Tema 9 - Replicación (7p) PDF

Tema-9-replicacion.pdf Mayana09 Bioquímica 1º Grado en Veterinaria Facultad de Veterinaria Universidad de León Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obr...

Tema-9-replicacion.pdf Mayana09 Bioquímica 1º Grado en Veterinaria Facultad de Veterinaria Universidad de León Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Replicación - La información contenida en los genes debe transferirse desde una célula progenitora a toda su descendencia. Esto se lleva a cabo mediante la replicación del ADN, proceso que permite a las células hijas contener la misma información genética que la célula progenitora. - El proceso es similar en procariotas y en eucariotas: cada hebra de la doble hélice se separa y actúa como molde para la síntesis de una nueva cadena que posee una secuencia de bases complementarias. - La replicación del ADN es semiconservativa, pues en cada una de las dobles hélices hijas, se conserva una cadena original de la doble hélice original, mientras que la otra cadena se sintetiza en el nuevo proceso. - El mecanismo general de la replicación fue intuido por Watson y Crick, cuando establecieron la estructura de doble hélice y la complementariedad de las bases. Propusieron que la doble hélice de ADN se abre y las dos cadenas de nucleótidos se separan; a partir de cada una de ellas se forma una nueva complementaria a la que ha servido de patrón. I. Generalidades - La replicación es un proceso semiconservativo - El ADN se desenrolla localmente, formando una horquilla de replicación. - Se trata de un proceso ordenado y secuencial. - Se inicia en puntos fijos de la cadena, denominados unidades de replicación (alu) - Es muy precisa, presenta un margen de error de un error por cada 1010 nucleótidos - Es muy rápida, se replican 2 000 bases por segundo - Se realiza siempre en dirección 5’-3’ - Necesita un cebador de ARN - Utiliza desoxirribonucleótidos trifosfatos - Es discontinua en una de las cadenas, en la que se forman los fragmentos de Okazaki. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-9288804 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  - Posee sistemas de revisión y corrección o reparación II. Proteínas que intervienen en el proceso Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. A. Proteínas ADN-A Son proteínas de iniciación que se unen a la cadena de ADN en los puntos ORI, desencadenando el desenrollamiento de la doble hélice produciendo ADN monocatenario. B. Proteínas ADN-B o helicasas Son enzimas que catalizan el desenrollamiento del ADN para formar la horquilla de replicación. Necesitan ATP para comenzar a actuar. Rompen los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las bases nitrogenadas. C. Primasas Genera el cebador - Se trata de una polimerasa que genera secuencias de RNA (5-11 ribonucleótidos) a partir del molde de ADN. Se activa por la presencia de otras proteínas además de la helicasa. Sirve de promotor para el inicio de la replicación. La helicasa y la primasa actúan en conjunto en la hebra retardada, denominándose primosoma (produce un nuevo cebador cada 1000 residuos/ en eucariotas es de 165 bases, un nucleosoma). D. Proteínas SSB Impide que se reencuentren las cadenas Se unen a las cadenas de ADN una vez están separadas y evitan que se vuelvan a unir. Estabilizan la cadena sencilla, favoreciendo la entrada de nucleótidos. Una vez replicada, favorece la formación de la doble hélice E. Topoisomerasa Son enzimas que relajan la tensión generada por las helicasas con las roturas del ADN, favoreciendo el giro libre de las cadenas (girasas). También, permiten el superenrollamiento una vez finaliza la replicación. Pueden ser de tipo I, que rompe solo una cadena o de tipo II, que rompe ambas. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-9288804 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin Bioquímica Banco de apuntes de la  F. ADN polimerasa En procariotas, hay 3 tipos (I, II y III). En eucariotas, hay varias, nombradas con letras griegas. La ADN polimerasa III es la encargada de la replicación en procariotas. Actúan de forma dimérica, una en la cadena conductora y otra en la cadena retardada. Es un agregado multiproteico de 10 cadenas polipeptídica diferentes. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. El complejo ADN-polimerasa III esta formado por: - Una polimerasa central, formada por la α-polimerasa, ε-3’-exonucleasa y la θ- polimerasa - τ: es una proteína dimérica que mantiene juntas las polimerasas de las 2 cadenas. - β: obliga a mantener la polimerasa unida al ADN - χ: cambia los ribonucleótidos del cebador por desoxirribonucleótidos - Las 5 restantes constituyen el complejo γ que participa en el enganche del complejo al ADN. La DNA polimerasa genera enlaces fosfodiéster entre los desoxirribonuclótidos en dirección 5’-3’, siempre con un molde previo. El OH-3’ ataca nucleofilamente al fosfato apha del desoxirribonucleótido apareado con la cadena molde, liberando PPi. Utiliza iones magnesio para su actividad y para estabilizar las cargas negativas de los desoxiribonucleótidos trifosfato. Su velocidad es de 1 000 nucleótidos por segundo G. Ligasas Une los fragmentos de Okazaki en una misma cadena. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-9288804 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  H. Telomerasa La telomerasa actúa en la cadena molde Se trata de una proteína que adiciona secuencias repetidas de 15 bases en tándem al extremo 3’ sobre el que se une al cebador para poder realizar la síntesis completa de la cadena retardada. Su actividad esta relacionada con el envejecimiento celular. Su expresión se reprime despues del nacimiento Con la edad los telómeros de los cromosomas se van acortando. III. Origen de la replicación - Los lugares donde comienza la replicación se denominan lugares ORI. En ellos se unen las proteínas de iniciación DNA-A. Son secuencias de 245 pares de bases con zonas repetidas - La unión de la DNA-A desencadena el desenrollamiento de la doble cadena (debilita los puentes de hidrógeno) por acción de la DNA-B (helicasas) y la unión de las proteínas SSB, que mantienen la cadena desenrollada. Todo ello desencadena la síntesis del cebador. Al conjunto se le denomina complejo precebador (dnaA + ori + helicasas + SSB). IV. Síntesis de las nuevas cadenas Iniciación: - DNA-A y helicasas desenrollan la doble hélice a partir de la unión de DNA-A con Ori - Las helicasas catalizan la formación de la horquilla de replicación (con ATP) - Las primasas sintetizan los cebadores. Usan la cadena parental como molde para generar el ARN-A (cebador o primer) a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-9288804 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  - En la hebra retardada la primosoma (helicasa + primasa) produce un nuevo cebador cada 1000 residuos - Actúan las topoisomerasas para relevar la tensión - Las SSB estabilizan la cadena para favorecer la entrada de nucleótidos. - Actúan las ADN polimerasas - Unión de los fragmentos de Okazaki Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. A. Replicación en procariotas - La cadena conductora se sintetiza de forma continua sin interrupciones en sentido 5’-3’. La DNA polimerasa se libera al finalizar todo el proceso - La cadena retardada (3’-5’) se sintetiza coordinadamente formando un bucle y en fragmentos de unos 1 000 residuos (en eucariotas es de 165 bases, un nucleosoma). Estos fragmentos se denominan fragmentos de Okazaki o La subunidad correspondiente de la DNA polimerasa III se libera en cada paso para facilitar el avance. o Con cada fragmento se genera un cebador de RNA (sintetizado por la primasa). o La DNA polimerasa I elimina el RNA cebador (exonucleasa 5’-3’) y rellane los huecos con desoxirribonucleótidos (acción polimerásica). o Los fragmentos se unen por enlace fosfodiéster generado por la acción de la ligasa que hidroliza ATP. o La DNA polimerasa I pero también la III reparan y vigilan errores de replicación. B. Replicación en eucariotas - Es parecida pero más compleja que en procariotas puesto que pasamos de 4.8 millones de pares de bases (en E. coli) a 6 000 millones de pares de bases en humanos. Además, pasamos de una DNA circular a una DNA lineal y mucho más compacto (en procariotas no existen los nucleosomas). - Hay varios orígenes de replicación (hasta 3000) de manera que: o Cada uno es una unidad de replicación o replicón o A cada origen se unen complejos de 6 polipeptidos constituyendo el factor de unión al origen uORC ORIc (en lugar de ORI) o Los nucleosomas se desensamblan y ensamblan en el proceso o Debido a la presencia de nucleosomas, cada fragmento de Okazaki abarca entre 135 y 165 pares de bases - Debido a todo esto, la replicación es 10 veces más lenta. - Los eucariotas poseen unos mecanismos que aseguran que cada unidad se replique solo una vez. Esto lo consiguen mediante factores de autorización. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-9288804 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  - En estos mecanismos, participan las DNA-polimerasas: o La polimerasa alpha es la iniciadora. Presenta actividad prismática, generando el RNA cebador, y actividad polimerásica, pero no exonucleásica, añadiendo desoxirribonucleótidos y desprendiéndose tras añadir 20 de ellos al cebador o La DNA polimerasa delta prosigue con la polimerización una vez se ha Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. unido a otra proteína (PCNA) que acelera el proceso, hasta que encuentra un nuevo origen de replicación. - Termina con la eliminación de los cebadores y la acción de la ligasa. También se produce la corrección, mediante la actividad exonucleásica en sentido 3’-5’. - La telomerasa regenera el espacio que deja el primer RNA cebador de la cadena retardada. V. Modificación del DNA - Se realiza un proceso de metilación gracias a las enzimas metilasas. - Actúan unas metilasas específicas que modifican resto de citosinas y adeninas específicas, formando metilcitosinas y metiladeninas - En el proceso de metilación, las bases rotan completamente hacia fuera de la doble hélice de DNA, se introducen en el interior de la estructura proteica e interaccionan con el centro catalítico de la enzima - Tiene lugar en las dos cadenas, en las bases complementarias correspondientes - Es un proceso que se hereda A. Metilación en procariotas - Se metila menos del 1% de las adeninas y citocinas (mA y mC) cuando aparecen en secuencias determinadas (5’-GATC-3’ y otras) - Participan en la corrección del mal apareamiento ya que las enzimas de corrección buscan las secuencias GATC aún no metiladas para repasar y corregir el DNA recién sintetizado. - Intervienen en el control de la iniciación de la replicación. - Protege frente a la acción de las endonucleasas de restricción - Sistemas de modificación-restricción o Los microorganismos modifican (metilan) su DNA en lugares específicos para marcarlo y evitar la destrucción de este cuando degradan el foráneo con endonucleasas de restricción o Son sistemas específicos de modificación-restricción B. Metilación en eucariotas - Principalmente se metila la citocina cuando aparece en secuencias 5’-CpG-3’ o 5’-CpNpGp-3’ a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-9288804 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  - La proporción es muy heterogénea o Entre el 3-5% de las citosinas en animales o En plantas algo más o En insectos es casi simbólica - Se considera relacionado con o La inactivación génica (procesos de diferenciación) o Prevención de la recombinación o Carcinogénesis · Epigenética VI. Amplificación del DNA (PCR) CAE EN EXAMEN - La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite la amplificación de fragmentos específicos de DNA mediante ciclos de desnaturalización- renaturalización por temperatura, en presencia de cebadores adecuados (primers), con los desoxirribonucleótidos trifosfato adecuados y gracias a la acción de la DNA polimerasa termoestable (Taq) - Se realiza mediante ciclos de 90 segundos a distintas temperaturas o A 95ºC durante 15-30 segundos (desnaturalización del ADN) o A 50-65ºC durante 30 segundos (anillamiento=cebadores) o A 72ºC durante 30 segundos (elongación) - Esto ciclos se repiten varias veces, de manera que en 20 ciclos aumentamos la cantidad de DNA en 106 veces - Esta técnica permite la utilización de muestras muy pequeñas en estudios genéticos, como: o Amplificación génica o Identificación génica o En el diagnostico de enfermedades infecciosas o En el diagnostico de enfermedades genéticas (incluso en neonatos y fetos) o Seguimiento de la efectividad de los tratamientos quimioterápicos y radioterápicos o Valoración de compatibilidades en trasplantes o Identificación en medicina forense a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-9288804 Reservados todos los derechos. 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