Moleculaire Biologie: Site-specifieke Mutagenese
52 Questions
0 Views

Choose a study mode

Play Quiz
Study Flashcards
Spaced Repetition
Chat to lesson

Podcast

Play an AI-generated podcast conversation about this lesson

Questions and Answers

Wat is een kernaspect van de 5’-add-on-mutagenese strategie?

  • Het bevat extra nucleotiden aan het 5'-uiteinde van de primer. (correct)
  • Het resulteert altijd in een vergrootte hoeveelheid DNA.
  • Het maakt geen gebruik van primers met mismatches.
  • Het introduceert mutaties aan het 3'-uiteinde van het DNA.

    • Wat is de rol van de primers 1M en 2M in site-specifieke mutagenese?

  • Ze bevatten een overeenkomstige sequentie die de mutatie bevordert.
  • Ze zorgen voor een verlaging van de PCR-efficiëntie.
  • Ze brengen alleen de juiste nucleotiden voor het doelwit-DNA aan.
  • Ze introduceren een interne mismatch die de mutatie veroorzaakt. (correct)

    • Wat gebeurt er na de PCR-reacties in site-specifieke mutagenese?

  • De PCR-producten worden samengevoegd zonder enige aanpassing.
  • Heteroduplexstructuren worden gevormd door gemengde PCR-producten. (correct)
  • DNA-polymerase werkt op de 5’-uiteinden van de heteroduplexen.
  • De primers worden verwijderd voordat het DNA wordt gedenatureerd.

    • Wat is het uiteindelijke resultaat van de PCR-producten in site-specifieke mutagenese?

    <p>Een volledig dubbelstrengs DNA-molecuul wordt gevormd.</p> Signup and view all the answers

    Welke functie hebben de extra nucleotiden in de 5’-add-on-mutagenese?

    <p>Ze integreren in het PCR-product om een mutatie te introduceren.</p> Signup and view all the answers

    Wat is het primaire doel van multiplex PCR voor klonaliteitsdiagnostiek?

    <p>Het bepalen van de klonaliteit van T-lymfocyten.</p> Signup and view all the answers

    Welke soort primers worden gebruikt in de multiplex PCR voor klonaliteitsdiagnostiek?

    <p>Een combinatie van sense en antisense primers wordt gebruikt.</p> Signup and view all the answers

    Wat kenmerkt een polyclonale populatie in de context van PCR-resultaten?

    <p>Er zijn verschillende amplicons van verschillende lengtes.</p> Signup and view all the answers

    Wat is het resultaat van een monoclonale populatie in capillaire elektroforese?

    <p>Een scherpe, enkele piek die oververtegenwoordigd is.</p> Signup and view all the answers

    Wat geeft de Gauss-curve aan bij de analyse van PCR-producten?

    <p>Er is een diversiteit aan PCR-producten met verschillende lengtes.</p> Signup and view all the answers

    Wat gebeurt er met pieken bij mutaties als deze homozygoot zijn?

    <p>Pieken verdwijnen.</p> Signup and view all the answers

    Wat is de rol van de MLPA-kit in de detectie van HER2-amplificatie?

    <p>Het bevat probesets waarvan enkele specifiek zijn voor het HER2-gen.</p> Signup and view all the answers

    Welke techniek wordt toegepast na hybridisatie en ligatie in het MLPA-proces?

    <p>PCR-amplificatie met generieke fluorescent-gelabelde primers.</p> Signup and view all the answers

    Hoe wordt de fluorescentie geanalyseerd in het elektroferogram?

    <p>Tegen de fragmentlengte.</p> Signup and view all the answers

    Welke toepassingsgebieden zijn er voor LPA?

    <p>Tumordiagnostiek en klinische genetica.</p> Signup and view all the answers

    Wat is het resultaat van de primer JAK-FO-1 bij gemuteerd DNA?

    <p>Een PCR-product van 199 bp</p> Signup and view all the answers

    Welke functie heeft het fluorescerende label (FAM) in de PCR-analyse?

    <p>Het stelt de detectie van PCR-producten mogelijk</p> Signup and view all the answers

    Wat is de rol van de primers in de multiplex PCR-techniek?

    <p>Ze amplificeren meerdere PCR-producten in een enkele reactie</p> Signup and view all the answers

    Wat gebeurt er bij de reorganisatie van het TCR-gen in T-lymfocyten?

    <p>Er ontstaat variatie in het TCR-gen bij een normale populatie</p> Signup and view all the answers

    Wat is een kenmerk van een monoclonale populatie T-lymfocyten?

    <p>Veel T-lymfocyten delen hetzelfde TCR-gen</p> Signup and view all the answers

    Wat is een belangrijk voordeel van het gebruik van multiplex PCR?

    <p>Het biedt een interne controle bij elke reactie</p> Signup and view all the answers

    Welke mutatie wordt vaak gedetecteerd met de ARMS-techniek?

    <p>G-2343-T mutatie</p> Signup and view all the answers

    Waarom wordt de PCR-product van JAK-FO-1 en JAK-RO-1 niet gedetecteerd in capillaire elektroforese?

    <p>Het is niet fluorescerend gelabeld</p> Signup and view all the answers

    Wat is de rol van de A-base aan het 3'-uiteinde van de primer?

    <p>Het bindt aan het gemuteerde T</p> Signup and view all the answers

    Welke functie hebben de primers zoals F, R, O en I?

    <p>Ze geven aan of het een forward of reverse primer is</p> Signup and view all the answers

    Wat is het doel van de denaturatiestap in het PCR-proces?

    <p>De temperatuur verhogen tot 94°C om DNA te splitsen.</p> Signup and view all the answers

    Welke eigenschap van Taq-polymerase beïnvloedt de snelheid van de PCR?

    <p>Het heeft geen proofreading-activiteit.</p> Signup and view all the answers

    Wat is de functie van primers in het PCR-proces?

    <p>Ze initiëren de verlenging van de nieuwe DNA-strengen.</p> Signup and view all the answers

    Welke temperatuur is optimaal voor de polymerisatiestap van Taq-polymerase?

    <p>72°C</p> Signup and view all the answers

    Wat is een nadeel van Taq-polymerase?

    <p>Het heeft een hoog foutpercentage.</p> Signup and view all the answers

    Hoe draagt de keuze van primers bij aan de specificiteit van de PCR?

    <p>Door de annealingtemperatuur aan te passen.</p> Signup and view all the answers

    Wat is de rol van hot start polymerasesystemen?

    <p>Het voorkomt aspecifieke priming.</p> Signup and view all the answers

    Wat veroorzaakt aspecifieke priming in een PCR-reactie?

    <p>Lage temperaturen bij het starten van de reactie.</p> Signup and view all the answers

    Waarom is het belangrijk om de te amplificeren DNA-sequentie te kennen bij het ontwerpen van primers?

    <p>Om primers correct te ontwerpen voor binding.</p> Signup and view all the answers

    Wat is het primaire doel van Pfu-polymerase in vergelijking met Taq-polymerase?

    <p>Hogere replicatiegetrouwheid.</p> Signup and view all the answers

    Wat is een kenmerk van een typische PCR-reactie?

    <p>Het omvat meestal ongeveer 30 cycli.</p> Signup and view all the answers

    Waarom is Taq-polymerase bijzonder geschikt voor PCR?

    <p>Het is thermostabiel en functioneert optimaal bij 72°C.</p> Signup and view all the answers

    Hoe verhoudt de polymerasesnelheid van Pfu-polymerase zich tot Taq-polymerase?

    <p>Taq is sneller dan Pfu.</p> Signup and view all the answers

    Wat kan duiden op een probleem met de extractie tijdens PCR?

    <p>Een gebrek aan PCR-product</p> Signup and view all the answers

    Wat gebeurt er tijdens de annealing-stap?

    <p>De primers binden aan de specifieke DNA-strengen.</p> Signup and view all the answers

    Waarom is PCR kwetsbaar voor contaminatie?

    <p>Omdat het een gevoelige techniek is</p> Signup and view all the answers

    Wat is een belangrijke maatregel om contaminatie te voorkomen in PCR?

    <p>Het scheiden van ruimtes voor pre- en post-PCR stappen</p> Signup and view all the answers

    Wat wordt er bedoeld met een positieve controle in PCR?

    <p>Een controle die altijd positief moet zijn zonder inhibitoren</p> Signup and view all the answers

    Welke techniek wordt doorgaans gebruikt voor de analyse van mutaties in PCR-producten?

    <p>PCR-RFLP</p> Signup and view all the answers

    Welke van de volgende opties beschrijft het beste de grootte van het amplicon die het meest efficiënt is in PCR?

    <p>Kleiner dan 200 bp</p> Signup and view all the answers

    Wat gebeurt er wanneer een puntmutatie zich bevindt in de buurt van een primerpaar?

    <p>Het beïnvloedt de sequentie maar niet de lengte</p> Signup and view all the answers

    Welke techniek biedt de meeste precisie bij het analyseren van de sequentie van een PCR-product?

    <p>Sequentie-analyse</p> Signup and view all the answers

    Wat wordt er bedoeld met exogeen DNA in de PCR?

    <p>DNA dat van buitenaf is toegevoegd</p> Signup and view all the answers

    Wat is een van de grootste zorgen met betrekking tot contaminatie in PCR?

    <p>Contaminatie van post-PCR staal met pre-PCR staal</p> Signup and view all the answers

    Welke uitspraak over kwantitatieve PCR (qPCR) is correct?

    <p>Het versterkt doorgaans kleinere fragmenten van 50-150 bp</p> Signup and view all the answers

    Wat is een gebruikelijke controle wanneer je de lengte van PCR-producten analyseert?

    <p>Een bp-ladder in een aparte lane</p> Signup and view all the answers

    Wat is het doel van mutagenese PCR?

    <p>Invoeren van opzettelijke mutaties in een DNA-segment</p> Signup and view all the answers

    Study Notes

    PCR-principe

    • PCR staat voor Polymerase Chain Reaction
    • In 1983 introduceerde Mullis een primerpaar in een polymerase-reactie
    • Doel was aanvankelijk om dNTP's uit een staal te verwijderen
    • Ontdekte dat de methode kopieën van geprimeerd DNA produceerde, die exponentieel toenamen in opeenvolgende cycli van denaturatie, annealing en polymerisatie

    Denaturatie en temperatuur

    • Denaturatiestap verhoogt temperatuur tot 94°C, waardoor dubbelstrengs DNA (dsDNA) smelt naar enkelstrengs DNA (ssDNA)
    • DNA-polymerase denatureert bij hoge temperaturen, wat de techniek arbeidsintensief maakte
    • Oplossing met Taq-polymerase in 1988: een thermostabiel enzym, waardoor de techniek vereenvoudigd werd en een revolutie teweegbracht in moleculaire biologie

    Het PCR-proces

    • Denaturatie: Temperatuur verhoogd tot 94°C om dsDNA in ssDNA te splitsen
    • Annealing: Primers binden aan specifieke DNA-strengen (sense/forward en antisense/reverse primer)
    • Optimale annealingtemperatuur hangt af van primerlengte en samenstelling
    • Verlenging: DNA-polymerase verlengt primers van 5' naar 3' richting bij 72°C (optimale temperatuur voor Taq-polymerase)
    • Polymerisatiestap duurt langer bij grotere DNA-fragmenten
    • Exponentiële amplificatie via herhaalde cycli van denaturatie, annealing en polymerisatie
    • Elke nieuwe DNA-streng is een template in de volgende cyclus, vermenigvuldigt het gewenste DNA-fragment

    dNTP's

    • Bouwstenen voor de verlenging van de nieuwe DNA-strengen door het polymerase

    Taq-polymerase

    • Oorsprong: geïsoleerd uit de thermofiele bacterie Thermus aquaticus
    • Thermostabiel, functioneert optimaal rond 72°C
    • Polymerasesnelheid: 1 tot 2 kb per minuut (bij optimale temperatuur)
    • Nadeel: Geen proofreading-activiteit, foutpercentage 1 fout per 9.000 nucleotiden
    • A-overhangs: produceert 3' A-overhangs. Nuttig voor cloneren met TA-cloning vectoren

    Pfu-polymerase

    • Oorsprong: Pyrococcus furiosus
    • Replicatiegetrouwheid: 1 fout per 1.300.000 nucleotiden
    • Polymerasesnelheid lager dan Taq: 0,5 tot 1 kb per minuut
    • Geen A-overhangs

    Keuze van polymerase

    • Taq of Pfu wordt gekozen afhankelijk van snelheid, replicatiegetrouwheid en A-overhangs bij cloneren

    Hot start polymerasesystemen

    • Voorkomen aspecifieke priming
    • Problemen bij lage temperatuur: aspecifieke priming en zelf-dimerisatie van primers
    • Oplossingen: DNA en primers worden gescheiden van polymerase bij lage temperatuur, activatie na verhitting

    Primers en ontwerp

    • Sense (forward) en antisense (reverse) primers hybridiseren aan complementaire DNA-strengen
    • Primerlengte: meestal 17-30 nucleotiden
    • GC-gehalte: ideaal tussen 50-60%
    • Annealingtemperatuur: 5°C lager dan Tm (smeltpunt) van primers
    • Repetitieve sequenties en identieke basenstrekken vermijden voor correcte hybridisatie

    Labelen van primers

    • Primer kan een label krijgen aan het 5' uiteinde, gebruikt voor markering van het PCR-product

    Mismatches in primers

    • Mismatches kunnen ontstaan wanneer basen in de primer niet perfect matchen met de template
    • Mismatches kunnen invloed hebben op Tm-berekening en specificiteit

    Template voor PCR

    • Doelwit voor PCR: DNA (genomisch, mitochondriaal, viraal, plasmiden, etc.)
    • RNA kan ook dienen als template na conversie naar DNA via reverse transcriptase

    Inhibitoren in PCR

    • Inhibitoren zijn verbindingen die de PCR-reactie verstoren
    • Inhibitie komt door binding aan nucleïnezuren, remming van DNA-polymerase of binding aan nucleïnezuren

    Voorbeelden van inhibitoren

    • Hemoglobine, galzouten, ureum, polysachariden
    • EDTA en Chelex, non-ionische detergenten
    • lonische detergenten (zoals SDS)

    Oplossing voor inhibitoren

    • Extra zuiveringsstap, minder DNA-extract, hulpstoffen (zoals BSA), robust polymerase, meer polymerase

    Interne controle in PCR

    • Gebruikt voor controle op inhibitie of detectie-problemen
    • Een interne controle wordt gerepliceerd samen met het te bepalen amplicon

    Contaminatie in PCR

    • PCR is gevoelig voor contaminatie (pre- en post-PCR-stallen)
    • Preventie: gescheiden, gecontroleerde ruimte, UV-lichtbestraling van werkruimtes, Uracil-N-glycosylase (UNG)

    Grootte van het amplicon

    • Kleiner amplicon, efficiëntere PCR

    Analyse van PCR-producten

    • Soorten analyse: lengte en sequentie van het geamplificeerde product

    Multiplex PCR

    • Methode om meerdere doelwitten tegelijkertijd te amplificeren
    • Toepassing in klonaliteitsdiagnostiek van T-lymfocyten (TCR-gen)

    Nested PCR

    • Twee opeenvolgende PCR-reacties voor verhoogde gevoeligheid en specificiteit
    • Tweede ronde gebruikt het PCR-product van de eerste ronde als template
    • Voordelen: verhoogde gevoeligheid, specificiteit vooral bij complexe mengsels

    MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

    • PCR-methode om 45 verschillende targets in één reactie te detecteren
    • Identificeert target-DNA door probe-amplificatie met specifieke lengtes die zichtbaar zijn via capillaire elektroforese

    Capillaire Elektroforese

    • Scheidt PCR-producten op basis van grootte
    • Resultaten worden geanalyseerd met elektroferogram
    • Piekoppervlakte is een maat voor kwantificatie

    Toepassingen van MLPA

    • Kwalitatief: mutatiedetectie (wild-type probes)
    • Kwantitatief: quantificatie van amplificatie (bijv., HER2-amplificatie)

    Studying That Suits You

    Use AI to generate personalized quizzes and flashcards to suit your learning preferences.

    Quiz Team

    Related Documents

    H4: PCR PDF

    Description

    Dit quiz behandelt de basisprincipes van site-specifieke mutagenese en multiplex PCR. Het richt zich op technieken, zoals de rol van primers en de analyse van PCR-producten. Beantwoord vragen over de verschillende strategieën en hun toepassingen in de biotechnologie.

    More Like This

    Use Quizgecko on...
    Browser
    Open
    Browser
    Browser