Triage Intracellulaire et Récepteur KDEL - PDF

Triage intracellulaire dans la **voie** de sécrétion : le récepteur KDEL Introduction  ============= Nous allons décrire *un des mécanismes que les cellules utilisent pour **trier les protéines.*** *Il y a un **transport permanent** de matériel dans la voie de sécrétion, cela signifie donc que s*...

Triage intracellulaire dans la **voie** de sécrétion : le récepteur KDEL Introduction  ============= Nous allons décrire *un des mécanismes que les cellules utilisent pour **trier les protéines.*** *Il y a un **transport permanent** de matériel dans la voie de sécrétion, cela signifie donc que s*ans mécanisme de triage, tous les compartiments auraient la même composition. Il faut **un triage qui soit associé au transport** sinon celui-ci mélangerait toutes les protéines dans chaque compartiment. Le mécanisme que nous allons étudier est un des mécanismes existants entre le RE et l'appareil de Golgi. *NB : il existe plusieurs mécanismes à chaque étape de la voie de sécrétion.* ***Le repliement des protéines*** - *Protéine **repliée** -\> **soluble*** - *Protéine **agrégée ou non repliée** -\> **insoluble*** *BiP -\> dans la RE -\> lier aux régions hydrophobes -\> stabilisent et donnent temps pour se replier* ***Vésicule constitutive*** - *Protéine retenue dans RE* Triage des protéines sécrétées ============================== Triage dans le réticulum endoplasmique -------------------------------------- [**C**onstat] : Les protéines dans la voie de sécrétion sont triées. On distingue **3 catégories de protéines retenues dans le RE** (qui ne sortent pas pour être sécrétées) : 1. Protéines participant aux fonctions **du RE** (ex : enzymes de la glycosylation) 2. Protéines dont la **conformation est incorrecte** (mal repliées donc pas fonctionnelles/instables) qui seront dégradées 3. Protéines **multimériques** (deux protéines ensemble ou plus) **incomplètes** (composées de sous-unités qui ne sont **pas encore assemblées**) Les 2 derniers points représentent la **fonction de triage et de contrôle de qualité dans le RE.** **[But ]**: Seules les protéines bien glycolysées, avec les bons ponts disulfures pourront être sécrétées. Si une protéine ne se replie pas bien, il faut qu'elle reste dans RE jusqu'à ce qu'elle se replie correctement à l'aide des **chaperonnes** (hors cellule, le repliement ne serait plus contrôlable). Si la protéine A est bien repliée elle est sécrétée. Si la même protéine A n'est pas bien repliée, une **protéine chaperonne** (BiP) s'y lie et l'empêche d'être sécrétée tant qu'elle n'a pas atteint sa forme stable. **Dans RE** BiP se lie sur une protéine mal repliée car elle **repère les acides aminés hydrophobes** exposés à la surface de la protéine, ce qui est anormal. BiP stabilise la protéine et évite qu'elle précipite. Une protéine peut être mal repliée pour plusieurs **raisons**, notamment : - Si elle est fondamentalement **incorrecte** (maladie génétique) : protéines ne se replieront jamais correctement à cause de cette mutation -\> défaut -\> comme si elle était absente - Si A et B forment une protéine multimérique et que A est produite avant B, il lui faut attendre la sous-unité manquante pour acquérir son bon repliement. Tant que la protéine A n**'a pas trouvé la protéine B**, BiP va rester liée sur A. Rôle de BiP (Binding Protein)** ** Se lier sur une protéine mal-repliée et s'assurer que la protéine ne sorte pas du RE et qu'elle y soit retenue. Toutes ces réactions s'effectuent dans la lumière du RE. - **Reconnaître et rester dans la RE** *Mais pourquoi BiP n'est pas sécrétée avec les autres protéines ?* **La tyrosinase** **Normale :** - Mélanosome = variante isosome - Influence sur la couleur de peau, cheveux et poils **Thermosensible :** - Froid = fonctionne - Chaud = fonctionne pas Chat siamois -\> corps blanc et les extrémités noires - Corps chaud -\> fonctionne pas - Extrémité froide -\> marche donc noir **Retenue dans RE :** - Replie pas mal mais pas assez bien - BiP la retient -\> comme s\'il n'y avait pas - Albinisme  **Mal repliée** - Dimère sécrétée avec 2 régions distinctes : A et B - Monomère lié à BiP retenu dans le RE - Excès de A -\> BiP reconnaît et s'associe - Permet d'éviter agrégats + permet la rétention dans RE Le signal de triage KDEL ------------------------ C'est [le 2^ème^ niveau d'analyse] de triage dans le RE. [Observation]** **: les quatre derniers acides aminés de la séquence de 3 protéines chaperonnes retenues dans le RE est **KDEL -\> protéines chaperonnes -\> calreticulin / BiP / PDI** [Hypothèse]** **: Peut-être que c'est cette séquence de 4 acides aminés KDEL **C-terminale** qui fait en sorte que ces protéines se retrouvent dans le RE. On pense qu'elle suffit pour assurer à une protéine sa **localisation dans le RE**. **On a fait 2 expériences pour confirmer l'hypothèse :** **[Expérience 1] :** On a pris la protéine BiP et on l'a mutée de sorte qu'elle n'ait pas la séquence KDEL. à On observe qu'elle est sécrétée hors de la cellule. [Conclusion 1] : La séquence KDEL C-terminale est **nécessaire** pour déterminer la localisation de BiP dans RE. **[Expérience 2] :** On a pris une protéine normalement sécrétée (Lysozyme). On a fait exprimer à une cellule une forme mutée de la protéine lysozyme à laquelle on a rajouté la séquence KDEL à l'extrémité C-terminale. à On observe que la protéine reste dans RE et n'est plus sécrétée. [Conclusion 2] : La séquence KDEL C-terminale est **suffisante** pour assurer la localisation de la protéine dans le RE. **[Conclusion générale] **: La séquence KDEL est **nécessaire et suffisante** pour qu'une protéine soit localisée dans RE. C'est **un signal de triage.** Un signal de transport rétrograde --------------------------------- On a imaginé 2 hypothèses expliquant le mécanisme permettant à BiP de rester dans le RE : 1. **Éviter que BiP ne sorte du RE** : implique un mécanisme qui empêche BiP de rentrer dans les vésicules qui quittent le RE pour aller dans l'appareil de Golgi (rétention) **à passif** 2. BiP peut s'échapper du RE et aller dans l'appareil de Golgi : mais **celui-ci la renvoie dans le RE** et elle est alors continuellement recyclée **à actif** La finalité du résultat est la même, BiP est localisée dans le RE. **[Modèle 1 :]** - **Les protéines KDEL sont retenues dans le RE** **[Modèle 2 :]** - **Les protéines KDEL peuvent sortir du RE, mais sont continuellement recyclées du Golgi vers le RE** **[Expérience]** pour déterminer quel modèle est juste : - On a purifié le RE - On analyse les sucres portés par les protéines KDEL **On sait que :** - Si une protéine ne sort pas du RE, elle aura **uniquement les sucres typiques du RE.** - Si une protéine sort et va dans l'appareil de Golgi puis revient dans le RE, ses sucres auront été modifiés par l'appareil de Golgi (elle portera les sucres typiques du Golgi). [Observation]** **: ces protéines portent des sucres typiques du Golgi  à Le modèle dynamique est donc correct. Il y a un **transport rétrograde** **continu et sélectif** des protéines KDEL de l'appareil de Golgi vers le RE. ### En résumé  Il n'y pas de rétention dans le RE mais un mécanisme de **transport rétrograde** dans le Golgi qui reconnaît les protéines portant la séquence KDEL et qui les renvoie en permanence vers le RE. On parle de transport rétrograde car il est à contre-sens par rapport à la sécrétion de protéines.   Le but est maintenant de découvrir un mécanisme dans l'appareil de Golgi qui est capable de sélectionner les protéines portant la séquence KDEL et de les **empaqueter** dans des vésicules qui **vont retourner dans le RE**. 3. Fonctionnement du récepteur au KDEL  [Composition] : 7 domaines transmembranaires, avec son domaine **luminal** contenant la partie **N-terminale** et son domaine **cytoplasmique** contenant la partie **C-terminale** [Localisation] : dans le **cis-Golgi**, le récepteur lie la séquence KDEL Le récepteur concentre ensuite les protéines dans des vésicules de transport rétrograde qui les ramènent dans le RE. De ce fait, une protéine sans KDEL gagne les citernes suivantes et est donc sécrétée. Fonction du récepteur au KDEL : 1. Liaison dans le cis-Golgi des protéines KDEL échappées du RE 2. Transport rétrograde sélectif des protéines KDEL vers le RE Arrivée à droite -\> récepteur reconnaît et concentre en vésicule -\> RE -\> récepteur retourne vers zone de réception. - **L'appareil de Golgi** - est par conséquent un des compartiments principaux où on opère du triage dans la voie de sécrétion. C'est aussi le compartiment qui possède toutes les **enzymes de glycosylation** (glycosyltransferase et glycosidase) et d'autres mécanismes liés à la modification post-transcriptionnelle des protéines. - **Citernes (5-7)** - Plein d'enzymes différentes - Au moins 3 compositions différentes -\> mélanges denses dans les compartiments   Flux constant -\> **appareil de Golgi ne bouge pas** Les enzymes doivent rester là-bas -\> ne doivent pas se mélanger Garder la composition -\> malgré le flux qui passe - **Transport vésiculaire : modèle 1**  **Formation de bourgeon** pour passer d'une citerne à une autre par la protéine en sécrétion - Se lie et rejoint le median Golgi - **Citernes sont stables** - **Enzymes golgiennes -\> retenues dans les citernes** - Protéines sécrétées sont transportées d'une citerne à une autre par des vésicules - **Maturation des citernes : modèle 2**  Toujours la même direction - Création de bourgeon sur la citerne cis -\> avec **les enzymes du Cis-golgi** - **Les protéines en sécrétion ne bougent pas** - Elles se lient avec des **enzymes de glycosylation** (protéine du RE) **sens retrograde** - **Décalage et disparition de l'ancien trans** -\> résultat final est le même que le modèle 1 car tout a été décalé sur le système cis. - **Pas les protéines qui se déplacent mais les enzymes** Modèle 1 -\> transport vésiculaire des protéines sécrétées - **Citernes stables** - Enzymes golgiennes retenues dans les citernes - Protéines sécrétées sont transportées d'une citerne à l'autre par des vésicules Modèle 2 -\> maturation des citernes golgiennes - Les citernes se forment du côté cis, se changent graduellement en citernes médias puis trans, qui se désagrègent - Les enzymes golgiennes sont transportées d'une citerne à l'autre (transport retrograde) **Maturation des citernes du Golgi chez la levure** - Comme chez les humains -\> les citernes sont **séparées** mais **pas en 1 unité** - Plus facile à observer avec la microscopie optique -\> les suivre grâce au **GFP** - Une cellule exprimant un marqueur du cis Golgi fusionné à la **GFP** et un marquer trans fusionné à la **RFP** - **Permet la visualisation directe** de la **maturation des citernes** du Golgi chez la levure **Limitations techniques** Résolution **optique** -\> vésicules **invisibles** (petite taille (peu fluorescent), signal faible, bougent vite) -\> taille 50nm et pixel à 200nm **Limitations conceptuelles** - Est-ce que le cadre de pensée (modèle, design expérimental, interpretation) est correct ? - Doute **Les vésicules** **3 types** dans les 2 modèles : 1. Vésicules issues du RE arrivent sur la face **cis** 2. Vésicules de **transport** se forment au niveau de chaque citerne 3. Vésicules d'**exocytose** se forment au nouveau de la face trans 2-\> transport vésiculaire -\> contingent les **protéines sécrétées** -\> pas les enzymes golgiennes 2-\> maturation des citernes -\> contiennent des **enzymes golgiennes** Immune-localisation d'une **enzyme golgienne** (ManII) ====================================================== Avec les **grains d'or** - Citernes -\> beaucoup d'or car les vésicules contiennent des enzymes golgiennes - Vésicules -\> peu ou presque pas car pas d enzyme golgienne dans les vésicules - **Transport vésiculaire** car dans les citernes -\> enzymes golgiennes - Et pas dans les vésicules car il y a les protéines sécrétées - Microscope électronique avec l'or Limitations techniques - La cellule est morte -\> une image fixe Limitations conceptuelles - Est-ce que le cadre de pensée (modèle, design expérimental, interpretation) est correct ? - Doute **MAN 2** A ce jour nous ne savons toujours pas.