Biologia Molecolare Past Paper PDF (13 Novembre 2023)

8.1 Biologia molecolare 13 novembre 2023 All’inizio della lezione la professoressa chiede ad un volontario di commentare un’immagine sul promotore eucariote all’inizio della trascrizione. Chiede inoltre di specificare quale sia l’elemento...

8.1 Biologia molecolare 13 novembre 2023 All’inizio della lezione la professoressa chiede ad un volontario di commentare un’immagine sul promotore eucariote all’inizio della trascrizione. Chiede inoltre di specificare quale sia l’elemento caratterizzante. Il volontario spiega che le silencers ed enhancer sono sopra e sono delle molecole che si attaccano anche a migliaia di basi, agiscono sulla polimerasi tramite un mediatore e vanno ad attivare o a disattivare la polimerasi se sono presenti o meno nell’ambiente esterno. A monte troviamo la TATA box, sito ricco di adenine e timine, ma prima troviamo un’altra sequenza, situata a -35 basi. Ci sono anche i repressori e gli attivatori che servono per appunto ad attivare o reprimere la replicazione. Infine, il complesso due è la polimerasi. TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI: IL MECCANISMO Quello che è tipico dell’organizzazione della cromatina è che ci siano dei punti del genoma estremamente remoti rispetto al promotore di ciascuno dei nostri geni, in grado di legare molecole specifiche con funzione di attivare o inibire la polimerasi; quindi, l’attività di quello che è un enzima che trascrive un gene subisce dei controlli da remoto estremamente importanti. Questa cosa in altri sistemi vitali non succede. Tutto questo è possibile grazie al DNA looping, quindi alla conformazione tridimensionale della cromatina che agevola questo tipo di controllo in remoto. Questi elementi distali (enhancer e silencer) si affiancano a quella che è la regolazione prossimale ad opera di fattori di trascrizione, rendono possibile infatti una trascrizione efficace in modo ubiquitario o tessuto specifico. Invece, a ridosso dell’enzima polimerasico, sono presenti tutta una serie di consensus che si estendono anche a valle rispetto al sito di inizio della trascrizione. Per quanto riguarda la trascrizione dell’RNA polimerasi II, questi consensus legano elementi di regolazione più peculiari. Queste zone sono le tipiche zone di legame di quelli che sono i fattori generali della trascrizione. FORMAZIONE DEL COMPLESSO DI PREINIZIO Al momento dell’inizio della trascrizione di un gene è essenziale il reclutamento di tutti i fattori generali a ridosso del sito di inizio della trascrizione, sul promotore. A questi si lega anche il mediatore che trasmette al complesso enzimatico quelli che sono gli aspetti positivi e negativi che arrivano da remoto. L’assemblaggio di questo “grappolo” proteico sui promotori è inerte perché in questa conformazione la trascrizione è bloccata: gli enzimi sono bloccati sul promotore e aspettano di essere accesi in qualche modo. SBOBINATORE: Maria Francesca Cariolato REVISORE: Lorenzo Zanello 8.1 Biologia molecolare 13 novembre 2023 I passaggi chiave che portano all’attivazione reale di quello che è il processo trascrizionale sono: 1. Identificazione del promotore: avviene tramite il riconoscimento della TATA box. Essa è riconosciuta in maniera specifica da una subunità proteica definita TBP (TATA-binding protein) che fa parte di un fattore generale della trascrizione essenziale al funzionamento della polimerasi. Questo fattore è il primo che si lega al DNA e la TBP è in grado in maniera specifica di riconoscere la TATA box. Questo fattore è il fattore D, indicato come TFII D. 2. Legame del fattore generale della trascrizione TFII D: Il legame della TBP al DNA crea l’intorno fisico ottimale per creare la bolla di trascrizione, in quanto il legame di TFII D piega la doppia elica a creare un angolo fisso di 80° che rappresenta la conformazione ideale per il reclutamento delle altre proteine necessarie ad attivare la trascrizione (complesso di pre-inizio). 3. Il legame è stabilizzato: il legame di TFII B è stabilizzato da altri fattori generali che impediscono contemporaneamente anche il legame di eventuali proteine che possono andare ad inibire il processo di attivazione della trascrizione. 4. Arriva la polimerasi: prende contatto con i fattori generali già presenti sul promotore e la posizione reciproca delle molecole permette il legame di essa in una posizione precisa. In questo modo è possibile dare inizio alla trascrizione a partire dal nucleotide +1. Il punto critico di questo passaggio è l’arrivo sul promotore di questo fattore generale della trascrizione H (TFII H), dove H sta per elicasi. TFIIH si aggiunge al complesso quando il promotore è riconosciuto in maniera inequivocabile. Quando la polimerasi è pronta per lavorare e sfruttando la propria attività elicasica denaturerà il DNA e creerà la bolla di trascrizione. Questo fattore generale della trascrizione è la chiave di attivazione del processo, senza di lui il DNA non si denaturerebbe. SBOBINATORE: Maria Francesca Cariolato REVISORE: Lorenzo Zanello 8.1 Biologia molecolare 13 novembre 2023 Inoltre, è molto importante l’azione del mediatore che interagisce con TFIID per assemblare un complesso attivo. Per fare ciò il mediatore: - Interagisce con il CTD della Polimerasi II - Stimola la fosforilazione TFIIH-dipendente del CTD - La fosforilazione del CTD causa la dissociazione del mediatore dalla Polimerasi II Trascrivere determinati geni è una scelta che costa energia quindi l’attività elicasica di TFIIH avviene mediante consumo di ATP. La quantità di ATP che consuma è immensamente grande perché l’ATP non viene soltanto idrolizzato per creare la bolla di denaturazione, ma perché di fatto TFIIH è una chinasi, un enzima in grado di fosforilare in SERINA e in TREONINA un dato substrato. Il suo substrato è la coda carbossiterminale delle RNA pol II, tratto caratterizzante solo e soltanto di questo enzima. FOSFORILAZIONE DELLA CODA CARBOSSI-TERMINALE DELL’RNA POL II Questa è una porzione, presente solo sulla RNA polimerasi II, estremamente antigenica dal punto di vista molecolare, che sporge dal nucleo dell’enzima ed è caratteristico delle cellule eucariotiche. La sequenza che domina questa regione è costituita esclusivamente dalla ripetizione di questi 7 amminoacidi: Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser Perché questa molecola con questo tipo di sequenza è estremamente antigenica dal punto di vista molecolare? Di questi amminoacidi, le serine e le treonine sono estremamente piccoli, la tirosina è invece più ingombrante perché è caratterizzata da un anello benzenico che ha una struttura rigida. Tuttavia, quello che fa la differenza sono questi due residui di prolina. Essa è un amminoacido che ha una forma pentagonale rigida e in corrispondenza di ogni residuo di prolina in un filamento amminoacidico la sequenza crea un brusco ripiegamento, passando da una struttura lineare ad una struttura a zig-zag, dove l’angolo di flesso è esattamente in corrispondenza della prolina. SBOBINATORE: Maria Francesca Cariolato REVISORE: Lorenzo Zanello 8.1 Biologia molecolare 13 novembre 2023 Quindi la presenza di questi due residui di prolina determina un ripiegamento di quella che è la sequenza amminoacidica della coda, soprattutto se i residui non solo soltanto due, sono infatti 2x52 nelle cellule di mammifero e 2x26 nelle cellule di lievito (la sequenza di questi 7 amminoacidi è infatti ripetuta rispettivamente 52 e 26 volte). Dunque, la struttura è antigenica poiché con tutte queste proline il ripiegamento non sarà un’alfa elica armoniosa o semplicemente un ripiegamento regolare, ma ci sono degli angoli netti che rendono questa regione estremamente riconoscibile. Cosa si intende per antigenica? Questa regione è antigenica dal punto di vista molecolare. La forma di questa regione è estremamente appariscente e riconoscibile dal punto di vista molecolare da parte di altre molecole proteiche eventualmente presenti nell’intorno. Se si avesse una conformazione estremamente regolare si renderebbe la molecola meno antigenica rispetto ad una struttura peptidica piena di spigoli. La regione trattata è piena di angoli acuti dovuti alla presenza di prolina. Perché una chinasi (TFIIH) è la chiave dell’attivazione dell’RNA polimerasi II? Come precedentemente detto, TFIIH è una chinasi, cioè un enzima in grado di spostare il gruppo fosfato su un bersaglio. Gli amminoacidi che possono essere fosforilati più facilmente sono serina treonina e tirosina. In questa ripetizione di 7 amminoacidi si hanno 5 amminoacidi fosforilabili. Si deduce che questa struttura è stata mantenuta inalterata nell’evoluzione proprio perché è la chiave di svolta dell’accensione dell’attività trascrizionale: TFIIH denatura il DNA e scatena tutta la propria attività chinasica nei confronti della coda carbossi-terminale della polimerasi. Viene denominata “firing” perché il legame di TFIIH sposta 5x52 gruppi fosfato sulle estremità carbossi-terminale, “accendendo una miccia” che attiva l’attività catalitica di trascrizione dell’enzima. Questo evento di fosforilazione ha anche un’altra importantissima funzione. Adese, infatti, alla coda dell’RNA polimerasi II, nelle cellule eucariotiche, ci sono le subunità enzimatiche che svolgono anche le modificazioni post traduzionali degli RNA appena trascritti. Queste modificazioni sono il capping, lo splicing e la poliadeninazione. Quando la polimerasi inizia a trascrivere un gene gli enzimi che devono processare il pre-RNA messaggero sono disponibili a iniziare la loro funzione. Quando TFIIH fosforila la porzione C-terminale della polimerasi fa saltare gli enzimi deputati alle modificazioni precedentemente dette sull’RNA messaggero. L’evento fosforilativo, oltre a far staccare la polimerasi dal promotore, fa scendere drammaticamente l’affinità degli enzimi deputati al processing dell’RNA messaggero per la polimerasi, in maniera tale che gli enzimi prendano contatto con l’RNA appena trascritto e procedano immediatamente al processo di trasformazione da pre- RNA messaggero a mRNA maturo. La fosforilazione dell’estremità carbossi-terminale della polimerasi forza quest’ultima a muoversi dal promotore, fa scendere l’affinità dei fattori generali, fa dissociare il mediatore dagli enzimi con cui aveva preso contatto sul promotore e quindi libera il promotore stesso da tutte le molecole utilizzate per far partire la trascrizione, rendendole disponibili per un altro ciclo di reclutamento sullo stesso o su un altro promotore. SBOBINATORE: Maria Francesca Cariolato REVISORE: Lorenzo Zanello 8.1 Biologia molecolare 13 novembre 2023 ALLUNGAMENTO Il processo di allungamento è esattamente sovrapponibile a quanto visto nei procarioti, nel senso che le subunità ribonucleotideiche entrano nel sito catalitico e vengono incorporate sulla base della complementarità. Quello che è caratterizzante della RNA polimerasi è il fatto di riuscire a discernere tra ribonucleotidi e desossiribonucleotidi. L’unico vero setaccio molecolare di controllo del processo della trascrizione è quello di fare entrare nel sito catalitico solo e soltanto ribonucleotidi. Al contrario della DNA polimerasi, in cui non esistono altri meccanismi ai fini di controllo. Il processo di trascrizione avviene su questa conformazione. Sembra quasi impossibile perché su questo intorno spaziale la cromatina è estremamente impaccata in una struttura da 30 nanometri, il super avvolgimento del DNA è assolutamente stretto e tutte le molecole descritte finora devono procedere al riconoscimento puntuale e preciso di ogni singolo promotore. Ci deve quindi essere un qualcosa che faciliti il riconoscimento e il reclutamento delle molecole in corrispondenza dei promotori. Questo qualcosa è legato alle molecole non istoniche presenti a livello di cromatina, cioè quei complessi di rimodellamento della cromatina responsabili, per esempio, dello spostamento reciproco dei nucleosomi lungo il filamento del DNA. Questi complessi proteici sono fondamentali per mantenere un assetto dinamico sull’impaccamento del DNA al momento della trascrizione. Queste molecole, modificando la posizione reciproca dei nucleosomi, facilitano il reclutamento delle proteine in posizioni in cui il tasso dell’impaccamento è stato allentato e quindi il DNA diventa più accessibile al legame da parte dei fattori di trascrizione specifici. Queste molecole riconoscono, infatti, dei consensus, cioè delle sequenze di riconoscimento specifiche che sono determinate dalla sequenza delle basi azotate. Tutte queste molecole devono andare a leggere la sequenza delle basi azotate nella porzione idrofobica del DNA. Tutto questo avviene in una porzione estremamente mobile e vengono trascritti migliaia di geni contemporaneamente. SBOBINATORE: Maria Francesca Cariolato REVISORE: Lorenzo Zanello 8.1 Biologia molecolare 13 novembre 2023 I complessi di rimodellamento della cromatina sono fondamentali per cambiare la struttura generale. Oltre alle proteine di rimodellamento, sulla cromatina lavorano altre classi di enzimi che provvedono a modificare chimicamente le proteine che compongono i nucleosomi, cioè gli istoni. Gli istoni subiscono continuamente acetilazioni, fosforilazioni, ubiquitinazioni e metilazioni su residui precisi, e queste modificazioni chimiche non soltanto cambiano l’accessibilità del DNA agli enzimi deputati a trascrivere un determinato gene, ma vanno ad alterare l’efficienza e l’attività della polimerasi stessa. Questa è la base della regolazione epigenetica dell’espressione genica. Nelle cellule l’attività della polimerasi è sicuramente legata ad un intorno nucleotidico ereditato di generazione in generazione, ma in ogni singolo tipo cellulare, modificazioni post-traduzionali, a carico degli istoni, riescono ad attivare o a reprimere ulteriormente l’attività della polimerasi. Questo succede in un modo non ereditato geneticamente. SBOBINATORE: Maria Francesca Cariolato REVISORE: Lorenzo Zanello