Kromozom Elde Etme Yöntemleri PDF

KROMOZOM ELDE ETME YÖNTEMLERİ DR. ÖĞR. ÜYESİ: SEVİDE ŞENCAN ŞEYH EDEBALİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Kromozom Bölgeleri ve İsimlendirme  Kromozomlar üzerinde bölgeler oluşturulurken (fiziki haritalama) öncelikle kromozomların kısa ve uzun kolları her biri kendi içinde üst bölge/bölge...

KROMOZOM ELDE ETME YÖNTEMLERİ DR. ÖĞR. ÜYESİ: SEVİDE ŞENCAN ŞEYH EDEBALİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Kromozom Bölgeleri ve İsimlendirme  Kromozomlar üzerinde bölgeler oluşturulurken (fiziki haritalama) öncelikle kromozomların kısa ve uzun kolları her biri kendi içinde üst bölge/bölgelere ayrılır.  Daha sonra her bölge kendi içinde alt bölgelere,  Alt bölgeler de kendi içlerinde daha alt bölgelere ayrılmak suretiyle alanlar daraltılır.  Bu şekildeki alan daraltmaları herhangi bir hastalık/özellikten sorumlu olan gen/genlerin (ör. Hemoglobin beta geni – HBG: 11p15.4-) veya belli birtakım DNA dizilerinin (ör. STR, VNTR, LINE, SINE vs) kromozomlar üzerindeki lokalizasyonunun belirlenmesinde kullanılır (alt bölge sayısı arttıkça gen/dizinin yeri daha da netleşir, çözünürlük artar). tekniği bu bantların önemi  G-bantlama Sitogenetik analizlerde ¤ G-bantlama, her bir kromozom büyüktür. boyunca değişik boyama profilleri  oluşturulur. Her bir kromozomun bant profili özgüldür. ¤ Değişik koşullar altında yapılan pek  çok Buboyama nedenlereaksiyonu, boyları ve sentromer kromozom yerleri birbirinin boyunca varkromozomlar olan heterojenliği ve edilebilir. aynı olan bile ayırt karmaşıklığı yansıtır. Prof. Dr. Bektaş TEPE  Kromozom, DNA molekülünün ileri derecede 50 yoğunlaşmış hali olduğundan numaralandırma ile belirtilen bir bölge aslında kilobazlarca uzunlukta DNA molekülü içerir. Dolayısıyla; bazı durumlarda herhangi bir bölgeye birden fazla gen/dizi haritalanabilir. Kromozom haritalama ve İsimlendirme C: Sentromer (Centromer) p: Kısa kol q: Uzunkol 1., 2..: Bölge/alt bölge 1 C Bant çözünürlüğü 1 2 Fiziki haritalama 12q23 (12. Kromozomun, uzun kolunun 2. bölgesinin 3. alt bölgesi) Xq24.1 ideogram kromozomun şematik halidir Ana band bölgeleri sayılarla gösterilir X kromozomu Xq24.1: Uzun kolu 2. bölge , 4. bant, 1. sub-bant KROMOZOM ELDESİ 1.Doku kültürü Fitohemaglutinin, amino asit ve antibiyotik içeren medyum içinde 72 saat 37°C de bekletilir 68 - 70. saatte kolşisin eklenir Hipotonik tuz çözeltisi Fiksatif çözeltisi (1 Asetik asit; 3 Metanol) Yayma (soğuk ve nemli lam üzerine) 2. Boyama (Bantlama ) 3. Analiz Kromozom Bantlama/Boyama ve İnceleme Yöntemleri  Kromozomların farklı özelliklerini ortaya koyabilen birçok boyama tekniği bulunmaktadır.  Her teknikle farklı şekilde bantlar ve polimorfik bölgeler elde edilir.  Kromozom bantları polimorfik bölgeler dışında her türün kendi bireyleri arasında benzerdir.  Kromozomlardaki bant paternleri, her hücre bölünmesinde doğru bir şekilde korunmaktadır.  Yaygın olarak kullanılan bantlama yöntemleri:  GTG-Bantlama  Q-Bantlama  C-Bantlama  R-bantlama  NOR Boyama  Diferansiyel Replikasyon Boyama  DA-DAPI vs. Bant teknikleri iki önemli gruba ayrılabilir: Tüm kromozoma uygulanan (G,Q,R) Sadece spesifik yada bazı kromozomların belli bölgeleri için uygulananlar (C,T, NOR, DAPI/DA ) Giemsa Tripsin bantlama yöntemi: Sitogenetik laboratuvarlarında en sık kullanılan yöntemdir. Kromozomların elde edilen bant özellikleri fonksiyonel hem de yapısal kompozisyonu yansıtmaktadır. A-T den zengin heterokromatin bölgeler koyu renk G-C den zengin ökromatin bölgeler açık renk Sayısal analiz için en az 20 metafaz, yapısal analiz için en az 5 metafaz değerlendirildikten sonra rapor verilebilir. Giemsa Bantlama (G-Bantlama) Preparatlar bir proteaz olan tripsin ile muamele edilerek histon ve nonhiston proteinler denatüre edilir. Sonuçta proteinlerinden ayrılan DNA giemsa ile boyanır. G bantlama ile 400-700 arasında bant değerlendirilir. Böylece A-T açısından zengin olan bölgeler daha koyu boyanır. Bu bantlama ile translokasyon, inversiyon, delesyon gibi kromozomal hastalıklar belirlenebilmektedir Giemsa Bantlama (G-Bantlama) Açık G bantlı bölgeler biyolojik olarak daha önemlidir ve aktif genlerin bulunduğu kromozom bölgeleridir. G bantlamada  Wright  Leishman boyaları da kullanılmaktadır GTG (Giemsa-Tripsin ile G) Bantlama (G Bantlama) Q bantlama (Floresan) Kromozomları, DNA’ya bağlanma özelliğinde olan ve Quinacrine olarak adlandırılan bir floresans boya ile boyama yöntemidir. İnsan kromozomlarını tanımlamak için kullanılan ilk yöntemdir. Floresan mikroskopta incelendiğinde parlak olan ve olmayan bantlar gözlenir Q bantlama (Floresan) A-T’ den zengin bölgeler floresan boya buraya bağlandığı için daha parlak olarak boyanmaktadır. G bantlamaya benzerlik gösterir Parlak bantlar G bantlamadaki koyu renk bantlara, soluk bantlar ise açık renk bantlara karşılık gelir C (Centromer) bantlama Kromozomların sentromer ve sekonder darlık bölgelerinin boyanmasını sağlayan bir tekniktir. Sentromerler, 1, 9, 16 kromozomların sekonder darlık ve Y kromozomun q kolu distal bölgesi koyu renk görülür Kromozomlar önce asit ve ardından alkali ile muamele edilir ve Giemsa ile boyanır C- bantlama R-BANTLAMA (REVERS BANTLAMA)  G bantlamanın tam tersi bir bant örneğidir  C-G’den zengin ökromatin bölgeler koyu veya parlak floresan boyanırlar  A-T’den zengin heterokromatin bölgeler ise açık renk veya floresan mat boyanırlar  G ve Q bantlamada soluk olarak boyanan telomerik bölgelerin koyu olarak boyanmasına imkan tanır  Kromozomların uç kısımlarını değerlendirilmesinde kullanılır kapsayan anomalilerin Reverse bantlama NOR BOYAMA (Nuclear Organiser Region-Gümüş boyama Akrosentrik kromozomların satellitlerindeki nukleolus organizasyonundan sorumlu bölgeler boyanır. rRNA içeren genler bulunur ve Gümüş Nitrat ile boyanır Kardeş kromatit bantlama Kardeş kromatid değişimi (KKD), kromozom morfolojisi değişmeksizin, kardeş kromatidler arasında, özdeş segmentlerin simetrik genetik materyal alışverişi sonucu oluşan bir değişimdir. Kardeş kromatid değişimleri nokta mutasyonların indüksiyonu, gen amplifikasyonu ve sitotoksisite ile ilişkilidir İki hücre döngüsü boyunca araşırıcıya kromatidleri ayırma fırsatı veren BrdU (bromo-deoxy-uridine) kültür ortamına eklenir. Sadece bir zincirde DNA BrdU almışsa normal karanlık Giemsa boyaması olur, diğer zincir daha açık renkle boyanır. Eğer değişim gerçekleştiyse, kromatid parça parça açık ve koyu renklerde görülür: "harlequin kromozomları“. Kardeş kromatit bantlama Kromozom kırıklarının gösterilmesinde kullanılır Normal kontrol ile karşılaştırma yapılarak oransal sonuç verilir. Kardeş kromatit bantlama FISH (Floresan In Situ Hibridization) Yöntemi  Bu yöntem sitogenetik ve moleküler genetiğin birlikte kullanıldığı ve ileri teknolojilerin kullanıldığı bir yöntemdir.  Normal kromozom bantlama yöntemlerinden farklı bir inceleme yöntemidir.  İstenen DNA dizilerinin kromozomlar üzerinde ve interfaz nükleusunda incelenmesine imkan sağlayan bir moleküler-sitogenetik tekniktir.  Floresan moleküllerle işaretli 50-1000 nükleotidden oluşan DNA/RNA parçalarının (prob), kromozomdaki veya interfaz çekirdeğindeki DNA’ moleküllerinin ısı ile denatürasyonunu (tek iplikli forma dönüşümünü) takiben özgün dizisi ile hibridizasyonu (eşleşmesi) prensibine dayanır.  Bu teknik prenatal tanı ve kanser genetiğinde ayrı bir önem taşımaktadır.  Ayrıca, diğer yöntemlerle tanımlanamayan çok sayıda kromozomal anomalilerin aydınlatılması da mümkün olmaktadır. Farklı tipte problar kullanılarak, kromozomların farklı bölgeleri incelenebilir. İncelenen kromozom dışında diğer kromozomlar hakkında bilgi veremez. Kromozom üzerinde 2-3 Mb lık değişiklikleri gösterebilir. Sentromer fish Telomer fish İnterfaz çekirdeği İnterfaz çekirdeği FISH yönteminin uygulandığı örnekler; * Fikse edilmiş kromozomlar * İnterfaz nukleusu üzerindeki çalışmalar * Uzatılmış tek zincirli DNA molekülleri * Nukleus ve alt ünitelerinin incelenmesi * Formalinle fikse edilmiş doku, kan ya da kemik iliği preparatları (Analiz için eski preparatlar, aylar yıllar sonra kullanılabilir) FISH with dual color and dual transfusion probes for BCR (green) and ABL1 (red). A normal cell shows 2 separate sets of red and green signals (2R2G), and a cell with a t(9;22) translocation shows individual BCR (green) and ABL1 (red) signals from the normal 9 and 22 chromosomes and red / green fusion signals from the derivative 9 and 22 chromosomes