free, serum with chemical media free. People realize that some contamination was made by serum. Undetermined medium component à at some point the didn’t even know where it was. Also, the operator can be a way of contamination. 57 The first method used to detect contamination is PCR, it allows the detection and identification in a relatively easy way. We can also use mass spectrometry. Come vengono analizzate queste contaminazioni? Da dove arrivano i contaminanti? In questa tabella possiamo notare che non tutti i virus sono patologici per l’uomo, ciò non toglie che non possono esserci contaminazioni virali nel batch di produzione. Un’altra cosa che si nota è che nel caso di cellule umane, la contaminazione deriva quasi sempre dall’operatore, più raramente dalla linea cellulare che era già infettata. Per le cellule di roditore, invece, la sorgente di contaminazione più frequente è il siero animale, motivo per cui non si utilizza più; Gli eventi contati possono avvenire in vari livelli: upstream (fermentazione) o downstream (purificazione) oppure, in altri casi, non si sa. IVV: In vitro viral assay (Gombold, J. et al. Systematic evaluation of in vitro and in vivo adventitious virus assays for the detection of viral contamination of cell banks and biological products. Vaccine 32, 2916– 2926 (2014).) Metodi più comuni per eliminare il virus, a seconda del tipo di virus: 58 Viruses can be found, even if it’s a rare event, but there are many different methods that can be used to eliminate them. The method depends also on the virus. Nobody died because of viral contamination of biologics with viruses, because the quality control is strong enough. If they find a contaminant, they shut down the production. Manufacturing shut down: months that manufacturing plants were shut down to virus contaminations. In qualche caso le industrie sono abbastanza veloci a riprendere la produzione, in altri casi possono passare anche diversi mesi. Remember: every step can be a contaminating step, but not the patient administration. Animal cells and cells lines are often used as synonyms, when you say cells lines you don’t refer to bacteria cells usually. Using only human cell lines in the production of biologics can be even more dangerous. Viral contamination - Detection problems: very low concentrations (magari un girono non li vediamo ma il giorno dopo si sono replicati e sono molti di più), latency; - Origin: anila serum, infected cell lines, purification (regenerated columns), handling. - Inactivation: physical and chemical methods Abbiamo detto che: Contaminants of biotech drugs - Host-related - Process-related - Product-related Abbiamo viso I contaminats host related, ora vedremo i process-related e i product related. 2. Process Related contamination —> (EMA) contaminazioni legate all’ospite ma tipiche del processo; —> sali che potrebbero essere utilizzati in processi cromatografici; NB: leachables, categoria di contaminanti. fa sapere tutto ciò che devi usare durante questi step. 59 Storage and the problem of extractables and leachables Mini-Review: on developing a process for conducting extractable-leachable assessment of components used for storage of biopharmaceuticals Leachableà something that leach when is in contact. If you extract something you have already an idea of what extractable are, anyway is usually an aggressive condition. Time is the one that actually is in favor of leaching something, during the shelf time of something they might leach. Two categories that belongs to the containers, part of the processes that could be leached. ì Video: BioPharMoore Episode 4 (ce l’ha fatto Vedere) Pur derivando dal processo (componenti del sistema come valvole, storage bags, single uses, ecc) queste impurezze vengono definite product-related: nel caso dei prodotti biotech diventano impurezze product related, perché interagiscono con la proteina e possono cambiarne conformazione, attività e sicurezza. —> rilasciate da un componente del processo (sono estratti in condizioni aggressive) —> sottoclasse degli esxtractables: sono più subdole perchè non richiedono condizioni aggressive. Definizioni FDA Extractables: compounds that can be extracted from the container closure system when in the presence of a solvent (può anche essere acqua); possono formarsi addotti tra questi composti e la proteina. Leachables: compounds that leach into the drug product formulation from the container closure as a result of direct contact with the formulation. 60 NB: questi eventi sono inattesi, difficili da predire e controllare! Per questo motivo le industrie prestano grandissima attenzione a questi due contaminanti Novel drug-delivery technologies such as prefilled syringes and pen-injector systems have also necessitated scrutiny of leachables as new materials are introduced to product contact. These devices consist of components such as plungers, stoppers, lined seals, and needles, each having the potential to leach chemicals into the drug product formulation. Additionally, these components utilize lubricants such as a silicone oil to coat the internal surface of the syringe barrel to ease motion of the plunger. Silicone oil is also applied to the exteriors of the hypodermic needle to ease movement through the epidermis during subcutaneous injections. L’uso di nuove tecnologie, come il single use, ha creato nuove sfide: capire come i materiali hanno un impatto nel sistema. Si ha la necessità di avere sistemi analitici sensibili che permettano di determinare quantitativamente e qualitativamente la presenza di contaminanti. Questi cambiamenti hanno portato ad evitare una serie di incidenti di contaminazione da componenti del sistema (siringhe, vials ecc). Oggi ci sono nuove attenzioni anche per i materiali di confezionamento dei biologici. Esempio: anche le vial dove sono contenuti i farmaci sono fatte di vetro; quindi, anche la qualità del vetro è molto importante! Non solo il farmaco in sé può essere tossico, ma anche tutte le plastiche, gomme, reattori che entrano a contatto con la proteina e reagiscono con essa, formando addotti che portano a tossicità. There were many cases of epoietin-associated pure red-cell aplasia. They had very nasty reactions and at the end they understood that it was a phenolic derivative that leached from the rubber stopper, used in prefilled syringes, into the formulation were postulated to be a causative agent for the immunogenic response observed. There’s a group that is working on new regulations/a new guideline on how to handle impurities and extractables and leachables. Disk stack centrifuges à vedi slides If you don’t control the system of your production and purification a good protein can become a bad protein. 11/12 3. Product related Alcune delle principali probabilità di contaminazioni sono: —> mutazioni della sequenza della proteina Questo elenco fa capire che le contaminazioni derivano dalle modifiche (anche post traduzionali, come la glicosilazione) che dipendono dal sistema, ad esempio quando non ci sono le condizioni adatte, e che si riflettono nella modifica della proteina stessa. Bisogna prestare quindi molta attenzione alle condizioni in cui si trova la proteina perché l’ambiente, dalla scelta del sistema ospite al vetro delle vials del prodotto finito, può influire modificando la proteina —> i farmaci biotech sono sensibili e possono avere una varietà di conformazioni e stadi che hanno un effetto importante su attività e tossicità del biologico stesso. 61 Farmacopea Europea: ha una parte dedicata a questo tipo di contaminazioni. La possibilità di avere delle varianti proteiche può portare ad un profilo diverso che consiste in svariate isoforme —> eterogeneità. Quando attività, sicurezza ed efficacia di queste varianti sono paragonabili a quelle del prodotto desiderato allora le varianti sono paragonabili al prodotto stesso, ma se questo non succede e la modifica ha un impatto su attività, sicurezza ed efficacia allora a quel punto la variante diventa impurezza. In quest’ultimo caso, il prodotto va controllato analiticamente per individuare e determinare le varianti. Spesso si utilizza una combinazione di sistemi analitici quali cromatografici, spettroscopici, ecc. Possiamo anche sfruttare la carica delle varianti (come varianti sialilate o deamidate)! La proteina si può trasformare da monomero in dimero o in oligomeri più grandi tramite aggregazione —> si ha la necessità di avere sistemi di separazione adatti e metodi sensibili di rilevazione di questi aggregati. I sistemi analitici, quindi, sono tanto vari quando varie sono le possibili varianti delle proteine. Quality control of biotech drugs Ci sono due tipi di forze nelle proteine: quelle covalenti e quelle non covalenti. Ogni volta che mettiamo la proteina in un ambiente diverso, i fattori ambientali possono influire su queste forze e cambiare la reazione. La proteina, anche in condizioni normali va incontro a cambiamenti...si dice la proteina respiri. “non covalent changes”à sono visti come cambiamenti fisici e non chimici. Quelli chimici sono molto drastici. Meccanismi coinvolti nella degradazione irreversibile. L’idea di fondo della degradazione è la “perdita di pezzi”, in quanto la degradazione, chimicamente, è un’idrolisi o proteolisi. Osservando le due categorie (cambi covalenti e non) in quelli covalenti si ha la perdita di qualcosa, mentre in quelli non 62 covalenti si ha la formazione di aggregati proteici che possono portare ad adsorbimento sulle superfici e precipitazione. Si possono formare in tutti gli step di purificazione e di storage della molecola. NB: spesso i cambi covalenti e non covalenti possono essere anche accoppiati! Questi cambi derivano da proteine che sono parzialmente o totalmente unfolded. Mechanical forces, such as shacking, shearing and pressure may denature proteins. The shaking might lead to aggregation and precipitation. Proteins are very sensible of mechanical stress. La degradazione irreversibile deriva quindi dalla proteina nativa: questa ha solitamente degli equilibri di folding e unfolding, se le condizioni in cui è posta non sono corrette, questo equilibrio può essere spostato verso la forma unfolded che può andare incontro alle modifiche riportate. La glicosilazione di un biologico va caratterizzata, è quindi parte del processo di caratterizzazione della sostanza, e dovrebbe dare informazioni sulla composizione quali-quantitativa dei monosaccaridi e sulla struttura della catena polisaccaridica (dimensione, ramificazione, legami coinvolti, ecc). 63 Protein Aggregation La formazione di aggregati proteici è una forma di degradazione grave di cui non si ha avuto subito cura; negli anni ha però assunto un’importanza sempre più ampia: ci sono condizioni anche non apparenti in cui si formano aggregati non fisiologici che hanno un’impatto su qualità ed efficacia del prodotto stesso. Review Protein aggregation: pathways, induction factor and analysis L’aggregazione delle proteine può accadere in vari punti del processo e questi aggregati possono essere di quantità e qualità diversa (dimensioni, forma e morfologia). E’ importante quindi capire che interazioni li tengono insieme, perchè si sono formati ed è importante caratterizzarli. Questa review dà outline su pathway e metodi di aggregazione delle proteine. NB: questi meccanismi sono di interesse anche pato-fisiologico. —> è più probabile che si formino negli ultimi passaggi ma le condizioni a contorno possono indurre aggregazione anche durante la fermentazione. —> è necessaria la quantificazione per i limiti stabiliti dalle farmacopee; —> gli effetti avversi sono principalmente risposta immunitaria; —> le particelle di aggregati possono anche non essere visibili! Purification is the most common step in forming aggregates. During purification you lower the ph and so you bring your protein into a non-physiological environment that can lead to aggregation. Classificazione degli aggregati —> i legami non covalenti sono dati anche da forze idrofobiche. They’re bound by electrostatic forces. —> ci sono anche molti aggregati irreversibili che non possono essere rinaturati; —> possiamo avere aggregati con una parte di struttura nativa + altri con strutture non attive (come fibrille). 64 Review Come controllare l’aggregazione proteica per mantenerla ad un livello accettabile? Fattori estrinseci di cui va conosciuto l’effetto su una particolare proteina: - Fermentation/expression (host cell: inclusion bodies, glycosilation); - Unfolding/folding causati da variazioni di pH o del solvente che utilizziamo; - Purificazione (low pH may induce aggregation); - Freeze-thaw (selective crystallization of buffering components); - Shaking and shearing; - Pressurization (high pressure could cause protein unfolding and facilitate protein aggregation due tu increased hydrophilic interactions): processi meccanici; - Drying; If it’s an extrinsic factor that comes from outside you can control it. The protein aggregation factors depend on specific protein. It’s diffuclt to have an algorithm that can predict these changes in those particular conditions. Gli effetti relativi dell’ambiente possono essere diversi da proteina a proteina — > le linee guida dell’EMA sono fatte su categorie di proteine. —> vanno comunque definite regole universali —> approccio studiato e messo a punto per quel particolare tipo di proteina Possibili tecniche analitiche utilizzabili per analizzare la presenza di aggregati proteici: a seconda della dimensione dell’aggregato abbiamo una linea guida che ci indica il metodo più adatto da utilizzare. NB: il light scattering viene quasi sempre utilizzato. It’s impossible to eliminate all form of aggregation. Contaminants and aggregates cannot be completely eliminated. To the best of our knowledge, we eliminated all the ones that we could, but there can be more. We also have to think that often the sensibility of our tool is not that sensitive to allow us to eliminate all of them. 65 AGGIUNGO SLIDES: IMPORTANCE OF PROCESS IN BLA MANUFACTORING It’s a paper very well written, it talks about real-life cases and the importance of events in the process of manufacturing biologics. It has case studies; lots of thing can go wrong. 16/12 Effetti avversi di prodotti biotecnologici Le proteine umane sono comunque ottenute e purificate dalle nostre cellule, nelle condizioni migliori ma non in quelle totalmente fisiologiche —> possono avere modifiche che vengono viste dal nostro organismo come non self e usare risposta immunogenica. Review Impact of product-related factors on immunogenicity of biotherapeutics: Antigenicity and Immunogenicity The terms are used interchangeably, but they actually have specific meanings. Questi termini sono spesso interscambiati ma hanno un loro specifico significato. —> riferito alla molecola —> riferito alla reazione; a livello molecolare tutto ciò (antigenicità) si riflette sul sistema immunitario del paziente. I biologici sono farmaci importanti che inducono risposte immunitarie umorali e cellulari. —> apparenza transiente di anticorpi contro il farmaco (togliendo il farmaco scompare; soprattutto per uso cronico). Questa risposta si chiama ADA (anti-drug antibodies): il paziente sente le proteine ricombinanti come non totalmente umane —> diminuisce l’efficacia del farmaco. —> reazioni severe come ipersensività e, in qualche caso, induzione di autoimmunità al farmaco, che si riflette poi con la neutralizzazione di forme endogene delle proteine. Si ha la neutralizzazione non solo della proteina somministrata, ma anche di quella prodotta dal nostro organismo à così si sviluppa l’autoimmunità. 66 Le forme endogene della proteina sono i biologici che sostituiscono proteine mancanti o carenti nel paziente: caso visto per alcune eritropoietine (proteine endogene prodotte in risposta all’ipossia); sono biologici abbastanza comuni in alcune condizioni, ma se hanno qualche modifica (come glicosilazione non controllata) possono dare ADA o formare anticorpi neutralizzanti anche per la bassa quantità di eritropoietina endogena prodotta dal paziente. Ogni produttore deve fare uno studio sulla possibile immunogenicità della proteina. Minimizzare l’immunogenicità delle proteine terapeutiche La prima da fare cosa per evitare questo tipo di conseguenze. Questa review suggerisce strategie utilizzate anni fa (2004) per ridurre l’immunogenicità dei biologici. AGGIUNGO SLIDE: AN EXAMPLE OF A STRATEGY FOR IMMUNOGENICITY ASSESMENT Immunogenicity risk assessment 1. Variables affecting incidence of ADAs 2. Variables affecting risk of consequences of ADAs 3. Impact of ADAs on patient safety —> aumentare il contenuto di sequenze umane della proteina biologica (i biologici di anni fa derivavano da sequenze animali); questa risposta (HAMA response) è stata corretta ingegnerizzando i mAb e riducendo le sequenze non umane. Al tempo si erano provati dei candidati chimerici, quindi, non c’era tutto umano e poteva creare problemi. —> miglioramento della solubilità delle proteine: non tutte le proteine sono molto idrosolubili (esempio: eritropioetina ha una parte proteica abbastanza lipofila ma è molto glicosilata e questo aumenta la solubilità). La presenza di parti della proteina capace di formare ponti H con acqua aumenta la solubilità e diminuisce l’aggregazione delle proteine. Questo è il motivo per cui tante proteine anche a medio PM vengono prodotte in cellule di mammifero (così vengono glicosilate). —> in qualche caso riconoscendo gli epitopi antigienici di un farmaco possiamo rimuoverli; processo molto complesso perchè spesso i biologici sono nuove molecole o modificate. —> anche la PEGilazione (modifica chimica fatta dopo la produzione ricombinante) aumenta la solubilità (< immunogenicità); la PEGilazione forma uno scudo intorno alla proteina grazie al quale aumenta la solubilità e diminuisce l’immunogenicità della proteina stessa (maschera epitopi antigenici). The most immunogenic route of administration is usually the subcutaneous. Sometimes the lower doses can be more immunogenic than higher ones. Re-engineering antibody molecules: - Chimerisation - Humanization (where only the antigen-combing***) - Expression of combination libraries in bacteriophages 67  - Expression of human IgG constructs in transgenic mice Impact of Product-Related factors on immunogenicity of biotherapeutics The product related factors are important because we can do something for them, we can control them. - Struttura della proteina: presenza di sequenze non umane, modifiche post-traduzionali (come la glicosilazione non corretta) o chimiche, presenza di epitopi riconosciuti dalle cellule T. - Parametri di qualità del prodotto: come viene fatto, in che condizioni, possibilità di ottenere isoforme, possibili degradazioni chimiche e fisiche. - Contaminanti e impurità che derivano dall’ospite. CMC-related factors: fattori correlati a chimica, manufacturing (produzione) e controllo; altro modo per chiamare i product related factors. (chemistry-manufactoring-control) The CMC factors can therefore be broken into four general elements that cover a range of attributes with potential to impact immunogenicity, given in Table 2. Elementi di impatto sull’immunogenicità: Selezione della linea cellulare che esprime la molecola (host): varianti, prodotti di degradazion, hotspot di aggregazione, glicosilazione, ecc. - Upstream processing: - Downstream processing: - Drug product: formulazione, leachables, ecc. LEGGI SLIDES SU CMC 68  - Alcuni attributi dell’immunogenicità possono essere analizzati con alcuni metodi analitici. Anche EMA ha moltissime linee guida e papers sull’immunogenicità. Una di queste riporta: - Therapeutic proteins are recognized by the human immune system. - This recognition is often followed by an immune response to therapeutic proteins. - This potentially harmful immune response is complex and, in addition to ADA formation, involves T cell activation and innate immune responses. - The consequences of an immune reaction to a therapeutic protein range from transient appearance of ADAs without any clinical significance to severe life- threatening conditions. - Potential clinical consequences of an unwanted immune response include - loss of efficacy of the therapeutic protein, - serious acute immune effects such as anaphylaxis, and, - for therapeutic proteins used for substitution, cross-reactivity with the endogenous counterpart. 69 Tabella con tutte le possibili variabili che hanno un effetto sull’incidenza di ADA EMA - European Medicines Agency The European Medicines Agency (EMA) is a decentralised agency of the European Union (EU), located in Amsterdam. It began operating in 1995. The Agency is responsible for the scientific evaluation, supervision and safety monitoring of medicines in the EU. EMA protects public and animal health in EU Member States, as well as the countries of the European Economic Area, by ensuring that all medicines available on the EU market are safe, effective and of high quality. EMA provides member states with information on regulatory topics in the three main stages of the medicinal product lifecycle. All users can find information as easily as possible. The three main sections are: - Research and development - Marketing authorization - Post-authorization 70