Synthèse des protéines et triage PDF

Traffic intracellulaire et sécrétion Synthèse des protéines  ======================= Fonction des ribosomes ---------------------- Les ribosomes libres assurent la **synthèse des protéines dans le cytoplasme**. Les ribosomes sont **tous dans le cytosol** à part mitochondrie avec ses propres ribo...

Traffic intracellulaire et sécrétion Synthèse des protéines  ======================= Fonction des ribosomes ---------------------- Les ribosomes libres assurent la **synthèse des protéines dans le cytoplasme**. Les ribosomes sont **tous dans le cytosol** à part mitochondrie avec ses propres ribosomes. La protéine est d'abord synthétisée à partir de son extrémité **N-terminale** et se termine à l'extrémité **C-terminale**. **[Exception] :** quelques rares protéines sont synthétisées dans la mitochondrie qui possède ses propres ribosomes ces protéines restent dans la mitochondrie Transport nucléaire (dans noyau) -------------------------------- Une protéine synthétisée à plusieurs destinations possibles : **[1^ère^ destination]** : à l'intérieur du noyau (entouré par **l'enveloppe nucléaire**) Pour arriver jusqu'au noyau, une protéine doit traverser l'enveloppe qui sépare le cytoplasme de l'intérieur du noyau. Cette enveloppe nucléaire est composée de 2 membranes, chacune étant une **bicouche lipidique** (4 feuillets en tout). Pour passer du cytoplasme jusqu'au noyau, une protéine traverse l'enveloppe via les **pores nucléaires.** Les pores nucléaires sont abondamment présents sur le noyau et sont répartis sur toute la surface de celui-ci. Ils traversent l'enveloppe et sont composés d'un complexe de protéines (comme un bouchon). Ce pore permet de faire le tri entre les molécules traversant la membrane nucléaire (pas de diffusion possible). C'est une **structure** **d'échange contrôlé**. -\> sens et qui passe Protéine : **ARNpoly ADN poly -\> rentre par les pores nucléaires** **ARNm sort par les pores nucléaires** Translocation dans la **mitochondrie**  --------------------------------------- **[2^ème^ destination] : la mitochondrie** ### Structure mitochondrie  ### Transport des protéines dans la mitochondrie (post-traductionnel) Dans la mitochondrie, il y a des ribosomes qui permettent de synthétiser **les quelques protéines qui la constituent.** Mais la majorité des protéines mitochondriales sont **codées** par des gènes dans le **noyau** et synthétisées dans le cytoplasme par les ribosomes. Elles sont **ensuite transportées à l'intérieur** de la mitochondrie. [Expérience :] Reconstitution *in vitro* de ce transport (3 étapes) : 1\. Synthèse *in vitro (en milieu artificielle)* de protéine : ARNm + ribosomes 2\. Après production de la protéine : **ajout de mitochondries purifiées** 3\. Observation si les protéines déjà produites ont été capables de rentrer dans la mitochondrie Oui **Les mitochondries reconnaissent les protéines et les captent** Conclusion : **insertion post-traductionnelle dans la mitochondrie** [Vérification] : On a rajouté une protéase qui détruit tout ce qui est resté en dehors de la mitochondrie. **Seules les protéines dans la mitochondrie « survivent ».** Insertion co-traductionnelle dans le **RE**  -------------------------------------------- [3^ème^ destination]** **: Réticulum Endoplasmique (dans toutes les cell **sauf globules rouges**) ### Structure du RE  Réticulum : « filet » à l'intérieur du cytoplasme. Réseau de membranes **connecté avec l'enveloppe nucléaire**. C'est une continuité de la membrane externe du noyau. **Le RE a également une membrane.** ### Types de RE (rugueux et lisse) **Rugueux** : **Ribosomes collés** à la surface du RE côté cytoplasmique. Il s'agit donc d'un élément impliqué dans la **synthèse des protéines**. **Lisse** : **Pas de ribosomes collés**. Cette partie est impliquée dans la **synthèse de lipides membranaires** qui forment les lipides de la bicouche (les phospholipides)RE est le principal organite qui produit les membranes. Ils **régénèreront la membrane** du RE. Fluorescence et RE -\> sous unité reticulum endoplasmique ### **Insertion** dans le RE de protéines produites dans le cytoplasme On a fait la même [expérience] qu'avant : 1\. Synthèse *in vitro* de protéines destinées à aller dans le RE (ARN + ribosomes). 2\. Ajout de microsomes (Vésicule provenant de la fragmentation du réticulum endoplasmique) (RE purifiés) après synthèse des protéines [Constatation] : les protéines déjà synthétisées **ne sont pas introduites** dans le RE  à Pas d'insertion post-traductionnelle (≠mitochondrie) On refait la [même expérience mais] cette fois, on met le RE dans le tube au moment où les protéines sont produites. [Constatation]** **: On voit que les protéines sont insérées dans le RE. à **Insertion co-traductionnelle** (pendant la traduction de la protéine) C'est donc au moment de la traduction qu'il y a insertion des protéines dans le RE. **[RE -\> CO-TRADUCTIONNELLE ]** **[MITO -\> POST-TRADUCTIONNELLE]** En résumé --------- **4 destinations** possibles : 1. Produite dans le cytosol et reste dans **cytosol** (la majorité) 2. Produite dans cytosol et après traduction transportée dans le **noyau** via pores nucléaires 3. Produite dans cytosol et après sa traduction est transportée dans **mitochondrie**capté et reconnu par les mitochondries 4. Produite et injectée dans **RE** de manière co-traductionnelleles ribosomes sont accrochés sur le RE Mécanisme d'insertion des protéines dans le RE ============================================== Séquence signal du RE --------------------- Une protéine qui doit être sécrétée, et donc être insérée dans le RE, à une séquence signal. Celle-ci est présente dans **toutes les protéines destinées à aller dans le RE**. Composition de cette séquence (**séquence signal (SS) / guide**) à **l'extrémité N-terminale** : - **Méthionine** (premier acide aminé) - Des acides aminés chargés **hydrophiles** - 6-12 acides aminés **hydrophobes** (valine, leucine) - Séquence qui permet clivage protéolytique (par protéase) Protéine mature : perte de la séquence signal qui a été éliminée à un moment donné [Expérience] : On prend une protéine normalement sécrétée, donc préalablement insérée dans RE, et on lui enlève la séquence signal (biologie moléculaire). La protéine est alors produite mais reste dans le cytoplasme. On a donc besoin de la séquence signal pour le transport dans le RE : elle est nécessaire.  [Expérience complémentaire] : On prend une protéine qui est normalement produite dans cytoplasme et on fait fabriquer à la cellule cette protéine mais avec une séquence signal. On observe que cette protéine cytosolique est maintenant transportée dans le RE. Séquence signal est suffisante pour transport dans le RE. [Conclusion] : La séquence signal est **nécessaire** et **suffisante** pour qu'une protéine soit reconnue et transportée dans le réticulum endoplasmique Mécanisme de translocation -------------------------- Un ribosome rencontre une molécule d'ARNm et s'y lie. Il commence alors à produire la protéine en commençant par l'extrémité N-terminale. *[Déf translocation] : Déplacement d\'une substance d\'un site à un autre.\ Des translocations de molécules peuvent se faire dans une cellule, généralement par passage à travers une membrane.* [Étape 1] : Ce petit bout de protéine SS (séquence signal) est reconnu par une protéine **SRP** (« signal recognition particle » )(qui contient des acides aminés hydrophobes) qui vient s'y lier directement ainsi qu'au ribosome. Conséquence de la liaison SRP : SRP **bloque le ribosome** et stoppe momentanément la traduction Le ribosome reste fixé sur l'ARNm avec l'extrémité N-terminale déjà produite (seulement séquence guide) [Étape 2]** **: Le tout diffuse jusqu'au **récepteur à la SRP** (complexe transmembranaire) qui se trouve dans la **membrane du RE**. Pendant ce temps, le ribosome reste inactif car la traduction a cessé. Puis, le complexe diffuse vers le **pore de translocation** qui est recruté par la SRP. Celle-ci y **transfère** alors le **ribosome** avant de s'en détacher accompagnée de son récepteur. [Étape 3] : Le ribosome est en place sur le pore de translocation. Le pore qui était fermé s'ouvre (activation) et le ribosome recommence à traduire tout en injectant la protéine via le pore de translocation **dans le RE**. Une fois à l'intérieur du RE, il y a une **coupure** à l'extrémité N-terminale du signal par la **signal peptidase** [Étape 4] : Le ribosome arrive à la fin de la traduction de la protéine, se détache du pore et de l'ARN et le pore se referme. La protéine est dans le RE. [Résumé] : La protéine qui porte une séquence signal est reconnue **au moment où sa synthèse commence, sa synthèse s'arrête** jusqu'à ce qu'elle soit amenée vers le RE et se fasse injecter dans celui-ci. Synthèse de **protéines transmembranaire**s (une protéine contient un domaine transmembranaire (création feuillet alpha dans bicouche du RE)) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- C'est une variante du même mécanisme. La protéine transmembranaire a une séquence signal que la SRP reconnaît. La SRP se lie sur le RE, le ribosome se retrouve sur le pore de translocation et recommence à produire la protéine. Jusque-là, le matériel de traduction ne distingue pas l'ensemble de la protéine et ne reconnaît que la séquence signal. Le domaine transmembranaire est reconnu par le pore de translocation et est arrangé en **hélice alpha** (20 acides aminés hydrophobes). [Conséquence] : La **translocation s'arrête** à cause du blocage du pore et le ribosome continue à faire son travail pour synthétiser la partie cytoplasmique de la protéine. Puis, le pore de translocation s'ouvre sur le côté et fait sortir la protéine [latéralement par diffusion] dans la membranela protéine sort du pore de translocation par diffusion latérale Protéine transmembranaire de type 1 On a les 3 domaines : cytoplasmiques, transmembranaires et luminal / extra cellulaires Sécrétion de protéines (cytosoldehors de la cellule (extracellulaire)) ====================================================================== Jusqu'à maintenant, on a étudié les 4 destinations possibles d'une protéine dans la cellule. Mais on sait que des cellules sécrètent **les protéines de manière extracellulaire.** Les compartiments de la voie de sécrétion  ------------------------------------------ ### L'[expérience] de marquage et chasse ### On aimerait connaître l'ordre des compartiments par lesquels une protéine sécrétée passe, et en combien de temps. - **On part du principe que la protéine finit en dehors** de la cellule et on veut voir par quels compartiments elle est passée. - On marque les protéines [radioactivement] (avec **Leucine tritié**) au moment de leur synthèse. - On suit la vague de synthèse radioactive jusqu'à la sécrétion. Après un marquage de 5 minutes, on ne marque plus les nouvelles protéines synthétiséeson **enlève la leucine radioactive** du milieu **La période de chasse débute**, on suit les protéines synthétisées. Selon la durée de la période de chasse, on verra la succession des différents compartiments pour la chasse on **doit fixer les cellules** (elles meurent)on peut donc regarder par le **microscope électronique**répéter avec des temps de durée de plus en plus long - Utiliser du **cristal de AgBr** et le faire couler pour voir **où la lumière a tapé** b) La voie de sécrétion ----------------------- On a donc pu observer les compartiments successifs dans lesquels passent les protéines sécrétées : - Après 3 minutes de marquage, on trouve les protéines dans le **RE.** Une protéine destinée à être sécrétée s'insère pendant sa synthèse dans le RE en premier lieu. - Après 10 minutes de plus laissées aux protéines pour voyager dans cellule, elles sont retrouvées dans **l'appareil de Golgi**. ### Appareil de Golgi  - Série de petits sacs entassés (**5 citernes**) les uns sur les autres délimités chacun par une **membrane simple.** - 3 phases : -**Cis** : là où arrivent les protéines en premier et entrent -**Médial** : partie du milieu +10min -**Trans** : côté où les protéines arrivent en dernier et sortent +20min Le sens que les protéines utilisent pour traverser l'appareil de Golgi : **Cis à Trans.** ### Transfert du RE jusqu'à l'appareil de Golgi  - Le RE se déforme (petits bouts de RE qui se détachent = vésicules) -\> bourgeonnement - Les **vésicules** viennent jusqu'au côté cis de l'appareil de Golgi et s'insèrent dans sa membrane. -\> vésicule -\> **fusion** - **Les vésicules assurent le transport entre compartiments membranaires** Le contenu de la vésicule est transféré d'un compartiment à l'autre dans l'appareil de Golgi et le transfert inclut aussi tous les constituants de la membrane de la vésicule. (principe d'endocytose) **Le transport entre compartiments cellulaires :** 1. Bourgeonnement du RE menant à la formation d'une vésicule 2. Vésicule diffuse dans le cytosol 3. Fusion avec la membrane de la citerne cis-Golgi *NB : Même mécanisme entre les citernes de l'appareil de Golgi* Granule de sécrétion Les **granules de sécrétion** (1000 fois plus de volume que les vésicules) sont formés à partir de la **face trans-Golgi**. Après un marquage de 5 min et une longue chasse (au total 20min), les protéines atteignent ce [3^ème^ compartiment]. Puis, le granule de sécrétion (**immature**) reste dans la cellule un certain temps et son contenu devient très condensé (**mature**). Le granule vient alors s'ancrer sur la membrane plasmique et la bicouche lipidique de la **membrane** **du** **granule** **fusionne** avec la bicouche de la **membrane** **plasmique**. Ceci provoque la **libération du contenu du granule hors de la cellule (principe d'exocytose)** - **Chemins des protéines et les canaux récepteurs** - **Spécialisée, régulée et relâchée de façon contrôlée** ### Résumé **Les protéines destinées à être sécrétées** sont insérées dans le RE au moment de leur synthèse, puis au bout de 10 min elles sont retrouvées dans les citernes de Golgi. Au bout de 20-40 minutes elles se trouvent dans les granules de sécrétion. **La physiologie de notre organisme régule et contrôl**e, depuis l'extérieur de la cellule, le **temps d'attente du granule** avant qu'il ne puisse fusionner avec la membrane de la cellule pour sécréter ses protéines. Sécrétion régulée/constitutive ------------------------------ En réalité, toutes les cellules sécrètent mais il y a 2 types de sécrétion. ### La sécrétion régulée (ce qu'on vient de voir) - Observée que chez certains **types cellulaires (spécifique)** - Met en jeu des **granules** de sécrétion - La fusion des granules avec la surface est **régulée** - La cellule est capable de distinguer ce qu'elle met dans le granule : **triage** au moment de la formation du granule de ce qui doit être empaqueté. Cela implique que les protéines incorporées dans les granules portent des **signaux spécifiques de triage.** ### La sécrétion constitutive (tous le temps sans exception et dans toutes les cell) - Chez **tous les types cellulaires** (y compris ceux qui font de la sécrétion régulée) - Met en jeu des **vésicules** de sécrétion (**diamètre de 50nm**) - Ininterrompue : les vésicules se forment en continu sur face trans-Golgi, vont jusqu'à la membrane plasmique avec laquelle elles fusionnent forcément. Il n'y a donc **pas de régulation** ni de temps d'attente. - Sécrétion de protéines ne portant **pas de signaux de triage** : tout ce qui sort de Golgi et doit aller à la surface de la cellule rentre dans les vésicules. *NB :* ***- Toutes les protéines transmembranaires de la surface de la cellule viennent par la voie de sécrétio**n (sont passées par RE et Golgi)* Modifications post-traductionnelles =================================== Repliement et protéines chaperonnes ----------------------------------- La voie de sécrétion a une fonction supplémentaire : modifier les protéines qui ont été synthétisées. Ce sont donc des **modifications post-traductionnelles**. Il en existe plusieurs types. ### Repliement des protéines (sécrétées dans milieu extracellulaire) C'est **dans le RE** que les protéines sécrétées sont repliées. Pour aider le repliement, le RE dispose de **protéines chaperonnes**, comme par exemple la **protéine BiP** (Binding protein). **BiP** se lie sur une protéine nouvellement synthétisée p**as encore repliées (pas stables)** et s'en détache seulement quand la protéine est bien repliée dans sa forme stable et fonctionnelle. **éviter la précipitation et l'agrégation** *NB : BiP n'est pas la seule chaperonne qui participe au repliement des protéines.* Formation de ponts disulfure ---------------------------- Il y a formation de **ponts disulfure** uniquement chez les protéines destinées à être **sécrétées** ou **être de surface**. C'est donc une spécificité de la voie de sécrétion, unique aux protéines qui passent par le RE. L'environnement extérieur de la cellule n'est pas identique à l'environnement intracellulaire : - **Extracellulaire** : Contient de l'**oxygène** donc milieu **[oxydant]** - **Intracellulaire** : Contient du **sucre** donc milieu **[réducteur]** *NB : oxydation = perte d'e-* La protéine est sécrétée dans des conditions différentes que celles dans lesquelles elle est synthétisée. Du coup, les protéines sécrétées peuvent acquérir une conformation particulière, due notamment à la formation de **ponts disulfure entre 2 résidus cystéine.** Une protéine dispose d'un acide aminé particulier sensible à l'oxydo-réduction : **cystéine.** Dans le cytoplasme, toutes les protéines qui ont des Cys sont sous forme réduites CH2SH. Quand une protéine se retrouve dans le milieu extracellulaire oxydant, il y a une réaction d'oxydation. La protéine est donc **sous forme oxydée**. **Le RE est un milieu oxydant** qui permet la **formation de ponts disulfure** en amont de la sécrétion. Quand la protéine se replie et que 2 Cys se retrouve face à face dans un milieu oxydant : réaction oxydation pour former pont disulfure (2 cystéines s'oxydent). **Stabilisation** de la protéine sous forme repliée dans le milieu oxydant. - **Liaison covalente** grâce à la géométrie *NB :* *- Ponts disulfure S-S peuvent être **intra- ou inter-protéique** (entre 1 ou deux protéines)* *- Ponts définitifs = **liaison covalente*** ***- Cette liaison reste stabl**e car la protéine reste dans un milieu oxydant* *Les ponts disulfures intra protéiques ou interprotéiques stabilisent les protéines exposées aux conditions extra cellulaires oxidantes.* - ***Aident à la résistance et à la dénaturation par chaleur*** *Glycosylation* --------------- Ce mécanisme **d'ajout de sucre** sur une protéine se fait par plusieurs enzymes. Cette modification est **particulière à la voie de sécrétion**. Ceci entraîne un ajout de sucres en bloc, **présents dans le RE**, sur cet acide aminé. ces sucres vont etre changés au cours de la sécrétion *NB : les noms qui suivent ne sont pas à retenir* Ces modulations déterminent ce que portent les **protéines sécrétées glycosylées**. A chaque étape, il y a modification des sucres grâce aux enzymes **glycosyltransférase** (ajout de sucres) et **glycosidase** (retrait de sucres). Ce sont des enzymes transmembranaires avec une fonction dans le domaine luminal qu'on trouve **sur le RE ou le Golgi.** L'ajout/suppression sucre est accompli dans un **compartiment spécifique** par une enzyme spécifique. On peut savoir par où est passée la protéine en regardant ses sucres. ### Fonction des sucres - Rôle structural  - Reconnaissance spécifique : les sucres peuvent être reconnus de manière spécifique par : \- Des récepteurs intracellulaires (pour assurer le triage de certaines protéines) \- Des récepteurs de la surface cellulaire (pour assurer les interactions entre cellules) **Si on retire les sucres, la protéine ne fonctionne pas bien** voire plus du tout. *NB : Les bactéries ne peuvent pas synthétiser des protéines requérant des sucres, seuls les mammifères en sont capables.* Maturation protéolytique  ------------------------- Les protéines subissent des **protéolyses (coupures)** afin de devenir **matures**. Par exemple, la séquence signal est coupée dans RE : 1er cas de maturation protéolytique qui touche quasiment toutes les protéines sécrétées. *La maturation protéolytique peut se produire presque à chaque étape de la sécrétion (même dans les granules et vésicules de sécrétion).* ### Exemple de l'insuline - Synthétisée et insérée dans RE : une protéase coupe la séquence signal, et **2 ponts disulfure** s'effectuent lors du repliement de la protéine qui devient de la pro-insulineinsuline tjr inactive - **Insuline active** (fonctionnelle): **doit subir 2 coupures** (2 bouts de protéines reliés par 2 ponts disulfure) qui se font dans les granules de sécrétion. *NB : L'insuline ne porte pas de sucres (protéine sécrétée sans sucre)* - *Les bactéries produisent des protéines [sans sucres]* Proteines thérapeutique =======================  **Insuline humaine** recombinante commerciale -\> produite en bactérie - Plus facile à faire **en bactérie** - Pas possible de faire glycosylation **Hormone de croissance** - **En bactérie** - Pont mais pas de sucre  **EPO** - Aider dans les anémies - Celllules mammifères - Avec des sucres - Taux globule rouge augmente - On devient allergique car tique nous injecte protéine avec alphaG