Downstream Biotechnológia PDF

Biotechnológia Downstream Fehérje, nukleinsav elválasztás Kiszerelés  Oszlopkromatográfia Elsősorban fehérjék elválasztására szolgáló eljárás Oszlop Oszlopban töltet helyezkedik el, mely lehet: – polimer, üveg – ezek szerkezeté...

Biotechnológia Downstream Fehérje, nukleinsav elválasztás Kiszerelés  Oszlopkromatográfia Elsősorban fehérjék elválasztására szolgáló eljárás Oszlop Oszlopban töltet helyezkedik el, mely lehet: – polimer, üveg – ezek szerkezetének, felületének módosítással olyan töltetet lehet előállítani, ami a fehérjénk elválasztásához szükséges A töltet kölcsönhat a fehérjével, mely alapján az elválasztás elve lehet: – méret szerinti – elektrosztatikus – hidrofób – affinitás  Oszlopkromatográfia: fehérjék elválasztása minta felvitele elválasztásra szolgáló oszlop eluens kromatogram  Méret szerinti elválasztás Ilyen a gélszűrés A töltet (neutrális) részecskéi között „széles” járatok: nagyobb fehérjék itt könnyen áthaladnak: hamar leérnek az oszlop aljára Nagy molekula = rövidebb úthossz Töltet részecskéiben „szűkebb” járatok: kis fehérjék ide bejutnak: nagyobb úthossz: később érnek az oszlop aljára  Töltés szerinti elválasztás – elektroforézis (fehérjék) Töltött részecske mozog elektromos térben térhálós polimerben (poliakrilamid) Elválasztás méret szerint történik SDS: denaturálja a fehérjéket, egységes negatív töltést ad nekik Analitikai módszer: kisebb fehérje mennyiségek elválasztására alkalmas Töltés szerinti elválasztás – elektroforézis (fehérjék) Coomassie Brilliant Blue festés ezüst festés  Töltés szerinti elválasztás – elektroforézis (nukleinsav) Térhálós polimer: agaróz (poliakrilamidnál nagyobb pórusméret) Elválasztás méret szerint történik Analitikai módszer: kisebb nukleinsav mennyiségek elválasztására alkalmas Festés etídium-bromiddal  Töltés szerinti elválasztás: izoelektromos fókuszálás Aminosavak ikerionok (+) és (-) töltésű oldalláncaik is vannak Felületi töltés ≠ össztöltés pI – izoelektromos pont: az a pH érték, ahol az össztöltésük 0 Ezt a tulajdonságukat izoelektromos fókuszálás esetében ki lehet használni  Töltés szerinti elválasztás: izoelektromos fókuszálás Izoelektromos Minta felvitele fókuszálás Töltött részecske mozog elektromos térben, pH gradiensben, gélben Csak addig mozog, ameddig el nem éri az izoelektromos pontját, ott az össztöltése 0 lesz, ezért megáll Össztöltés (pI) alapján választ el Analitikai módszer  Kétdimenziós elektroforézis: 2D-PAGE pH 3 pH 10 fehérjekeveréket két, egymástól eltérő, egymásra merőleges irányú futtatással frakcionálják első dimenzió: izoelektromos fókuszálás második dimenzió: gélelektroforézis  2D-PAGE első dimenzió: izoelektromos fókuszálás pH 3 pH 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH 3,9-4,7 pH 4,7- pH 5-8 strip pH 7-10 strip strip 5,9 strip 2D-PAGE  Töltés szerinti elválasztás – ioncserélő kromatográfia Felületi töltés alapján választ el Töltött aminosav oldalláncok elektrosztatikus kölcsönhatásba lépnek a hordozóval Anioncserélő (negatív felületi töltésű fehérjéket köt), kationcserélő oszlop (pozitívat) Preparatív módszer: nagyobb mennyiségek elválasztására alkalmas Az oszlopra felkötődött fehérjéket le kell mosni: mosófolyadék ionerősségének, vagy pH-jának változatásával Töltés szerinti elválasztás – ioncserélő kromatográfia Töltés szerinti elválasztás – ioncserélő kromatográfia  Töltés szerinti elválasztás – kromatofókuszálás Össztöltés alapján választ el Kromatográfiás oszlopon Töltött aminosav oldalláncok elektrosztatikus kölcsönhatásba lépnek a hordozóval pH gradiens mozog a puffer áramlással Fókuszáló hatás – sokszor kötődik és eluálódik Preparatív módszer  Hidrofób kromatográfia Hidrofób fehérjék elválasztására alkalmas Hidrofób oldalláncok a fehérjében Hidrofób felületi csoportok a hordozón Hidrátburok: vizes közegben hidrát burok borítja a fehérjéket és a hordozót is: el kell távolítani Hidrofób kromatográfia  Hidrofób kromatográfia Felkötés: magas sókoncentrációnál, chaotróp ionokkal Elúció: vízzel  Hidrofób kromatográfia – fordított fázisú elválasztás Felkötés: apoláros szerves oldószerrel Elúció: poláros szerves oldószer konc. növelés Fehérjét az oldószer károsíthatja! Hidrofób kromatográfia – fordított fázisú elválasztás  Affinitás kromatográfia Elválasztás specifikus biológiai kölcsönhatás alapján. Specifikus ligand a hordozón Affinitás kromatográfia  Affinitás kromatográfia Elválasztás specifikus biológiai kölcsönhatás alapján. Specifikus ligand a hordozón – Koenzim – Affinitás tag: His6-tag Kötés nikkel, kobalt ionokhoz Eluálás imidazollal  Affinitás kromatográfia Affinitás tag: glutation S-transzferáz (GST) + trombin hasítóhely Hordozón ligand: glutation Eluálás után trombinnal (szerin proteáz) levágható a GST  Affinitás kromatográfia Affinitás tag: STREP-Tag kötődik a Biotin kötő helyhez Hordozón ligand: STREP-Tactin Eluálás: destiobiotin Regenerálás: HABA festék  Immunaffinitás kromatográfia Antigén – antitest (IgG) kapcsolat Szelektív, érzékeny Sokoldalú, majdnem minden ellen lehet ellenanyagot termeltetni IgG tisztítás antigén oszlopon Antigén tisztítás IgG oszlopon Immunaffinitás kromatográfia Kiszerelés  Kiszerelés A termékeket tartósítani, kereskedelmi forgalomba hozhatóvá kell tenni Füstölés: legrégebben alkalmazott élelmiszer tartósítási lehetőség – sót, NaNO3-t adnak hozzá Cukor, ecet, fűszerek még mehetnek hozzá – füstölés Tartósít, de karcinogén nitrózaminok keletkezhetnek  Kiszerelés - vízelvonás Szárítás – Gyümölcs, tojás, leveskocka, paprika,stb. Napon (hagyományos módszer), pl. paradicsom Szárítóban  Kiszerelés - vízelvonás Kristályosítás – Cukor, só – Citromsav – Glükonsav így készül  Kiszerelés - vízelvonás Fagyasztva szárítás = liofilizálás – Fagyasztás vákumban – A víz szublimál – Érzékeny termékekre alkalmazható (főként hőre érzékeny) gyógyszerekre, vakcinákra  Kiszerelés - vízelvonás Spray drying – Apró cseppek formájában viszik be a folyadékot a szárító kamrába – Érzékeny termékekre – Tejpor, kakaópor  Kiszerelés - tartósítás Konzerv doboz, üveg – Konzerv gyártás Doboz megtöltése O2 eltávolítás vákuummal Légmentes lezárás Hőkezelés: steril lesz – Előny Kényelmes, sokáig eláll Félig elkészített – Hátrány Vitaminok, hőlabil vegyületek sérülhetnek  Kiszerelés - tartósítás Aszeptikus csomagolás – Műanyag, papír edényben Hőkezelés helyett H2O2-t alkalmaznak sterilezésre Könnyű Sokáig eláll Csomagoló gáz: : élelmiszer megromlásának késleltetése O2, etilén eltávolítás N2, Ar, CO2 - töltőgáz  Kiszerelés - hőkezelés Hűtés, fagyasztás – Hűtés – Gyorsfagyasztás – Fagyasztás Pasztőrözés – Magas hőmérséklet (70-80°C)– rövid idő (2x15sec) – baktérium spórák megmaradnak: hűteni kell, vagy – Ultramagas hőmérséklet (140°C) - >1sec (ultrapasztőrözés: itt már baktérium spórák is elpusztulnak: tovább eláll, de az íz változik)  Kiszerelés - besugárzás Besugárzás: nagy energiájú sugárzás szükséges – UV – Radiaktív γ sugárzás – Röntgen  Kiszerelés - adalékok E951 Adalékok – Só – Mesterséges édesítő aszpartám, szacharin – Szinezékek – Emulgeáló szerek – Vitaminok – E-szám jelölések Színezék, ízesítő, tartósító, savanyúság szabályozó, emulgeáló, sűrítő, ízfokozó, stb. Alap vs. adalékanyag Immobilizálás  Immobilizálás előnyei Védekezés: Flokkulumokban élő szervezetek sokkal jobban viselik környezetük változásait (pl. időszakos tápanyaghiányt, pH változások, antimikrobiális ágensek. Közösségi lét: Metabolikus terhek megosztása (pl. xenobiotikumok kometabolizmusa) vagy a géntranszfer lehetősége. Biofilm vagy flokkulum, mint alap életforma: Számos mikroorganizmusnak ez az elsődleges életformája, számukra a szuszpenzált állapot csupán kedvezőtlen időszakokra jellemző.  Immobilizálási technikák: prokarióta Bezárás  Immobilizálási technikák: prokarióta Felületi adszorpció  Immobilizálási technikák: prokarióta Keresztkötés: pl. kagylók bisszuszfonalai  Immobilizálási technikák: prokarióta Makropórusos hordozó  Immobilizálási technikák: prokarióta Felületi kitapadás  Immobilizálási technikák: prokarióta Természetes aggregátumok  Immobilizálási technikák: eukarióta Roller bottle  Immobilizáló mátrixok Alginát – D-mannuronsav – L-gülkuronsav – Zegzugos kopolimer Kétértékű kation: Ca2+ – Keresztkötés Ionos kötés – Gyenge – Koncentráció függő Pórusméret: 1-15 μ  Alginát immobilizálás Alginát oldat – Viszkózus folyadék Sejtekkel keverés Cseppek – 50 mM CaCl2 oldatba – 0,5-2 mm átmérő Biológiailag lebontható Szárítva tárolható  Immobilizáló mátrixok Pektin – D-galakturonsav – Mechanikai stabilitás nagy – Keresztkötő szer kell Glutáraldehid Polietilénimin  Immobilizáló mátrixok Pektin – Növényi sejtfal alkotó – Különböző mértékben észterezett – GRAS prebiotikum  Immobilizáló mátrixok Controlled pore glass – Kétféle üveg keverék Borát + szilikát – Egyiket kioldják – Térhálós szerkezet – Mechanikai stabilitás – Sterilezhető – Felület derivatizálható Sejt, molekula megkötés kromatográfia  Immobilizáló mátrixok Controlled pore rubber – Kétféle gumi keverék – Egyiket kioldják – Térhálós szerkezet – Mechanikai stabilitás – Sterilezhető – Sejt, molekula megkötés  Immobilizáló mátrixok Poliuretán – Izocianát + alkohol + katalizátor – Cianát + hidroxil csoport: uretán kötés – Adalékokkal sokféle Forma Keménység – Víznél könnyebb Aerob mikrobáknak – Biológiailag NEM lebontható  Immobilizáló mátrixok Poliuretán – Nagy, inert felület – Levegő szűrő biofilterekben  Biotechnológia Pezsgőgyártás – Üvegbe félig érlelt bor + cukor + élesztő – Parafadugó – 1-3 év érlelés után élesztő eltávolítás forgatással – Nyak fagyasztása – Élesztő “kilövés” CO2 serkenti az EtOH felszívódását  Biotechnológia Pezsgőgyártás – Élesztő alginátban – “kabátolás” Kitin, kitozán – Érlelés = szabadon lebegő élesztő – Ülepítés gyorsan, hatékonyan – Kisebb pezsgő veszteség  Biotechnológia Apró magvak + alginát – Könnyebb vetni Répa, fehérrépa Tápanyag, csírázást segítő anyagok, patogének elleni védekezés – P. fluorescens