Microscopio e Conta Batterica - PDF

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Il microscopio e la conta batterica diretta  Maria Luisa Savo Sardaro MICROSCOPIO OTTICO È uno strumento costituito da una seri...

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Il microscopio e la conta batterica diretta  Maria Luisa Savo Sardaro MICROSCOPIO OTTICO È uno strumento costituito da una serie di parti meccaniche, elettriche e ottiche che consente di superare i limiti di risoluzione dell’occhio umano e della lente di ingrandimento, grazie a un sistema di lenti opportunamente disposte che sfruttano una sorgente luminosa permette di visualizzare la struttura e la morfologia delle cellule. I microscopi possono essere suddivisi in due categorie in funzione dei principi su cui si basano: Microscopio ottico; Microscopio elettronico; Il microscopio e la conta batterica diretta 2 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro MICROSCOPIO OTTICO Parti meccaniche: a) Stativo: elemento centrale di sostegno e di assemblaggio di tutte le parti che costituiscono il microscopio. (3) b) Tavolino portaoggetti: piano mobile destinato a sorreggere il preparato da osservare. (5) c) Traslatore: permette di spostare il tavolino in direzione X, Y. d) Tubo: struttura cilindrica entro la quale si forma l’immagine intermedia. A una delle sue estremità è montato l’oculare di tipo monoculare oppure di tipo bioculare (2). E’ anche possibile l’acquisizione dell’immagine mediante telecamera inserita nell’ apposito tubo (1). Il microscopio e la conta batterica diretta 3 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro e) Revolver portaobiettivi: supporto girevole destinato a sorreggere più obiettivi a diverso ingrandimento. (4) f) Comandi di messa a fuoco: meccanismi di regolazione che consentono di focalizzare l’immagine del preparato. La vite macrometrica consente grandi spostamenti in verticale. La vite micrometrica consente una messa a fuoco più fine (7) g) Diaframma di apertura: Permette di variare la quantità di luce che viene fatta transitare attraverso l’obiettivo. (6) Parte elettriche: a) Trasformatore b) Regolatore della luminosità c) Lampada d’illuminazione (8) Il microscopio e la conta batterica diretta 4 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Componenti ottiche: Condensatore: Sistema di lenti interposto tra la sorgente luminosa e il tavolino portaoggetti. Ha il compito di far convergere (condensare) la luce sul piano del preparato da osservare. Obiettivi: Sistema di lenti che riproduce l’immagine ingrandita del preparato in esame. Sono montati sul revolver portaobiettivi. Ingrandimenti: 10x, 20x, 40x e 100x (in immersione) Oculari: Sistema di lenti che ingrandisce ulteriormente l’immagine prodotta dall’obiettivo, consentendone l’effettiva percezione visiva. È posto all’estremità superiore del tubo. Ingrandimento: 10x Il microscopio e la conta batterica diretta 5 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro 4°) INGRANDIMENTO: è pari al prodotto FUNZIONAMENTO dell’ingrandimento apportato dall’obiettivo 10x per l’ingrandimento e apportato dall’oculare. Es. Obiettivo 40x e oculare 10x, il potere d’ingrandimento totale sarà 40 X 10 = 400 volte. 3°) La lente dell’oculare produce una seconda rifrazione e un secondo 100x ingrandimento della immagine (10x). 2°) I raggi luminosi, passando attraverso il sistema di lenti dell’obiettivo, rifrattando la luce, producono un primo ingrandimento dell’oggetto in esame (es. 100x). 1°) Fascio di luce prodotta dalla sorgente luminosa viene inviato sul preparato tramite il condensatore. Il microscopio e la conta batterica diretta 6 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro POTERE DI INGRANDIMENTO: OBIETTIVO X OCULARE PROPRIETÀ DI UN MICROSCOPIO POTERE DI RISOLUZIONE (D): La distanza minima alla quale due punti possono ancora essere visualizzati come distinti e separati. Questo parametro limite rappresenta un dato fondamentale in quanto determina il massimo ingrandimento possibile di un oggetto all’ interno del preparato. Con un microscopio ottico si possono ottenere un ingrandimento massimo di 1500x e 0,2 µm di potere di risoluzione. Il limite di risoluzione D : 0.5 l l: lunghezza d’onda della luce utilizzata D: a: angolo di apertura del cono di luce che entra N sen a nell’obiettivo APERTURA NUMERICA (AN) , DESCRIVE N: indice di rifrazione del mezzo interposto tra LE PROPRIETA’ DELL’OBIETTIVO. Es 0,3 l’oggetto e la lente dell’obbiettivo Più il limite di risoluzione è basso, migliore è la definizione dell’immagine Si interpone tra oggetto e obiettivo un fluido (olio) di indice di rifrazione maggiore dell’unità (aria N= 1, olio N= 1,515) (obbiettivi a immersione). CONTRASTO: Può essere definito come la differenza di intensità di illuminazione fra l’immagine di un oggetto e quella dei suoi dintorni. Il microscopio e la conta batterica diretta 7 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro TIPI DI MICROSCOPIO MICROSCOPI IN CAMPO CHIARO: il preparato apparirà più scuro su uno sfondo chiaro e illuminato. I campioni analizzati vengono spesso colorati, poichè il basso contrasto rende il campione poco visibile. MICROSCOPI IN CAMPO OSCURO: solo la luce riflessa dalle cellule è in grado di raggiungere l’obiettivo. Il preparato appare chiaro su sfondo oscuro. MICROSCOPI A CONTRASTO DI FASE: incrementa il contrasto tra cellule e mezzo circostante, consente una migliore visualizzazione senza ricorrere all’uso di preparati colorati. Le cellule appaiono scure contro un sfondo più chiaro. MICROSCOPI A FLUORESCENZA Il microscopio e la conta batterica diretta 8 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro COLORAZIONI BATTERICHE: Per fornire informazioni specifiche sulla struttura interna o sulle proprietà chimiche delle cellule. ü Colorazioni semplici: Rendono le cellule meglio evidenziabili all'osservazione microscopica. Richiedono l'uso di un solo colorante (es. blu di metilene, cristal violetto, fucsina basica). ü Colorazioni differenziali: colorazione di Gram Richiedono l'uso di più coloranti. Mettono in evidenza non solo la morfologia, ma anche determinate caratteristiche di gruppi di microrganismi. Colorante primario (cristal violetto), mordente iodato, agente decolorante (etanolo) e un colorante di contrasto (safranina). Le differenti reazioni sono dovute alla composizione e allo spessore della parete cellulare. Gram positivi: blu-violetto, Gram negativi (parete cellulare più complessa): rosa. ü Colorazioni strutturali: colorazione endospora con il verde malachite Il microscopio e la conta batterica diretta 9 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Preparati a secco Preparati a fresco Sono vetrini con sospensioni cellulari Sono vetrini preparati con cellule trattati al calore. ed acqua. Poiché molte procedure di colorazione E’ il modo più semplice e migliore uccidono le cellule, quest’ultime per osservare microrganismi allo vengono fissate con trattamenti tesi a stato vivente (es: osservazione minimizzare i cambiamenti post- della mobilità dei microrganismi) mortem. Il fissatore più usato è il calore, nonostante spesso provochi cambiamenti nella forma e dimensione delle cellule. Il microscopio e la conta batterica diretta 10 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI CONTA 1. Metodi di conta diretti: a) con l’ausilio di microscopi vengono visualizzate e contate direttamente le cellule usando camere di conta (Thoma, Burker, Neubauer), filtri o vetrini speciali; b) con coloranti fluorescenti è possibile contare separatamente cellule vive e cellule morte; c) con sonde oligonucleotidiche marcate con coloranti fluorescenti (FISH) è possibile contare gruppi diversi di microrganismi e quindi identificare le specie. 2. Metodi di conta indiretti: i microrganismi vitali vengono contati sulla base di una manifestazione visibile della crescita; a) su agar (formazione di colonie); b) in provetta (metodo Most Probable Number (MPN)): torbidità, viraggio indicatori. Il microscopio e la conta batterica diretta 11 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro 1a. Metodi di conta diretti: le Camere di Conta Vetrino reticolato di cui è nota l’area di ogni riquadro. Utilizzato per determinare il numero totale di cellule (vitali e non vitali) in un volume noto di campione. Presenta nella parte centrale due aree di conta caratterizzate da dimensioni note, ciascuna suddivisa in un reticolo di quadrati. Unità di conta per la camera di Thoma: Area: 0.05 x 0.05 = 0.0025 mm2 Volume: 0.0025 mm2 x 0.1 mm = 0.00025 mm3 = 0.00025 µl (1/ 4.000.000 ml) Il microscopio e la conta batterica diretta 12 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro 1a. Metodi di conta diretti: le camere di conta 1° QUADRANTE PREPARAZIONE: 1°) Pulire con alcol e carta morbida il vetrino ed il coprivetrino e NON PASSARE SU FIAMMA! 2° QUADRANTE 2°) Diluire il campione 10n 3°) Posizionare il coprivetrino e posizionare 10 µl di campione sul reticolo 4°) CONTA E CALCOLO DEI MICRORGANISMI 3°QUADRANTE PRESENTI 4° QUADRANTE Il microscopio e la conta batterica diretta 13 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro ESEMPIO DI CALCOLO: OSSERVAZIONE DILUIZIONE 10–n DI UN CAMPIONE 1° QUADRANTE Esempio di conta: 1° QUADRANTE 34 Diluizione 10-2 (1/100) 2° QUADRANTE 32 TOTALE: 139 2° QUADRANTE 3° QUADRANTE 38 4° QUADRANTE 35 3° QUADRANTE CALCOLO: 4° N° cellule/ml = ∑ quadranti x 4.106 x 10n QUADRANTE 16 COSTANTE n: diluizione N° cellule/ml = 139 x 4.106 x 102 16 N° cellule/ml = 3,47. 109 Il microscopio e la conta batterica diretta 14 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Vantaggi e svantaggi delle camere di conta Vantaggi: E’ un metodo rapido e poco costoso Svantaggi: Il limite di rivelazione è di circa 106 cellule/ml. Con 1x106 cellule/ml solo poche cellule sono visibili in ogni campo; Non è possibile distinguere cellule vive da cellule morte; Difficoltà di conta di cellule mobili o molto piccole; L’affaticamento degli operatori può causare errori. Il microscopio e la conta batterica diretta 15 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Morfologia di cellule (preparato microscopico a fresco) Materiale: Anse sterili Coltura liquida o in piastra. Pipette Vetrini porta e copri-oggetti Acqua Microscopio ottico Alcol Procedura: Da coltura liquida (a): 1-Omogeneizzare Da colonia (b): 2-Prelevare con pipetta una goccia e depositare sul 1-Depositare una goccia di acqua sterile sul vetrino. vetrino 2- Prelevare con un’ansa sterile parte di una colonia ben isolata 3- Stemperare il materiale microbico nell'acqua. (a) (b) 4- Coprire con il vetrino copri-oggetto, evitare la formazione di bolle d’aria. 5- Osservare al microscopio. N.B. Per una buona osservazione le lenti devono essere pulite, il campo deve essere ben illuminato, non devono essere presenti bolle d’aria o quantità eccesiva di liquido sotto il vetrino. Il microscopio e la conta batterica diretta 16 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Possono presentare diverse forme: Morfologia delle cellule batteriche: A) cellule sferiche (cocchi): Ø diplococchi (in coppia); Ø streptococchi (in catene); Ø stafilococchi (grappolo); Ø Tètradi (4) e sarcine (8); B) cellule bastoncellare (bacilli): Ø In coppia (diplobacilli) o in catena (streptobacilli); C) cellule bastoncellare: a forma di bastoncino corto, rigonfio e con margini arrotondati: coccobacilli; D) cellule bastoncellare: a forma di bastoncino ricurvo (vibrioni); a spirale (spirilli, spirochete). Il microscopio e la conta batterica diretta 17 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Il microscopio e la conta batterica diretta 18 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Osservazione al microscopio a contrasto di fase, ingrandimento 1000X: Streptococchi Streptobacilli Il microscopio e la conta batterica diretta 19 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Diplobacilli Spirali, formata da più cellule Il microscopio e la conta batterica diretta 20 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Diplococchi bifido Il microscopio e la conta batterica diretta 21 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Micelio vegetativo Colorazione blue di metilene Il microscopio e la conta batterica diretta 22 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Buono studio Il microscopio e la conta batterica diretta 23 di 23