4-Introduction à l’enzymologie 2024 PDF

SBP1130 4-Introduction à l’enzymologie Automne 2024 Simon-Pierre Gravel, PhD [email protected] 1  Introduction Les enzymes sont des macromolécules qui facilitent des réactions chimiques....

SBP1130 4-Introduction à l’enzymologie Automne 2024 Simon-Pierre Gravel, PhD [email protected] 1  Introduction Les enzymes sont des macromolécules qui facilitent des réactions chimiques. En biochimie, les enzymes sont le plus souvent des protéines (globulaires), souvent sous forme de tétramères, et parfois des acides ribonucléiques (ARN). Dans ce dernier cas on parle de ribozymes. Les protéines et les ARN peuvent s’assembler pour former des structures hybrides appelées ribonucléoprotéines (RNPs, ex: les ribosomes, l’enzyme télomérase, les snRNPs qui participent à la formation du spliceosome, les voûtes, etc.). Une réaction peut avoir lieu spontanément ou non, tel que vu précédemment. Une enzyme va servir de catalyseur. Elle va permettre d’augmenter la vitesse d’une réaction. L’enzyme favorisera la formation de produits et/ou de réactifs. Catalyse enzymatique : effectuée par une enzyme ou un ribozyme in vivo ou in vitro, le plus souvent dans des conditions physiologiques optimales. Catalyse chimique : effectuée par un mélange réactionnel de composés chimiques (ex: les réactions de chimie organique impliquant des catalyseurs métalliques) le plus souvent dans des conditions expérimentales non- physiologiques (ex: un mélange bouillant avec ou sans barreau magnétique). 2  Objectifs généraux du cours 1- Connaître les différentes propriétés des enzymes 2- Connaître les types de cofacteurs enzymatiques suggérés et leurs rôles 3- Connaître les différentes classes d’enzymes et leurs rôles 4- Connaître les fondements de l’enzymologie et de l’allostérie 5- Être en mesure de reconnaître une réaction enzymatique simple, ses caractéristiques et être capable d’associer une classe d’enzyme à cette réaction. 6- Connaître les principaux types d’inhibition 3  Plan de cours 1- Propriétés des enzymes biologiques (et allostérie) 2- Notions de base en enzymologie (Michaelis-Menten) 3- Les cofacteurs a) coenzymes de transfert de groupe ATP et CoA b) coenzyme d’oxydo-réduction : NAD+/NADH 4- Les 7 classes d’enzymes et exemples 5- Les inhibiteurs enzymatiques 4  Culture générale 1- Une enzyme ou un enzyme? Les 2, préférence du féminin 2- Quelle molécule naturelle catalytique a été découverte et isolée en premier? Diastase (amylase) isolée du malt 3- Quelle canadienne est pionnière de l’enzymologie? Maud Menten (1879-1960) Amidon (Diastase) Maltose Maltase Glucose 5 1- Propriétés des enzymes biologiques 6  Terminologies de base site Le site actif reçoit le ou les actif substrats et le ou les E cofacteurs (s’il y a lieu). C’est à S cet endroit que se produit la Enzyme catalyse enzymatique. Substrat Certains résidus de l’enzyme interviennent dans la réaction S E Complexe ES ou bien participent à des La réaction enzymarique est écrite comme suit: liaisons chimiques S + E ES P + E E P Produit 7 Lorsqu’il y a plus d’un substrat : on utilise les lettres A, B,... pour les désigner ; lorsqu’il y a plus d’un produit : P, Q, …  Les réactions enzymatiques biologiques présentent de nombreux avantages par rapport aux réactions enzymatiques chimiques (effectuées in vitro). Voici les 7 avantages: 1- Vitesse de réaction plus grande Le site actif d’une enzyme est si bien organisé que tout est mis en place pour faciliter la réaction. Les enzymes évoluent depuis des millions d’années et se sont sans cesse perfectionnées. 2- Conditions de réaction plus douces La majorité des réactions biochimiques ont lieu à des pH autours de la neutralité, à des températures autours de 37 C. Ce n’est certainement pas le cas des réactions de chimie organique ! 3- Spécificité plus grande vis-à-vis d’un substrat sucres D acides aminés L À cause de la configuration de son site actif, l’enzyme ne peux pas effectuer une réaction sur tous les composés possibles. Son substrat devra avoir la bonne taille et la bonne orientation. Cependant, il existe une grande échelle de spécificité chez les enzymes. Certaines le sont peu d’autres le sont énormément. 8 4- Moins de produits secondaires de réaction Les enzymes biologiques donnent le plus souvent 1 produit. Si vous avez déjà effectué une synthèse simple en chimie organique et avez analysé la pureté de vos produits, vous avez très probablement isolé de 3 à 5 produits secondaires indésirables en quantités variables. 5- Possibilité de régulation Les enzymes peuvent être régulées (modulées) de diverses façons : a) en modulant leur expression b) en modulant leur activité les modifications post-traductionnelles pouvant être impliquées dans ces 2 types de modulation. 9 6- Compartimentation des réactions La compartimentation est d’une importance capitale dans l’étude du métabolisme. Les enzymes sont le plus souvent placées spécifiquement dans les organelles où elles sont utiles à un procédé catabolique ou anabolique. 7- Possibilité de chaînes de réactions enzymatiques Imaginons une séquence de réactions organiques. Il faut le plus souvent isoler des produits intermédiaires de réaction pour pouvoir continuer jusqu’à l’obtention du produit final. Et chaque étape peut nécessiter des conditions complètements différentes (température, composés organiques, métaux, etc.), ainsi que l’isolation de chaque produit… Dans la cellule, les enzymes sont souvent placées à proximité d’une autre, ce qui permet une suite logique dans les réactions. Les enzymes sont même souvent regroupées dans des très gros complexes contenant une multitude de protéines. Nous allons aborder les points 1,2,3 et 5 dans ce cours. Les autres points vont s’éclairer d’eux-mêmes lors de l’étude du métabolisme. 10  1-Vitesse de réaction plus grande A) diagrammes d’état de transition : les bases état de transition C A B G C B répulsion A B C A répulsion C B A B C A réactifs produits trajet réactionnel Nous pouvons dessiner le graphique du trajet réactionnel de réactions chimiques en fonction de l’énergie libre G. Imaginons 3 atomes identiques. Les produits finaux auront donc le même niveau d’énergie que les réactifs. Si les molécules AB et C ont assez d’énergie pour se rapprocher suffisamment et correctement, les liaisons chimiques pourront être brisées pour en former de nouvelles. Ceci correspond à un état instable bien évidemment, l’état de transition. 11  Variation d’énergie libre de Gibbs associée à une réaction enzymatique état de transition G  G G = 0 réactifs produits trajet réactionnel Il faut donc de l’énergie aux réactifs pour atteindre l’état de transition. Les molécules présentes à l’état de transition sont nommées complexe activé. G est l’énergie d’activation, donc l’énergie nécessaire au rapprochement optimal pour que la réaction ait lieu. Il faut différencier le G du G global de la réaction, qui dans le cas présenté ci-haut, est = 0. 12 B) diagrammes d’état de transition : spontanéité et équilibre La variation d’énergie libre globale permet d’identifier 3 types de réactions enzymatiques: Exergonique À l’équilibre Endergonique   G G  G  G G R P G G R P G G R P G < 0 G > 0 R P R G = 0 P R P libération Ici, l’énergie est la Absorption Énergie même pour former Énergie les produits ou les L’énergie des produits réactifs. Il n’y a pas L’énergie des produits est inférieure à celle de gain ou de perte est supérieure à celle des réactifs. Cette réaction globale d’énergie des réactifs. Cette réaction est spontanée et un excédent n’est pas favorable (produits d’énergie est disponible pour instables) et une énergie globale effectuer un travail fut nécessaire pour atteindre cet état final. Nous avons attribué dans les graphiques précédents une énergie d’activation du complexe activé nécessaire aux réactifs (R) ou aux produits (P), soit G R ou GP respectivement. Toutes ces réactions sont présentes dans la cellule ! Nous identifierons le type de réaction lors de l’étude du métabolisme cellulaire. 13  C) Une enzyme, comme tout bon catalyseur, va abaisser l’énergie d’activation du complexe activé. (lent) sans catalyseur GR (rapide) avec G catalyseur GP GRcat GPcat réactifs G < 0 produits trajet réactionnel Cet exemple typique nous montre qu’un catalyseur abaisse l’énergie d’activation du complexe activé. Ceci est valable pour les 2 sens de la réaction. L’étude de la cinétique enzymatique nous montre que la vitesse de réaction est inversement proportionnelle à l’énergie d’activation du complexe activé. Cependant, nous observons que même si on abaisse le seul d’énergie d’activation du complexe activé, le G global de la réaction demeure inchangé. 14  Comment expliquer cet effet catalytique des enzymes ? produit réactif produit 1 (85%) catalyseur catalyseur métallique métallique réactif produit 2 (10%) site actif produit 3 (5%) source de chaleur () expérience de chimie site actif d’enzyme La catalyse effectuée par une enzyme ressemble souvent à celle réalisée in vitro dans une expérience de chimie. Cependant, elle a lieu dans une toute petite cavité, le site actif, qui a pour rôle de placer à proximité tous les ingrédients nécessaires à la réaction et uniquement ceux-ci ! 15  2- Conditions de réaction plus douces… mais fragiles ! Les enzymes sont des biomolécules qui nécessitent une organisation 3D optimale pour effectuer leur catalyse. Cela suppose que le la reconnaissance du substrat soit parfaite et que le mécanisme de catalyse soit parfait. Tel que vu précédent, les interactions ioniques et les ponts H auront une influence décisive sur la structure d’une protéine, et donc pourront affecter l’activité d’une enzyme. La température et le pH sont 2 paramètres majeurs qui influencent l’activité enzymatique. Remarquez les différences de tracé d’activité dans la figure ci-dessus. Certaines conditions environnantes peuvent même mener à la dénaturation de la protéine. 16  3- Spécificité de substrat Les enzymes sont toujours sélectives vis-à-vis de leur substrat. Cependant, cette sélectivité peut être plus ou moins lâche. Clé Par exemple, la première enzyme de la glycolyse est -Chiralité l’hexokinase. Cette enzyme peut phosphoryler le D- -Géométrie glucose, le D-mannose ou le D-fructose. Serrure Certaines bactéries contiennent une glucokinase (à ne pas confondre avec la glucokinase du foie). Cette dernière est hautement sélective au D-glucose. Ces 2 enzymes n’ont donc pas le même degré de spécificité. L’hexokinase est dite non-spécifique. L’hypothèse clé-serrure 17  3- Spécificité de substrat: exemple d’une kinase (phosphotransférase) Voici un exemple de kinase, la protéine kinase A. Les kinases sont hautement régulées par différents processus qui permettent leur activation ou leur inactivation. Les kinases ont un site actif qui permet la reconnaissance d’un substrat (qui sera phosphorylé) et d’un co-substrat, l’ATP, qui est un cofacteur essentiel à l’activité. Le phosphate gamma de l’ATP sera transféré sur le substrat dans le site actif de l’enzyme. Le cœur catalytique de 250-300 acides aminés est celui-ci: LOBE N 5 feuillets  antiparallèles Fosse Site de liaison de l’ATP hydrophobe et 1 hélice +Site de liaison du substrat liaison de l’ATP + activité catalytique LOBE C Hélices multiples et boucles Contient des motifs d’aa qui Le substrat doit être bien coordonnent les phosphates de positionné pour recevoir le l’ATP phosphate gamma de l’ATP L’ATP, un co-subtrats des kinases, retenu dans le site de liaison à l’ATP. Identifiez l’ATP dans cette figure, ainsi que des phosphates. Quel ion participe au positionnement des phosphates? Quels acides aminés sont présentés dans le site actif? 18  Spécificité de substrats : exemple de la kinase AKT (alias PKB) Afin d’illustrer la spécificité de substrat, nous allons étudier l’exemple de la Le kinome humain : > 500 kinases protéine kinase AKT, une phosphotransférase à sérine et à thréonine (Ser-Thr kinase) qui possède de nombreux substrats, faisant d’elle une enzyme qui n’a pas une très grande spécificité. Domaine régulateur Séquence et domaines de AKT: Site actif Liaison au phosphatidylinositol- 3,4,5-triphosphate membranaire Les kinases AGC (dont fait partie AKT): La famille AGC tire son nom des familles de protéines kinases A, G et C (PKA, PKC, PKG) qui ont une longue histoire en tant que sérine/thréonine kinases cytoplasmiques régulées par des seconds messagers comme l'AMP cyclique (PKA) ou les lipides (PKC). Le groupe est composé de 16 sous-familles. La sous- famille d’AKT contient 3 membres, AKT1, AKT2, AKT3. Voir: Science 06 Dec 2002: Vol. 298, Issue 5600, pp. 1912-1934 19  Spécificité de substrats : exemple de la kinase AKT (aka PKB) Activation d’AKT: un exemple de signalisation cellulaire 10 substrats de AKT Cell 129, June 29, 2007 Mécanisme d’activation (simplifié et hors contexte): AKT a des dizaines de substrats impliqués dans divers processus liés à la croissance et la survie cellulaire. Est-ce qu’AKT phosphoryle certaines séquences plus particulièrement? A-t-elle des substrats préférés? Peut-on définir cette séquence? Oui, ceci est traité à la prochaine diapositive. 20  Spécificité de substrats : exemple de la kinase AKT (aka PKB) Pour connaître la séquence préférée de phosphorylation de kinases, il faut effectuer des tests in vitro avec la kinase d’intérêt et une grande quantité de peptides, chacun ayant une séquence différente. Si la kinase phosphoryle un peptide donné, on étudie alors sa séquence et on combine les analyses de tous les peptides afin de trouver la séquence commune, préférée, de part et d’autre du site phosphoaccepteur (la sérine à l’étude), qui détermine la phosphorylation de ce site. L’identification d’un motif consensus de phosphorylation Motif de phosphorylation préféré des substrats de AKT par une kinase donnée est déterminé expérimentalement selon un article scientifique: Banque de peptides RR S D DE Peptide 1 Phosphorylé AKT + WD S S AD Peptide 2 Non-phosphorylé RR S G EL Peptide 3 Phosphorylé Sérine phosphoacceptrice Résultat (position 0) expérimental contexte Sérine phosphoacceptrice contexte (position 0) Plus une lettre est grosse, plus elle est retrouvée à cet emplacement dans les substrats testés. La position est cruciale. Parfois des acides aminés de même type (polaire/apolaire/chargés) sont interchangeables. 21  Exemples de séquences consensus de kinases variées Savoir interpréter les motifs Identifier les résidus phosphorylés Voir similitudes entre kinases 22  4- Possibilité de régulation (point 5 de la liste) Les enzymes peuvent être régulées de diverses manières. Bien sûr, des inhibiteurs pharmacologiques peuvent les rendre inactives. Cependant, la cellule s’est dotée depuis bien longtemps de nombreux mécanismes pour diminuer l’activité de ses enzymes selon ses besoins. Nous pouvons même associer à une voie empruntée par une cellule une voie complètement opposée. Par exemple : Stimulation de la migration versus Inhibition de la migration Stimulation de la prolifération versus Inhibition de la prolifération Protection contre l’apoptose versus L’apoptose Catabolisme versus Anabolisme Il va sans dire que tous ces processus nécessitent un nombre considérable d’enzymes, tous soumis à de nombreux types de régulations. Une même enzyme peut être modulée par plusieurs modes de régulation. Nous pouvons classer ces modes de régulation : 1) Régulation de l’expression 2) Régulation de l’activité A) par modification post-traductionnelle B) par effet allostérique 23  1- Régulation de l’expression facteurs de croissance Signaux choc thermique infection, etc. Signaux Enzyme Protéasome (le cimetière des protéines) protéases diverses Traduction Demi-vie de la protéine (t1/2) Stabilité des ARNm Transcription Voies de synthèse Voies de dégradation balance Toute protéine est en équilibre avec sa synthèse et sa dégradation. Si l’une de ces voies est modulée à la baisse ou à la hausse, il peut s’agir d’une réponse normale, mais il peut également y avoir des problèmes (voire des maladies) associés à ces fluctuations. Également, de nombreuses protéines ont une expression constitutive et ne dépendent que peu de signaux externes. Il faut voir le niveau d’expression d’une protéine à un moment donné comme le résultat global des processus qui favorisent son expression et les processus qui entraînent sa dégradation. 24  2A- Régulation de l’activité par modification post-traductionnelle ATP Enzyme inactive phosphate P P P A P inorganique (Pi) kinase phosphatase Signaux Signaux activatrice inhibitrice P P A H2O P ADP Enzyme active S : substrat S catalyse P P : produit Nous avons déjà abordé les modifications post-traductionnelles lors de l’étude des protéines. La phosphorylation, comme présentée sur cette image, est une modification post-traductionnelle qui peut activer des enzymes (voir chapitre sur les protéines). Une phosphatase pourrait au contraire inhiber l’enzyme en la déphosphorylant. À chaque type de modification post-traductionnelle peut être associée sa modification inverse. Ex: méthylation/déméthylation ; ubiquitination/désubiquitination, acétylation/désacétylation, etc. 25  2B- Régulation allostérique de l’activité 10 étapes Glycolyse enzymatiques Rétro-inhibition PFK Glucose PEP Pyruvate Acétyl-CoA Citrate Cycle de Krebs oxaloacétate 8 étapes enzymatiques Ce dernier type de régulation est particulièrement présent dans le métabolisme, et c’est pourquoi nous nous y attardons davantage. Plusieurs enzymes du métabolisme sont inhibées par des produits (parfois très distants) de la voie métabolique étudiée. Lors de la glycolyse, la phosphofructokinase (PFK) (3e enzyme de la glycolyse) est inhibée par le citrate et le phosphoénolpyruvate (PEP), par exemple. Comme nous le verrons, la régulation allostérique implique une liaison de ces produits inhibiteurs au niveau de la protéine, ce qui favorise une conformation inactive de la protéine. 26  Qu’est-ce que l’allostérie ? L’allostérie est le procédé par lequel une molécule influence la conformation 3D d’une protéine en se fixant quelque part sur cette dernière. L’effet allostérique exerce donc une influence sur la conformation du site actif : il pourra le favoriser ou l’inhiber. Ce modèle proposé par Monod, Changeux et Wyman (modèle MWC) il y a plus de 50 ans est d’une grande importance dans de nombreux phénomènes enzymatiques, mais également pour expliquer le comportement des médicaments et de l’hémoglobine. On étudiera ici l’hémoglobine comme exemple classique, mais il ne s’agit pas d’une enzyme. oligomère monomère dimère protomère protomère Le monomère forme des dimères ou des oligomères (ici un tétramère) composés de protomères (un monomère qui n’est pas dissocié). Ces protomères sont tous grandement homologues et lient les mêmes substrats (voir l’hémoglobine du chapitre sur les protéines). Imaginons les globines alpha et beta. Les molécules allostériques ont toujours un axe de symétrie. Ainsi, ce n’est pas toutes les protéines qui subissent l’effet allostérique. 27 Les molécules allostériques sont toujours en équilibre sous 2 formes 3D différentes, les formes R et T ❑ Avec un site de liaison stéréospécifique sur chaque protomère: Site de liaison d’un substrat ou Ici, la poche Ici, la poche ligand permet de lier ne permet pas un substrat ou de lier un substrat ligand ou ligand forme R forme T relâchée tendue (relaxed) (tense) ❑ Avec 2 sites de liaison stéréospécifique différents sur chaque protomère: Site A Site B forme R forme T 28 Important : tous les protomères sont soit T ou soit R en même temps (pas un mélange des 2).  Ligands homotropes Un ligand homotrope qui lie un protomère à un état donné favorise la liaison d’un ligand identique sur un autre protomère en favorisant la stabilité de cet état donné. forme R forme T déplacement de l’équilibre La liaison du ligand stabilise la forme R Ce qui facilite la liaison d’un autre substrat = coopération etc. etc. 29 Les ligands homotropes sont habituellement les substrats ou cosubstrats  Ligands hétérotropes Un ligand différent du substrat qui peut moduler de façon positive (coopération, page précédente) ou négative la liaison d’un autre ligand. forme R forme T ligand hétérotrope déplacement de l’équilibre La liaison du ligand hétérotrope stabilise ici la forme T L’enzyme de peut plus lier son substrat. Notons qu’un ligand hétérotrope peut être activateur ou inhibiteur, selon sa liaison spécifique à l’état T ou R Cet exemple explique l’effet observé durant la glycolyse (PEP ou citrate inhibent la 30 liaison du substrat de la PFK par effet allostérique hétérotrope négatif). Exemple de l’hémoglobine: pas une enzyme, mais comportement allostérique + + La désoxyHb est plus Forme T - - stable à l’état T. Ceci majoritaire à est expliqué par la désoxyHb : + + faibles [O2] (pO2), - - présence de ponts = faible salins dans la affinité pour O2 forme T molécule. O2 etc. oxyHb : forme R L’hémoglobine (Hb) peut exister dans 2 états, R et T. L’oxygène moléculaire O2 a peu d’affinité pour la forme T. Lorsqu’il lie la forme T, il force la rupture de ponts salins, et ceci est transmis mécaniquement à chaque protomère. OxyHb a donc une forme R. La liaison allostérique coopérative de O2 à une sous-unité de Hb bloque Hb à l’état R, ce qui facilite la liaison d’autres O2. 31 Cette coopération allostérique des molécules d’O2 donne un profil particulier à la courbe de saturation de O2. La liaison de O2 à l’hémoglobine (Hb) est toujours coopérative. Cependant, nous pouvons imaginer ce qu’il serait advenu de la saturation de Hb en O2 si elle n’avait été que de forme T ou R, sans possibilité de changement réversible entre ces 2 états : Hb sous forme R Hb sous forme T uniquement uniquement plateau 100 100 saturation saturation de Hb (%) de Hb (%) pO2 pO2 O2 n’aurait aucune difficulté à lier Hb. Il O2 n’a pas d’affinité pour la forme T. y aurait de moins en moins de sites Cependant, il peut toujours y avoir une disponibles, et il y aurait théoriquement liaison non-spécifique, très faible, qui une saturation complète à pO2 élevée. augmente sous la forme d’une droite lorsqu’on augmente la pO2. 32  Nous pouvons imaginer la résultante de ces 2 formes lorsque l’on sait qu’à faible pO 2, la forme T est majoritaire et lie peu O2, et qu’à haute pO2 la forme R est majoritaire. Hb sous forme R 100 hyperbole uniquement saturation de Hb (%) droite Hb sous forme T uniquement pO2 Exemple expérimental typique d’un effet allostérique positif 100 100 résultante liaison ou activité pO2 à faible pO2, à pO2 élevée, il y a plus de T il y a plus de R [Substrat] = courbe sigmoïdale qui montre une coopération allostérique (allostérie positive) 33  Exemple d’allostérie chez les enzymes La pyruvate kinase: une enzyme de la glycolyse Modulateurs allostériques Monomère Dimère Tétramère Alanine Phopshoenolpyruvate (PEP) ATP Fructose 1,6-bisphosphate (FBP) - + ADP ATP Structure: Domaine B: Couvercle: ferme le site actif en présence du substrat Domaine A: Baril ()8 : contient le site catalytique (actif) Substrat Produit Domaine C: Contrôle allostérique (via des effecteurs) Mécanisme: La liaison d’un ligand allostérique au domaine C entraîne un changement conformationnel du domaine A. On a une transition T → R (actif) Modèle ‘’Rock & lock’’ L’état R est stabilisé par 8 ponts salins entre chaque dimère, ce qui ‘’verrouille’’ le tétramère dans un état rigide. Ces changements augmentent de 7 fois l’activité catalytique. https://doi.org/10.1002/pro.3691 34  Étude de ligands allostériques d’une pyruvate kinase Voici une expérience d’enzymologie qui tente d’identifier des sucres phosphates qui pourraient être des ligands allostériques d’une pyruvate kinase. La pyruvate kinase a été produite in vitro, a été isolée, puis on lui donne son substrat, le phosphoénolpyruvate (PEP) et on mesure la vitesse de formation du produit, le pyruvate. On parvient avec ces données de à produire un graphique de la vitesse en fonction de la concentration en PEP. Avec G6P On remarque que le glucose 6-phosphate (G6P) modifie dramatiquement le graphique de vitesse. C’est un Sans G6P ligand hétérotrope positif. Vitesse enzymatique Km: constante de Michaelis (sera vue plus loin) Vmax: vitesse maximale (sera vu plus loin) nH: coefficient de Hill, une mesure de la coopérativité. Une coopérativité parfaire est une courbe sigmoïde. Concentration en substrat 35 DOI: 10.1007/s00436-002-0739-8  Mesure indirecte d’une activité enzymatique Mesure de l’absorbance à 340 nm ADP ATP NADH + H+ Lactate déshydrogénase NAD+ Les nucléotides absorbent la lumière à certaines longueurs d’ondes. Le NADH et le NAD+ n’ont pas le même spectre d’absorbance. Pour la mesurer l’activité de la pyruvate kinase, il suffit d’ajouter dans l’essai l’enzyme lactate déshydrogénase (LDH) et du NADH. Si du pyruvate est produit par la pyruvate kinase, celui-ci sera réduit en lactate. Du coup, il y aura diminution de l’absorbance à 340 nm, longueur d’onde où absorbe le NADH. 36  Retour sur les objectifs de cette section ❑ Connaître les 7 caractéristiques des enzymes ❑ Être en mesure d’interpréter une séquence consensus de phosphorylation ❑ Interpréter une réaction enzymatique selon les différents types de variation d’énergie libre de Gibbs abordés ❑ Connaître différents modes de régulation des enzymes ❑ Connaître et prédire l’impact de la température et du pH sur les enzymes ❑ Connaître la terminologie et les mécanismes associés à l’allostérie ❑ Se familiariser avec l’étude expérimentale des enzymes (vitesse, activité) 37 2- Notions de base en enzymologie 38  L’enzymologie de Michaelis-Menten L’enzymologie est un domaine d’étude d’une grande complexité qui nécessite de solides bases en physico- chimie et en mathématiques pour pleinement apprécier le comportement des enzymes. Voilà pourquoi nous nous limiterons à des simplifications intéressantes des caractéristiques générales des enzymes, ce qui permettra de saisir des concepts très utiles et ainsi mieux comprendre le fonctionnement des enzymes. L’enzymologie a considérablement évolué grâce aux travaux de Leonor Michaelis et Maud Menten. Ces deux chercheurs ont caractérisé les enzymes avec des mathématiques en étudiant leurs vitesses de réaction. Les paramètres issus de ces analyses sont très utiles, mais ne s’appliquent pas à toutes les enzymes. Les enzymes répondant à leurs critères se nomment les enzymes de Michaelis-Menten. Les prochaines diapositives ont pour but d’introduire une équation de vitesse qui permet de décrire les enzymes. Abordons un exemple simple de réaction enzymatique au fil des pages suivantes : Enzyme Substrat Produit Au début de la réaction, on a : [Substrat] = [S] = une valeur quelconque [Enzyme] = [E] = une valeur quelconque [ ] = concentration [Produit] = [P] = 0 39  Une expérience d’enzymologie Dans un tube, nous plaçons donc une quantité fixe d’enzyme E [E] et de substrat S [S]. Nous quantifions rapidement l’apparition de produit P. Ici nous analysons [P]. Qu’observons-nous ? [P] La formation des produits n’est pas linéaire, il plateau s’agit plutôt d’une courbe qui atteint un plateau. La vitesse change au cours de la réaction. La vitesse la plus proche de la réalité serait celle du départ, où la courbe a une pente (ou tangente) t=0 la plus élevée. temps Au fil de la réaction, différents paramètres altèrent l’activité de l’enzyme et le graphique ne [S] peut nous informer sur la vitesse catalytique réelle, optimale de l’enzyme. t=0 [ ] = concentration 40  Une expérience d’enzymologie Nous pouvons donc effectuer la même expérience avec une quantité différente de substrat. À chaque expérience, nous mesurons avec le plus de justesse possible la tangente de la courbe. Expérience 1 Expérience 2 Expérience 3 Expérience 4 où [S]1 < [S]2 < [S]3 < [S]4 Nous observons que plus la quantité de substrats ajouté à la réaction est élevée, plus la quantité de produits formé est élevée. À chacune de ces expériences, nous mesurons la tangente de la courbe, ce qui nous donne la vitesse de formation de produit la plus élevée selon la quantité de substrat utilisé. Nous nommons cette vitesse la vitesse initiale (vo) 41  Une expérience d’enzymologie Il suffit par la suite de combiner tous ces résultats et de dresser un graphique de la vitesse initiale vo en fonction de la quantité de substrat : plateau 4 3 2 1 Cette expérience nous montre que la vitesse initiale vo augmente en fonction de la quantité de substrat, tel que prévu. Plus la quantité de substrat est grande (ex: point 4), plus nous approchons d’un plateau. Ce plateau, impossible à atteindre par l’expérience, représente la vitesse maximale (Vmax) de l’enzyme. Il faudrait une concentration quasi-infinie de substrat pour atteindre ce plateau, ce qui est impossible. Il faudrait que le substrat aille directement dans le site actif, sans être rebuté par aucun obstacle. 42  Règles de base en enzymologie Selon Michaelis-Menten, une réaction enzymatique se présente comme suit. Elle se divise en 2 étapes où chaque étape est associée à une constante de vitesse réaction k1 k2 enzymatique E + S k-1 ES k-2 P + E remarquons que le complexe ES, un état transitoire, k-2 est négligeable. On se est tiré des 2 côtés (constantes k-1 et k2). On parle de place au tout début de la la décomposition du complexe ES. réaction Sachant que : la vitesse de réaction pour une réaction est la suivante : k réaction : A → P vitesse d’apparition de P = [P]/t ou bien d’ordre 1 = k[A] où k = constante de vitesse k réaction : A + B → P vitesse d’apparition de P = [P]/t ou bien d’ordre 2 = k[A][B] Nous pouvons : associer à la réaction placée plus haut différentes constantes de vitesse k 1, k-1 et k2. 43 Les explications suivront (des hypothèses ont été émises pour définir ces constantes).  Règles de base en enzymologie 1- Concept d’étape limitante E S S E P E k1 k2 réaction enzymatique E + S k-1 ES P + E Si nous avons une quantité très grande de substrat S, nous favoriseront grandement la formation du complexe ES, à un point tel que tous les E présents seraient sous forme ES. Cependant, même si E est saturé en S, rien ne nous indique que P sera produit. Ainsi, k2 définit l’étape limitante. C’est elle qui déterminera si la réaction a lieu. La vitesse globale de la réaction dépendra de l’étape limitante. ES saturé en S S S S S E S PE P P S E S S P k2 petite E k2 grande P S E S E S E S S E S E S P P S S S S P S E S E S E S S S S P 44  Règles de base en enzymologie 2- Concept d’étapes à l’équilibre et d’état stationnaire réaction 1 réaction 2 réaction k1 k2 enzymatique E + S k-1 ES P + E Le complexe ES peut être décomposé en E + S d’un côté, et en P + E de l’autre côté. Si nous supposons que k2 est beaucoup plus faible que k-1, ES aura tendance à favoriser davantage E + S que P + E. Ainsi, cette approximation de Michaelis veut que la réaction 1 parvienne à l’équilibre. Une autre hypothèse veut que la concentration de ES soit constante durant presque toute la durée de la réaction globale, jusqu’à ce qu’il y ait épuisement du substrat. On peut imaginer un flux réactionnel (voir diapo suivante) : On force la formation de ES (excès de S) On force sa disparition (formation de P) = ES est à l’état stationnaire 45  Visualisation de l’état stationnaire Imaginons ces cuves vides qui peuvent être remplies de liquide. S ES P On place un excès de substrat. Ce qui signifie qu’il SS ES P y en aura TOUJOURS au début de la réaction. S Si on créé une ouverture entre le compartiment S et le compartiment ES, il y aura écoulement du k-1 liquide jusqu’à saturation du compartiment ES. Il y aura alors un équilibre entre S et ES, dicté par S k1 ES P les constantes de vitesse. ES 46  Visualisation de l’état stationnaire Si on créé maintenant une ouverture entre le compartiment ES et le S limitante compartiment P, il y aura remplissage progressif du compartiment P, k-1 k2 apparition de produit P déterminée par la constante de vitesse limitante k2. Si l’ouverture contrôlée par k2 est toute petite, il y aura peu S k1 ES de produit formé durant une période de temps donnée. Si elle est ES P grande, beaucoup de produit sera formé. Dans cette illustration, on remarque donc que la concentration du complexe ES, saturé en substrat, est toujours constante : alimentée d’une part par l’excès de substrat (k1), et diminuée par la formation de produit P. Il s’agit de l’état stationnaire. Il faut comprendre que cette vision de la biochimie enzymatique en flux (comme un courant d’eau), permet d’expliquer le comportement des enzymes dans une voie métabolique. Sans entrer dans les détails, nous pouvons transposer ces notions de flux au déroulement in vivo de la glycolyse. différentes étapes entrée constante enzymatiques limitantes Utilisation de sucre dans la ou non limitantes constante du produit cellule (ex: pyruvate) le flux net sera donc sensible aux enzymes limitantes. k2 est donc S ES très important et flux caractérise les enzymes. 47 GLYCOLYSE  L’équation de Michaelis-Menten Toutes ces hypothèses peuvent être mises en formule pour mener à l’équation de Michaelis-Menten réaction k1 k2 enzymatique E + S k-1 ES P + E Puisque k2 est limitante, la vitesse de réaction globale est : v globale = [P]/t = k2 [ES] La vitesse formation de ES est égale à la vitesse de sa formation (k1) moins les vitesses qui mènent à sa décomposition (k-1 et k2). formation décomposition v formation ES = [ES]/t = k1 [E][S] - k-1 [ES] - k2 [ES] Puisque ES est à l’état stationnaire, on peut dire que : [ES]/t = 0 Il est impossible de mesurer les proportions fluctuantes de E et ES pendant l’expérience. Nous savons toutefois que la quantité d’enzyme totale est [E]t = [E] + [ES] [E]t = concentration totale d’enzyme (connue) 48  L’équation de Michaelis-Menten Nous pouvons combiner ces équations : Pas de mathématiques à l’examen. Retenir les formation et décomposition état stationnaire grandes lignes et les points importants dits en classe. [ES]/t = k1 [E][S] - k-1 [ES] - k2 [ES] et [ES]/t = 0 on place le terme de gauche à droite (changement Nous avons : k1 [E][S] - k-1 [ES] - k2 [ES] = 0 de signe), puis on inverse les parties de l’égalité on isole [ES] puis on multiplie par -1 les 2 parties de -k1[E][S] = -k-1 [ES] – k2 [ES] l’égalité k1[E][S] = [ES] (k-1 + K2) En combinant l’équation [E]t = [E] + [ES] où on isole [E] → [E] = [E]t – [ES] k1([E]t – [ES])[S] = [ES](k-1+k2) On distribue k1 et [S] à gauche k1[E]t[S] - k1[ES][S] = [ES](k-1+k2) On place le terme –k1[ES][S] à droite (changement de signe) de l’égalité k1[E]t[S] = [ES](k-1+k2) + k1[ES][S] On isole [ES] k1[E]t[S] = [ES](k-1 + k2 + k1[S]) On inverse les parties de l’égalité [ES](k-1 + k2 + k1[S]) = k1[E]t[S] 49  L’équation de Michaelis-Menten [ES](k-1 + k2 + k1[S]) = k1[E]t[S] On divise par k1 (1) k1 k1 On isole [ES] [ES](k-1 + k2 + [S]) = [E]t[S] k1 [ES] = [E]t[S] (k-1 + k2 + [S]) k1 Ce terme comprenant les 3 constantes est Km, la constante de Michaelis. On obtient donc: [ES] = [E]t[S] où Km = (k-1 + k2)/k1 (Km+ [S]) Cette équation montre une relation entre la concentration du complexe ES, la concentration en substrats, et les 3 constantes de vitesses formant le Km. Cependant, il ne s’agit pas d’une équation de vitesse, et la [ES] n’est pas mesurable. Il sera toutefois possible, comme nous le verrons, d’utiliser cette équation pour remplacer le [ES] dans une équation de vitesse. 50  L’équation de Michaelis-Menten Km est la constante de Michaelis Km = (k-1 + k2) / k1 Quelle est la signification du Km ? Il y a 2 informations à en tirer. La première est la suivante, mais nécessite une condition bien précise. Lorsque k2 est beaucoup plus faible que k-1, l’équation devient une approximation : k2