Tema 9: Terapia Génica - Genética Humana - 2024

Comisión 22 10/12/2024 Comisionista 1: Aroa Ramírez Álvarez Corrector/a: Elisa Rodríguez Pérez Comisionista 2: Noa de Olazábal Arteaga...

Comisión 22 10/12/2024 Comisionista 1: Aroa Ramírez Álvarez Corrector/a: Elisa Rodríguez Pérez Comisionista 2: Noa de Olazábal Arteaga Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz TEMA 9: TERAPIA GÉNICA Antes de comenzar con el temario, el profesor menciona a la profesora Belinda Rivero. Ella es una experta en aplicar esta tecnología y Fabián se ofrece, para aquel que quiera hablar con ella, a dar su correo aprovechando que está en Tenerife. 1. Definiciones de “Terapia génica”: Por definición, dependiendo de la fuente bibliográfica, terapia génica se puede entender de diferentes maneras: - “Técnica que permite introducir o modificar secuencias de ADN o ARN en células diana para regular la expresión de los genes de una persona” - “Cualquier tratamiento que introduzca material genético en las células del paciente” - “Utilizar como principio activo ácidos nucleicos con el objetivo de regular, reparar, sustituir, añadir o eliminar una secuencia génica” El denominador común entre todas ellas es que hay que introducir ADN o ARN dentro de una célula para codificar tanto la secuencia o la expresión de genes que tengan que ver con patologías. 2. Hitos históricos: La terapia génica no es algo reciente, aunque aparentemente sí. Realmente han habido abordajes de terapia génica desde el siglo pasado, desde los años 80. En 1999, se da un caso crítico en la aplicación de este tipo de terapia en enfermedades humanas. El caso de Jesse Gelsinger, paciente con déficit de ornitina transcarbamilasa, fallece a sus 18 años por respuesta inmunitaria al vector empleado en la terapia (derivado de adenovirus). ¿Qué ocurrió en este caso concreto? Tuvo una respuesta inmune exagerada frente a los vectores o vehículos (virus, en este caso, concretamente un adenovirus) que se emplearon para dirigir ADN hacia la célula dañada. Al no llevar a cabo las recomendaciones que en ese momento incluso ya estaban sobre la mesa, supuso un parón absoluto en el uso de la terapia génica para curar enfermedades o variar los síntomas de enfermedades. Pocos años después, en 2002, algunos niños que recibieron también en Estados Unidos terapia génica desarrollaron cáncer y se demostró que se debía a la propia terapia por inserción de ADN en zonas no deseadas del genoma esenciales para el correcto desarrollo de la célula (además en las zonas en las que se quería integrar desde un principio). 1 Comisión 22 10/12/2024 Comisionista 1: Aroa Ramírez Álvarez Corrector/a: Elisa Rodríguez Pérez Comisionista 2: Noa de Olazábal Arteaga Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz En el 2012, a nivel ya europeo, se aprobó la primera terapia génica, dirigida a una patología concreta, la deficiencia de lipoproteína lipasa hereditaria. Pero duró muy pocos años debido a cuestiones económicas y a que las patologías son muy poco frecuentes en la población (monogénica*). Entonces, para una compañía farmacéutica destinar millones de euros o dólares en diseñar estrategias para tratar patologías en 4 o 5 personas en todo el planeta sin beneficio, no compensa. Lo diseñaron para intentar avanzar en la parte de aplicación, pero luego se dieron cuenta que en la realidad era poco viable. *Monogénicas son enfermedades raras, hereditarias, y se encuentran en unas pocas personas en todo el planeta. Ya en 2016, en Europa, se aprobó la segunda terapia dirigida a déficit en adenosina desaminasa. En 2017, se da la primera terapia génica basada en células CAR-T para tratar la leucemia linfoblástica. Siendo las células CAR-T linfocitos T modificados en los que se generan receptores que podemos dirigir a la carga hacia cualquier tejido. En 2020 llegó la pandemia y con ella la terapia clínica basada, no en patologías humanas, sino en infecciones. Es decir, vacunas de ARNm para inmunizar frente a SARS-CoV-2 durante la pandemia COVID-19. Dicho de otra forma, para sintetizar ciertas proteínas y de esa manera inmunizar a la población en manera colectiva con vacunas que expresan parte de las proteínas que están en el genoma del virus. Pregunta de alumno: ¿Para hacer esto, antes se tuvo que aislar el virus? - Claro, en 2019, a finales en China, recuerdo, el 19 de diciembre, primeros casos en China, en el mercado este de Wuhan, comenzaron a haber casos de neumonía bilateral grave, y demás. Empezaron a aislar los laboratorios a ver si se trataba y encontraron que había un virus nuevo que no se había desplazado anteriormente. La clave para llevar a cabo todo este tipo de terapia o el diagnóstico basado en PCR para detectar presencia o ausencia del virus en una muestra nasal fue conocer el fenómeno del virus, secuenciarlo. Y a partir de ahí, diseñar vacunas, estrategias de diagnóstico para ver si está o no, PCR, pero una modificación de PCR en tiempo real. Y aquí falta un punto clave, que es noviembre de 2023, que se explica al final de la clase. 3. Tipos de terapia génica: Se pueden clasificar en dos dependiendo de qué células estemos modificando: Terapia génica de células germinales: ○ Modifica la dotación genética de los gametos, transmisible a la descendencia. 2 Comisión 22 10/12/2024 Comisionista 1: Aroa Ramírez Álvarez Corrector/a: Elisa Rodríguez Pérez Comisionista 2: Noa de Olazábal Arteaga Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz ○ Está prohibida en humanos debido a las limitaciones tecnológicas de manipulación de células germinales y a consideraciones éticas. Como ya se comentaba anteriormente, sigue habiendo problemas para dirigir específicamente un bloque ADN a una región concreta del genoma y editar solamente esa región. Si además de hacer eso, hay lo que se llama en inglés “off-target", el ADN entra donde queremos, pero se nos cuela por otro lado del genoma, en otro cromosoma o en algún punto que no queremos, puede haber problemas. Si modificamos la línea general, puede que estemos modificando el futuro de la población humana. Por lo tanto, aunque esto sí se permite en el modelo animal para investigación, en el humano no. (PREGUNTA DE EXAMEN) Como curiosidad, saber que hubo un caso en el ser humano que si cruzó esa línea. El caso de un investigador en China que editó la línea germinal para eliminar un receptor del VIH de manera que la descendencia no estaba expuesta a pesar de estar en un entorno con VIH. Esta persona está en la cárcel. Terapia génica de células somáticas: ○ Modifica la dotación genética de células no germinales, las células somáticas o constituyentes del organismo, no transmisible a la descendencia. ○ Permitida con fines clínicos en humanos, pero no para ingeniería genética de la potenciación. Pregunta del profesor relacionada con la terapia génica de células somáticas: ¿Podría usarse esta tecnología para editar el genoma de los individuos y quitarle el receptor del dolor o estimular el desarrollo muscular? Se podría hacer. ¿Para qué? Por ejemplo, soldados que van a una guerra. Si no tienen receptores del dolor y tienen musculatura desarrollada son robots. Ahí no se puede usar la terapia génica, está prohibido. Otra cosa es que alguien lo esté haciendo. Pero hay normativas muy estrictas a nivel global que regulan el uso de terapia. 4. Estrategias de terapia génica: Terapia génica in vivo: El material genético se introduce directamente en las células del organismo, de manera que introducimos ADN en la persona directamente. Ventaja: sencillez. Desventaja: menor eficiencia, especificidad tisular y control sobre la transferencia de ADN. Terapia génica ex vivo: Las células son extraídas del paciente, aisladas, crecidas en cultivo y sometidas al proceso de transferencia in vitro. Ventaja: selección de células a modificar, control sobre el proceso y mayor eficacia. Desventaja: mayor complejidad y coste. Tejidos que no son susceptibles de crecer in vitro. Para comprobar que la terapia génica ha funcionado correctamente, es decir, asegurarnos de que el bloque de ADN se ha integrado en un punto y no en otro, lo haríamos mediante la secuenciación del genoma completo de esa célula. Si esto ha ocurrido correctamente, se usaría esta célula para hacer un trasplante autólogo. 3 Comisión 22 10/12/2024 Comisionista 1: Aroa Ramírez Álvarez Corrector/a: Elisa Rodríguez Pérez Comisionista 2: Noa de Olazábal Arteaga Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz 5. Vectores empleados en terapia génica: *A partir de lo nombrado por el profesor, se señalizarán las ventajas del vector en verde, las desventajas en rojo y, en caso de ser tanto una ventaja como desventaja se marcará en azul. VIRALES: Obtenidos a partir de virus, eliminando de sus genomas los factores de virulencia. Existen diferentes tipos de vectores, en función del tipo de célula en la que se integran: ○ Retrovirales: genoma de ARN, no inducen inmunidad y se integran dentro del genoma (podrían integrarse en regiones de desinterés), pero solo en células que se están dividiendo y pueden inducir mutaciones no esperadas. ○ Adenovirales: genoma de ADN bicatenario, transducen en células que no están en división y no se integran en el genoma (no hay riesgo de mutagénesis por inserción), pero su expresión es temporal (provoca respuesta inmune). ○ Virus adenosasociados: no patológicos (no hay respuesta inmune), pero el tamaño de DNA a introducir es limitado. Este se suele usar bastante dado que la cantidad de ADN que se necesita a introducir es muy pequeña por lo tanto no hay problema con la limitación. NO VIRALES: ○ Liposomas: lípidos catiónicos con carga postiva para encapsular ADN con carga negativa sin restricción de tamaño. Alta eficacia, inmunogenicidad casi nula, estabilidad de almacenaje y sencillez de uso. Pero no presentan especificidad celular. Existen variantes de liposomas, “virosomas”, combinadas con ciertas partículas de proteínas víricas para dirigirse de otra manera. ○ Métodos físicos: introducción de ADN en la célula mediante un microinyección (para dirigir ADN a un sitio completo), bombardeo de partículas (sobre todo de oro), electroporación (descargas eléctricas en células). Limitaciones por su aplicación local y el número reducido de células. Patologías que se pueden tratar con esta terapia: aquellas con un gen causal concreto, este es el caso concreto de las enfermedades monogénicas, pues están muy bien caracterizadas y que, modificando la secuencia del gen, o curamos o reducimos la dosis. Sin embargo, si es multigénicas, pueden haber muchos puntos que están contribuyendo a la patología y que, a día de hoy, no conocemos. ○ Otros: conjugados moleculares con anticuerpos monoclonales que confieren especificidad celular. Policationes que permiten la interacción con el DNA, su condensación y la interacción con las membranas celulares. Péptidos. 6. Enfermedades objeto de terapia génica: Aquellas en las que: El gen o el locus causal está identificado, es decir, cúal es el gen casual (normalmente en enfermedades monogénicas dado que solo habría que “tocar” una región del genoma para tratarla). Por ejemplo: Fibrosis quística. Las células diana son accesibles y están bien caracterizadas. La relación riesgo/beneficio es favorable. Es decir, hay más beneficios que riesgos. 4 Comisión 22 10/12/2024 Comisionista 1: Aroa Ramírez Álvarez Corrector/a: Elisa Rodríguez Pérez Comisionista 2: Noa de Olazábal Arteaga Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz La vida del paciente está gravemente comprometida debido a los costes económicos que suponen. Escenarios patológicos posibles: Terapia de adición: la proteína no se sintetiza o carece de función total o parcial (autosómica recesiva). Terapia de silenciamiento: la proteína se sintetiza pero su función es función anómala o excesiva (autosómica dominante). 7. Terapia de Adición Génica: Dirigida a mutaciones con pérdida de función, introduciendo en las células una copia funcional del gen. Vemos el ejemplo: Strimvelis - Mutaciones en el gen ADA (chr 20), codificante de la adenosina desaminasa (por lo que está implicada en el catabolismo de las purinas), que derivan en la producción de una proteína no funcional. - Inmunodeficiencia combinada grave (autosómica recesiva): carencia de linfocitos, aumentando el riesgo de infecciones, cáncer y desarrollo lento. - Consiste en obtener una muestra de médula ósea del paciente, enriquecer células CD34+, insertar una copia de ADN complementario del gen ADA usando un retrovirus y hacer una transfusión. (Al ser el caso de autosómica recesiva con una dosis se solucionaría el problema, pues con una dosis sería suficiente de cara a generar cantidad de proteína para que cumpla esa función esencial para la célula). Se emplean retrovirus en este caso, en los que se encapsula ADN con copias de este gen. - Primera terapia génica autóloga ex vivo aprobada por la EMA (European Medicines Agency) en 2016 (caso comentado anteriormente). - De aplicación en pacientes sin opciones de donantes de médula ósea compatibles. - Resultados: mediante una sola intervención, los efectos son duraderos y hay una mejora considerable de la capacidad para combatir infecciones. *Recomendación del profesor: https://www.youtube.com/watch?v=xOQFJJOBGM0 5 Comisión 22 10/12/2024 Comisionista 1: Aroa Ramírez Álvarez Corrector/a: Elisa Rodríguez Pérez Comisionista 2: Noa de Olazábal Arteaga Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz 8. Terapia de Silenciamiento Génico Este sería un caso de enfermedad autosómica dominante que en lugar de añadir como en la terapia de adición génica, lo que se hace es silenciar. Está basado en virus de ADN asociado y dirigida a mutaciones con ganancia de función, bloqueando la función del gen con expresión anómala. Vemos el ejemplo: Patisiran (Onpattro) - Dirigida a mutaciones en el gen TTR (chr 18) producen transtirretina mal plegada y acumulación de fibrillas amiloides. - Enfermedad de Andrade (autosómica dominante): polineuropatía, miocardiopatía y distonía neurovegetativa (inhabilitante y mortal). - La estrategia es el RNA interferente (siRNA), encapsulado en partículas lipídicas o virus adenoasociados (AAV), para degradar el ARNm de TTR. Esto consiste en que pequeños ARN mensajeros forman puentes de hidrógeno con pequeñas moléculas de ARN mensajero del gen en concreto. En caso de que ocurra, se degrada el ARN de ese gen. Si se degrada dado que es autosómica dominante producimos al mínimo de esa proteína con función anómala. - Aprobado por la FDA (Food and Drug Administration) en 2018. - Mejora la polineuropatía, la calidad de vida del paciente, el estado nutricional y los síntomas neurovegetativos. Pacientes con esta patología tienen una esperanza de vida muy corta. La estrategia basada en esta terapia génica. *Recomendación del profesor: https://www.youtube.com/watch?v=t5jroSCBBwk En ninguno de los dos casos de terapia anteriores estamos resolviendo el problema de raíz ya que las mutaciones siguen estando presente, no estamos modificando el ADN genómico, en el último caso intervenimos a nivel de ARN pero el gen que codifica ese ARN se traduce en una proteína anómala de función anómala. 9. Terapia de Edición Génica En este caso se va directamente al genoma y se modifica el problema. Está dirigida a mutaciones con ganancia o pérdida de función, incorporando fragmentos de ácidos nucleicos que inserten, eliminen o cambien las regiones específicas del ADN. Este es el investigador de la Universidad de Alicante. Descubrió que en muchos genomas y bacterias diferentes, encontró lo que él definió como CRISPR. Este sistema tiene dos partes principales: CRISPR (repeticiones palíndromiscas cortas que se agrupan de manera regular y que están interespaciadas por secuencias únicas) y Cas (conjunto de genes que codifican proteínas con capacidad endonuclea, estas son enzimas que cortan el ADN dentro de la doble cadena). En el genoma bacteriano, hay fragmentitos de virus que pertenecen a esas bacterias y que van haciendo una especie de copia del genoma, llevando a cabo luego un evento de integración que supone que se dupliquen estas regiones de manera palindrómica. Esto es dinámico. 6 Comisión 22 10/12/2024 Comisionista 1: Aroa Ramírez Álvarez Corrector/a: Elisa Rodríguez Pérez Comisionista 2: Noa de Olazábal Arteaga Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz Es un mecanismo de defensa natural de las bacterias frente a virus, se está planteando el uso de virus bacteriófagos paar modificarlos y dirigirlos con CRISPR. De modo que usaríamos el virus como arma de mi bacteria patogénica. Basada en el sistema CRISPR-Cas, identificado en el genoma de diferentes especies de bacterias y arqueas. Funciona como un ‘sistema inmunitario adaptativo’ y está compuesto por dos partes: Región CRISPR, acuñado por Francis Mojica como ‘Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente Interespaciadas, de origen exógeno (virus). Operón Cas: contiene genes codificantes de varias endonucleasas Cas. Viene del término CRISPR-associated proteins. Estas son, básicamente, tijeras. Lo que está representado en rombos negros son secuencias idénticas mientras que las que tiene colores, (violeta, verde, azul, amarillo…) son diferentes. Los rombos de colores son secuencias idénticas al genoma de diferentes tipos de bacterias o virus. *Recomendación del profesor: https://genotipia.com/crispr-cas/ 10. Función natural de CRISPR-Cas Fase de adaptación Entra el virus, coge una parte del genoma y lo integra, es decir sigue la fase inicial. Fase de producción de ARN CRISPR Se genera una molécula de ARN en la que tenemos secuencias de ARN que representan al genoma. Es decir, vamos a tener ARN, cuyas secuencias van a ser iguales a las del virus que ha producido la bacteria a partir de la transcripción de su propio genoma. Fase de Targeting El ARN CRISPR guía la maquinaria molecular para atacar y destruir el genoma viral. 7 Comisión 22 10/12/2024 Comisionista 1: Aroa Ramírez Álvarez Corrector/a: Elisa Rodríguez Pérez Comisionista 2: Noa de Olazábal Arteaga Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz 11. Uso de CRISPR-Cas9 para edición génica En 2012, Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna publicaron la herramienta CRISPR-Cas9 para editar moléculas de ADN a la carta (premio Nobel de Química del año 2020). La nucleasa Cas9 desnaturaliza el ADN bicatenario y corta ambas cadenas en sitios específicos, en base a ARN guías (crRNA y tracrRNA) diseñados a la carta para que formen puentes de hidrógeno con la región deseada. Permite corregir mutaciones, suprimir e insertar secuencias de ADN e incluso para inactivar genes concretos. 12. Variantes de la herramienta CRISPR-Cas Las dos primeras emplean mecanismos ya conocidos. El mecanismo en color verde de ARN, ADN que queremos modificar en color azul bicatenario de la célula diana y la proteína Cas9 que es la que trata de orientar el ADN. Si yo combino dentro de un virus ADN asociado, por ejemplo, Cas9 con el ADN guía y con un molde en ADN bicatenario que simula una cromátida hermana, lo que va a ocurrir es que estamos simulando la rotura de doble cadena como por ejemplo en exposición a radiación ionizante. Luego de este corte, metemos un bloque de ADN dentro; si no le ponemos el ADN molde, como no hay cromátida hermana, entra en juego el mecanismo, comentado a continuación, de reparación o emparejamiento de extremos no homólogos (mediante inserciones o delecciones). Pregunta de clase: ¿Qué mecanismos de reparación están implicados en reparar daños en rotura de doble cadena? Recombinación homóloga o emparejamiento de extremos no homólogos. Las siglas empleadas para los homólogos era “HR” y la otra era “NHEJ” (Non-Homologous End Joining). 8 Comisión 22 10/12/2024 Comisionista 1: Aroa Ramírez Álvarez Corrector/a: Elisa Rodríguez Pérez Comisionista 2: Noa de Olazábal Arteaga Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz Si modificamos el gen que codifica a la proteína Cas9 y le quitamos la capacidad de cortar (solo mantenemos la capacidad de unión y separación de cadenas) y, además la fusionamos con otra proteína que tiene un dominio de fusion diferente, siendo capaz de retirar grupos de amino de la citosina (desaminación). Ahora, con el ARN guía se lleva a este complejo de proteínas a donde queramos, pautándole que queremos desaminar a una proteína concreta, convirtiéndola en uracilo (si no está metilada) o en timina (si está metilada). Por lo que estaríamos introduciento una transición y así revirtiendo un posible problema mediante la edición de bases. *Recomendación del profesor: https://www.youtube.com/watch?v=4YKFw2KZA5o 13. Ensayos clínicos con CRISPR-Cas Existen diversos ensayos clínicos con CRISPR-Cas: a) Desórdenes sanguíneos b) Patologías oculares c) Plegamiento erróneo de proteínas d) Cáncer e) Infecciones crónicas f) Diagnóstico *Recomendación del profesor: https://innovativegenomics.org/crisprpedia/crispr-in-medicine/ 14. Casgevy: primera terapia CRISPR-Cas Aprobada a finales de 2023, noviembre, para pacientes con anemia falciforme o beta-talasemia causada por mutaciones en el gen HBB. Terapia celular ex vivo con células células madre hematopoyéticas modificadas para producir hemoglobina funcional, para luego llevar a cabo un trasplante autólogo. Inducción del gen que produce la beta-globina fetal (hemoglbina especial que tiene una curva de saturación diferente y que permite captar el oxígeno mediante la sangre, esto lo hace expresando un gen que codifica esta hemoglobina), silenciado poco después del nacimiento, al ser reemplazado por la beta globina de adultos. Mediante CRISPR se elimina una región intensificadora (enhancer) que aumenta la expresión del gen BLC11A. Este gen codifica un represor de la expresión de la proteína beta globina fetal. En Estados Unidos la terapia cuesta 2 millones de dólares/paciente. Una vez que el niño nace, que equivale al punto 0 en la gráfica, se inhibe la expresión de ese gen y se induce la expresión del gen de la beta-globulina humana para generar hemoglobina adulta 9 Comisión 22 10/12/2024 Comisionista 1: Aroa Ramírez Álvarez Corrector/a: Elisa Rodríguez Pérez Comisionista 2: Noa de Olazábal Arteaga Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz COMI X: Seleccione la(s) afirmación(es) correcta(s): a. Es un sistema con amplias aplicaciones tales como sustitución de un solo nucleótido o modificación del estado de condensación de la cromatina. b. Es un sistema muy restrictivo en cuanto al tipo de modificaciones que puede hacer en el genoma. c. Es un sistema que se puede aplicar a realizar cambios genéticos en células en cultivos o tejidos humanos, mientras no se afecte la línea germinal. d. Se desarrolló gracias al descubrimiento de secuencias repetitivas en el genoma humano. e. Es un sistema preciso, pero actualmente no se puede emplear en células en cultivo ni en ratones de laboratorio. Respuesta: a y c Correlacione los conceptos con las opciones Conceptos: 1. Terapia de silenciamiento 2. Terapia de adición 3. Terapia de modificación Opciones: a. Mutación que causa pérdida de función b. Mutación que causa ganancia de función c. Mutación que causa pérdida y/o ganancia d. Se resuelve con bloqueo de la función e. Se resuelve con adición de función f. Se resuelve editando la secuencia para ganar o perder función Respuesta: 1bd; 2ae; 3cf El uso del sistema CRISPR en el contexto de la investigación y terapia génica. Seleccione la(s) afirmación(es) correcta(s): a. Es un sistema con amplias aplicaciones tales como sustitución de un solo nucleótido o modificación del estado de condensación de la cromatina. b. Es un sistema muy restrictivo en cuanto al tipo de modificaciones que puede hacer en el genoma. c. Es un sistema que se puede aplicar a realizar cambios genéticos en células en cultivos o tejidos humanos, mientras no se afecte la línea germinal. d. Se desarrolló gracias al descubrimiento de secuencias repetitivas en el genoma humano. e. Es un sistema preciso, pero actualmente no se puede emplear en células en cultivo ni en ratones de laboratorio. Respuesta: a, c, d 10