Enzymes - Réaction Enzymatiques PDF

Biochimie et Métabolisme Pierre Maechler 3. Enzymes-1: Réaction enzymatique Ref: Moussard 2ème & 3ème éditions: p.43-51 1 Biochimie et Métabolisme (Pierre Maechler) 1. Introduction Introduction à la biochimie 2. Bioénergétiq...

Biochimie et Métabolisme Pierre Maechler 3. Enzymes-1: Réaction enzymatique Ref: Moussard 2ème & 3ème éditions: p.43-51 1 Biochimie et Métabolisme (Pierre Maechler) 1. Introduction Introduction à la biochimie 2. Bioénergétique Bioénergétique 3. Enzymes 1 Réaction enzymatique 4. Enzymes 2 Régulation + coenzymes 5. Énergétique cellulaire 1 Glycolyse 6. Énergétique cellulaire 2 Cycle de l’acide citrique et chaîne respiratoire 7. Adaptation métabolique Intégration tissulaire 2  Biochimie et Métabolisme Enzymes-1 Ref. Moussard 2ème & 3ème éditions: p.43-51  Définitions et propriétés (catalyseurs, protéines, spécifiques, régulables)  Cinétique enzymatique (vitesse initiale, Vmax, Km)  Site actif des enzymes (clé-serrure, ajustement induit, catalyse)  Facteurs influents (température, pH, inhibiteurs compétitifs/non compétitifs/mixtes, activateurs)  Enzymes allostériques (courbe sigmoïde, effet coopératif, modèles concerté/séquentiel)  Classification (6 classes d’enzymes)  Enzymes Définitions et propriétés Une réaction exergonique est spontanée Mais: spontanée ≠ instantanée Ex: saccharose +H2O glucose + fructose 4  Enzymes Définitions et propriétés Une réaction exergonique est spontanée Mais: spontanée ≠ instantanée Ex: saccharose +H2O glucose + fructose ∆G°’= -29.3 kJ/mol Une enzyme spécifique (ici saccharase) catalyse (accélère) la réaction d’hydrolyse du saccharose (sucrose) à l’échelle de secondes. 5  Enzymes Définitions et propriétés  enzyme vient des racines grecques en (dans) zume (levain).  Le levain, est la pâte de levures vivantes utilisée pour faire lever le pain.  Les premières enzymes identifiées ont été extraites des levures (transforment le glucose en alcool). 6  Classification des enzymes  Oxydoréductase: transfert d’électrons  Transférase: transfert d’atomes ou de groupements  Hydrolase: coupure de liaison par H2O  Lyase (ou synthase): coupe ou crée des liaisons  Ligase (ou synthétase): crée des liaisons en consommant de l’ATP  Isomérase: isomérisation 7 M  Énergie libre d’activation ∆G#: La vitesse de réaction dépend de ∆G#: différence d’énergie libre entre l’état initial et l’état de transition. 8 M  Définitions et propriétés Enzyme:  Est une protéine  Catalyseur biologique de réactions biochimiques  Augmente la vitesse de réaction  Ne change pas la constante d’équilibre Keq  Diminue l’énergie libre d’activation ∆G#  Est spécifique (à son substrat)  Est régulable 9 M  Cinétique enzymatique à t0: V A +B C+D A et B: substrats C et D: produits 10 Cinétique enzymatique à l’équilibre: V A +B C+D A et B: substrats C et D: produits 11  Cinétique enzymatique: vitesse initiale E Soit la réaction S P A l’instant t0 : v est optimale pour cette réaction = vitesse initiale vi 12 M  Cinétique enzymatique à t0: 1 V A +B C+D 2 V A +B C+D 13  Cinétique enzymatique: vitesse maximale La concentration de substrat influence la vi, on détermine la vitesse maximale de E = vmax 14 M  Cinétique enzymatique: vitesse maximale La concentration de substrat influence la vi, on détermine la vitesse maximale de E = vmax 15 M  Cinétique enzymatique: vitesse maximale Substrat – Enzyme – Produit: une relation à trois 16 M  Modèle Michaelis-Menten Étude de l’activité enzymatique E+S  ES  EP  E+P IN OUT En 1911, Maud MENTEN obtient son doctorat à Toronto et part pour Berlin chez “Boîte noire” Leonard MICHAELIS En 1913 ils publient Mesurables: E, S (en excès), V, P leur fameuse équation  Liaison substrat + enzyme Hexokinase Glucose E+S  ES Site de Liaison du glucose induit Liaison une altération de conformation 18  Modèle Michaelis-Menten sans enzyme substrat État de transition Produit Enzyme complémentaire au substrat aimant E+S  ES  E+P Enzyme complémentaire à l’état de transition 19  Modèle Michaelis-Menten E Soit la réaction S P se décompose en: v1, k1 v3, k3 E+S ES E+P v2, k2 KM = k2 + k3 = [E] [S] k1 [ES] KM = constante de Michaelis-Menten elle définit la relation enzyme - substrat 20 M  Modèle Michaelis-Menten Equation de Michaelis-Menten: vi = vmax [S] kM + [S] Quand [S] tend vers l’infini, vi = vmax 21 M  Modèle Michaelis-Menten Equation de Michaelis-Menten: vi = vmax [S] kM + [S] Quand [S] tend vers l’infini, vi = vmax 22 M  Modèle Michaelis-Menten Equation de Michaelis-Menten: vi = vmax [S] kM + [S] Quand [S] tend vers l’infini, vi = vmax Dans ces conditions, la vitesse dépend des propriétés de l’enzyme définies par le KM On définit que pour vi = vmax/2  [S] = KM Constante Michaelis-Menten KM = [S] à vmax/2 23 M  Modèle Michaelis-Menten KM: concentration de substrat qui permet à l’enzyme de travailler a la moitié de sa vitesse maximale. Constante Michaelis-Menten KM = [S] à vmax/2 24 M  Modèle Michaelis-Menten  Vmax/2: la concentration de substrat [S] est à ½ saturante = KM  Vmax: la concentration de substrat est saturante, plus d’enzyme libre XS. Xie Science 2013  En conditions réelles cellulaires: système ouvert non équilibré, en lien avec d’autres voies (substrats S et produits P entrent et sortent du système) Modèle Michaelis-Menten XS. Xie Science 2013  KM indique la cadence de travail d’une enzyme Le nombre de places sur un télésiège aussi. Produits 2 places Substrat 6 places 27  Substrat: Comment l’évaluer? 28  KM indique la cadence de travail d’une enzyme Le nombre de places sur un télésiège aussi. A l’arrivée du télésiège, qu’est ce qui vous renseigne sur le nombre de skieurs au départ ? Produits Substrat 29  Modèle Michaelis-Menten Or donc…  La vmax est la vitesse de réaction lorsque l’enzyme est à saturation  La KM est la concentration de substrat lorsque l’enzyme est à demi-saturation (indique la cadence de travail d’une enzyme) KM basse rime avec haute affinité et faible capacité. KM élevée rime avec faible affinité et haute capacité. ….affinité à comprendre dans le sens de saturabilité… 30  Modèle Michaelis-Menten La KM permet de prédire si, dans des conditions physiologiques,  une enzyme opère proche de sa Vmax  un changement dans la concentration du substrat va changer sa vitesse 31 M  Modèle Michaelis-Menten: comparons la KM de deux kinases (enzymes phosphorylantes) pour leur substrat (glucose): hexokinase et glucokinase GLUCOSE + ATP cerveau - HEXOKINASE foie - GLUCOKINASE GLUCOSE - 6 - P + ADP KM KM (µM ATP) (mM glucose) HEXOKINASE 400 0.05 GLUCOKINASE 100 10 32  Modèle Michaelis-Menten: comparons la KM de deux kinases (enzymes phosphorylantes) pour leur substrat (glucose): hexokinase et glucokinase Vmax KM (mM glucose) 1/2 Vmax HEXOKINASE: 0.05 mM GLUCOKINASE: 10 mM [S] KM La concentration sanguine de glucose (glycémie) varie de 4 à 10 mM. Laquelle de ces kinases va réagir aux changements de la concentration de glucose? 33  Modèle Michaelis-Menten: comparons la KM de deux kinases (enzymes phosphorylantes) pour leur substrat (glucose): hexokinase et glucokinase Vmax KM (mM glucose) HEXOKINASE (cerveau): 0.05 mM 1/2 Vmax GLUCOKINASE (foie): 10 mM [S] KM 0.05 mM Avec son KM bas, l’hexokinase est continuellement en vmax, métabolisant le glucose efficacement dans des conditions physiologiques. 34  Modèle Michaelis-Menten: comparons la KM de deux kinases (enzymes phosphorylantes) pour leur substrat (glucose): hexokinase et glucokinase KM Vmax (mM glucose) HEXOKINASE (cerveau): 0.05 mM 1/2 Vmax GLUCOKINASE (foie): 10 mM [S] KM 10 mM Avec son KM élevé, la glucokinase peut « sentir » des changements de glucose entre 4-10 mM. (+/- active, donc senseur au glucose) 35 Modèle Michaelis-Menten: comparons la KM de deux kinases (V en valeur absolue [mmol/sec]) pour leur substrat (glucose): hexokinase et glucokinase KM~10 mM: faible affinité, haute capacité (foie, cellule ß) [mmol/sec] KM~0,05 mM: haute affinité, faible capacité (cerveau, muscles, etc…) 36  KM indique la cadence de travail d’une enzyme Le nombre de places sur un télésiège aussi. Hexokinase: Produits 2 places Glucokinase: 6 places 2 places Substrat 6 places 37 KM est inversement proportionnel à l’affinité de l’enzyme pour le substrat. Representation de LINEWEAVER-BURK ou "double inverse" 38 Site actif des enzymes Site actif 39  Site actif des enzymes Site actif d’une enzyme:  Site catalytique  Lieu de la réaction  Site de liaison du/des substrat/s  Localisé au fond d’une poche de la zone interne de la protéine  Modèle de clé – serrure  Modèle d’ajustement induit 40 M Modèle clé - serrure de deux substrats sur site actif de l’enzyme pour un produit 41 Modèle d’ajustement induit (induced fit) 42  Site actif des enzymes dans le site actif, il y a catalyse car:  Augmentation de la concentration des réactants  Orientation propice des molécules  Abaissement de l’énergie libre d’activation ∆G# pour atteindre l’état de transition 43  Site actif des enzymes 44 M  Site actif des enzymes Abaissement de l’énergie libre d’activation 45  Facteurs influençant la réaction  Température  pH A l’extrême, une dénaturation des protéines (enzymes) produit une Blanc d’œuf = Eiweiss = protéines inhibition non spécifique 46 M  Les inhibiteurs  Irréversibles (se lient de façon covalente à un groupe fonctionnel)  Réversibles (compétitifs, non compétitifs, mixtes) 47  Inhibiteurs réversibles compétitifs Analogues structuraux du substrat Augmentent la KM, ne changent pas la Vmax 48 Le cyanure est un inhibiteur compétitif de la cytochrome oxydase. Enzyme essentielle à l'une des dernières étapes de la respiration cellulaire. Sans son activité, les mouvements respiratoires pulmonaires cessent. Le Zyclon-B utilisé dans les camps de la mort nazis était constitué d'acide cyanhydrique. 49 L’éthanol est catabolisé dans le foie par une double oxydation: 1) en acétaldéhyde, 2) en acide acétique. Antabuse: inhibiteur compétitif de l'acétaldéhyde déshydrogénase, causant une accumulation d’acétaldéhyde aux effets indésirables…vomissements, nausée! Inhibiteur compétitif 50  Inhibiteurs non compétitifs Non-analogues structuraux du substrat Ne changent pas la KM, mais diminuent la Vmax 51 Typiquement des ions métalliques (cuivre, mercure, argent…)  En LINEWEAVER-BURK "double inverse" Inhibiteurs compétitifs Inhibiteurs non compétitifs Augmentent la KM, ne Ne changent pas la KM, mais changent pas la Vmax diminuent la Vmax 52  Les activateurs  Protéolyse limitée activatrice (clivage d’une liaison peptidique d’une proenzyme ou zymogène, enzymes digestion)  Modification covalente réversible (phosphorylation / déphosphorylation)  Ions métalliques (calcium, magnésium, etc..) 53  Les enzymes allostériques Enzymes allostériques caractérisés par une courbe sigmoïde (donc non-Michaeliens) 54 M  Modèle Michaelis-Menten Equation de Michaelis-Menten: vi = vmax [S] kM + [S] Quand [S] tend vers l’infini, vi = vmax 55 M  Les enzymes allostériques  Vi accélère à l’approche du KM (ou K0.5), point d’inflexion au KM, puis Vi ralenti brutalement après KM  La fixation du substrat sur l’enzyme augmente l’affinité de l’enzyme pour le substrat: coopératif 56 M Les enzymes allostériques ont des effecteurs  Se lient sur les sites allostériques (du grec allos [allo-], autre, différent), donc ≠ site substrat  Effecteurs positifs (activateurs) ou négatifs (inhibiteurs)  Augmentation ou diminution de l’affinité envers le substrat 57  Les enzymes allostériques: principe de coopérativité entre les sous-unités d’une enzyme. modèle concerté modèle séquentiel Quel que soit le modèle (concerté ou séquentiel): La présence d’un peu de substrat augmente l’affinité de l’enzyme pour ce même substrat  Déplacement de la courbe à gauche  Effet activateur 58 M La phosphofructokinase (glycolyse) est sous contrôle allostérique: +++ par ADP - - - par ATP 59  Inhibiteurs enzymatiques Non-spécifique Spécifique Dénaturation Réversible Irréversible Température Compétitif Non-compétitif pH Effecteur (acides/bases) allostérique négatif Alcool Métaux lourds Métaux lourds 60 Inhibiteur non compétitif et effecteur allostérique négatif: quelles différences ? Inhibiteur non compétitif Effecteur allostérique Ne changent pas la KM Module la K0.5 Effets sur une enzyme Effets sur une enzyme Michaelienne allostérique non-Michaelienne Effets non physiologiques, Effets physiologiques, enzyme piratée enzyme régulée (assimilable à un poison) 61