Identificazione Carica Batterica Microbica PDF

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Identificazione carica batterica microbica  Maria Luisa Savo Sardaro Preparazione del campione * I campioni alimentari liquidi possono es...

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Identificazione carica batterica microbica  Maria Luisa Savo Sardaro Preparazione del campione * I campioni alimentari liquidi possono essere trasferiti in piastra tal quali oppure dopo diluizione. * Le cellule microbiche imbrigliate nelle matrici alimentari, per essere contate, devono essere trasferite nell’adatto substrato nutritivo. I campioni solidi, quindi, prima di essere analizzati, vanno omogeneizzati in un adatto diluente, al fine di disperdere i microrganismi nella fase liquida che può essere facilmente manipolata per l’analisi. E’ necessario pesare sterilmente una quantità sufficientemente rappresentativa del campione in esame (10-25 g) in un sacchetto sterile, aggiungere in ragione 1:10 diluente sterile, quindi omogeneizzare. L’omogeneizzazione viene effettuata con Stomacher, un apparecchio che grazie alla presenza di pedali che si muovono in senso rototraslatorio schiaccia il campione e ne determina lo sfibramento; la durata dell’omogeneizzazione sarà stabilita in base alla durezza e alla consistenza del campione. Identificazione carica batterica microbica 2 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Teoria delle diluizioni decimali: Cosa comporta Realizzando delle diluizioni decimali seriali del campione di latte (ad es. 1 ml di campione in 9 ml di diluente sterile), operiamo una diluizione del numero di microrganismi inizialmente presenti in esso, realizzando così una procedura che rende possibile contare le UFC che possono svilupparsi. SOLUZIONI DILUENTI Utilizzate per l’allestimento delle diluizioni decimali Soluzione fisiologica (NaCl, H2O) Sale peptone o triptone (peptone/triptone,NaCl,H2O) Soluzione di Ringer (NaCl, KCl, CaCl2, NaHCO3) Citrato di sodio Identificazione carica batterica microbica 3 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro DILUIZIONI SERIALI Sono necessarie in microbiologia quantitativa per conoscere la carica batterica del campione in esame (alimento, suolo, fluidi corporei, etc…) CARICABATTERICA : il numero di Unità Formanti Colonie (UFC) per ml o g in un determinato campione PROCEDIMENTO Immaginiamo di avere un campione liquido: 1. Prelevare 1ml di campione e diluirlo in 9 ml 2. Realizziamo una seconda diluizione 1:10, rispetto al campione iniziale: 1:10 x 10 =1:100 3. Si prosegue diluendo 1ml delladiluizione in 9 ml di eluente 4. Si piastrano le diluizioni su terrenonutritivo per spatolamento oinclusione Identificazione carica batterica microbica 4 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Analisi microbiologiche – campioni liquidi Materiale occorrente Pipette sterili da 1ml. Tubi contenenti 9 ml di diluente sterile. Operazioni 1.Prelevare, con una pipetta sterile, 1ml del campione liquido 2. Trasferirlo in 9 ml di diluente sterile. 3.In tal modo si realizza una diluizione 1/10 (10-1) del campione. 4.Omogeneizzare con cura mediante agitatore automatico. 5. Ripetere le operazioni per ottenere diluizioni decimali successive (10-2, 10-3 ecc.). NOTA: utilizzare sempre una nuova pipetta sterile per ogni diluizione da realizzare. Identificazione carica batterica microbica 5 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Analisi microbiologiche – campioni solidi Materiale occorrente Pipette sterili da 1ml, Tubi contenenti 9 ml di diluente sterile, sacchetti per stomacher sterili, Omogeneizzatore stomacher Operazioni 1. Pesare 10 g di prodotto,in sterilità. 2. Aggiungere 90 ml di diluente sterile. 3. In tal modo si realizza una diluizione 1/10(10-1) del campione. 4. Omogeneizzare con cura mediantestomacher 5.Prelevare 1ml di omogenato e trasferirlo in provetta con 9 ml di diluente sterile 6.Abbiamo ottenutola diluizione 10- 2 7.Ripetere le operazioni per ottenere diluizioni decimali successive (10-3, 10-4ecc.). NOTA: utilizzare sempre una nuova pipetta sterile per ogni diluizione da realizzare. Identificazione carica batterica microbica 6 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Una considerazione: DILUIZIONI SERIALI Vs. Il numero minimo di microrganismi Il numero minimo di microrganismi teoricamente rilevabili teoricamente rilevabile 10 UFC/g con la tecnica per inclusione; 1 UFC/ml con la tecnica dell’inclusione; 10 UFC/ml con la tecnica di spatolamento 100 UFC/g con la tecnica dispatolamento Identificazione carica batterica microbica 7 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Quante diluizioni realizzare? Al momento dell’analisi dobbiamo dunque decidere quante volte diluire il campione. Ø CONOSCENDO CON APPROSSIMAZIONE IL CARICO DEI MICRORGANISMI DA RICERCARE PRESENTE NEL CAMPIONE (DA ANALISI PRECEDENTI O DA RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI) VENGONO ALLESTITE LE DILUIZIONI E MESSE IN PIASTRA SOLO QUELLE IN CUI SI SUPPONE DI AVERE UN NUMERO DI COLONIE CONTABILI. (IN GENERE SI METTONO IN PIASTRA LE ULTIME TRE DILUIZIONI CONTABILI) Ø NEL CASO IN CUI NON SI ABBIA IDEA DEL CARICO TEORICO SUPPOSTO NEL CAMPIONE DA ANALIZZARE SI ALLESTISCE UN RANGE AMPIO DI DILUIZIONI E SI METTE OGLI DILUIZIONE IN PIASTRA. Identificazione carica batterica microbica 8 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Tecniche di semina in piastra 1. Tecnica per inclusione dell’inoculo in substrato solidificabile (“INGLOBAMENTO”): in una piastra petri sterile vuota si versa prima la sospensione del campione da analizzare (1 ml di inoculo), quindi si aggiunge il substrato agarizzato (12-15 ml) mantenuto in fusione a 45-46°C. Roteare delicatamente la piastra in modo da descrivere un 8 per 30 sec. al fine di miscelare l’inoculo (i microrganismi) con il substrato. Si lascia solidificare il substrato prima di incubare le piastre in termostato. 2. Tecnica per distribuzione superficiale dell’inoculo su substrato solido (“SPATOLAMENTO”): Preparare il terreno specifico e dopo sterilizzazione versarlo nelle piastre e lasciare solidificare. Seminare quindi 0.1 ml della diluizione del campione, precedente a quella prescelta, al centro di una piastra di Petri da 9 cm di diametro, contenente il terreno ben asciutto, preferibilmente preparato 24 ore prima. La sospensione microbica è quindi distribuita su tutta la superficie mediante l’aiuto di una spatola sterile a L, avendo cura di cambiare spatola per ogni diluizione oppure, iniziando a spatolare dalla diluizione più alta per evitare di trascinare microrganismi da una piastra all’altra. Identificazione carica batterica microbica 9 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Identificazione carica batterica microbica 10 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro INCUBAZIONE DELLE PIASTRE SCEGLIERE: Temperatura Tempo Condizioni di ana/aerobiosi OTTIMALI PER IL/I MICRORGANISMI RICERCATI Identificazione carica batterica microbica 11 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Unità Formanti Colonie (UFC) La miriade di cellule figlie che si originano e rimangono intrappolate tra le maglie dell’agar adese le une alle altre danno origine ad un ammasso che diventa generalmente visibile ad occhio nudo quando il numero delle cellule supera la decina di milioni. Questo ammasso, costituito da cellule tutte uguali tra loro ed uguali alla primitiva cellula presente nel campione e trasferita nel terreno di coltura, prende il nome di colonia. Identificazione carica batterica microbica 12 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro DILUIZIONI SERIALI Le piastre derivanti dalle diluizioni avranno un numero di colonie progressivamente inferiore, che diminuisce di un fattore10, ad es: 500.000 cellule/ml ( 5x105 cell/ml) Si considerano contabili le piastre Teoricamente, ogni contenenti un cellula, una volta numero non piastrata, darà vita superiore a 200 a una singola colonie colonia 50.000 5000 500 50 5 Non colonie colonie colonie colonie colonie contabili ü Contabili Identificazione carica batterica microbica 13 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro DILUIZIONI SERIALI Determinare la carica batterica iniziale, consideriamo le sole piastre contabili: 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 50.000 5000 500 50 5 colonie colonie colonie colonie colonie Non ü Contabil contabili i Identificazione carica batterica microbica 14 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro TECNICHE DI CONTA CONTA IN PIASTRA Sono considerate solamente le piastre che contengono un numero di colonie non superiore a 200 (numero convenzionale). Il numero dei unità formanti colonie (UFC) in 1 ml di prodotto, o in 1 g, nel caso dei prodotti solidi, è dato dalla formula: dove: ΣC: è la somma del numero di colonie contate n1 : rappresenta in numero di piastre utilizzate per la prima diluizione contabile n2 : rappresenta in numero di piastre utilizzate per la seconda diluizione contabile d: è il fattore di diluizione relativo alla prima diluizione contabile. Identificazione carica batterica microbica 15 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Ad esempio: Sono state seminate le piastre in doppio e dalla conta delle colonie si sono ottenuti i seguenti valori: nella prima diluizione (10-2): 83 e 97 colonie nella seconda (10-3): 13 e 10 colonie Il risultato sarà quindi 9.1 x 103 ufc/g o ufc/ml Identificazione carica batterica microbica 16 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Esempi Diluizioni Diluizioni 10-4 Inc. (>300) Inc. (>300) 10-5 Inc. (>300) Inc. (>300) 10-5 124 10-6 100 130 10-6 20 27 10-7 10 12 10-7 1 10-8 10-8 100+130+10+12 124+20+27+0+1 = 1,14*108 = 1.4*107 (1+2*0,1+2*0.01)*10-5 (2+2*0,1)*10-6 Identificazione carica batterica microbica 17 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Diluizioni 124+130 10-1 Inc. (>300) Inc. (>300) = 1,27*104 10-2 124 130 2*10-2 10-3 10-4 Ufc/ml o Ufc/ gr Identificazione carica batterica microbica 18 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Identificazione carica batterica microbica 19 di 19