Moleculaire Biologie: Site-specifieke Mutagenese
52 Questions
0 Views

Choose a study mode

Play Quiz
Study Flashcards
Spaced Repetition
Chat to Lesson

Podcast

Play an AI-generated podcast conversation about this lesson

Questions and Answers

Wat is een kernaspect van de 5’-add-on-mutagenese strategie?

  • Het bevat extra nucleotiden aan het 5'-uiteinde van de primer. (correct)
  • Het resulteert altijd in een vergrootte hoeveelheid DNA.
  • Het maakt geen gebruik van primers met mismatches.
  • Het introduceert mutaties aan het 3'-uiteinde van het DNA.

Wat is de rol van de primers 1M en 2M in site-specifieke mutagenese?

  • Ze bevatten een overeenkomstige sequentie die de mutatie bevordert.
  • Ze zorgen voor een verlaging van de PCR-efficiëntie.
  • Ze brengen alleen de juiste nucleotiden voor het doelwit-DNA aan.
  • Ze introduceren een interne mismatch die de mutatie veroorzaakt. (correct)

Wat gebeurt er na de PCR-reacties in site-specifieke mutagenese?

  • De PCR-producten worden samengevoegd zonder enige aanpassing.
  • Heteroduplexstructuren worden gevormd door gemengde PCR-producten. (correct)
  • DNA-polymerase werkt op de 5’-uiteinden van de heteroduplexen.
  • De primers worden verwijderd voordat het DNA wordt gedenatureerd.

Wat is het uiteindelijke resultaat van de PCR-producten in site-specifieke mutagenese?

<p>Een volledig dubbelstrengs DNA-molecuul wordt gevormd. (A)</p> Signup and view all the answers

Welke functie hebben de extra nucleotiden in de 5’-add-on-mutagenese?

<p>Ze integreren in het PCR-product om een mutatie te introduceren. (A)</p> Signup and view all the answers

Wat is het primaire doel van multiplex PCR voor klonaliteitsdiagnostiek?

<p>Het bepalen van de klonaliteit van T-lymfocyten. (B)</p> Signup and view all the answers

Welke soort primers worden gebruikt in de multiplex PCR voor klonaliteitsdiagnostiek?

<p>Een combinatie van sense en antisense primers wordt gebruikt. (C)</p> Signup and view all the answers

Wat kenmerkt een polyclonale populatie in de context van PCR-resultaten?

<p>Er zijn verschillende amplicons van verschillende lengtes. (B)</p> Signup and view all the answers

Wat is het resultaat van een monoclonale populatie in capillaire elektroforese?

<p>Een scherpe, enkele piek die oververtegenwoordigd is. (C)</p> Signup and view all the answers

Wat geeft de Gauss-curve aan bij de analyse van PCR-producten?

<p>Er is een diversiteit aan PCR-producten met verschillende lengtes. (D)</p> Signup and view all the answers

Wat gebeurt er met pieken bij mutaties als deze homozygoot zijn?

<p>Pieken verdwijnen. (D)</p> Signup and view all the answers

Wat is de rol van de MLPA-kit in de detectie van HER2-amplificatie?

<p>Het bevat probesets waarvan enkele specifiek zijn voor het HER2-gen. (B)</p> Signup and view all the answers

Welke techniek wordt toegepast na hybridisatie en ligatie in het MLPA-proces?

<p>PCR-amplificatie met generieke fluorescent-gelabelde primers. (A)</p> Signup and view all the answers

Hoe wordt de fluorescentie geanalyseerd in het elektroferogram?

<p>Tegen de fragmentlengte. (A)</p> Signup and view all the answers

Welke toepassingsgebieden zijn er voor LPA?

<p>Tumordiagnostiek en klinische genetica. (B)</p> Signup and view all the answers

Wat is het resultaat van de primer JAK-FO-1 bij gemuteerd DNA?

<p>Een PCR-product van 199 bp (C)</p> Signup and view all the answers

Welke functie heeft het fluorescerende label (FAM) in de PCR-analyse?

<p>Het stelt de detectie van PCR-producten mogelijk (D)</p> Signup and view all the answers

Wat is de rol van de primers in de multiplex PCR-techniek?

<p>Ze amplificeren meerdere PCR-producten in een enkele reactie (D)</p> Signup and view all the answers

Wat gebeurt er bij de reorganisatie van het TCR-gen in T-lymfocyten?

<p>Er ontstaat variatie in het TCR-gen bij een normale populatie (B)</p> Signup and view all the answers

Wat is een kenmerk van een monoclonale populatie T-lymfocyten?

<p>Veel T-lymfocyten delen hetzelfde TCR-gen (B)</p> Signup and view all the answers

Wat is een belangrijk voordeel van het gebruik van multiplex PCR?

<p>Het biedt een interne controle bij elke reactie (D)</p> Signup and view all the answers

Welke mutatie wordt vaak gedetecteerd met de ARMS-techniek?

<p>G-2343-T mutatie (D)</p> Signup and view all the answers

Waarom wordt de PCR-product van JAK-FO-1 en JAK-RO-1 niet gedetecteerd in capillaire elektroforese?

<p>Het is niet fluorescerend gelabeld (D)</p> Signup and view all the answers

Wat is de rol van de A-base aan het 3'-uiteinde van de primer?

<p>Het bindt aan het gemuteerde T (B)</p> Signup and view all the answers

Welke functie hebben de primers zoals F, R, O en I?

<p>Ze geven aan of het een forward of reverse primer is (D)</p> Signup and view all the answers

Wat is het doel van de denaturatiestap in het PCR-proces?

<p>De temperatuur verhogen tot 94°C om DNA te splitsen. (C)</p> Signup and view all the answers

Welke eigenschap van Taq-polymerase beïnvloedt de snelheid van de PCR?

<p>Het heeft geen proofreading-activiteit. (A)</p> Signup and view all the answers

Wat is de functie van primers in het PCR-proces?

<p>Ze initiëren de verlenging van de nieuwe DNA-strengen. (C)</p> Signup and view all the answers

Welke temperatuur is optimaal voor de polymerisatiestap van Taq-polymerase?

<p>72°C (B)</p> Signup and view all the answers

Wat is een nadeel van Taq-polymerase?

<p>Het heeft een hoog foutpercentage. (B)</p> Signup and view all the answers

Hoe draagt de keuze van primers bij aan de specificiteit van de PCR?

<p>Door de annealingtemperatuur aan te passen. (B)</p> Signup and view all the answers

Wat is de rol van hot start polymerasesystemen?

<p>Het voorkomt aspecifieke priming. (D)</p> Signup and view all the answers

Wat veroorzaakt aspecifieke priming in een PCR-reactie?

<p>Lage temperaturen bij het starten van de reactie. (A)</p> Signup and view all the answers

Waarom is het belangrijk om de te amplificeren DNA-sequentie te kennen bij het ontwerpen van primers?

<p>Om primers correct te ontwerpen voor binding. (D)</p> Signup and view all the answers

Wat is het primaire doel van Pfu-polymerase in vergelijking met Taq-polymerase?

<p>Hogere replicatiegetrouwheid. (D)</p> Signup and view all the answers

Wat is een kenmerk van een typische PCR-reactie?

<p>Het omvat meestal ongeveer 30 cycli. (A)</p> Signup and view all the answers

Waarom is Taq-polymerase bijzonder geschikt voor PCR?

<p>Het is thermostabiel en functioneert optimaal bij 72°C. (A)</p> Signup and view all the answers

Hoe verhoudt de polymerasesnelheid van Pfu-polymerase zich tot Taq-polymerase?

<p>Taq is sneller dan Pfu. (A)</p> Signup and view all the answers

Wat kan duiden op een probleem met de extractie tijdens PCR?

<p>Een gebrek aan PCR-product (B)</p> Signup and view all the answers

Wat gebeurt er tijdens de annealing-stap?

<p>De primers binden aan de specifieke DNA-strengen. (D)</p> Signup and view all the answers

Waarom is PCR kwetsbaar voor contaminatie?

<p>Omdat het een gevoelige techniek is (C)</p> Signup and view all the answers

Wat is een belangrijke maatregel om contaminatie te voorkomen in PCR?

<p>Het scheiden van ruimtes voor pre- en post-PCR stappen (D)</p> Signup and view all the answers

Wat wordt er bedoeld met een positieve controle in PCR?

<p>Een controle die altijd positief moet zijn zonder inhibitoren (B)</p> Signup and view all the answers

Welke techniek wordt doorgaans gebruikt voor de analyse van mutaties in PCR-producten?

<p>PCR-RFLP (A)</p> Signup and view all the answers

Welke van de volgende opties beschrijft het beste de grootte van het amplicon die het meest efficiënt is in PCR?

<p>Kleiner dan 200 bp (D)</p> Signup and view all the answers

Wat gebeurt er wanneer een puntmutatie zich bevindt in de buurt van een primerpaar?

<p>Het beïnvloedt de sequentie maar niet de lengte (B)</p> Signup and view all the answers

Welke techniek biedt de meeste precisie bij het analyseren van de sequentie van een PCR-product?

<p>Sequentie-analyse (D)</p> Signup and view all the answers

Wat wordt er bedoeld met exogeen DNA in de PCR?

<p>DNA dat van buitenaf is toegevoegd (A)</p> Signup and view all the answers

Wat is een van de grootste zorgen met betrekking tot contaminatie in PCR?

<p>Contaminatie van post-PCR staal met pre-PCR staal (A)</p> Signup and view all the answers

Welke uitspraak over kwantitatieve PCR (qPCR) is correct?

<p>Het versterkt doorgaans kleinere fragmenten van 50-150 bp (D)</p> Signup and view all the answers

Wat is een gebruikelijke controle wanneer je de lengte van PCR-producten analyseert?

<p>Een bp-ladder in een aparte lane (B)</p> Signup and view all the answers

Wat is het doel van mutagenese PCR?

<p>Invoeren van opzettelijke mutaties in een DNA-segment (D)</p> Signup and view all the answers

Flashcards

PCR (polymerase chain reaction)

Een techniek die gebruik maakt van DNA-polymerase om een specifiek DNA-fragment exponentieel te vermenigvuldigen.

Denaturatie

De eerste stap in het PCR-proces waarbij de dubbele helix van DNA wordt gescheiden in twee enkelstrengs DNA-moleculen door verhitting tot 94°C.

Annealingstemperatuur

Een temperatuur waarbij de primers binden aan de complementaire DNA-strengen.

Sense (forward) primer

Een van de twee primers die aan de complementaire DNA-streng binden tijdens het PCR-proces.

Signup and view all the flashcards

Antisense (reverse) primer

Een van de twee primers die aan de complementaire DNA-streng binden tijdens het PCR-proces.

Signup and view all the flashcards

DNA-polymerase

Een enzym dat DNA-strengen synthetiseert door het toevoegen van nucleotiden aan de 3'-eind van de primer.

Signup and view all the flashcards

Taq-polymerase

Een thermostabiel DNA-polymerase dat optimaal functioneert rond 72°C, waardoor het geschikt is voor PCR.

Signup and view all the flashcards

Pfu-polymerase

Een thermostabiel DNA-polymerase met proofreading-activiteit, waardoor het nauwkeuriger is dan Taq-polymerase.

Signup and view all the flashcards

dNTPs (deoxyribonucleotide trifosfaten)

Nucleotiden die de bouwstenen vormen van de nieuwe DNA-streng tijdens de polymerisatiestap.

Signup and view all the flashcards

Verlenging (elongation)

Het proces waarbij het DNA-polymerase de primers verlengt vanaf het 3'-uiteinde, waardoor een nieuw DNA-fragment wordt gecreëerd.

Signup and view all the flashcards

Proofreading-activiteit

Het vermogen van een DNA-polymerase om fouten tijdens het kopiëren van DNA te detecteren en te corrigeren.

Signup and view all the flashcards

A-overhangs

Het vermogen van een DNA-polymerase om A-overhangs aan het einde van een DNA-fragment te creëren.

Signup and view all the flashcards

Aspecifieke priming

Het ontstaan van aspecifieke primerbindingen aan niet-doel-DNA, wat de efficiëntie en specificiteit van de PCR verlaagt.

Signup and view all the flashcards

Hot start

Een methode om aspecifieke priming te voorkomen door de activiteit van het DNA-polymerase te vertragen tot een hogere temperatuur.

Signup and view all the flashcards

Mutagenese PCR

Een techniek die gebruikmaakt van primers met een opzettelijke mismatch om een ​​specifieke mutatie in DNA te introduceren.

Signup and view all the flashcards

5'-add-on-mutagenese

Een strategie waarbij de primer extra nucleotiden bevat aan het 5'-uiteinde, die niet aanwezig zijn in het doelwit-DNA. Deze extra nucleotiden worden in het PCR-product geïntegreerd, waardoor het uiteindelijke PCR-product de mutatie bevat.

Signup and view all the flashcards

Site-specifieke mutagenese

Een methode die mutaties in het midden van het PCR-product introduceert door twee parallelle PCR-reacties met primers die een interne mismatch bevatten.

Signup and view all the flashcards

Heteroduplex-structuren

Het mengen en denatureren van PCR-producten van PCR A en B, gevolgd door hereniging, wat leidt tot de vorming van heteroduplex-structuren.

Signup and view all the flashcards

Vorming van dubbelstrengs DNA

Het DNA-polymerase verlengt de 3'-uiteinden van de heteroduplexen, waardoor een volledig dubbelstrengs DNA-molecuul ontstaat.

Signup and view all the flashcards

Interne controle

Een controle die samen met het diagnostisch amplicon geamplificeerd wordt. Een afwezigheid van het PCR-product kan wijzen op inhibitie of een probleem met de extractie.

Signup and view all the flashcards

Exogeen DNA

Een vaste hoeveelheid exogeen DNA dat aan alle extracten wordt toegevoegd om de amplificatie van het exogeen amplicon te controleren. Dit wordt vaak gebruikt in kwantitatieve PCRs.

Signup and view all the flashcards

PCR zonder product

Een situatie waarbij een PCR geen product oplevert, wat kan duiden op inhibitie of afwezigheid van het diagnostisch amplicon.

Signup and view all the flashcards

Contaminatie tijdens staalname

De toevoeging van contaminatie tijdens het verzamelen van het staal.

Signup and view all the flashcards

Contaminatie tussen stalen

De overdracht van contaminatie van één staal naar een ander.

Signup and view all the flashcards

Contaminatie door onderzoeker

De overdracht van contaminatie van de onderzoeker naar het staal.

Signup and view all the flashcards

Contaminatie van pre-PCR-staal met post-PCR-staal

Contaminatie van pre-PCR-staal met post-PCR-staal.

Signup and view all the flashcards

Pre-PCR ruimte

Een speciale ruimte die gebruikt wordt voor de voorbereiding van staal voor PCR-reacties.

Signup and view all the flashcards

Post-PCR ruimte

Een speciale ruimte die gebruikt wordt voor het uitvoeren van PCR-reacties.

Signup and view all the flashcards

UV-lichtbestraling

Het gebruik van UV-licht om werkplekken te decontamineren voor PCR-reacties.

Signup and view all the flashcards

Uracil-N-glycosylase (UNG)

Een enzym dat DNA met uracilbasen hydrolyseert.

Signup and view all the flashcards

Positieve controle

Een controle die altijd positief moet zijn, tenzij inhibitoren aanwezig zijn.

Signup and view all the flashcards

Negatieve controle

Een controle die altijd negatief moet zijn, tenzij er sprake is van contaminatie.

Signup and view all the flashcards

Amplicon

Het fragment DNA dat met behulp van PCR wordt geamplificeerd.

Signup and view all the flashcards

Grootte van het amplicon

De grootte van het DNA-fragment dat met PCR wordt geamplificeerd.

Signup and view all the flashcards

Klonaliteitsdiagnostiek

Een techniek om te onderzoeken of een populatie van T-lymfocyten afkomstig is van een enkele cel (monoclonaal) of van meerdere cellen (polyclonaal).

Signup and view all the flashcards

Multiplex PCR

De veel voorkomende techniek die gebruikt wordt voor klonaliteitsdiagnostiek. Deze techniek gebruikt meerdere primers om meerdere variabele regio's van het TCR-gen tegelijkertijd te amplificeren.

Signup and view all the flashcards

Monoclonale populatie

Een populatie van T-cellen afkomstig van één cel. Dit betekent dat alle T-cellen in deze populatie identiek zijn.

Signup and view all the flashcards

Polyclonale populatie

Een populatie van T-cellen afkomstig van meerdere cellen. Dit betekent dat de T-cellen in deze populatie verschillend zijn. Dit is de norm bij gezonde individuen.

Signup and view all the flashcards

Enkele piek op capillaire elektroforese

Het resultaat van multiplex PCR in een monoclonale populatie. Er wordt een scherpe piek gezien op de elektroforese. Deze piek komt overeen met het specifieke PCR-product dat sterk oververtegenwoordigd is.

Signup and view all the flashcards

Kwantitatieve MLPA

Bij deze techniek wordt het aantal kopieën van een specifiek DNA-fragment gekwantificeerd door te meten hoeveel fluorescentie er wordt uitgezonden tijdens de PCR-reactie.

Signup and view all the flashcards

MLPA: Principe

MLPA maakt gebruik van probes die hybridiseren met specifieke DNA-sequenties. Deze probes worden vervolgens geamplificeerd met behulp van PCR, waardoor de detectie van meerdere targets in één reactie mogelijk is.

Signup and view all the flashcards

MLPA: Toepassingen

MLPA wordt gebruikt om het 'copy number' van een specifiek gen te bepalen. Deze techniek wordt toegepast in onderzoek naar kanker en genetica.

Signup and view all the flashcards

MLPA: Analyse

Na hybridisatie van fluorescentie-gelabelde probes met het DNA, worden de probes geamplificeerd via PCR. De resulterende DNA-fragmenten worden vervolgens gescheiden via capillaire elektroforese, waarna de oppervlakte onder de fluorescentie-pieken wordt geanalyseerd.

Signup and view all the flashcards

MLPA: Mutaties

Mutaties in een gen kunnen leiden tot een halvering van de fluorescentie-piek (heterozygoot) of het verdwijnen ervan (homozygoot).

Signup and view all the flashcards

Wat is de werking van de ARMS-primer voor mutatiedetectie?

Een specifieke techniek, ARMS genaamd, gebruikt een primer die alleen aan mutant DNA bindt. Deze primer heeft aan zijn 3'-uiteinde een A-base die complementair is aan het gemuteerde T, maar geen binding aangaat met wild-type DNA.

Signup and view all the flashcards

Wat gebeurt er als de ARMS-primer aan mutant DNA bindt?

De ARMS-primer vormt een paar met een andere primer (JAK-FO-1) die een PCR-product van 199 bp oplevert bij aanwezigheid van het mutant DNA.

Signup and view all the flashcards

Hoe worden de PCR-producten zichtbaar gemaakt?

Zowel de forward- als de reverse-primer zijn gelabeld met een fluorescente probe (FAM). Dit zorgt ervoor dat de PCR-producten zichtbaar worden na amplificatie tijdens capillaire elektroforese.

Signup and view all the flashcards

Waarom worden alle 4 primers gecombineerd?

In de praktijk worden alle 4 primers gecombineerd in 1 PCR-reactie. Zo kunnen beide mutaties tegelijk gedetecteerd worden, en dient de PCR als interne controle omdat altijd een PCR-product wordt verkregen, ongeacht de aanwezigheid van de mutatie.

Signup and view all the flashcards

Wat is de rol van het 370 bp PCR-product?

Het product van JAK-FO-1 en JAK-RO-1 vormt een PCR-product van 370 bp, maar dit is niet fluorescerend gelabeld en wordt niet gedetecteerd. Dit product dient als controle voor de PCR-reactie.

Signup and view all the flashcards

Wat is multiplex PCR?

Multiplex PCR is een techniek waarbij meer dan 2 primers worden gebruikt om meerdere PCR-producten in 1 reactie te amplificeren.

Signup and view all the flashcards

Wat is het voordeel van multiplex PCR?

Multiplex PCR kan verschillende doelwitten amplificeren, zoals verschillende genen of regio's binnen 1 gen.

Signup and view all the flashcards

Waarvoor wordt multiplex PCR vaak gebruikt?

Een veelgebruikte toepassing van multiplex PCR is de klonaliteitsdiagnostiek van T-lymfocyten.

Signup and view all the flashcards

Wat is het verschil in TCR-genen tussen een gezonde en een monoclonale populatie?

Het TCR (T-cell receptor) gen ondergaat reorganisatie tijdens de maturatie van T-lymfocyten, wat resulteert in variatie van het TCR-gen in een gezonde populatie.

Signup and view all the flashcards

Waarom heeft een monoclonale populatie T-lymfocyten hetzelfde TCR-gen?

Een gezonde populatie T-lymfocyten heeft veel variaties in het TCR-gen, terwijl een monoclonale populatie veel T-lymfocyten heeft met hetzelfde TCR-gen.

Signup and view all the flashcards

Study Notes

PCR-principe

  • PCR staat voor Polymerase Chain Reaction
  • In 1983 introduceerde Mullis een primerpaar in een polymerase-reactie
  • Doel was aanvankelijk om dNTP's uit een staal te verwijderen
  • Ontdekte dat de methode kopieën van geprimeerd DNA produceerde, die exponentieel toenamen in opeenvolgende cycli van denaturatie, annealing en polymerisatie

Denaturatie en temperatuur

  • Denaturatiestap verhoogt temperatuur tot 94°C, waardoor dubbelstrengs DNA (dsDNA) smelt naar enkelstrengs DNA (ssDNA)
  • DNA-polymerase denatureert bij hoge temperaturen, wat de techniek arbeidsintensief maakte
  • Oplossing met Taq-polymerase in 1988: een thermostabiel enzym, waardoor de techniek vereenvoudigd werd en een revolutie teweegbracht in moleculaire biologie

Het PCR-proces

  • Denaturatie: Temperatuur verhoogd tot 94°C om dsDNA in ssDNA te splitsen
  • Annealing: Primers binden aan specifieke DNA-strengen (sense/forward en antisense/reverse primer)
  • Optimale annealingtemperatuur hangt af van primerlengte en samenstelling
  • Verlenging: DNA-polymerase verlengt primers van 5' naar 3' richting bij 72°C (optimale temperatuur voor Taq-polymerase)
  • Polymerisatiestap duurt langer bij grotere DNA-fragmenten
  • Exponentiële amplificatie via herhaalde cycli van denaturatie, annealing en polymerisatie
  • Elke nieuwe DNA-streng is een template in de volgende cyclus, vermenigvuldigt het gewenste DNA-fragment

dNTP's

  • Bouwstenen voor de verlenging van de nieuwe DNA-strengen door het polymerase

Taq-polymerase

  • Oorsprong: geïsoleerd uit de thermofiele bacterie Thermus aquaticus
  • Thermostabiel, functioneert optimaal rond 72°C
  • Polymerasesnelheid: 1 tot 2 kb per minuut (bij optimale temperatuur)
  • Nadeel: Geen proofreading-activiteit, foutpercentage 1 fout per 9.000 nucleotiden
  • A-overhangs: produceert 3' A-overhangs. Nuttig voor cloneren met TA-cloning vectoren

Pfu-polymerase

  • Oorsprong: Pyrococcus furiosus
  • Replicatiegetrouwheid: 1 fout per 1.300.000 nucleotiden
  • Polymerasesnelheid lager dan Taq: 0,5 tot 1 kb per minuut
  • Geen A-overhangs

Keuze van polymerase

  • Taq of Pfu wordt gekozen afhankelijk van snelheid, replicatiegetrouwheid en A-overhangs bij cloneren

Hot start polymerasesystemen

  • Voorkomen aspecifieke priming
  • Problemen bij lage temperatuur: aspecifieke priming en zelf-dimerisatie van primers
  • Oplossingen: DNA en primers worden gescheiden van polymerase bij lage temperatuur, activatie na verhitting

Primers en ontwerp

  • Sense (forward) en antisense (reverse) primers hybridiseren aan complementaire DNA-strengen
  • Primerlengte: meestal 17-30 nucleotiden
  • GC-gehalte: ideaal tussen 50-60%
  • Annealingtemperatuur: 5°C lager dan Tm (smeltpunt) van primers
  • Repetitieve sequenties en identieke basenstrekken vermijden voor correcte hybridisatie

Labelen van primers

  • Primer kan een label krijgen aan het 5' uiteinde, gebruikt voor markering van het PCR-product

Mismatches in primers

  • Mismatches kunnen ontstaan wanneer basen in de primer niet perfect matchen met de template
  • Mismatches kunnen invloed hebben op Tm-berekening en specificiteit

Template voor PCR

  • Doelwit voor PCR: DNA (genomisch, mitochondriaal, viraal, plasmiden, etc.)
  • RNA kan ook dienen als template na conversie naar DNA via reverse transcriptase

Inhibitoren in PCR

  • Inhibitoren zijn verbindingen die de PCR-reactie verstoren
  • Inhibitie komt door binding aan nucleïnezuren, remming van DNA-polymerase of binding aan nucleïnezuren

Voorbeelden van inhibitoren

  • Hemoglobine, galzouten, ureum, polysachariden
  • EDTA en Chelex, non-ionische detergenten
  • lonische detergenten (zoals SDS)

Oplossing voor inhibitoren

  • Extra zuiveringsstap, minder DNA-extract, hulpstoffen (zoals BSA), robust polymerase, meer polymerase

Interne controle in PCR

  • Gebruikt voor controle op inhibitie of detectie-problemen
  • Een interne controle wordt gerepliceerd samen met het te bepalen amplicon

Contaminatie in PCR

  • PCR is gevoelig voor contaminatie (pre- en post-PCR-stallen)
  • Preventie: gescheiden, gecontroleerde ruimte, UV-lichtbestraling van werkruimtes, Uracil-N-glycosylase (UNG)

Grootte van het amplicon

  • Kleiner amplicon, efficiëntere PCR

Analyse van PCR-producten

  • Soorten analyse: lengte en sequentie van het geamplificeerde product

Multiplex PCR

  • Methode om meerdere doelwitten tegelijkertijd te amplificeren
  • Toepassing in klonaliteitsdiagnostiek van T-lymfocyten (TCR-gen)

Nested PCR

  • Twee opeenvolgende PCR-reacties voor verhoogde gevoeligheid en specificiteit
  • Tweede ronde gebruikt het PCR-product van de eerste ronde als template
  • Voordelen: verhoogde gevoeligheid, specificiteit vooral bij complexe mengsels

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

  • PCR-methode om 45 verschillende targets in één reactie te detecteren
  • Identificeert target-DNA door probe-amplificatie met specifieke lengtes die zichtbaar zijn via capillaire elektroforese

Capillaire Elektroforese

  • Scheidt PCR-producten op basis van grootte
  • Resultaten worden geanalyseerd met elektroferogram
  • Piekoppervlakte is een maat voor kwantificatie

Toepassingen van MLPA

  • Kwalitatief: mutatiedetectie (wild-type probes)
  • Kwantitatief: quantificatie van amplificatie (bijv., HER2-amplificatie)

Studying That Suits You

Use AI to generate personalized quizzes and flashcards to suit your learning preferences.

Quiz Team

Related Documents

H4: PCR PDF

Description

Dit quiz behandelt de basisprincipes van site-specifieke mutagenese en multiplex PCR. Het richt zich op technieken, zoals de rol van primers en de analyse van PCR-producten. Beantwoord vragen over de verschillende strategieën en hun toepassingen in de biotechnologie.

More Like This

Use Quizgecko on...
Browser
Open
Browser
Browser