H4: PCR PDF
Document Details
Uploaded by ProgressiveTeal566
Karel de Grote Hogeschool
Tags
Summary
This document provides an overview of the Polymerase Chain Reaction (PCR) process. It describes the basic steps involved, including denaturation, annealing, and extension, and explains the concept of exponential amplification. The document also highlights the importance of thermostable enzymes, such as Taq polymerase, in PCR.
Full Transcript
H4: PCR Het PCR-principe (Polymerase Chain Reaction) kan als volgt samengevat worden: Ontwikkeling van PCR: ○ In 1983 introduceerde Mullis voor het eerst een primerpaar in een polymerase-reactie. ○ Het doe...
H4: PCR Het PCR-principe (Polymerase Chain Reaction) kan als volgt samengevat worden: Ontwikkeling van PCR: ○ In 1983 introduceerde Mullis voor het eerst een primerpaar in een polymerase-reactie. ○ Het doel was aanvankelijk om dNTP’s uit een staal te verwijderen. ○ Mullis ontdekte dat zijn methode kopieën van het geprimede DNA produceerde, die exponentieel toenamen door opeenvolgende cycli van denaturatie, annealing en polymerisatie. Denaturatie en de temperatuur: ○ In de denaturatiestap wordt de temperatuur verhoogd tot94°C, zodat dubbelstrengs DNA (dsDNA) smelt naar enkelstrengs DNA (ssDNA). ○ Het DNA-polymerase denatureert echter bij hoge temperaturen, waardoor Mullis steeds nieuw polymerase-enzym moest toevoegen. Dit maakte de techniek arbeidsintensief en duur. De oplossing met Taq-polymerase: ○ In 1988 werd Taq-polymerase, een thermostabiel enzym, geïntroduceerd, wat de techniek vereenvoudigde en het huidige PCR-protocol mogelijk maakte. ○ Dit leidde tot de moderne PCR, die een revolutie teweegbracht in moleculaire biologie. Het PCR-proces: ○ Denaturatie:De temperatuur wordt verhoogd tot 94°Com het dsDNA in ssDNA te splitsen. ○ Annealing:Primers binden (annealen) aan de specifiekeDNA-strengen: Desense (forward) primerbindt aan de ene DNA-streng. Deantisense (reverse) primerbindt aan de complementaire DNA-streng. De optimale annealingstemperatuur hangt af van de lengte en samenstelling van de primers. ○ Verlenging:Het DNA-polymerase verlengt de primersvan 5' naar 3' richting, bij een temperatuur van72°C(de optimale temperatuurvoor Taq-polymerase). Bij grotere DNA-fragmenten duurt de polymerisatiestap langer. Exponentiële amplificatie: ○ Door herhaalde cycli van denaturatie, annealing en polymerisatie wordt het gewenste DNA-fragment exponentieel vermenigvuldigd. ○ Elke nieuwe DNA-streng dient als template in de volgende cyclus. ○ Een typische PCR-reactie omvat ongeveer 30 cycli. dNTPs:De bouwstenen voor de verlenging van de nieuweDNA-strengen door het polymerase. Het DNA-polymerase en zijn eigenschappen kunnen als volgt worden samengevat: Taq-polymerase: ○ Oorsprong:Geïsoleerd uit de thermofiele bacterieThermus aquaticus, die leeft in warme waterbronnen en geisers. ○ Thermostabiliteit:Het is thermostabiel en functioneertoptimaal rond72°C, wat de temperatuur bepaalt voor de polymerisatiestap in PCR. ○ Polymerasesnelheid:1 tot 2 kb per minuut bij optimaletemperatuur. ○ Nadeel:Het heeftgeen proofreading-activiteit, watresulteert in een foutpercentagevan 1 fout per 9.000 nucleotiden. ○ A-overhangs:Het creëert3' A-overhangswanneer hetde template bereikt, wat nuttig is voor cloneren met TA-cloning vectoren. Pfu-polymerase: ○ Oorsprong:Geïsoleerd uitPyrococcus furiosus. ○ Replicatiegetrouwheid:Het heeftproofreading-activiteit,waardoor het slechts 1 fout per 1.300.000 nucleotiden maakt. ○ Polymerasesnelheid:Trager dan Taq, slechts 0,5 tot1 kb per minuut, vanwege de proofreading-activiteit. ○ Geen A-overhangs:Bij gebruik van Pfu ontstaan geenA-overhangs. Keuze van polymerase: ○ De keuze voor Taq of Pfu hangt af van desnelheidvan de PCR, de replicatiegetrouwheidof de noodzaak voorA-overhangsbij het cloneren. Hot start polymerasesystemen: ○ Hot start polymerase systemen worden gebruikt omaspecifiekeprimingte voorkomen. ○ Problemen bij lage temperatuur: Aspecifieke priming kan optreden, waarbij primers binden aan niet-doel-DNA of zelf dimeren vormen. Dit verlaagt de specificiteit van de PCR en verbruikt dNTP's, waardoor de efficiëntie afneemt. ○ Oplossing voor hot start: DNA-polymerase wordt pas actief na het bereiken van een bepaalde temperatuur, waardoor aspecifieke bindingen worden voorkomen. Manuele hot start:Het enzym wordt pas toegevoegdnadat de reactie is verhit (onpraktisch). Fysieke barrière:Het DNA en de primers worden gescheidenvan het polymerase door een waslaagje dat bij hogere temperaturen smelt. Geavanceerde hot start-systemen: Sommige systemen gebruikenantilichamenofpolypeptiden die het enzym blokkeren en bij verhitting de blokkade verwijderen. Andere systemen bevattencovalent gemodificeerde DNA-polymerases, die pas bij verhitting actief wordenna de hydrolyse van de covalente binding. De primers en hun rol in PCR: Keuze van primers: ○ Desense (forward)enantisense (reverse)primershybridiseren aan de complementaire DNA-strengen. ○ Het DNA-polymerase verlengt de primers vanaf het vrije3'-uiteindedoor toevoeging vandNTP's. ○ De te amplificeren DNA-sequentie (amplicon) moet bekend zijn om de primers correct te ontwerpen. Ontwerp van primers: ○ Deannealingtemperatuurvan de sense en antisenseprimers moetgelijk zijn om specifieke hybridisatie te garanderen. ○ Lengte van primers:Tussen17 en 30 nucleotiden. Langeprimers hebben een hogere annealingtemperatuur en zijn specifieker. ○ GC-gehalte:Ideaal tussen50-60%. Hoe hoger het GC-gehalte,hoe hoger de annealingtemperatuur. ○ De annealingtemperatuur ligt5°C lagerdan deTm(smeltpunt)van de primer. Formules voor Tm: ○ Twee formules worden gebruikt, afhankelijk van de lengte van de primer (meer of minder dan 20 nucleotiden). Te vermijden factoren: ○ Repetitieve sequentiesenidentieke basenstrekkenmoeten worden vermeden om problemen zoalsslipped strand mispairingte voorkomen. ○ Vermijd primers die makkelijkprimerdimerenofhairpinsvormen bij hoge temperaturen, omdat dit de PCR-efficiëntie en -specificiteit verlaagt. Labelen van primers: ○ Een primer kan eenlabelaan het vrije 5'-uiteindekrijgen, wat de markering van het PCR-product mogelijk maakt. Mismatches in primers: ○ Mismatchesontstaan wanneer enkele basen van de primerniet correct baseren met de template. Dit beïnvloedt de Tm-berekening. ○ Speciaal voor mismatches:Er wordt een andere formulegebruikt om de Tm te berekenen, rekening houdend metGC%,primerlengteenpercentage mismatches. Toepassingen van mismatched primers: ○ Interne mismatch primersworden gebruikt ommutatiesin het PCR-product in te voeren. ○ Mismatches aan het 5’-uiteindevoegen extra sequentiestoe aan het PCR-fragment, vaakRE-herkenningssitesvoor clonering. ○ Mismatches aan het 3’-uiteindeverhinderen dat deprimer wordt verlengd door het DNA-polymerase, omdat het polymerase niet kan binden zonder perfecte complementariteit op het 3'-uiteinde. De template voor PCR: Doelwit-DNA: ○ Het doelwit (template) voor een PCR-reactie isDNA.Verschillende typen DNA kunnen dienen als template: Genomisch DNA Mitochondriaal DNA Bacterieel DNA Viraal DNA Plasmides YACs (Yeast Artificial Chromosomes) en BACs (Bacterial Artificial Chromosomes). ○ De extractiemethoden variëren afhankelijk van het type DNA. RNA als indirecte template: ○ RNAkan ook gebruikt worden als template in PCR, maaralleenindirect. Dit gebeurt via eenreverse transcriptase-reactie (RT),waarbij RNA wordt omgezet naar DNA. ○ Deze techniek wordt gebruikt voor de detectie vanmRNAofviraal RNA. ○ Voorbeeld:DeAmplicor HIV-1 Monitorgebruikt dezetechniek voor het kwantificeren van HIV-1 virustiters. Protocol bij RNA-template: ○ RNA-extractie: Het RNA wordt eerst geïsoleerd. ○ Reverse transcriptie (RT): Het RNA wordt omgezet naarDNA. ○ PCR-reactie: De omgezette DNA-template wordt gebruiktin PCR. Detectie van PCR-product: ○ Eén van de PCR-primers is gelabeld metbiotineaanhet5'-uiteinde. ○ Het PCR-product wordt gedetecteerd in eencupjegecoatmet eencapture probedie complementair is aan de gelabelde strandvan het PCR-product. ○ Na een wasstap wordt eenconjugaattoegevoegd:streptavidine geconjugeerd met een enzym. Streptavidine bindt sterk aan biotine. ○ Het enzym zet eenchromogeen substraatom, wat resulteertin een detecteerbare kleur. Kwantificatie: ○ Deze techniek maakt kwantificatie mogelijk van virustiters over een dynamisch bereik van400 tot 750.000 virussen/mL. Inhibitoren in PCR: Wat zijn inhibitoren? ○ Inhibitoren zijn verbindingen die het PCR-proces verstoren, waardoor er weinig of geen PCR-product wordt gevormd. ○ Ze werken voornamelijk door het remmen van de werking van DNA-polymeraseof door binding aan nucleïnezuren,waardoor ze niet beschikbaar zijn voor amplificatie. Oorzaken van inhibitie: ○ Inhibitoren kunnen afkomstig zijn van: Hetstaalwaaruit het DNA werd geëxtraheerd. Dereagentiadie gebruikt worden in de isolatiemethode. Voorbeelden van inhibitoren uit het staal: ○ Hemoglobine(uit bloed) ○ Galzouten(uit stoelgang) ○ Ureum(uit urine) ○ Polysachariden(uit zuivelproducten) ○ Oplossing:Een geschikte isolatiemethode kan dezeinhibitoren zoveel mogelijk verwijderen. Voorbeelden van reagentia die de PCR beïnvloeden: ○ EDTA en Chelex:Bindendivalente kationenzoalsMg²⁺,wat essentieel is voor de werking van Taq-polymerase. ○ Non-ionische detergenten(zoalsTween-20enTritonX100): Remmen PCR bij concentraties boven 5%. ○ Ionische detergenten(zoalsSDS): Remmen de PCR-reactieal bij zeer lage concentraties (boven 0,01%). ○ Proteasen(zoalsproteinase K): Hydrolyseren eiwitten,inclusief DNA-polymerase, en zorgen zo voor inactivatie. Oplossingen bij aanwezigheid van inhibitoren: ○ Extra zuiveringsstapom de hoeveelheid inhibitor teverlagen. ○ Minder DNA-extracttoevoegen aan de PCR-reactie (doorverdunningen van het extract te gebruiken). ○ HulpstoffenzoalsBSA (boviene serumalbumine)kunneninhibitoren binden en inactiveren. ○ Gebruik eenrobust DNA-polymeraseof verhoog de hoeveelheid DNA-polymerase. Interne controle in PCR: ○ Interne controle:Een PCR wordt ontwikkeld om minstenséén amplicon te leveren, afkomstig van eeninterne controle. Dezecontrole wordt samen met het diagnostische amplicon geamplificeerd. ○ Bijafwezigheid van een PCR-productkan dit wijzenopinhibitieof een probleem met de extractie (zoals geen DNA in het extract). ○ Exogeen DNA toevoegen:In sommige gevallen wordt eenvast hoeveelheid exogeen DNA aan alle extracten toegevoegd, zodat de amplificatie van het exogene amplicon gelijk verloopt, tenzij inhibitoren aanwezig zijn. Dit wordt vaak gebruikt inkwantitatieve PCR's. Belangrijk:Een PCR zonder product kan duiden opinhibitieen de afwezigheid van het diagnostische amplicon heeft dangeen diagnostischewaarde. Contaminatie in PCR: Gevoeligheid voor contaminatie: ○ PCR is een zeer gevoelige techniek door deexponentiëlevermeerdering van een doelwitfragment. Dit maakt de reactie ook kwetsbaar voor contaminatie. Oorzaken van contaminatie: ○ Staalname: Contaminatie kan optreden tijdens het verzamelenvan het staal. ○ Overdracht tussen stalen: Contaminatie kan van staalop staal plaatsvinden. ○ W etenschapper op staal: Verontreiniging kan ook van de onderzoeker zelf komen. ○ De grootste zorg is decontaminatie van pre-PCR-staal(dat nog de PCR-reactie moet ondergaan) metpost-PCR-staal(datal PCR-product bevat, wat als template kan dienen voor verdere amplificatie). Preventie van contaminatie: ○ Gescheiden ruimtesvoor pre- en post-PCR-stappen moetenaltijd worden gebruikt. ○ Decontaminatiemaatregelen: UV-lichtbestralingvan werkruimtes voor de PCR-reactie. Uracil-N-glycosylase (UNG):Een enzym dat DNA meturacilbasen hydrolyseert. Het PCR-product wordt afgebroken als dUTPs in plaats van dTTPs worden gebruikt in de reactie, maar het template-DNA blijft intact. Controles in PCR: ○ Positieve controle:Dit moet altijd positief zijn,tenzijinhibitorenaanwezig zijn. ○ Negatieve controle:Dit moet altijd negatief zijn,tenzij er sprake is van contaminatie. Het Amplicon in PCR: Grootte van het amplicon: ○ Hoe kleiner het te amplificeren fragment, des te efficiënter de PCR verloopt. ○ Klassieke PCR:Versterkt meestal fragmenten van200-1500bp. ○ Kwantitatieve PCR (qPCR):Versterkt doorgaans kleinerefragmenten van 50-150 bp. ○ Grote amplicons (>2000 bp):Hiervoor zijn specialekits en protocollen beschikbaar op de markt. Analyse van de PCR-producten: Soorten analyse: ○ Er wordt onderscheid gemaakt tussen technieken die delengtevan het PCR-product bepalen en diegenen die desequentievanhet PCR-product analyseren. ○ Eenpuntmutatieflankeert een primerpaar en beïnvloedtde sequentie, maar niet de lengtevan het PCR-product. Lengteanalyse van PCR-producten: ○ Agarosegel elektroforesemetethidiumbromide: Eenbp-ladderwordt geladen in een aparte laan omde lengte van het PCR-product te schatten. Positieve controleskunnen worden gebruikt voor vergelijking,vooral als de fragmenten slechts 10-30 bp in lengte verschillen. K leine verschillen in lengte (bijvoorbeeld tussen 100 en 120 bp) zijn gemakkelijker zichtbaar dan grotere verschillen (bijvoorbeeld tussen 1000 en 1020 bp). Capillaire gel elektroforese: ○ Bij deze methode wordt één primer gelabeld, zodat het PCR-product ook gelabeld is. Eenbp-ladderwordt toegevoegd aan elk staal. Computerprogramma’s kunnen de ampliconlengte tot op 1 nucleotide nauwkeurig schatten. Technieken voor mutatie-analyse: ○ SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism),HA(Heteroduplex Analyse)enDGGE (Denaturerende Gradiënt Gelelektroforese)worden gebruikt om PCR-producten snel te screenen op mutaties. ○ Deze technieken worden vaak ingezet ompatiëntenpopulatieste screenen op mutaties in kandidaatgenen. ○ De analyse toont welke patiënten afwijkende PCR-producten vertonen, maar voor de precieze mutatie issequentie-analysenodig. PCR-ASO en PCR-RFLP analyses: ○ PCR-ASO-analyse: Vergelijkbaar met de ASO dot blot,maar het vertrekpunt is nu een PCR-product. ○ PCR-RFLP-analyse: Vergelijkbaar met klassieke RFLP,maar het vertrekpunt is ook een PCR-product. Sequentie-analyse: ○ De ultieme methode voor het analyseren van desequentievan een PCR-product issequentie-analyse. Gespecialiseerde PCR’s: . M 1 utagenese PCR Doel van mutagenese PCR: Mutagenese PCR wordt gebruikt om opzettelijke mutaties (zoals puntmutaties, inserties of deleties) in een specifiek DNA-segment in te brengen. Dit gebeurt door het gebruik van primers met minstens één opzettelijke mismatch, die de gewenste mutatie introduceren. Strategieën voor mutagenese PCR: ○ 5’-add-on-mutagenese: Bij deze strategie bevat de primer extra nucleotiden aan het 5'-uiteinde die niet aanwezig zijn in het doelwit-DNA. Deze extra nucleotiden worden geïntegreerd in het PCR-product, waardoor het uiteindelijke PCR-product de mutatie bevat. ○ Site-specifieke mutagenese: Deze methode introduceert mutaties in het midden van het PCR-product door twee parallelle PCR-reacties. PCR Agebruikt primer 1 en 1M, terwijlPCR Bprimer2 en 2M gebruikt. D e primers 1M en 2M bevatten een interne mismatch die de mutatie veroorzaakt. De PCR-producten van PCR A en B worden gemengd, gedenatureerd en gereneerd, wat leidt tot de vorming vanheteroduplex-strukturen. Het DNA-polymerase kan inwerken op de 3’-uiteinden van de heteroduplexen, waardoor een volledig dubbelstrengs DNA-molecuul ontstaat. Dit molecuul dient als template voor een nieuwe PCR-reactie, wat resulteert in een mutatie in het midden van het PCR-product. Voorbeeld: Mutatie van factor V (G-20210-A) ○ Een speciaal PCR-protocol is ontwikkeld om het onderscheid te maken tussenwild-typefactor V en factor V met deG-20210-Amutatie, die wordt geassocieerd met een verhoogd risico op thrombose. ○ Primers: Desense primeris ongeveer 500 bp stroomopwaartsvan de mutatie. Deantisense primeris achter de mutatie geplaatsten bevat een interne mismatch. Door deze mismatch in de antisense primer wordt een HindIII-restrictie-sitetoegevoegd in het PCR-productvan de mutatie. ○ Resultaat van PCR en restrictie-enzym digestie: Het PCR-product wordt gedigesteerd met HindIII. Homozygoot wild-typegeeft een fragment van 406 bp. Homozygoot mutatiegeeft een fragment van 383 bp. Heterozygootgeeft beide fragmenten van 406 en 383bp. De aanwezigheid van een extra HindIII-site in zowel wild-type als mutante PCR-producten dient ter controle dat de digestie correct is uitgevoerd. 2. ARMS (Amplification Refractory Mutation System) RMS is een techniek die gebaseerd is op de concepten van competitive oligonucleotide A priming, en maakt gebruik van primers met een 3'-mismatch, die niet door het DNA-polymerase verlengd worden. Het systeem maakt het mogelijk om primers te ontwerpen die specifiek binden aan ofwel wild-type ofwel mutant doelwit-DNA, afhankelijk van de aanwezigheid van een specifieke mutatie. Basisprincipes van ARMS: 3'-Mismatch: ○ Primers met een mismatch aan het3'-uiteindezullenniet effectief binden of verlengd worden door het polymerase. Dit zorgt ervoor dat primers alleen werken voor het specifieke doel-DNA dat perfect complementair is aan de primer. Mutatie-specifieke primers: ○ Door twee verschillende sets primers te ontwerpen — eentje die alleen werkt met het wild-type DNA en de andere die alleen werkt met het mutant DNA — kan men specifieke PCR-producten genereren afhankelijk van de aanwezigheid van de mutatie. Voorbeeld: G-2343-T Mutatie in JAK2 e G-2343-T mutatie in het JAK2-gen is van belang voor de diagnose en prognose van D leukemie. ARMS kan worden toegepast om deze mutatie te detecteren met de volgende primers: JAK-FI-1 (Sense primer): ○ Deze primer bindt uitsluitend aanwild-typeDNA. Het3'-uiteinde van de primer bevat een G-base, die perfect complementair is aan de wild-type sequentie, maar een mismatch vormt met het mutant DNA. ○ Deze primer vormt een primerpaar metJAK-RO-1, wateen PCR-product van 224 bpoplevert bij wild-type DNA. JAK-RI-1 (Antisense primer): ○ Deze primer bindt uitsluitend aanmutantDNA. Het3'-uiteinde van de primer bevat een A-base, die complementair is aan het gemuteerde T, maar geen binding aangaat met wild-type DNA. ○ Deze primer vormt een primerpaar metJAK-FO-1, wateen PCR-product van 199 bpoplevert bij mutant DNA. Fluorescente detectie: Fluorescerende labels (FAM): ○ ZowelJAK-FI-1alsJAK-RI-1zijn gelabeld met eenfluorescerende probe (FAM), waardoor de PCR-producten na de amplificatie geanalyseerd kunnen worden met behulp vancapillaire elektroforese. Toepassing van ARMS: In de praktijk wordtalle 4 primersgecombineerd inéén enkele PCR-reactie. Hierdoor is het mogelijk om beide mutaties tegelijkertijd te detecteren, en biedt de PCR een interne controle, omdat altijd een PCR-product wordt verkregen, ongeacht de aanwezigheid van de mutatie. Het product vanJAK-FO-1enJAK-RO-1vormt een PCR-productvan370 bp, dat echter niet fluorescerend gelabeld is en dus niet gedetecteerd zal worden in de capillaire elektroforese, maar wel als controle dient voor de PCR-reactie. Samenvatting van Primernaamgeving: = Forward F R = Reverse O = Outer I = Internal ezetechniekiskrachtigvoorhetdetecterenvanspecifiekemutatiesenwordtveelgebruikt D voor genetische diagnostiek, vooral bij het identificeren van mutaties zoals de G-2343-T mutatie in JAK2. 3. Multiplex PCR ultiplex PCR is een techniek waarbij meer dan twee primers worden gebruikt om M meerdere PCR-producten tegelijkertijd te amplificeren inéénenkelereactie.Hetbiedtde mogelijkheidomverschillendedoelwitten(bijvoorbeeldverschillendegenenofverschillende regio’s binnen een gen) te amplificeren, wat het een krachtige methode maakt voor genetische diagnostiek en analyse. Toepassing van Multiplex PCR: Klonaliteitsdiagnostiek van T-lymfocyten en veelgebruikte toepassing van multiplex PCR is in de klonaliteitsdiagnostiek van E T-lymfocyten. Het TCR-gen (T-cell receptor) ondergaat reorganisaties tijdens de maturatie van T-lymfocyten. Deze reorganisatie resulteert in eenvariatievanhetTCR-gen bijeennormale,polyclonalepopulatievanT-lymfocyten.DitbetekentdatelkeT-lymfocytin een gezonde populatie een uniek TCR-gen heeft. Polyclonale populatie: ○ Bij een gezonde, polyclonale populatie vertonen de T-lymfocyten veel variaties in het TCR-gen. Monoclonale populatie: ○ Wanneer een T-lymfocyt na de reorganisatieabnormaalsnel prolifereert, ontstaat een monoclonale populatie, waarbij veel T-lymfocyten hetzelfde TCR-gen dragen. Dit is kenmerkend voor aandoeningen zoals leukemie. Multiplex PCR voor Klonaliteitsdiagnostiek: De multiplex PCR voor klonaliteitsdiagnostiek maakt gebruik vanmeerdere primers: S ense primersworden gebruikt voor verschillende variabeledomeinen in het TCR-gen. Een antisense primerwordt gericht op het constantedomein van het TCR-gen. oor deze combinatie van primers kunnen verschillende regio’s van het TCR-gen D tegelijkertijd geanalyseerd worden. Het resultaat vandePCRhangtafvandeaardvande T-lymfocytenpopulatie: Polyclonale populatie: ○ In een polyclonale populatie wordt eenverscheidenheidaan PCR-productengeproduceerd, dieverschillen in lengte.De resulterende amplicons zullen een reeks van verschillende lengtes vertonen, die samen eenGauss-curvegeven wanneer ze geanalyseerd wordenmetcapillaire elektroforese(een grafiek met regelmatige piekendie overeenkomen met een bp-ladder). Monoclonale populatie: ○ In een monoclonale populatie is één specifieke PCR-productsterk oververtegenwoordigd. Dit resulteert in een scherpe,enkele piekop de capillaire elektroforese (met de regelmatige pieken afkomstig van de bp-ladder). Dit wijst op een abnormale proliferatie van T-lymfocyten met een identieke reorganisatie in hun TCR-gen. Samenvatting: M ultiplex PCRmaakt het mogelijk om meerdere doelwittentegelijk te amplificeren, wat efficiëntie verhoogt in diagnostische tests. Bijklonaliteitsdiagnostiek van T-lymfocytenwordtmultiplex PCR gebruikt om te bepalen of een T-lymfocytenpopulatie monoclonaal of polyclonaal is, wat belangrijk is voor de diagnose van ziekten zoals leukemie. De resultaten van multiplex PCR worden geanalyseerd viacapillaire elektroforese, waar polyclonale populaties een verscheidenheid aan amplicons tonen, terwijl monoclonale populaties zich manifesteren als een enkele dominante piek. Nested PCR ested PCR is een techniek waarbij twee opeenvolgende PCR-reacties worden N uitgevoerd om de gevoeligheid en specificiteitvandePCRteverhogen.Hetprocesomvat de volgende stappen: Werking van Nested PCR: 1. Eerste PCR-ronde (traditionele PCR): ○ In de eerste ronde wordt een klassieke PCR uitgevoerd met een primerpaar dat gericht is op een breed doelwit. ○ Deze PCR produceert een initiële hoeveelheid van het PCR-product (de amplicon), maar deze is mogelijk vervuild met niet-specifieke producten of bevat een lage concentratie van het specifieke doelwit. 2. Tweede PCR-ronde (Nested PCR): ○ In de tweede ronde wordt het PCR-product van de eerste ronde gebruikt als het doelwit-DNA. ○ Voor deze tweede PCR gebruikt mentwee nieuwe primersdie binnen het doelwit van de eerste PCR liggen, en die specifiek aan hetPCR-product van de eerste rondebinden. De primers van de eerste rondeflankeren de primers van de tweede ronde, wat zorgt voor een meer gerichte amplificatie van het gewenste fragment. Voordelen van Nested PCR: V erhoogde gevoeligheid: Door twee opeenvolgende PCR-rondes uit te voeren, wordt de kans vergroot dat een zeer lage hoeveelheid doelwit-DNA gedetecteerd kan worden, omdat de hoeveelheid van het targetproduct exponentieel toeneemt. Verhoogde specificiteit: Omdat er twee verschillende primerparen worden gebruikt (één voor elke ronde), wordt de kans op amplificatie van niet-specifieke producten verkleind. Dit verbetert de nauwkeurigheid van de PCR, vooral wanneer het doelwit-DNA zich in een complexe mengsel bevindt. Toepassing: Nested PCR wordt vaak gebruikt in gevallen waarin: L age hoeveelheden DNAaanwezig zijn, zoals bij moeilijk te verkrijgen monsters (bijvoorbeeld voor DNA-extracties uit klinische monsters of oude monsters). Hoge specificiteit vereist is, zoals in gevallen vanmutatieanalyseofpathogene detectie, waarbij slechts een klein aantal doelwittenmoeten worden geïdentificeerd uit een complexe achtergrond van DNA. Samenvatting: ested PCRiseenkrachtigetechniekdiegevoeligheidenspecificiteitverhoogtdoorhet N uitvoeren van twee opeenvolgende PCR-reacties met verschillende primers.Ditmaakthet mogelijkomzelfslagehoeveelhedendoel-DNAbetrouwbaarteamplificeren,terwijldekans op vervuiling of niet-specifieke amplificatie wordt verminderd. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) LPA is een PCR-methode die het mogelijk maakt om 45 verschillende targets in één M enkele PCR-reactie te detecteren. Dit gebeurt door probe-amplificatie, wat verschilt van andere PCR-technieken die staal-DNA amplificeren. De geamplificeerde probes hebben specifieke lengtes, zodat ze na capillaire elektroforese als afzonderlijke pieken verschijnen. Werking van MLPA: 1. Ontwikkeling van halfprobes: ○ Voor elk target-DNA wordentwee halfprobesontwikkeld:eenupstreamen eendownstreamhalfprobe. ○ Upstream-halfprobe: Het 5'-uiteinde isniet complementairaan de targetsequentie, het 3'-uiteindewel complementair. ○ Downstream-halfprobe: Het 3'-uiteinde isniet complementairaan de targetsequentie, het 5'-uiteindewel complementair. ○ Deupstream halfprobebevat eenupstream primerbindingsplaats (identiek voor alle upstreamprobes). ○ Dedownstream halfprobebevat eendownstream primerbindingsplaats (identiek voor alle downstreamprobes) en eenstuffersequentiedie afhankelijk van het target korter of langer is, en zorgt voor een specifieke lengte van alle probes. 2. Hybridisatie en ligatie: ○ De halfprobeshybridiserenmet het target-DNA. ○ Eenligase-enzymverbindt het vrije 3’-uiteinde vande upstreamprobe met het vrije 5’-uiteinde van de downstreamprobe, maar dit gebeurt alleen als de halfprobesperfect complementairzijn aan de targetsequentie. ○ Dit maakt MLPA geschikt voorkwantitatieve analyses,aangezien de ligatie-afhankelijkheid van de target-DNA-moleculen het aantal geligeerde probes bepaalt. 3. PCR-amplificatie: ○ De geligeerde probes dienen als het doelwit voorPCRmet één primerpaar, waarbij één van de primers fluorescerend gelabeld is. ○ H et PCR-product is een mengsel van geamplificeerde probes die fluorescerenen door hun grootte te onderscheidenzijn. 4. Capillaire elektroforese en analyse: ○ Na PCR wordt het mengsel gescheiden viacapillaireelektroforese. ○ Het elektroferogram toontpiekpatronendie het resultaatzijn van de geamplificeerde probes. ○ De pieken kunnen vergeleken worden met die van eencontrolestaalom zowel deaan- en afwezigheidvan pieken als depiekoppervlaktete analyseren. Toepassingen van MLPA: K walitatief: Detectie vanmutatiesdoor het gebruikvan wild-type probes. Bij mutaties worden pieken gehalveerd (heterozygoot) of verdwijnen ze (homozygoot). Kwantitatief: Toepassingen zoals deHER2-amplificatiebij borsttumoren of het syndroom van Down. ○ Bijvoorbeeld, eenMLPA-kit voor HER2-amplificatiebevat 40 probesets, waarvan 3 gericht zijn op het HER2-gen. ○ Na hybridisatie en ligatie worden de probes geamplificeerd met generieke fluorescent-gelabelde primers en geanalyseerd via capillaire elektroforese. ○ In het elektroferogram wordt defluorescentieuitgezettegen de fragmentlengteen wordt deoppervlakte onder elkepieksoftwarematig verwerkt om de amplificatie te kwantificeren. Samenvatting: LPA is een krachtige techniek die via probe-amplificatie in één PCR-reactie meerdere M targetsequenties kan detecteren. Het proces omvat hybridisatie, ligatie van probes, PCR-amplificatieencapillaireelektroforese.Dezetechniekwordtveeltoegepastinzowel tumordiagnostiek als klinische genetica, voor zowel kwantitatieve als kwalitatieve toepassingen.
