Transcripción de ADN al ARN (Expresión génica)- Dra. Rodriguez

TRANSCRIPCIÓN DE ADN AL ARN “Expresión génica” Dogma Central de la Biología Molecular  Del Gen a la Proteína La transcripción y traducción son los recursos mediante la célula expresa sus genes Cada gen puede ser transcrito y...

TRANSCRIPCIÓN DE ADN AL ARN “Expresión génica” Dogma Central de la Biología Molecular  Del Gen a la Proteína La transcripción y traducción son los recursos mediante la célula expresa sus genes Cada gen puede ser transcrito y traducido para sintetizar las proteínas Estructura del Gen: Los genes están conformados por secuencias de nucleótidos de ADN que se ubican a lo largo de todo el genoma Exones: Secuencias de DNA codificantes para una proteína Intrones: Secuencias de DNA que no codifican para una proteína  Ácido ribonucleico (RNA) Características Son más pequeños que las moléculas de DNA Cadenas sencillas (pueden presentar regiones dobles por complementariedad) Con estructuras tridimensionales complejas Tipos de RNA Mensajero: ARNm Ribosomal: ARNr Transferencia: ARNt  ARN mensajero Contiene la información genética procedente del ADN para utilizarse en la síntesis de proteínas, es decir, determina el orden en que se unirán los aminoácidos Los RNAm de eucariotes son monocistrónicos: contienen información para una sola cadena polipeptídica Los RNAm de procariotes son con frecuencia policistrónicos: codifican más de una proteína AUG Stop AUG Stop AUG Stop AUG Stop  Moléculas participantes en la transcripción Factores de transcripción: Son proteínas que se unen a las secuencias consenso del ADN para iniciar la transcripción del mismo a ARN ARN polimerasa: Es la enzima que sintetiza el ARNm a partir de DNA Une nucleótidos de ARN Actúa similar a la ADN polimerasa ARN polimerasas de eucariotes ARN Función polimerasa I Síntesis, reparación y revisión. Sintetiza precursores de ARN ribosómico II Sintetiza precursores de ARN mensajero, Micro ARNs III Sintetiza ARN transferencia, ARN ribosómico Org Transcripción del ARN mitocondrial o de cloroplastos  Transcripción La transcripción del ADN, proceso que transfiere la información contenida en la secuencia del ADN hacia la secuencia de proteína utilizando diversos ARN como intermediarios Durante la transcripción genética: Se utiliza la ARN polimerasa Se sintetiza un ARN mensajero que mantiene la información de la secuencia del ADN (cambia la secuencia de T por U) Iniciación Elongación Terminación  Iniciación La RNApolimerasa entra en contacto con una secuencia de iniciación (promotor) en la hebra patrón de DNA Procariotas la ARN polimerasa se une a la secuencia promotor Eucariotas la unión esta mediada por otra proteína denominada factor de iniciación. La unión de la RNA polimerasa al promotor genera una serie de cambios: Separación del DNA duplex formandose una burbuja u horquilla de transcripción. La RNA polimerasa inicia la sintesis del nuevo RNA por su extremo 5‘. Comienza habitualmente por un residuo de GTP o ADP.  Elongación La ARN polimerasa agrega nucleótidos complementarios a la hebra 3’-5’ para que el ARNm se sintetice en 5’-3’ Se forma una molécula duplex DNA-RNA (facilita el proceso de lectura). El dúplex tiene una vida muy corta separandose poco después de su formación. Agregando G-C y A-U Terminación en ARNm de eucariotas Proceso no preciso en eucariotas 481 GGCGAGCATGGTGACTCCTCTGTACCTGTCTGGTCTGGCGTTAATGTTGCTGGTGTGCGT No hay señales de terminación exactas ARN polimerasa sigue la transcripción del gen 541 CTGCGTGACTTGAACCCAAAAGTGGGAACTCCAGAAGATCCTGAAAAGTATGATGAACTC incluyendo la secuencia no codificante 3'-UTR 601 CACAAAGATGTTGTGAACAGTGCATATGAGATCATCAAACTGAAGGGATACACCTCCTGG Se forma un bucle en una región rica e C-G antes de Uniones menos 661 GCCATCGGTCTCTCTGTCGCCTCTCTGGTGTCATCTATCGTCAAGAACATGCGCGCCTGC llegar a la región donde irá la cola poli-A fuertes de A-T Se separa la polimerasa y el ARNm de la hebra molde 721 TATGCTGTCTCTGTAGCTGTTCAGAATTACCATGGTATCGACAAGGATGTGTTCCTGAGC 781 TTGCCTGTGGTCTTGGGTGAGAACGGTGTCACTCATGTCATCAAGCAGACCCTAACAGAA 841 GCTGAAATTGCTCAGCTGCAAAAGTCTGCTAACACACTCTGGGACGTTCAGGCCGGAATT 901 CAGTTCTAAGGCGCGTGATGCAACAATGTGAAGCTCTAGAAAACAACCTGACCTTGAACG 961 TTCAGCAATGGTTCACGCTGGTGGCACTGCTTGAAGGATCAAATTTCGAGGAGTGTAAAT 1021 ATACTGCCAAACGAGAAGGAAGAGAGAGTTTACATGCTGCTAATGTGCAATATTATTTT 1081 GAGGATAGAATGGTTCTTGATTGTACTAAGGATGAAGTATTAATATGCGGTTCCAATACA 1141 GTGTATTTTGCATTCTGCTGCATGTGCTTTTTATGTATTCAGGAGATCATATAGAGTAAT 1201 AACTGATTATGGCTTATTGGAATAAAAGTGTGAGTGCCTAAAGGCCAGATATATGTGATG 1261 AATTAGAATGATATTCCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA  Terminación de ARNm- Rho dependiente en procariotas ARN contiene un sitio de unión para la proteína rho Rho se une a esta secuencia y comienza a "desplazarse" por el transcrito hacia la ARN polimerasa ARN polimerasa se detiene en el codon de termino Rho alcanza a la ARN polimerasa Rho separa el ARNm, la ARNpol y ADN molde Stop codon  Transcripción del ARNm https://www.youtube.com/watch?v=P4MLjyZasJo  Reacciones del procesamiento de maduración del ARNm Adición de la Caperuza en el extremo 5’: Casi inmediatamente después de iniciarse la síntesis de RNA se añade una caperuza “cap” en el extremo 5’ Es una molécula de metilguanosina Lo protege de la degradación durante el alargamiento Adición de una cola de poli (A) : Secuencia que se agrega en el extremo 3’ del transcrito primario, al final de la transcripción Señal de poliadenilación (AAAAAAAAAA) hasta 250 nucleótidos de adenina Video de Transcripcion del ADN Español.wmv  Poli adenilación del ARNm Proceso de maduración de l ARNm Indispensable para la estabilidad de ARNm y señalización para que salga del núcleo al citoplasma Se lleva a cabo en el extremo 3’ del ARNm Mediante una Poli-A polimerasa que agrega de 60 to 80 (A) en levaduras y hasta 250 (A) en mamíferos Existen señales en el pre-ARNm que son reconocidas por la maquinaria de poliadenilación, al parecer tejido especifico Señal de poliadenilación (PAS) AAUAAA aprox 15-30 bases, puede ser similar dependiendo del organismo Elementos DSE (downstream sequence element), regions ricas en U o GU 5’ ORF 3’ AUG UAA AAUAAA GU/UUUUUUUU Codón Codón Señal término DSE inicio poliadenilación  5’ 3’ ADN 5’-3’ ATG TAA AATAAA GT/TTTTT ADN 3’-5’ TAC ATT TTATTT CA/AAAAA 3’ 5’ El pre-ARNm se transcribe sin la cola poli-A, pero si con las señales para que se poliadenile 5’ ORF 3’ pre-ARNm AUG UAA AAUAAA GU/UUUUU Codón Codón Señal término DSE inicio poliadenilación  Las secuencias palindrómicas ricas en GC forman el bucle para la terminación Permanece un extremo corto de nucleótidos uracilos (U), el cual se escinde antes de la poliadenilación El conjunto de proteínas de poliadenilación extiende el ARNm con múltiples adeninas (A) Complejo de ensamble para la poliadenilación CstF se une a las regiones ricas en GU CPSF se une fuertemente a la secuencia AAUAAA Los factores de escisión ( CFI y CFII) o la endonucleasa corta un segmento de UUUUUU Reacciones de poliadenilación: 1. Se agregan aprox 1’ bases de Adenina 2. La cola de poli-A se extiende hasta aprox 250 residuos. Esta reacción requiere otro factor estimulante que reconoce la cola del oligo (A) y dirige la poli A- polimerasa específicamente hacia el extremo 3’ 3. La proteína PABP se va adhiriendo a la cola poli A, para darle mas estabilidad a la molécula Adición de la cola poly-A al ARNm  Eliminación de intrones Los intrones se encuentran en el gen, por lo que se transcriben a RNA y necesitan ser removidos para formar el RNAm maduro Secuencia aceptora y donadora del “splicing” Se encuentran en los extremos 5’ y 3’ de los intrones Sirven para eliminar los intrones del transcrito primario Comienzan con GU y terminan con AG (regla del GT- AG en el ADN)  Eliminación de intrones El ayustosoma (estructura que convierte el RNAm a RNAm maduro) reconoce los sitios de corte (ayuste) del intron Retiran el intro, unen los exones Finalmente queda el RNAm maduro que codifica para la proteína Ver video Maduración de ARNm Resultados del splicing alternativo  ¿Se retiran los intrones en un orden especifico? El orden de eliminación podrá deberse a la accesibilidad de la secuencia del intrón No hay una vía única, pero si vías preferidas En el ejemplo se perdieron los intrones: Primero los intrones 5/6 Después el 4/7 Al final el intrón 3 Fallos en la eliminación de intrones Si no se eliminan los intrones, el ARNm no codifica para la proteína Generando enfermedades como Talasemia: No se elimina el intrón que se encuentra en el gen de la hemoglobina Por lo tanto, no se produce la hemoglobina generando anemia  Splicing críptico Se forman por mutaciones en el ADN Formando señales de corte para splicing Si la señal de splicing se puede encontrar dentro de un intrón: El intrón se hace corto y el exón mas alargado, no se produce la proteína Exón 1 Intrón Exón 2 Intrón Exón 3 Gen sin mutación GT TTACG AG GT AG Señal críptica de ayuste Gen con mutación GT TTAGG AG GT AG Exón 2 GT-AG en el ADN ARNm resultante Exón 1 Exón 2 Exón 3 GU-AG en el ARN Si la señal de splicing se puede encontrar dentro de un exón: Se puede generar un exón mas corto, no se produce la proteína Exón 1 Intrón Exón 2 Intrón Exón 3 Gen sin mutación GT AG GT AG Mutación en límite del intrón Señal críptica de ayuste Gen con mutación Exón 1 GU AC AG GT AG Exón 3 Pre-ARNm Exón 1 GU GT AC AG AG GT AG Exón 3 resultante de la transcripción Límite del intrón se recorre Exón 2 Enfermedades: Progeria, ARNm resultante Exón 1 Exón 2 Exón 3 causa envejecimiento del splicing prematuro en niños  Estabilidad y degradación del ARNm Las regiones UTR 5’ y 3’ ayuda a la estabilidad y protegen de la degradación al ARNm Degradación del ARNm pude ser por: Estructuras secundarias por fallos en la eliminación de intrones El ribosoma no puede avanzar hasta el AUG, no se inicia la traducción Exonucleasa Mutación en región codificante, se traduce una proteína s eliminan la incorrecta cola de poli Mutación en el stop codón, el ribosoma se desensambla A en el 3’ Perdida del stop codón, la traducción sigue mas allá del stop, el péptido es erróneo Se promueve la eliminación de la REVISIÓN DE ARNm caperuza 5’  Degradación del ARNm Eliminación de la cola de poli A 3’ y de la caperuza 5’ La desadenilación del UTR 3’ promueve la eliminación del cap 5’ una vez que las PABP se disocien de la Poli A La poli A contiene múltiples PABP Exonucleasas (estabiliza el ARNm y evita que las eliminan la cola de poli A en el desadenilasas se unan) 3’ Menos de 10-15 residuos de A, se desprende PABP La Ccr4 (levaduras) o PARN (vertebrados) desadenila Se degrada el cap 5’ y actúa la XRN1 Se promueve la eliminación de degradando (endonucleolítica) de 5’-3’ la caperuza 5’ Aceleración de la degradación Secuencia ARE (AUUUA aprox 50 bases) Se le unen las proteínas AREBP (ARE X desadenilación binding protein) Forman un complejo ribonucleoproteico y promueve la desadenilación, la eliminación del cap 5’ y la degradación Secuencias IRE (iron responsive element): Levaduras Localizadas el UTR 3’ Inhibe el elemento desestabilizador En función de la concentración de hierro EJC: complejos de unión exónica Revisores de la traducción, el ribosoma los elimina conforme recorre el ARNm Se localizan en los puntos de unión de exones después del splicing Si hay stop codón prematuros, degradación del ARNm Expresión de los genes se puede evaluar: Analizando los ARN transcritos específicos generados o el transcriptoma celular.  Transcriptoma El transcriptoma es el conjunto de moléculas de ARN mensajero y de ARN no codificante presente en una célula o tejido. Toda célula tiene su transcriptoma, El transcriptoma se mantiene reemplazando incluso las esporas bacterianas o semillas ARNm que han sido degradados de las plantas, pero la traducción a proteínas esta desactivada Toda célula tiene su transcriptoma basal Objetivo: Los cambios se dan bajo ciertas Caracterizar perfiles de expresión génica para: Diagnóstico molecular de enfermedades circunstancias : Búsqueda de nuevas moléculas dianas Pronóstico y predicción de la respuesta terapéutica División celular Estudio de expresión de genes relacionados con el Alteraciones en el medio ambiente metabolismo Patologías  El estudio y análisis del transcriptoma es esencial para el entendimiento de la función de genes Si un gen se expresa en una condición o célula determinada es porque cumple allí una función Intensidad Ejemplo: Expresión de genes en las branquias de camarones sometidos a periodos 2 horas de ayuno de ayuno Intensidad 24 horas de ayuno Intensidad 72 horas de ayuno  Técnicas para el análisis de la expresión génica Análisis cualitativo o Northern-blot semicuantitativo de un Hibridación in situ gen candidato por RT- PCR análisis RT-qPCR Técnica cuantitativa Expresión de miles de transcritos Microarreglos simultáneamente Secuenciación masiva de todas Secuenciación de nueva generación (NGS) las moléculas de ARN Técnica ARN-seq presentes en una muestra “transcriptoma completo”  Microarrays (Microarreglos) y Tiling arrays  Microarreglos Tecnología para el estudio de la expresión de muchos genes a la vez Se colocan miles de secuencias génicas en una matriz (Portaobjetos, chip, etc) Una muestra que contiene ADN o ARN se pone en contacto con el chip. Aplicaciones Perfiles de expresión génica (respuesta a estrés) Estudios de patogenicidad Resistencia bacteriana Farmacogenómica Diagnóstico y detección de microorganismos Síntesis del cDNA con marcaje de sondas Hibridaciones  Imagen de microarreglos https://www.youtube.com/watch?v=16V1q4nctdg