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Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Terreni di coltura e isolamento colture pure  Maria Luisa Savo Sardaro COLTURE MICROBICHE In campo micro...

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Terreni di coltura e isolamento colture pure  Maria Luisa Savo Sardaro COLTURE MICROBICHE In campo microbiologico è di primaria importanza riuscire a coltivare e perpetuare i microrganismi in laboratorio e ciò è reso possibile solo dalla disponibilità di adeguati terreni di coltura. I terreni di coltura possono essere costruiti completamente impiegando componenti ben definiti chimicamente, si parla di TERRENI DEFINITI o SINTETICI oppure possono contenere costituenti come peptoni (derivati proteici), estratti di lievito o di carne di cui non si conosce l’esatta composizione si parla di TERRENI COMPLESSI. Terreni di coltura e isolamento colture pure 2 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro I vari terreni di coltura sono classificati in base alla funzione ed alla composizione come: qTERRENI PER USO GENERICO, tipo PCA (Plate count Agar) qTERRENI ARRICCHITI con particolari nutrienti per stimolare la crescita di un determinato microrganismo, (MRS, MSA, TSA etc) qTERRENI SELETTIVI contengono sali biliari o coloranti basici come il blu di metilene che inibiscono la crescita dei gram + favorendo lo sviluppo dei gram -, qTERRENI DIFFERENZIALI in grado di distinguere tra diversi gruppi di organismi. Il terreno di coltura può essere solidificato con l’aggiunta di AGAR, un polisaccaride complesso che deriva dalle alghe rosse. Terreni di coltura e isolamento colture pure 3 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro I primi terreni di coltura erano liquidi e di difficile gestione, solo nel 1881 Koch usò terreni solidi derivati da fette di patate bollite e poi sterilizzati. Nello stesso periodo un collaboratore di Koch, Loeffler sviluppò un terreno che contenesse come ingrediente base un peptone e riscosse un buon successo. Data la passione per la fotografia di Koch, fu il primo a fare microfotografie ai batteri, ed essendo capace di prepararsi le lastre fotografiche con Sali d’argento e gelatina, intuì che lo stesso metodo poteva essere usato per i terreni solidi, usò quindi il terreno con il peptone più la gelatina ma vi erano numerosissimi svantaggi, la gelatina non resisteva alle alte temperature ed alcuni batteri erano in grado di idrolizzarla. Terreni di coltura e isolamento colture pure 4 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Nel 1882 fu usato per la prima volta l’Agar già noto da molto tempo come agente solidificante nella preparazione della gelatina. Fu FANNIE HESSE la moglie di un collaboratore di Koch a suggerire l’uso dell’agar quando viene a conoscere le difficoltà incontrate con la gelatina. Fu un grande successo!!! Cinque anni più tardi nel 1877 JIULIUS RICHARD PETRI, un altro assistente di Koch inventò la piastra per coltura che porta il suo nome, da quel momento caddero in disuso le piastre di vetro ricoperte di agar. Queste innovazioni resero possibile l’isolamento di colture pure, che contenevano un solo tipo di batterio, dando un notevole impulso in tutti i campi della Batteriologia. Terreni di coltura e isolamento colture pure 5 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Terreni di coltura Terreni di coltura e isolamento colture pure 6 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Nutrizione Microbica Macronutrienti: Carbonio ( C) Ossigeno ( O) Carboidrati Calcio Attività Idrogeno ( H ) Lipidi Magnesio enzimi Proteine Azoto ( N) Ferro Cofattori Acidi Ecc. Zolfo( S) nucleici Fosforo ( P) Micronutrienti (sufficienti intracce) Manganes Attività enzimi e Cofattori Zinco Ecc. Cobalto UBIQUITARI Molibdeno Terreni di coltura e isolamento colture pure 7 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro FORMULAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA I vari ingredienti, riportati nella composizione di ciascun terrenodi coltura, possono essere raggruppati a seconda delle loro funzioni Fonti di carbonio glucosio lattosio carboidrati saccarosio maltosio Fonti di azoto composti di ammonio (NH4)2SO4 - nitrati NH4NO3 NaNO3- peptoni e idrolizzati KNO3 Ottenuti tramite digestione enzimatica (peptoni) o tramite idrolisi acida (idrolizzati) peptidi e aminoacidi di matrici ricche di proteine animali (caseina, carne) o vegetali (soia) Terreni di coltura e isolamento colture pure 8 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Fattori di crescita estratto di lievito fonte ottimale di vit. gruppo B, azoto, carbonio, oligoelementi Sali NaCl sostanzetamponanti fosfati, acetati; è importante che il pH di un terreno colturale sia scelto intorno al valore ottimalenecessario per la crescita dei microrganismi desiderati. L’uso di questi tamponi è necessario quando si aggiungono carboidrati fermentabili come fonti di energia. Metalli e mineraliessenziali Ca, Mg, Fe, P Terreni di coltura e isolamento colture pure 9 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Agenti selettivi Agenti selettivi Azione Antibiotici Inibizione in funzione dello spettro d’azione dell’antibiotico utilizzato Cloruro di sodio Favorisce la crescita dei soli microrganismi alofili Sali biliari Inibizione dei batteri Gram+ Indicatori di variazioni di pH Indicatore Colore Colore Intervallo di forma acida forma basica viraggio Rossofenolo Giallo Rosso 6.4-8.0 Giallo di metile Rosso Giallo 2.9-4.0 Blu di bromotimolo Giallo Blu 6.0-7.6 S. aureus cresce su MSA Metilarancio Rosso Giallo 3.1-4.4 producendo composti acidi Terreni di coltura e isolamento colture pure 10 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Terreni liquidi e solidi Utilizzati quotidianamente neilaboratori Aspetto Categoria Necessità di O2 Specie (esempi) 1 Aerobi obbligati Necessario Micrococcus spp., Bacillus subtilis, Muffe 2 Anaerobi obbligati Tossico Clostridium botulinum 3 Anaerobi Richiesto, ma E.coli, Salmonella spp., facoltativi sopravvivono anche Listeria monocytogenes, in assenza S.cerevisiae… 4 Microaerofili Necessario, ma a Campylobacter spp., conc. inferiori Aerococcus spp. 5 Anaerobi Non richiesto, S.thermophilus, L. aerotolleranti ma plantarum, sopravvivono in Enterococcus spp. sua presenza Terreni di coltura e isolamento colture pure 11 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Sostanze gelificanti Agar polisaccaride usato come gelificante naturale ricavato da alghe rosse composto da 30% agaropectina e 70% agarosio solidifica sotto i 45°C e si liquefa sopra i 95°C Terreni di coltura e isolamento colture pure 12 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Preparazione Terreni Liquidi Pesare la quantità di polvere per il volume di terreno desiderato seguendo le proporzioni riportate in etichetta, e trasferire in flacone. Aggiungere l’adatta quantità di acqua deionizzata o distillata, mescolando per portare in sospensione omogenea la polvere. Agitare il brodo sopra agitatore magnetico mettendo nel flacone un’ancoretta. Attendere 10-15 minuti Sterilizzare in autoclave, a 121°C per 15 min. Dopo la sterilizzazione lasciare raffreddare a temperatura ambiente Aliquotare il brodo nelle provette con il dosatore posizionato in corrispondenza del volume desiderato (sotto cappa microbiologica o vicino al bunsen per mantenere la sterilità). Terreni di coltura e isolamento colture pure 13 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Preparazione Terreni Solidi Pesare la quantità di terreno, terreno agarizzato o separatamente di brodo ed agar (la concentrazione per agarizzare un terreno è di 15 g/l) e versare in una beuta Aggiungere la quantità di acqua secondo le proporzioni descritte in etichetta Aliquotare nei boccetti chiudendo con il tappo ma non completamente Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15 minuti (salvo diverse indicazioni del terreno) Terreni di coltura e isolamento colture pure 14 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Finito il processo di sterilizzazione terreni e brodi si lasciano raffreddare a temperatura ambiente e si conservano in frigo, ad eccezione del caso in cui occorrano per un’analisi immediata. In tal caso i brodi si lasciano raffreddare a temperatura ambiente mentre i terreni solidi si lasciano all’interno di un bagno termostatato a circa 46-48°C per impedire la solidificazione dell’agar prima del momento in cui vengono utilizzati. La permanenza del terreno solido in bagnetto non deve essere protratta a lungo poiché si alterano i complessi vitaminici che sono importanti coenzimi per le attività metaboliche dei batteri (di conseguenza una volta raffreddato il terreno solido deve essere utilizzato entro 2-3 ore) Ogni terreno solido dopo che è stato utilizzato si lascia raffreddare e quindi solidificare. Successivamente si conserva in frigo ed ogni volta che si utilizza si scioglie al microonde e si pone in bagnetto. Tale processo freddo/caldo è preferibile non farlo più di tre volte per possibili degradazioni che possono avvenire a carico dei costituenti del terreno. Terreni di coltura e isolamento colture pure 15 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro ISOLAMENTO COLTURE PURE Terreni di coltura e isolamento colture pure 16 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro COLTUREPURE DEF:Per coltura pura o axenica si intende una popolazione di organismi che derivano da un unico organismo viventeiniziale. 1) Strisciare un campione su piastra 2)Incubare 3) Isolare le singolecolonie Postulati di Henle – Koch (fine 1800) 1.il presunto agente responsabile della malattia deve essere presente in tutti i casi riscontrati di quella malattia 2.deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo crescere in colturapura 3. ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene inoculata in un ospite sano, si riproduce la malattia 4.il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato sperimentalmente Terreni di coltura e isolamento colture pure 17 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro TECNICHE DI ISOLAMENTO COLTURE 1.Isolamento per diffusione PURE 1) Depositare una gocciolina di campione 4) piastrare INCUBAZIONE 2) e 3) sterilizzare un‘ansa di vetro Terreni di coltura e isolamento colture pure 18 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro TECNICHE DI ISOLAMENTO COLTUREPURE 2. Isolamento per striscio Otterremo delle colonie singole, da cui poter ricavare colturepure 1) Prelevare una piccola 2) Strisciare l’ansa, diluendo quantità dicampione (B) il campione sulla sup. solida INCUBAZIONE Terreni di coltura e isolamento colture pure 19 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro 3. Isolamento per inclusione TECNICHE DI ISOLAMENTO Utile per campioni con basse concentrazioni microbiche COLTUREPURE Consente la crescita di batteri anaerobi INCUBAZIONE Terreni di coltura e isolamento colture pure 20 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Terreni di coltura e isolamento colture pure 21 di 21