סיכום לבגרות בהנדסה גנטית PDF

‫‪1‬‬ ‫סיכום החומר לבגרות בהנדסה גנטית‬ ‫מאת‪:‬דר' אורית לוסטיג יריב‬ ‫הערות‪ :‬החומר פה סיכום בספר ובכיתה יש יותר פירוט אבל כאן ניסיתי לכתוב את התמצית של הידע‬...

‫‪1‬‬ ‫סיכום החומר לבגרות בהנדסה גנטית‬ ‫מאת‪:‬דר' אורית לוסטיג יריב‬ ‫הערות‪ :‬החומר פה סיכום בספר ובכיתה יש יותר פירוט אבל כאן ניסיתי לכתוב את התמצית של הידע‬ ‫שאתם צריכים‪.‬בבקשה תשאלו שאלות ואשפר‪.‬בהצלחה‪.‬‬ ‫מ‪ DNA-‬לחלבון‬ ‫מבנה ה‪DNA-‬‬ ‫יחידת המבנה של ה‪ DNA -‬היא נאוקלאוטיד‪.‬‬ ‫ ‬ ‫כל נאוקלאוטיד מכיל‪ :‬בסיס שזה המשתנה‪.‬חומצה פוספורית וריבוז‪.‬כאשר ב‪ DNA -‬לריבוז‬ ‫ ‬ ‫אין חמצן על פחמן מספר ‪.2‬‬ ‫‪OH‬‬ ‫‪HO‬‬ ‫‪P‬‬ ‫‪O‬‬ ‫‪CH2‬‬ ‫‪Base‬‬ ‫‪O‬‬ ‫‪O‬‬ ‫‪C‬‬ ‫‪H‬‬ ‫‪H‬‬ ‫‪C‬‬ ‫‪C‬‬ ‫‪C‬‬ ‫‪H‬‬ ‫‪H‬‬ ‫‪H‬‬ ‫‪H or OH‬‬ ‫ארבעת הבסיסים של ה‪:DNA-‬‬  ‫‪2‬‬ ‫יצירה של מולקולת ‪ DNA‬נעשית על ידי הוספת בסיסים לקצה ה‪. 3' -‬בתהליך שנעשה על ידי אנזים‬ ‫‪ DNA‬פולימראז יש צורך בנאוקלאוטידים במצב טרי פוספאט‪.‬ולא מונופוספאט כמו שהם בסוף‬ ‫התהליך‪.‬‬ ‫כך בקצה אחד (העליון בתמונה) נותרת חומצה פוספורית שאינה קשורה והיא נמצאת על פחמן מספר‬ ‫‪ 5‬של הריבוז לכן לקצה הזה של מולקולת ה‪ DNA -‬קוראים קצה '‪. 5‬בקצה שלמטה רואים שיש‬ ‫קבוצה של הידרוקסיל לא בקשר והיא מצויה על פחמן מספר ‪ 3‬של הריבוז ולכן קרויה קצה '‪(.3‬את‬ ‫הצ'ופצ'יק אומרים פריים‪ ).‬לכן ל‪ DNA-‬וגם ל‪ RNA-‬יש קצה חמש פריים וקצה שלוש פריים‪.‬לקשר‬ ‫הכימי בין הבסיסים קוראים קשר פוספודיאסטרי‪.‬‬ ‫ה‪ DNA-‬בטבע מופיע בצורת דו גדיל‬ ‫אדנין משלים את טימין עם שני קשרי מימן וציטוזין משלים את גואנין עם שלושה קשרי מימן‪.‬כמו‬ ‫שניתן לראות בציור הבא‪:‬‬  ‫‪3‬‬ ‫קשרי המימן הם חלשים יותר מקשרים קוולנטיים ולכן ניתן לפתוח (לעשות דנטורציה) לדו גדיל של‬ ‫‪ DNA‬על ידי העלאת טמפרטורה‪.‬‬ ‫גדילי ה‪ DNA-‬מצויים לרוב בטבע בצורה אנטי מקבילה כלומר גדיל אחד בכיוון מ‪ 5' -‬ל‪ 3' -‬ושני בכיוון‬ ‫מ‪ 3'-‬ל‪.5'-‬‬ ‫שימו לב אנחנו אומרים שהגדילים משלימים זה לזה‪.‬כלומר בזיווג בסיסים זה עם זה‪.‬התהליך בו‬ ‫גדילים של ‪ DNA‬נצמדים זה לזה קרוי היברידיזציה‪.‬‬ ‫כל כרומוזום הוא מולקולת דו גדיל של ‪ DNA‬של כמילארד זוגות בסיסים זאת היא היחידה למדוד‬ ‫אורך של ‪.DNA‬‬ ‫הכרומוזומים ארוזים בצורה מאד דחוסה וצורת האריזה שלהם היא חלק מבקרת תעתוק הגנים שלא‬ ‫צריך לדעת לבגרות אבל זה מעניין ולכן נלמד כהעשרה‪.‬‬ ‫שכפול ‪ -DNA‬רפליקציה‬ ‫תהליך שכפול ה‪ DNA -‬מתקיים פעם אחת בחיי תא והוא מרכזי בתהליך חלוקת התא‪.‬בתהליך זה‬ ‫מדו גדיל אחד של ‪ DNA‬נוצרים שנים שזהים לו‪(.‬מלבד מוטציות) התהליך הוא מורכב אך אנחנו‬ ‫נתרכז במה שצריך לזכור‪.‬‬  ‫‪4‬‬ ‫באאוריוטיים התהליך מתרחש בגרעין‪.‬מעורבים בו אנזימים רבים‪.‬חלקם לא צריך לזכור כמו‪:‬‬ ‫האנזים טופואיזומראז דואג שהגדילים לא יתלפפו סביב עצמם בפתיחה‪.‬האזנים הליקאז פותח את‬ ‫ה‪ DNA-‬ואז הוא נפרד לשני חד גדילים‪.‬‬ ‫חשוב לדעת! האנזים ‪ DNA‬פולימראז שיוצר את הגדיל המשלים של ה‪ DNA-‬לא מסוגל להתחיל יש‬ ‫מאין‪ ,‬הוא יכול להוסיף בסיסים רק לגדיל ‪ DNA‬שכבר קיים‪.‬למקטע הקטן ההתחלתי שאליו נוספים‬ ‫הבסיסים קוראים פריימר‪.‬בטבע‪ ,‬הפריימר עשוי מ‪ RNA-‬ויוצר אותו אנזים בשם פרימאז‪.‬לאחר סיום‬ ‫תהליך שכפול ה‪ ,DNA-‬אנזימי התיקון התאיים יוציאו את מקטעי ה‪ RNA -‬המצויים בתוך ה‪DNA-‬‬ ‫ויחליפו אותם ב‪.DNA-‬בעבר גם היה צורך להבין לבגרות שבחיידק שני גדילי ה‪ DNA-‬משתכפלים‬ ‫באופן שונה כיום אתם רק צריכים לדעת שגדיל אחד משתכפל באופן מקוטע והמקטעים מתחברים‬ ‫על ידי אנזים ליגאז‪.‬אנזים זה חשוב בהמשך להנדסה גנטית הוא מוצא מקומות בהם אין קשר‬ ‫פוספודיאסטרי בין בסיסים של ‪ DNA‬ומוסיף אותו‪.‬‬ ‫לאחר שהבנו את זה צריך להבין שה‪ DNA-‬פולימראז יוצר את הגדיל המשלים לפי זיווג הבסיסים מול‬ ‫כל ‪ A‬ישים ‪ T‬וההיפך ומול כל כל ‪ G‬ישים ‪ C‬וההיפך‪ ,‬הכיוון של הפולימריזציה הוא מ‪ 5'-‬ל‪.3'-‬הנה‬ ‫תמונת התגובה‪.‬‬  ‫‪5‬‬ ‫ועוד תמונה שמראה גם את ההתחשבות בזיווג הבסיסים‪:‬‬ ‫השכפול של ‪ DNA‬מתחיל באזור מסוים שקרוי )‪ Origin of replication (ORI‬בגנום יש מספר אתרים‬ ‫כאלה שנפתחים בעת שכפול ה‪ DNA-‬ובהם יתחיל השכפול במקביל‪.‬כאמור זהו שלב מקדים לחלוקת‬ ‫התא‪ ,‬כך יווצרו מכל תא שני תאים בעלי אותו מטען תורשתי‪.‬‬ ‫לשם הפעלתו של האנזים ‪ DNA‬פולימראז במבחנה דרושה נוכחותם של ארבעה גורמים‪:‬‬ ‫תבנית דנ"א‪.‬‬ ‫‪.1‬‬  ‫‪6‬‬ ‫רצף חד‪-‬גדילי הרנ"א משלים לאיזור התחלה של ההכפלה לתבנית דנ"א ‪.‬רצף זה קרוי‬ ‫‪.2‬‬ ‫פרימר‪.‬מסתבר שבאופן מלאכותי אפשר גם להוסיף פריימר של ‪.DNA‬‬ ‫יוני ‪( Mg+2‬קופקטור של אנזים דנ"א פולימרז)‬ ‫‪.3‬‬ ‫ארבעה סוגי חומרי מוצא‪.dTTP, dCTP , dGTP , dATP :‬‬ ‫‪.4‬‬ ‫בופר בעל ‪ pH‬מתאים לתגובה‪.‬‬ ‫‪.5‬‬ ‫מ‪ DNA-‬ל‪RNA-‬‬ ‫‪ RNA‬ריבונאוקלאיק אסיד היא מולקולה מאד דומה ל‪ DNA-‬ההבדלים הם‪:‬‬ ‫‪.1‬הסוכר בנאוקלאוטיד הוא ריבוז ולא דאוקסיריבוז כמו ב‪.DNA-‬‬ ‫ההבדל בין הסוכרים הוא המקור להבדל בין שמות החומרים‪:‬‬ ‫‪Deoxyribo-Nucleic Acid=DNA‬‬ ‫‪Ribo-Nucleic Acid=RNA‬‬ ‫‪.2‬הבסיסים הם ‪ G,C ,A‬ו‪ U-‬ולא ‪ G, C ,A‬ו‪ T-‬כמו ב‪DNA -‬‬ ‫‪.3‬מולקולת ה‪ RNA-‬נוצרת לרוב כחד גדיל‪.‬‬ ‫‪.4‬מולקולת ה‪ RNA-‬קצרה מאד יחסית לזו של ה‪.DNA -‬‬  ‫‪7‬‬ ‫תעתוק‪ -‬תהליך יצירת ‪ RNA‬על תבנית של ‪)transcription ( DNA‬‬ ‫תהליך התעתוק הוא תהליך בנית מולקולת ‪ RNA‬על פי רצף הבסיסים באחד מגדילי ה‪.DNA -‬‬ ‫באאוקריוטיים הוא מתרחש בגרעין‪.‬התהליך מורכב מאד‪ ,‬אך מתרחש על ידי האנזים ‪ RNA‬פולימראז‬ ‫שנקשר לגורמי תעתוק הנקשרים לרצף הכרה ב‪ DNA-‬הקרוי פרומוטר‪.‬ה‪ DNA -‬נפתח באופן מקומי‬ ‫ועל הגדיל שבו זוהה הפרומוטר יתרחש תעתוק שהוא הרכבת ‪ RNA‬לפי זיווג בסיסים לרצף ה‪.DNA-‬‬ ‫בתום התהליך תשתחרר מולקלות ה‪ RNA-‬וה‪ DNA-‬יסגר חזרה‪.‬‬ ‫באאוקריוטים תעבור מולקולת ה‪ RNA-‬עיבוד נוסף (יוסבר בהמשך ) לפני יציאתה מהגרעין‪.‬‬ ‫זה התהליך באופן פשוט‪.‬שימו לב! האנזים ‪ RNA‬פולימראז אינו צריך פריימר הוא מתחיל יש מאין את‬ ‫סינטזת ה‪.RNA -‬‬ ‫זיכרו! כל תהליך תעתוק מתחיל מפרומוטר‪.‬הפרומוטר לא עובר תעתוק‪.‬‬  ‫‪8‬‬ ‫כך נראה פרומוטר פרוקריוטי‪.‬זהו אתר איניציאציה‪ ,‬התחלה של התעתוק‪.‬יש בו אזורים של ‪TATA‬‬ ‫באזור התחלת פרימת ה‪ DNA-‬בסיסים אלה יוצרים פחות קשרי מימן ולכן קל יותר לפתוח אותם‪.‬‬ ‫באאוקריוטיים יש פקטורים רבים שמקדימים קישור לפרומוטר לפני שה‪ RNA -‬פולימראז נקשר‬ ‫ומתחיל תעתוק‪.‬הנה התמונה להמחשה‬  ‫‪9‬‬ ‫אינכם צריכים להכיר את כל הפקטורים אך יש להבין שזהו מקום מאד חשוב בבקרה על הביטוי של‬ ‫הגנים‪.‬למשל אם פקטור אחד לא מתבטא או יקשר רק לאחר שינוי מסוים אז הוא מהווה פקטור‬ ‫רגולטורי‪.‬בקרה זו מאד חשוב ונחקרת הרבה‪.‬‬  ‫‪10‬‬ ‫בתמונה זו ניתן לראות כמה פקטורי תעתוק שנקשרים למספר אתרים ב‪ DNA-‬ורק בהתניה כזו‬ ‫יתקשר ויתעתק ‪ RNA‬פולימראז‪.‬קיימות דוגמאות רבות לאתרים כאלה ולבקרת תעתוק מאד מורכבת‪.‬‬ ‫לבגרות אתם צריכים להבין שיש פרומוטרים שתמיד יחול מהם תעתוק‪.‬קונסטיטוטיביים‬ ‫ופרומוטרים שרק יחול מהם תעתוק בתנאים מסוימים – רגולטוריים‪.‬‬ ‫אתם צריכים להבין שמוטציה בפרומוטר יכולה להביא לאבדן של תעתוק של גן‪.‬במקרה כזה לא יחול‬ ‫שינוי ברצף הגן רק ברצף הפרומוטר‪.‬מוטציה בפרומוטר יכולה גם לגרום לכך שגן שמתועתק רק‬ ‫באופן רגולטורי יתועתק באופן קונסטיטוטיבי‪.‬‬ ‫יכולה גם להיות מוטציה בגורם תעתוק גם זה יכול להביא או לאי קישור שלו ואז אי תעתוק של גן או‬ ‫לקישור חזק מדי ואז לתעתוק יתר‪.‬‬ ‫תהליך עיבוד ה‪ mRNA-‬מתרחש רק באאוקריוטיים (למי שקורא את החומר בפעם הראשונה כדאי‬ ‫לחזור לסעיף זה לאחר הבנת תהליך התרגום)‬ ‫לאחר שנוצרת מולקולת ה‪ mRNA-‬בתהליך התעתוק (שימו לב יש עוד סוגי מולקולות של ‪ RNA‬שמה‬ ‫שכתוב כאן לא מתרחש במקרה שלהן) היא עוברת עיבוד בגרעין בטרם צאתה לציטופלסמה‪.‬‬ ‫העיבוד כולל שלושה שלבים‪::‬‬ ‫‪.1‬תהליך שחבור‪ :‬הוצאת הרצפים שלא מקודדים לחלבון ששמם אינטרונים תוך כדי חיבור‬ ‫הרצפים המקודדים לחלבון ששמם אקסונים‪.‬‬ ‫‪.2‬הוספת נאוקלאוטיד ב‪ 5'-‬ששמו ‪CAP‬‬ ‫‪.3‬הוספת זנב של ‪ A‬ב‪.3' -‬‬  ‫‪11‬‬ ‫נפרט‪:‬‬ ‫תהליך השחבור‬ ‫ב‪ DNA-‬האאוקריוטי מצוי הרצף המקודד לחלבון בצורה מקוטעת‪.‬הרצפים המקודדים מופרדים‬ ‫וביניהם יש רצפים שאינם מקודדים לחלבון‪.‬הרצפים המקודדים קרויים אקסונים והרצפים ביניהם‬ ‫קרויים אינטרונים‪.‬מערך אנזימטי שלם יוציא את האינטרונים תוך כדי חיבור האקסונים‪.‬‬ ‫בתמונה זו אתם רואים כמה אנזימים מעורבים בהוצאה של אינטרון וחיבור האקסונים‪ ,‬זהו תהליך‬ ‫מאד מורכב‪.‬היתרון לתהליך כזה הוא שהוא מאפשר רמת בקרה נוספת‪.‬רוב ה‪ DNA-‬אינו מקודד‬ ‫לחלבון מוערך כי רק שני אחוזים מכלל ה‪ DNA-‬מקודד לחלבון‪ ,‬רוב שאר ה‪ DNA-‬משמש לרמות‬ ‫שונות של בקרה וארגון‪.‬קיום של תהליך שחבור מאפשר שמרצף אחד שמקודד יתקבלו מספר‬ ‫חלבונים שונים בשחבור חליפי כפי שמתואר בתמונה הבאה‪:‬‬  ‫‪12‬‬ ‫בדוגמה זו ניתן לראות כי מרצף מקודד אחד מתקבלים שלושה חלבונים שונים‪.‬מאד חשוב לדעת‬ ‫שאינטרון יש בו הרבה קודוני פסק כך שאם יש מוטציה שבה אינטרון מסוים לא עובר שחבור יופסק‬ ‫תהליך תרגום החלבון על פי רוב בשל קודון פסק באינטרון‪.‬אז יווצר ‪ mRNA‬ארוך יותר אבל החלבון‬ ‫שיתקבל יהיה קטן יותר על פי רוב מהחלבון המקורי‪.‬‬ ‫‪Capping‬‬ ‫ה‪ mRNA-‬עובר תהליך של הוספת שבע מתיל גואנין בצורה הפוכה ב‪ 5'-‬קוראים לזה כיפה‪.‬הכיפה‬ ‫מיצבת את ה‪ mRNA -‬ומסיעת לריבוזום להכירו‪.‬אין צורך להכיר את התהליך לבגרות אך בכל זאת‬ ‫הנה הוא‪:‬‬  ‫‪13‬‬ ‫פוליאדנילציה ב‪3'-‬‬ ‫בקצה ה‪ 3'-‬שלו עובר ה‪ mRNA-‬תהליך של הוספת בסיסים מסוג ‪.A‬טוענים שגם תהליך זה נועד‬ ‫לייצוב ה‪.mRNA-‬במולקולת ‪ mRNA‬באדם יש בממוצע ‪ 200‬בסיסים בקצה ה‪.3'-‬כאשר הוא פוחת ל‪-‬‬ ‫‪ 30‬סיכוייו להתפרק גדלים‪.‬יש בקרות על יציבותו שקשורות בכך‪.‬‬ ‫לאחר העיבוד יוצאת מולקולת ה‪ mRNA -‬מהציטופלסמה לשלב הבא‬ ‫מ‪ RNA-‬לחלבון – תהליך התרגום ‪translation‬‬ ‫שלוש מולקולות של ‪ RNA‬מעורבות בסינטזת חלבון‪.‬שימו לב‪ ,‬סינטזת ‪ RNA‬בגרעין וחלבון‬ ‫בציטופלסמה‪.‬‬ ‫)‪mRNA (messenger RNA‬‬ ‫)‪rRNA (ribosomal RNA‬‬ ‫)‪tRNA (transfer RNA‬‬  ‫‪14‬‬ ‫תהליך התרגום נעשה על יד הריבוזומים‪.‬שהם קומפלקס חלבונים עם ‪RNA‬‬ ‫הריבוזום בעצם יסנטז מולקולת חלבון כאשר רצף חומצות האמינו שלה יהיה על פי הקוד הגנטי‪.‬זהו‬ ‫הקוד הגנטי‪:‬‬ ‫דברים שצריך לדעת על הקוד הגנטי‪:‬‬ ‫יחידת הקידוד היא צרוף של שלושה בסיסים ושמה קודון‪.‬‬ ‫‪-‬‬ ‫יש ‪ 20‬חומצות אמינו ו‪ 64-‬צרופים אפשריים אז יש חומצות אמינו שמקודדות על ידי מספר‬ ‫‪-‬‬ ‫רק של צרופים שהשיאניון כמו לאוצין ארגינין וסרין מקודדות על ידי שישה צרופים שונים‬ ‫ואילו מתיונין וטריפטופאן על ידי צרוף אחד בלבד‪.‬אין משמעות ידועה לכמות הצרופים מלבד‬ ‫למתיונין שזהו הצרוף של התחלת התרגום בנוסף למתיונין‪.‬‬ ‫כאמור יש צרוף ‪ AUG‬שמקודד להתחלת תרגום וגם למתיונין – היחיד שכדאי לזכור‪.‬‬ ‫‪-‬‬ ‫יש שלושה צרופים שמקודדים לסיום ‪UGA ,UAG , UAA‬‬ ‫‪-‬‬ ‫הקוד הגנטי הוא אוניברסאלי כלומר בכל היצורים החיים שנחקרו עד היום יש אותו קוד גנטי‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫מגניב!!!‬ ‫הרמה שלרוב נדרשת להבין את תהליך התרגום היא כזו‪:‬‬  ‫‪15‬‬ ‫כלומר להבין שמתחילם מקודון התחלה ואז כל שלשה בודקים בקוד הגנטי לאיזו חומצה אמינית היא‬ ‫מקודדת עד שמגיעים לאחד מקודוני הסיום‪.‬‬ ‫חשוב לזכור‬ ‫הרצף המקודד לחלבון ב‪ mRNA -‬כלומר מ‪ AUG-‬עד לקודון הסיום קרוי‬ ‫מסגרת קריאה‪ Open Reading Frame ,‬בביואינפורמטיקה בכלי ‪ ENTREZ‬הוא גם קרוי ‪cds -‬‬ ‫‪coding sequence‬‬ ‫חשוב מאד לזכור מושג זה כי משתמשים בו הרבה גם במוטציות (ראו בהמשך)‪.‬‬ ‫איך התהליך מתבצע או מה צריך לזכור מהתהליך‬ ‫התהליך נעשה על ידי הריבוזום‪.‬‬ ‫‪.1‬‬ ‫התהליך מתרחש בציטופלסמה של התא‪.‬‬ ‫‪.2‬‬ ‫‪ RNA‬שליח ‪ mRNA‬עוזב את הגרעין ומגיע לציטופלסמה‪.‬‬ ‫‪.3‬‬ ‫הריבוזום מתחבר לרצף הכרה שמצוי ב‪ 5'-‬של ה‪ mRNA -‬בעצם בהתחלה זו תת היחידה‬ ‫‪.4‬‬ ‫הקטנה של הריבוזום‪.‬‬ ‫התחלת התרגום מתחילה מקודון ההתחלה הקרוב יותר לרצף ההכרה‪.‬הקודון הוא ‪AUG‬‬ ‫‪.5‬‬ ‫חומצות האמינו מגיעות לריבוזום על ידי מולקולות של ‪ RNA( tRNA‬מוביל) ההכרה נעשית על‬ ‫‪.6‬‬ ‫ידי זיווג בסיסים באזור מסוים ב‪ tRNA-‬ל‪ RNA( mRNA-‬שליח) כמו כל זיווג בסיסים צריך‬ ‫לזכור שזה אנטי מקביל‪.‬חומצת האמינו קשורה ל‪ 3' -‬של ה‪.tRNA -‬לאחר קישור ה‪tRNA -‬‬ ‫הראשון תצטרף תת היחידה הגדולה‪.‬בכל פעם יכנס ‪ tRNA‬המתאים לקודון הבא יווצר קשר‬ ‫פפטידי בין חומצות האמינו‪.‬‬ ‫יש בתא סוגים שונים של מולקולת ‪ RNA‬מוביל הנבדלות זו מזו באנטי קודונים‪.‬כל אחת מהן‬ ‫‪.7‬‬ ‫קושרת חומצה אמינית אחת מבין עשרים חומצות האמינו שבונות חלבון‪.‬‬ ‫במולקולה הגאונית של הריבוזום מתרחש זיווג הבסיסים יצירת קשר פפטידי בין חומצות‬ ‫‪.8‬‬ ‫האמינו של כל ‪ tRNA‬שנכנס עם חומצה אמינית לחומצה אמינית הקודמת ותזוזה מסודרת‬ ‫לפי שלשות של קודונים‪.‬החלבון נוצר מצד אמינו טרמינלי לצד קרבוקסי טרמינלי‪.‬‬ ‫כאשר הריבוזום מגיע לאחד מקודוני הסיום משתחרר הפפטיד‪.‬‬ ‫‪.9‬‬  ‫‪16‬‬ ‫‪.10‬מכל מולקולה של ‪ mRNA‬יתורגמו חלבונים רבים‪.‬כמות החלבונים שיתורגמו תלויה ביציבות‬ ‫המולקולה‪.‬‬ ‫וקחו דקה לראות את הסרטון המגניב‪:‬‬ ‫חשוב!!!‬ ‫באאוקריוטיים חלבונים עוברים עיבוד לאחר תרגום‪.‬בחיידקים פחות‪.‬‬ ‫‪-‬‬ ‫העיבוד כולל הוספת סוכרים ‪ -‬גליקוזילציה – לא קורה בכלל בחיידקים‪.‬‬ ‫‪-‬‬ ‫עיבוד זה כולל חיתוך החלבון לא ממש קורא בחיידקים‪.‬‬ ‫‪-‬‬ ‫העיבוד כולל הוספת קבוצות שונות כמו שומנים גם‪ -‬לא קורה בחיידקים‬ ‫‪-‬‬ ‫ולמה זה חשוב?! כי בהנדסה גנטית אם ננסה לבטא חלבון אאוקריוטי בחיידק אז אפילו אם נעשה‬ ‫זאת מ‪( cDNA -‬ראו בהמשך) כלומר ממקטע ללא אינטרונים‪ ,‬עדיין יתקבל חלבון שלא יעבור עיבוד‬ ‫ואז הרבה פעמים החלבון לא יהיה פעיל‪.‬‬  ‫‪17‬‬ ‫מוטציות‬ ‫מוטציה היא כל שינוי ברצף ה‪.DNA-‬‬ ‫כל שינוי ב‪ DNA-‬מוגדר כמוטציה‪ ,‬יכול להיות שינוי שכרוך בבסיס אחד או בכרומוזום שלם‪.‬‬ ‫ביצורים רב תאיים יכולה להיות מוטציה סומטית (סומא זה גוף) כלומר לא בתאי מין‪.‬מוטציה כזו לא‬ ‫תעבור לדורות הבאים‪ ,‬אך היא יכולה לגרום נזק לאבר או לרקמה או לגידול ממאיר‪.‬‬ ‫יכולה גם להיות מוטציה בתאי המין כלומר בתאים שיוצרים זרע או בביציות‪ ,‬מוטציה זו תעבור לדורות‬ ‫הבאים ובעצם המחלות הגנטיות הן כתוצאה ממוטציות כאלה‬ ‫ניקח מבט מקרוב על מוטציות סוגי המוטציות העיקריות‪:‬‬ ‫‪.1‬שינויים ברמה כרומוזומלית‪.‬‬ ‫‪.2‬שינויים ברמה של נאוקלאוטידים בודדים‪.‬‬ ‫נתחיל מהרמה הכרומוזומלית דוקא משום שעליה שואלים פחות‪(.‬אז מה שאני שמה פה זה יותר‬ ‫העשרה ומי שרוצה יכול לדלג לחלק השני של הרמה הנאוקלאוטידית‪ ).‬מדובר על מוטציות בקנה‬ ‫מידה גדול לעיתים עד כדי כך שניתן להבחין בהן במיקרוסקופ אור לאחר צביעת כרומוזומים‪ :‬שכפול‬ ‫של אזורים‪ ,‬חסר ‪ , deletion‬היפוך של אזורים‪ ,‬טרנסלוקציה‪ -‬מעבר של מקטעי כרומוזום לכרומוזום‬ ‫אחר‪.‬כמובן‪ ,‬יש גם מוטציות של חסר או תוספת של כרומוזום שלם‪.‬נראה כמה דוגמאות‪:‬‬ ‫כאן ניתן לראות שינויים נפוצים ברמה של כרומוזומים‪.‬‬ ‫דוגמה לטרנסולוקציה מפורסמת התגלתה בפילדלפיה ונקראת על שמה הטרנסלוקציה היא שחלוף‬ ‫בין כרומוזומים ‪ 9‬ל‪ 22-‬ואז זה גורם לאיחוי של שני גנים האיחוי גורם לחלבון שיוצר פוספורילציה על‬ ‫שיירי טירוזין בצורה לא מבוקרת וכך מביא לסרטן בשם ‪.Acute myelogenous leukemia AML‬‬  ‫‪18‬‬ ‫(תמונה מתוך ויקיפדיה) ואתם מוזמנים לקרוא יותר כי יש כמה טרנסלוקציות דומות עם מאפיינים‬ ‫שונים‪.‬‬ ‫הדוגמא המפורסמת ביותר של עודף בכרומוזום היא תסמונת דאון ששם יש עוד כרומוזום ‪.21‬הדבר‬ ‫נובע מפגם במיוזה באם (מה לעשות הטבע לא שיוויוני) שבה אין הפרדה בין שני כרומוזומי ‪21‬‬ ‫ושניהם מגיעים לאותה גמטה‪.‬כאשר הביצית הזאת מופרית על ידי גמטה גברית תקינה נוצר עובר‬ ‫עם שלושה כרומוזומי ‪.21‬זה יכול להתרחש לכל כרומוזום אבל רק טריזומיות (שלושה כרומוזומים)‬ ‫של כרומוזומים ‪ -21‬תסמונת דאון‪ ,‬טריזומיה ‪- 18‬תסמונת אדוארד‪ ,‬טרוזומיה ‪ 13‬תסמונת פתאו ‪,‬‬ ‫טריזומיה ‪ ,9‬וטריזומיה ‪ – 8‬סינדרום וורקני ‪ 2‬טריזומיה ‪ 22‬מגיעים ללידה‪.‬השאר פשוט יופלו‬ ‫במהלך ההריון‪.‬הנפוצים ביותר הם ‪ 21‬ו‪ 18 -‬וטריזומיה ‪ 21‬יוצרת ילדים עם מראה אופיני והתנהגות‬ ‫אופיינית‪.‬אתם מוזמנים לחפש תמונות שלהם אני לא שמה כאן אבל את תמונת הכרומוזומים‬ ‫במיקרוסקופ הקרויה קריוטיפ אני מצרפת‪:‬‬ ‫יש גם טריזומיות של כרומוזמי מין ‪ XXX‬יוצר אשה תקינה‪ XXY ,‬יוצר זכר עם תסמונת קליינפנטר ו‪-‬‬ ‫‪ XYY‬יוצר זכרים עם תסמונת ג'קוב שהם כנראה אלימים יותר‪.‬‬ ‫חסר בכרומוזום שלם ידוע רק בתסמונת טרנר של נקבה עם ‪ X‬אחד‪.‬‬ ‫מוטציות ברמת נאוקלאוטידים בודדים‪.‬‬ ‫בעצם ההפרדה היא בעיקר מעשית ארוע מוטציה ברמה של מספר נאוקלאוטידים קשה יותר למעקב‬ ‫או לפחות היה קשה למעקב עד להמצאת ה‪.PCR -‬אך לא רואים אותו במיקרוסקופ‪.‬ארוע נקודתי כזה‬  ‫‪19‬‬ ‫יהיה במקום מסוים אחד‪.‬מבחינת החומר עליו שואלים יותר הוא אירוע של מוטציה נקודתית כלומר‬ ‫מוטציה בנאוקלאוטיד אחד בלבד ואז ניתן לחלק אירוע זה לשלושה‪:‬‬ ‫למה זה יכול לגרום‪.‬‬ ‫אז קודם בבקשה לא לשכוח רוב ה‪ DNA-‬באדם אינו מקודד לחלבון ורק חלקו הקטן מקודד לחלבון‪.‬‬ ‫על פי רוב מוטציה נקודתית ברצף שאינו מקודד לחלבון לא תשפיע‪.‬אלא אם כן היא בנקודת שחבור‬ ‫שבא מוצא אינטרון או במקום מאד קריטי בפרומוטר‪.‬רוב השאלות עוסקות במוטציות ברצף המקודד‬ ‫לחלבון ואז‪:‬‬ ‫פה יש תרשים שמסכם מוטציות של החלפת נאוקלאוטיד‪.‬יש אפשרות שההחלפה תהיה כזו שהקודון‬ ‫יקודד לאותה חומצה אמינית לזה קוראים מוטציה שקטה‪.‬יש אפשרות שקודון מקודד יהפוך לקודון‬ ‫פסק‪ ,‬יש אפשרות הפוכה שלא נראית בתרשים שקודון פסק יהפוך למקודד‪.‬ויש אפשרות לסלף‬ ‫כלומר שינוי בקידוד וזה יכול להזיק יותר אם יקודד לחומצה אמינית עם קבוצה פונקציונלית שונה‬ ‫מאד‪ ,‬זה יכול להזיק פחות אם זו תהיה קבוצה פונקצינית דומה כמו שליזין תהפוך לארגינין שתיהן עם‬ ‫שייר פונקציונאלי של אמין טעון חיובית‪.‬‬ ‫מוטציה מסוכנת מאד היא המוטציה של הוצאה או הכנסת נאוקלאוטיד לרצף משום שמוטציה זו‬ ‫מהווה שינוי במסגרת הקריאה כלומר מאתר המוטציה והלאה ישתנו כל הקודונים בשל תבנית‬ ‫הקריאה המשולשת של הריבוזום‪.‬‬  ‫‪20‬‬ ‫הנה פה אתם קוראים כמו ריבוזום מילים שעשויות משלשות ואז יש מוטציה שמחסירה את האות‬ ‫הראשונה‪.‬שוב הכל מסתדר בשלשות אבל כבר אין לזה משמעות‪.‬‬ ‫הנה כך זה קרה פה כאשר יש השמטה של ‪ G‬מהרצף של מסגרת הקריאה‪.‬‬ ‫לזכור!!! הרבה פעמים בשאלות מדגישים שהכל תקין במסגרת הקריאה במקרה זה יש לחפש תקלות‬ ‫בפרומוטר בשחבור ובגורמי תעתוק הנקשרים לפרומוטר‪.‬‬ ‫הגורמים למוטציות‬ ‫‪.1‬שינויים שנובעים מטעויות בתהליך שכפול ה‪ – DNA-‬כי גם ‪ DNA‬פולימראז עושה טעויות‪.‬יש‬ ‫לזה יתרון אבולוציוני שפרטים יהיו שונים במעט זה מזה וכך במקרה של שינויים סביבתיים‬ ‫ישרדו יותר פרטים אבל לעיתים זה גם יוצר מחלות‪.‬‬ ‫‪.2‬גורמים סביבתיים‪:‬‬ ‫‪ -‬חומרים כימיים שיוצרים הוספה של קבוצות לבסיסי ה‪ DNA-‬או חימצון של הבסיסים או‬ ‫לעיתים שבירה של מולקולת ה‪.DNA-‬‬ ‫‪ -‬חומרים כימיים שמהווים מעכבים לאנזימי תיקון של ה‪ DNA-‬או לאנזימים הקשורים‬ ‫בשכפול ה‪.DNA-‬‬ ‫‪ -‬קרינה אלקטרומגנטית – קרינות אנרגטיות יכולות לשבור את מולוקלת ה‪ DNA-‬מדובר‬ ‫על קרינות של סגול רחוק וקצרות יותר כלומר קצרות מ‪.280nm -‬בשפה שלנו זה אומר‬ ‫קרינת ‪ UV‬קרינת רנטגן וקרינה רדיואקטיבית מסוג גאמא‪.‬שימו לב! לא הוכח קשר‬ ‫לקרינות מיקרו או רדיו‪.‬‬ ‫‪ -‬וירוסים‪ -‬קיימיים וירוסים שמשתלבים בגנום וכך משנים אותו‪.‬שילוב בגנום יכול להפריע‬ ‫לביטוי של גן או לבקרה על ביטוי גנים‪.‬‬ ‫דוגמאות למה גורמות מוטציות‬ ‫אז קודם כבר כתבתי יש מוטציות שקטות שהן מוטציות ברצף שאינו מקודד לחלבון למשל ברצף‬ ‫שמטרתו רק רווח‪.‬יש מוטציות שגורמות לשינוי בקודון כך שיקודד לאותה חומצה אמינית‪.‬‬  ‫‪21‬‬ ‫מוטציות ברצף מקודד לדוגמה אנמיה חרמשית גורמת לשינוי בקודון שמקודד להמוגלובין בעמדה‬ ‫שש יהיה ולין ולא חומצה גלוטמית‪.‬כלומר חומצה אמינית שהיתה מאד הידרופילית מוחלפת‬ ‫בהידרופובית‪.‬‬ ‫זוהי מחלה שמורשת באופן אוטוזומלי רצסיבי‪.‬נפוצה באפריקה כנראה משום שההטרוזיגוטים לגן‬ ‫עמידים יותר למלריה‪.‬‬ ‫ראינו כבר כיצד מוטציה שנובעת מטרנסלוקציה גורמת לסרטן בעצם כל תהליך סרטני הוא כתוצאה‬ ‫ממוטציה‪.‬‬ ‫ויש מוטציות שמעלות שרידות של הפרט כמו בדוגמה של עמידות לאנטיביוטיקה להגברה‬ ‫ובביואינפורמטיקה למדנו על עוד המוגלובין שלא יוצר מחלה אבל יוצר עמידות למלריה‪.‬למדנו גם על‬ ‫אנשים שיש להם רצפטור מוטנטי שגורם שמחלת האיידס לא תדביק אותם‪.‬בקיצור מעניין אבל אנחנו‬ ‫מתרכזים במטרה‪....‬‬ ‫פרק ב – הנדסה גנטית‬ ‫הנדסה גנטית כשמה כן היא‪ ,‬מניפולציות בחומר התורשתי‪.‬אבל גם שיטות לאנליזה של החומר‬ ‫התורשתי ומחקר שקשור אליו נכללים בתחום‪.‬לאחר שהבנתם טוב את החלק הראשון נעבור על‬ ‫שיטות בהנדסה גנטית‪.‬הנדסה גנטית לכן‪ ,‬תהיה קשורה בכל תחומי החיים סביבה רפואה חקלאות‬ ‫מזון ועוד‪.‬נתחיל בצורה הסטורית מפלסמידים ואנזימי רסטריקציה שביחד "ילדו" את ההנדסה‬ ‫הגנטית‪.‬‬ ‫פלסמידים‬ ‫מצויים בחלק מהחיידקים באופן טבעי‪ ,‬התגלו בתור מקטעי ה‪ DNA-‬שנושאים עמידות לאנטיביוטיקה‬ ‫בחיידקים‪.‬‬ ‫ה‪ DNA-‬של הפלסמיד הוא דו גדילי ומעגלי‪.‬משתמשים בעיקר בפלסמידים שהם קטנים מאד‪.‬גודל‬ ‫גנום חיידקי הוא בסדר גודל של כמה מיליונים של זוגות בסיסים ואילו פלסמידים הם בסדר גודל של‬ ‫מספר אלפים של זוגות בסיסים סביב חמשת אלפים‪.‬‬ ‫שימו לב!! המידה לאורך של ‪ DNA‬היא זוגות בסיסים ‪ base pairs bp‬אז בבקשה להשתמש‪...‬‬ ‫לפלסמידים יש כושר הכפלה אוטונומית יש להם אזור המוכר על ידי ה‪ DNA -‬פולימראז ושם האזור‬ ‫הזה הוא ‪. Origin of replication ORI‬אם אזור זה נפגע הפלסמיד לא יוכל להשתכפל‪.‬‬  ‫‪22‬‬ ‫בטבע החיידקים מעבירים את הפלסמידים ביניהם בתהליך שקרוי קוניוגציה כך שפלסמיד בעל‬ ‫עמידות יכול להעביר פלסמיד לחיידק ללא עמידות‪.‬‬ ‫היתרונות של הפלסמיד כנשא לגנים (שעוד רגע נכניס אליו באמצעות אנזימי הרסטריקציה) הם‪:‬‬ ‫הוא קטן ולכן קל לטיפול ולמניפולציות‪.‬‬ ‫‪.1‬‬ ‫בעל יכולת שכפול אוטנומית ובכל שכפול של החיידק ישתכפלו הפלסמידים עשרות פעמים‪.‬‬ ‫‪.2‬‬ ‫קל להכניסו ולהוציאו מהחיידק (בהמשך פירוט איך)‪.‬‬ ‫‪.3‬‬ ‫יש לו גן המקנה עמידות לאנטיביוטיקה וכך קל למיין את החיידקים שקיבלו את הפלסמיד כי‬ ‫‪.4‬‬ ‫כל חיידק שלא קיבל אותו ימות עם נוסיף את האנטיביוטיקה המדוברת‪.‬לזה קוראים סלקציה‬ ‫וגם על זה נחזור עוד מעט‪.‬‬ ‫הכלי השני שיצר את ההנדסה הגנטית הם אנזימי ההגבלה‪.‬‬ ‫אנזימי הגבלה הם אנזימים שמופיעים בחיידקים באופן טבעי והם מהווים את אחד המנגנונים בהם‬ ‫החיידקים מגנים על עצמם מפני פאז'ים‪.‬נזכיר שבקטריופאז'ים הם וירוסים שמשתלטים על‬ ‫המנגנונים התאיים של החיידק על ידי החדרת ה‪ DNA-‬שלהם‪.‬אז למינים שונים של חיידקים יש‬ ‫אנזימים שמזהים רצפים שונים ב‪ DNA-‬וחותכים אותם‪.‬אותם רצפים כאשר הם מופיעים בחיידק‬ ‫עוברים מתילציה כלומר הוספת שייר ‪ CH3‬לשיירי גואנין ב‪ DNA-‬שלו ואז אותו אנזים לא מזהה את‬ ‫הרצף בחיידק אלא רק בפאז'‪.‬‬ ‫עכשיו האנזימים הללו הם דימרים שצריכים לזהות משני הצדדים של ה‪ DNA-‬אותו רצף‪.‬לכן רוב‬ ‫המקטעים אותם מזהים אנזימי ההגבלה הם פלינדרומים‪.‬המונח הושאל מלשון אבל הוא מבלבל‪.‬‬ ‫פלינדרום ב‪ DNA-‬הוא רצף שזהה לרצף המשלים שלו‪.‬כמו‪:‬‬ ‫שימו לב לכל הרצפים שבתמונה בבקשה‪.‬תבדקו מדוע כל אחד מהם הוא פלינדרום‪.‬שימו לב זה לא‬ ‫כמו פלינדרום לשוני‪ ,‬זה לא שהרצף נקרא משני הצדדים באופן שווה‪.‬זה רצף שזהה לרצף המשלים‬ ‫שלו‪.‬‬ ‫עכשיו יש אנזימים שמזהים אורכים שונים שזה בין ‪ 4‬לשמונה בסיסים‪.‬ככך שהאנזים מזהה רצף‬ ‫ארוך יותר כך הסיכוי שלו למצוא את הרצף באופן אקראי בגנום קטן יותר‪.‬‬  ‫‪23‬‬ ‫למה‪ :‬הסיכוי של רצף מסוים להיות בגנום באופן עצמאי הוא רבע בחזקת אורך הרצף‪.‬אז רבע‬ ‫בחזקת ארבע נותן מספר הרבה יותר גדול מרבע בחזקת שמונה‪.‬כי הסיכוי למצוא בסיס אחד מתוך‬ ‫ארבע הוא רבע וכל אחד נוסף הוא רבע פעמים רבע‪.‬‬ ‫אז למה זה טוב?‬ ‫לפני החשיבה על השימוש באנזימי הגבלה לא היה ניתן לחתוך ‪ DNA‬בצורה ספציפית‪.‬אפשר היה‬ ‫לשבור אותו בצורה מכנית עם ערבוב חזק או גלי קול אבל השברים לא היו מוגדרים‪.‬אנזימי הגבלה‬ ‫מאפשרים לחתוך במקום ידוע‪.‬‬ ‫בשנות השמונים היה קשה למצוא רצף של ‪ DNA‬ולכן על מנת לדעת היכן כל אנזים חותך עשו מפות‬ ‫הגבלה‪.‬לרוב אנחנו מדברים על מפות הגבלה בפלסמיד שכן הוא קצר וקל יחסית ליצור לו מפת‬ ‫הגבלה‪.‬‬ ‫אז מפת הגבלה היא איזה אנזים הגבלה חותך היכן על פני רצף ‪.DNA‬‬ ‫איך מוצאים זאת?‬ ‫חותכים רצף בעל אורך נתון ומריצים בג'ל‪.‬‬ ‫הרצה בג'ל‬ ‫ג'ל הוא חומר סיבי‪ ,‬שסופח מים וכך הוא שומר על צורה מרחבית אבל יש לו גם תכונות נוזליות כלומר‬ ‫מולקולות יכולות לנוע בו‪.‬‬ ‫אנחנו משתמשים בשני חומרים סיביים אגרוז לרוב משמש לחומצות גרעין‪.‬ואקריל אמיד שנותן‬ ‫הפרדה איכותית יותר אך קשה לעבודה ואף מסרטן בעת הכנתו‪ ,‬משמש להרצת חלבונים (ראה‬ ‫בהמשך) ולהרצת חומצות גרעין לשם קביעת רצף כי איכות ההפרדה בו היא עד להבדל בנאוקלאוטיד‬ ‫אחד‪.‬‬ ‫חומצות הגרעין מוטענות לבאריות בג'ל ואז הג'ל מונח בנוזל מוליך (תמיסה יונית) מופעל שדה‬ ‫חשמלי וחומצות הגרעין שטעונות שלילית ירוצו לקוטב החיובי‪ ,‬אבל הג'ל הסיבי מתנגד להרצה ‪ ,‬כך‬ ‫ירוצו המקטעים הקצרים מהר יותר מהמקטעים הגדולים‪.‬במקביל למקטעים שרוצים לדעת את גודלם‬ ‫מריצים תערובת מקטעים בעלת גדלים ידועים המכונה "סרגל מולקולרי"‪.‬בסיום ההרצה ניתן‬ ‫להשוות‪.‬‬ ‫מוסיפים או בעת הריצה או לאחר מכן אתידיום ברומיד‪.‬זהו חומר שנספח לחומצות גרעין וכאשר‬ ‫שמים את הג'ל לאחר ההרצה על "שולחן" הפולט קרינה אולטרה סגולית הוא זורח בקרינה‬ ‫פלואורסצנטית‪.‬‬ ‫כמובן שזהו חומר מסרטן אז כל העסק ממש כיף‪....‬‬  ‫‪24‬‬ ‫זה המכשיר אתם רואים את החורים בהם שמים תערובת של חומצות גרעין‪ ,‬ספק כוח שגורם לשדה‬ ‫חשמלי‬ ‫ככה נראה הג'ל לאחר ההרצה על גבי שולחן אולטרה סגול‪.‬מצד ימין אתם רואים סרגל מולקולרי‪.‬‬ ‫הסרגל מגיעה עם דף שמסביר מה גודלה של כל חתיכה לשם השוואה‪.‬‬ ‫ככה לרוב יציגו את זה בפניכם‪.‬אתם רואים פה גודלה של כל חתיכה בסרגל‪.‬ותוך השוואה אתם‬ ‫יכולים לדעת מה גודלה של כל חתיכה שרצה‪.‬חתיכות קטנות יותר יהיו בתמונה למטה וגדולות‬ ‫למעלה‪.‬‬ ‫מפת הגבלה‬ ‫אז מפת הגבלה היא באופן פשוט איזה אנזים הגבלה חותך היכן על גבי מקטע נתון‪.‬למשל‪:‬‬  ‫‪25‬‬ ‫מפה של פלסמיד‪.‬נראה מיד שאם אני רוצה להכניס חתיכת ‪ DNA‬לתוך הפלסמיד המפה תיתן לי‬ ‫אפשרות לתכנן לאן הוא יכנס‪.‬ותיכף נכתוב בדיוק כיצד‪.‬‬ ‫אז למה אתם שונאים את זה?‬ ‫כי אתם צריכים לדעת איך מסיקים מסקנות מחיתוך של מקטע ‪ DNA‬הרצתו והרצתו בג'ל‪.‬ככה‪:‬‬ ‫הנה הדוגמה של הספר‪.‬זוהי דוגמה פשוטה ולרוב לא תצטרכו לפתור תרגיל יותר קשה‪:‬‬ ‫איך חושבים על זה‪:‬‬ ‫נתון הגודל אז לא צריך לחשב אותו‪6kb.‬‬  ‫‪26‬‬ ‫זה אומר ‪ 6000‬זוגות בסיסים ובבקשה לזכור שתמיד יש לכתוב מספרים עם יחידות‪.‬‬ ‫עכשיו מבינים שכל אנזים חתך פעם אחת ‪ Eco‬לארבע ושתים ו‪ bam -‬לחמש ואחת‬ ‫בודקים בחיתוך על ידי שני האנזימים איזו חתיכה נחתכה ואילו לא‪.‬לרוב אילו שלא נמצאים בצדדים‬ ‫וזאת שנחתכה במרכז‪.‬פה רואים שהחתיכה של אחד קילובייס לא נחתכה וגם לא זאת של השתים‪.‬‬ ‫רואים שהחתיכה של ‪ 4kb‬נחתכה לשלוש ואחת‪.‬וזאת של החמש לשלוש ושתים‪.‬‬ ‫מכאן די ברור אם משחקים שניה על נייר שהתשובה היא‪:‬‬ ‫דוגמה קשה יותר‪:‬‬ ‫זה יותר מסובך החתיכה שנקטעת אינה באמצע היא בקצה‪.‬‬ ‫א‪.‬אם לא נתון אז מהו גודל המקטע? סוכמים את שני כל החיתוכים כי לפעמים אם רוצים‬ ‫להקשות יש חיתוך לשני מקטעים שווים ואז נראה שאחד הטורים שונה מהשאר‪.‬אבל זה‬ ‫תרגיל פשוט אז הגודל הוא ‪ 5000bp‬תבדקו שאתם מבינים למה‪.‬‬ ‫ב‪.‬עכשיו ‪ Eco‬חתך פעם אחת אז אתחיל איתו וארשום לי קו שמציין ‪ 5000bp‬שנחתך לאלף‬ ‫וארבעת אלפים זוגות בסיסים‪.‬‬ ‫ג‪ Bam.‬חתך פעמיים אבל לא אצייר עוד כלום על הקו כי אבדוק בחיתוך עם שני האנזימים איזו‬ ‫חתיכה שלו נחתכה בחיתוך הכפול‪.‬אני רואה שהחתיכה של ‪ 500‬בסיסים נותרה כשהיתה‬ ‫וגם של האלף חמש מאות‪.‬ואילו החתיכה של ה‪ 3000 -‬נחתכה לאלפיים ואלף‪.‬כלומר ‪eco‬‬ ‫חותך באמצע החתיכה הזאת‪.‬אז אני מנסה למצוא סידור הגיוני שיסביר לי את המצב‪.‬‬  ‫‪27‬‬ ‫לוקחת את האפשרות הראשונה והשניה של סידור החתיכות שאתם רואים מימין וקוטעת את‬ ‫החתיכה של השלושת אלפים‪.‬יש שתי אפשרויות עדין לשתי החתיכות בצד שני‪.‬קורה‪...‬‬ ‫עכשיו לפעמים בשאלה נותנים פלסמיד‪.‬תזכרו חיתוך ראשון בפלסמיד לא עושה ממנו שתי חתיכות‬ ‫אלא עושה אותו לינארי‪.‬‬ ‫אתם רואים פה שני תרגילים תנסו בעיקר את הראשון‪.‬אותם עקרונות רק לזכור שפלסמיד עגול‪...‬‬ ‫חיתוך ישר ומדורג‬ ‫אנזים ההגבלה חותך את הקשרים הפוספודיאסטרים בשני גדילי ה‪. DNA-‬לעיתים החיתוך סימטרי‬ ‫בשני הצדדים ויוצר קצה חלק כמו שאתם רואים בדוגמה למטה את ‪ EcoRV‬חיתוך זה מותיר קצוות‬ ‫חלקים‪.‬שני האנזימים האחרים מותירים קצה חד גדילי ששמו גם מדורג או דביק‪.‬‬  ‫‪28‬‬ ‫החדרת מחדר לפלסמיד‪ -‬קוראים לזה גם שיבוט‬ ‫בעצם זה הרגע ללדת את ההנדסה הגנטית‪.‬שהתחילה ביצירה של צירופים חדשים של ‪DNA.DNA‬‬ ‫כזה שנוצר מצרוף מכוון של החוקרים נקרא ‪ DNA‬רקומביננטי‪.‬‬ ‫ממעוף הציפור‪ ,‬הרעיון הוא לחתוך מקטע ‪ DNA‬ופלסמיד באנזימי הגבלה מתאימים‪.‬לחבר בין‬ ‫המקטעים‪.‬ואז להחדיר את הפלסמיד לחיידק כי החיידקים מתרבים מהר וכך מרבים את הפלסמיד‬ ‫ואיתו את מקטע ה‪ DNA-‬שהחדרנו אליו‪.‬‬ ‫עכשיו בואו (לצערכם) נפרט ונבין את השלבים‪:‬‬ ‫חיתוך המחדר והפלסמיד בצורה תואמת‪ :‬נביט על מפת הפלסמיד שיצרנו בעמל וביזע‪ ,‬נמצא‬ ‫א‪.‬‬ ‫אתר הגבלה שחותך או פעם אחת או מוציא חלק מהפלסמיד שלא חיוני לפעילותו או בשני‬ ‫אנזימי הגבלה שונים אם נרצה לשלוט בכיוון של המחדר‪.‬נבדוק שהחיתוך לא פוגע באתר‬ ‫ה‪ ORI -‬או באתר הסלקציה‪.‬‬ ‫נחתוך באותו אנזים את מקטע ה‪ DNA-‬המיועד להחדרה‪ ,‬או באנזים שנותן קצה מתאים‪.‬אם‬ ‫ב‪.‬‬ ‫זה קצה חלק זה תמיד מתאים ואם דביק בודקים שהקצוות קומפלימטריים‪ -‬מתאימים‬ ‫מבחינת זיווג בסיסים‪.‬‬ ‫ניתן להריץ בג'ל את הפלסמיד ואת ה‪ DNA-‬שממנו אנחנו רוצים חתיכה לשיבוט‪ ,‬אפשר‬ ‫ג‪.‬‬ ‫לחתוך מהג'ל חתיכה רצויה ולהפיק ממנה את ה‪.DNA-‬‬ ‫מערבבים פלסמיד ומחדר ומוסיפים אנזים בשם ליגאז‪.‬האנזים הזה יוצר קשר‬ ‫ד‪.‬‬ ‫פוספודיאסטרי בין מקטעי ‪.DNA‬הרבה יותר קל לו לעשות זאת כאשר אלה קצוות דביקים כי‬ ‫הם מיצבים את המקטעים‪(.‬חייבת לספר ליגציה עם קצוות דביקים לקחה לי אחר צהרים‬ ‫אחד וליגציה עם חלקים כמעט שנה‪....‬אבל למזלכם אתם רק עונים על שאלות ולא עושים‬ ‫את זה)‪.‬‬ ‫עכשיו מאד מקווים ומתפללים שהפלסמיד לא סתם נסגר על עצמו והותיר את המחדר בחוץ‬ ‫ה‪.‬‬ ‫(בהמשך כיצד יודעים שתפילותינו נענו)‪.‬על מנת להרבות את הפלסמיד צריך להחדירו‬ ‫לחיידקים לשלב זה קוראים טרנספורמציה‪.‬יש שיטות שונות אפשר על ידי ערבוב הפלסמיד‬ ‫עם קלציום‪ ,‬או אלקטרופורציה או לעשות מכת חום לחיידקים‪.‬‬ ‫כמות הפלסמידים שיכנסו לחיידקים היא מזערית בכל השיטות ולכן צריך להרוג את‬ ‫ו‪.‬‬ ‫החיידקים שלא נכנס אליהם הפלסמיד וזאת עושים באמצעות סלקציה‪.‬מוסיפים למצע‬ ‫הגידול את האנטיביוטיקה שהפלסמיד מקנה אליה עמידות וכך ימותו כל החיידקים שלא‬ ‫קיבלו את הפלסמיד‪.‬‬ ‫והסימנים שזוכרים הכל הם ‪ :‬ליגציה טרנספורמציה סלקציה‪.‬‬  ‫‪29‬‬ ‫ככה נראית ליגציה‬ ‫החתיכות נדבקו אבל החיבור של קשר פוספודיאסטרי יעשה עם אנזים ליגאז‪.‬‬  ‫‪30‬‬ ‫וסיכום התהליך‬ ‫דברים לשים לב אליהם‬ ‫לאחר שהשיטה הזאת היא הלחם וחמאה של כל מעבדה יצרו פלסמידים נוחים לעבודה‬ ‫‪-‬‬ ‫הכניסו לפלסמידים אתר ששמו פולילינקר‪ ,‬אתר זה הוא אתר עם הרבה רצפי הגבלה‬ ‫שיודעים שאין אותם באף מקום בפלסמיד ואז לרוב משבטים אליו‪.‬‬ ‫על מנת לודא שהפלסמיד לא יסגר על עצמו שמים את הפולילינקר באמצע גן לביתה‬ ‫‪-‬‬ ‫גלקטוזידאז‪.‬הגן הזה מקודד לאנזים שניתן לעקוב אחר פעולתו על ידי הוספת סובסטראט‬ ‫מלאכותי בשם ‪ x-gal‬שנותן צבע כחול‪.‬כך מושבות של חיידקים כחולות הן כאלה שלא נכנס‬ ‫אליהן המחדר‪ ,‬כאלה שאנחנו לא רוצים למרות שהן מגניבות והלבנות הן אלה שנכנס‬ ‫המחדר והפריע לכן לגן לביתה גלקטוזידאז‪.‬‬  ‫‪31‬‬ ‫המושבות הלבנות הן אלה עם המחדר‪.‬‬ ‫עוד שיטות לדעת שיש מחדר בפלסמיד הן לחתוך את הפלסמיד עם אנזימי הגבלה ולהריץ בג'ל‪.‬לרוב‬ ‫אם הכנסנו מחדר נוצרים מצדדיו אתרי ההגבלה שבהם השתמשנו להכניסו‪.‬אז אפשר לחתוך את‬ ‫הפלסמיד ונקבל בג'ל פס של הפלסמיד ופס של המחדר‪.‬‬ ‫אפשר גם לזהות עם ‪ PCR‬כמובן ועל זאת בהמשך‪.‬‬ ‫פה אתם רואים ג'ל של חיידקים לבנים שבכל אחד היה פלסמיד עם מחדר אחר‪.‬הפס האחיד למעלה‬ ‫הוא הפלסמיד והפס שבכל שורה גודלו משתנה הוא מחדר שונה שנכנס לפלסמיד‪.‬‬ ‫הרחבה קטנה‪ :‬היות שלעשות שיבוט עם קצוות חלקים זה פוי‪ ,‬אפשר לשנות את הקצוות‪.‬איך עושים‬ ‫זאת? לוקחים מקטעים קצרים ששמם פולילינקרים שהם מקטעי ‪ DNA‬עם הרבה אתרי הגבלה‪.‬כאשר‬ ‫המקטעים קצרים הליגציה יותר קלה‪.‬כך ניתן לעשות להם ליגציה למקטע עם הקצוות החלקים ואז‬ ‫לחתוך עם אנזים הגבלה ולקבל קצוות דביקים‪.‬‬ ‫שימושים אפשריים למה שלמדנו עד עכשיו‬ ‫ניתן לשבט לפלסמידים מקטעי ‪ DNA‬על מנת לחקור אותם או לשנות אותם‪.‬במקור זוהי‬ ‫‪-‬‬ ‫שיטה שבה ניתן להרבות את המקטעים‪.‬כך למשל אם רוצים למצוא רצף של מקטע אזי‬ ‫קשה מאד לעשות זאת מתא אחד וצריך הרבה מהמקטע‪.‬‬ ‫ניתן להחדיר לפלסמיד מחדר של גן שרוצים לבטא‪.‬ואז צריך לחשוב על מספר דברים‪:‬‬ ‫‪-‬‬ ‫א‪.‬על מנת שגן יתבטא צריך שיהיה לו פרומוטר מתאים‪.‬מתחננת תזכרו בבקשה בלי‬ ‫פרומוטר אין תעתוק ‪ RNA‬ואין לכן תרגום של חלבון‪.‬ופרומוטר של תעתוק באאוקריוטיים‬ ‫אינו זהה לפרומוטר של פרוקריוטיים‪.‬כך שאם מכניסים גן של בן אדם לחיידק צריך‬ ‫פרומוטר מתאים‪.‬‬  ‫‪32‬‬ ‫ב‪.‬זכרו! חיידקים לא עושים שחבור‪.‬אז אם מכניסים גן לחיידק הוא צריך להיות ‪ cDNA‬מי‬ ‫שלא זוכר בשלב זה מה זה שימשיך לחלק של ה‪ PCR-‬שם זה מוסבר‪.‬אבל בקיצור זה‬ ‫‪ DNA‬דו גדילי שנוצר על ידי האנזים הויראלי "המתעתק לאחור" מ‪. mRNA -‬כלומר אין‬ ‫בו אינטרונים ולכן יש בו את מסגרת הקריאה ליצירת חלבון‪.‬‬ ‫בשיטה זו הצליחו לבטא בחיידקים אינסולין אנושי בשנת ‪.1980‬בעצם זאת היתה מהפכה‪.‬‬ ‫‪-‬‬ ‫לאחר מכן גם הפיקו הורמון גדילה אנושי וסומטוסטטין ועוד‪.‬ואז היה ניתן להפיק אותם‬ ‫בחיידקים בכמויות ענק‪.‬כמובן נרחיב בכיתה‪.‬‬ ‫מדגישים בחומר לבגרות שימוש בשיבוט לפלסמיד לאיפיון פרומוטרים‪.‬בעצם אם רוצים‬ ‫‪-‬‬ ‫לדעת אם מקטע מסוים הוא פרומוטר‪.‬ניתן לקחת פלסמיד המכיל רצף המקודד לגן מדווח‬ ‫(גן שקל לדעת אם הוא מתבטא‪ ,‬למשל אם החלבון שלו הוא מקודד מאיר כמו ‪.)GFP‬כך אם‬ ‫נשבט מחדר '‪ 5‬לגן המדווח נקבל ביטוי שלו אם המקטע הוא פרומוטר‪.‬בספר הסבר נהדר‬ ‫בעמוד ‪.137‬אני נותנת הסבר פחות נהדר כי לא נעים לי להעתיק‪.‬‬ ‫בתמונה אתם רואים באדום את הרצף שבודקים אם הוא רצף בקרה אותו משבטים '‪ 5‬לגן‬ ‫המדווח‪.‬אם הרצף אכן פרומוטר אז הגן יעבור תעתוק ותרגום ויתקבל תוצר זוהר בירוק‪.‬‬ ‫אפשר גם לאפיין את סוג הפרומוטר בדרך זו‪.‬קיימים פרומוטרים קונסטיטוטיביים‪ ,‬כאלה‬ ‫שבכל תא יש את כל גורמי התעתוק על מנת שיתבטאו‪.‬ויש פרומוטרים רגולטוריים‪ ,‬הם לא‬ ‫מתבטאים‪ ,‬או מתבטאים ממש קצת‪ ,‬אלא אם כן מוסיפים חומר משרן או תנאים משרים‬ ‫שגורמים להם להתבטא‪ ,‬כמו חום‪ ,‬או חומר שפוגע ב‪ DNA-‬או מתכות וכו'‬ ‫זאת המדוזה אקווה ויקטוריה שזוהרת בזכות החלבון הקסום ‪Green fluorescence Protein‬‬ ‫ועכשיו אם שיבטתם פרומוטר '‪ 5‬בפלסמיד תקבלו חיידקים שיראו ככה‬  ‫‪33‬‬ ‫‪PCR‬‬ ‫אז אחרי שהבנו איך אפשר להרבות מקטעי ‪ DNA‬רצויים בפלסמיד נעבור לשיטה בה משתמש העולם‬ ‫היום ‪.PCR‬‬ ‫מזכירה לכם שבטבע ‪ DNA‬משתכפל פעם אחת במחזור התא‪.‬בתא התהליך של השכפול הוא מורכב‬ ‫ודורש הרבה מאד אנזימים ופקטורים הנה תמונה שמראה את חלקם‪.‬‬ ‫אחת הבעיות המרכזיות שצריך להתגבר עליהם הוא פתיחת גדיל ה‪ DNA -‬שאתם בטח זוכרים‬ ‫מהחלק הקודם נעשה על ידי אנזים הליקאז‪.‬אבל אז ה‪ DNA-‬יטה מייד לעבור זיווג בסיסים מחודש ‪,‬‬  ‫‪34‬‬ ‫נקרא לזה היברידיזציה לקיצור‪.‬ואתם רואים בתמונה עיגולים ירוקים למשל שהם חלבונים שדואגים‬ ‫שהוא לא יסגר‪.‬‬ ‫אם רוצים לשכפל ‪ DNA‬במבחנה זה מקשה מאד להכניס את כל החלבונים הללו וכמובן עושה את‬ ‫התהליך יקר מסובך ודי בלתי אפשרי‪.‬‬ ‫על מנת לפתוח ‪ DNA‬הדרך הכי קצרה היא לחמם אותו לתשעים וחמש מעלות‪.‬אבל אז כל אנזים‬ ‫נורמאלי יעבור דנטורציה ויהרס‪ K. B. Mullis.‬חשב על הרעיון הגאוני לבודד ‪ DNA‬פולימראז מחיידק‬ ‫שמקורו ממעינות רותחים‪.‬הפולימראז הזה ששמו ‪Thermus aquaticus polymerase‬‬ ‫ובקיצור ‪ Taq pol‬פועל באופן מיטבי בטמפ' של ‪ 72‬מעלות צלזיוס ועמיד לטמפרטורות של ‪100‬‬ ‫מעלות צלזיוס‪.‬אז על מנת לשכפל ‪ DNA‬כמה פעמים שרוצים מכניסים למבחנה את המרכיבים‬ ‫הבאים‪:‬‬ ‫תבנית דנ"א‪ -.‬תיאורתית מספיקה אחת‬ ‫‪-‬‬ ‫שני רצפים של ‪ DNA‬חד גדיליים המשלימים לשולי האזור הרצוי להגברה שללתבנית‬ ‫‪-‬‬ ‫דנ"א ‪.‬רצפים אלה קרויים פריימרים‪.‬צריך מהם הרבה משום שכל מחזור הגברה הם‬ ‫יהוו את תחילת ה‪DNA -‬‬ ‫‪.‬יוני ‪( Mg+2‬קופקטור של אנזים דנ"א פולימרז)‬ ‫‪-‬‬ ‫ארבעה סוגי חומרי מוצא‪.dTTP, dCTP , dGTP , dATP :‬גם בריכוזים גבוהים כי הם‬ ‫‪-‬‬ ‫משמשים לבניית הגדילים‪.‬‬ ‫זהו תיאור סכמטי של התהליך‬ ‫השלבים הם‪:‬‬ ‫א‪ – Denaturation.‬הפרדה של הגדילים ע"י חימום ב‪ 94 Cº -‬למשך ‪ 20‬שניות‪.‬‬ ‫ב‪ -Annealing.‬הדבקת הפריימרים ע"י חמום ב‪ 50 Cº -‬במשך ‪ 30‬שניות (משך החימום תלוי באורך‬ ‫הפריימרים)‪.‬‬ ‫ג‪ -Synthesis.‬ייצור ‪ DNA‬דו גדילי בעזרת נוקלאוטידים והאנזים ‪ ,Taq polimerase‬חמום ב ‪72 Cº‬‬ ‫במשך ‪ 30‬שניות‪.‬‬ ‫לשלב הדנטורציה אפשר גם לקרוא שלב התכת הגדילים או הפרדת הגדילים‪.‬‬ ‫חוזרים על השלבים הללו מספר פעמים‬ ‫ובכל שלב ישוכפל ה‪DNA-‬‬ ‫נכון שבסיבובים הראשונים עדיין אין תוצר אך לרוב בחישוב מתעלמים מזה ובעצם ההגברה היא ‪2‬‬ ‫בחזקת מספר המחזורים‪.‬כפול מספר הגדילים ההתחלתי‪.‬אני שמה פה תמונה אבל ביוטיוב יש מלא‬ ‫סרטונים שממחישים את התהליך‪.‬למשל זה ‪https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo‬‬ ‫ממש חמוד אם מתעלמים מהמוזיקה‪...‬‬  ‫‪35‬‬ ‫אז היתרון של השיטה‪:‬‬ ‫שכפול של מקטע רצוי בזמן קצר ובמאמץ מינימלי למספרים עצומים‪.‬‬ ‫‪-‬‬ ‫יש צורך במעט מאד ‪ DNA‬התחלתי‪.‬‬ ‫‪-‬‬ ‫לשיטה יש גם חסרונות‬ ‫האנזים יכול גם לעשות טעויות‪.‬עם השנים שיפרו את בידוד האנזים אך הוא עדיין טועה‬ ‫‪-‬‬ ‫לעיתים‪.‬‬ ‫יש לשיטה בעיות עם זיהומים‪.‬אם במקרה הפריימרים נצמדים ל‪ DNA-‬בצורה לא ספציפית‬ ‫‪-‬‬ ‫הרי שתחילתו הופכת להיות הפריימרים שלנו ואז הם ימשיכו להגביר את התוצר הלא רצוי‪.‬‬ ‫צריך לדעת את הרצף של הגן להגברה על מנת לתכנן פריימרים‪.‬‬ ‫‪-‬‬ ‫יש הגבלה לאורך המקטע המוגבר ב‪ PCR-‬מדובר על כמה אלפי זוגות בסיסים לכל היותר‪.‬‬ ‫‪-‬‬ ‫(גם בפלסמיד רגיל שיבוט מקטע גדול הוא אתגר אבל יש אפשרויות של שיבוט לפאז' או‬ ‫לפלסמידים מיוחדים‪).‬‬ ‫מבחינת שאלות עד כאן יש לזכור את התהליך ואת השלבים‪.‬להבין שמדי פעם בג'ל רואים תוצרים‬ ‫של הגברה של זיהומים‪.‬אני יודעת מי מבין הפסים הוא הפס הרצוי לפי גודלו‪.‬‬ ‫‪ PCR‬עושים תמיד עם בקרת מים‪.‬שמים את כל החומרים במבחנה ללא ‪ DNA‬רק עם מים‪.‬במבחנה זו‬ ‫לא אמור להתקבל תוצר‪.‬אם מתקבל זה מצביע על זיהום אפשרי‪.‬‬ ‫ניתן לעשות תגובת ‪ PCR‬עם שני זוגות של פריימרים‪ ,‬הם לא יפריעו לרוב זה לזה‪.‬לרוב בכל תגובת‬ ‫‪ PCR‬משתמשים בזוג פריימרים שיודעים שהם אמורים לתת תוצר‪.‬זוהי הבקרה החיובית של‬ ‫התגובה‪.‬‬ ‫בתגובת ‪ PCR‬רגילה מריצים לרוב את התוצרים בג'ל עם אתידיום ברומיד‪.‬‬ ‫שימושי ה‪PCR-‬‬  ‫‪36‬‬ ‫יש ל‪ PCR-‬שימושים רבים ובעצם יכולים להיות עוד כיד הדימיון הטובה‪.‬אנחנו מביאים את השימושים‬ ‫ששואלים עליהם‪.‬‬ ‫‪.1‬שיבוט – אם אנו מעוניינים להכניס מקטע ‪ DNA‬מסוים לפלסמיד למטרה של שינוי שלו‪,‬‬ ‫הנדסה גנטית שלו או כל מטרה אחרת נוכל להגביר אותו ולהחדירו לפלסמיד‪.‬הבעיה‬ ‫שהקצוות שלו הם חלקים‪.‬אז יש שתי שיטות להתמודד או לצרף לו פולילינקר כפי שלמדנו‬ ‫קודם‪.‬אבל ב‪ PCR-‬זה הרבה יותר פשוט‪ ,‬וכאן אנחנו לומדים עיקרון חשוב‪.‬ב‪ PCR-‬ההתאמה‬ ‫של החלק ה‪ 3'-‬של הפריימר היא קריטית אי דיוק בהתאמת הבסיסים שם תגרום שלא תהיה‬ ‫תגובה וזה ישמש אותנו עוד רגע‪ ,‬אבל ב‪ 5'-‬העסק די ליבראלי‪ ,‬אז מנצלים זאת להכניס שם‬ ‫אתר הגבלה‪.‬זה לא יפריע לתגובה ונקבל תוצר שאפשר לחתוך אותו ולשבט בקלות‪.‬‬ ‫‪.2‬הכנסת מוטציות מכוונות – העיקרון שכרגע הוסבר גם משמש להכניס מוטציות מכוונות‬ ‫למקטע המוגבר‪.‬‬ ‫טוב אז בואו נדבר על הקצה ה‪( – 3'-‬על זה יחסית שואלים הרבה) הרגישות של ההתאמה‬ ‫‪.3‬‬ ‫לקצה זה של הפריימר היא קריטית אז ניתן לבדוק קיום של מוטציה על ידי התאמת הקצה‬ ‫ה‪ 3'-‬של הפרימר למוטציה‪.‬אם מתאים תהיה הגברה ואם לא אז לא‪.‬כמובן כדאי לעשות את‬ ‫התגובה במקביל פעם אחת עם הפריימר שמתאים למוטציה ופעם אחת עם הפריימר שאינו‬ ‫מתאים‪.‬כי לקבל תוצאה שלילית זה בעייתי‪.‬‬ ‫בדיקות ואנליזות – ‪ PCR‬יכול לשמש לבדוק קיום של גן‪ ,‬קיום של מחדר בפלסמיד‪ ,‬גודל של‬ ‫‪.4‬‬ ‫גן‪ ,‬גודל של מחדר (מתכננים פריימרים לפלסמיד בשולי המקום שבו יכנס המחדר ובודקים)‬ ‫ניתן גם להגביר מחדר מסוים ולבדוק אתרי הגבלה שלעיתים משתנים כאשר יש מוטציות‪.‬‬ ‫במקרה זה צריך לראות מה בודקים בניסוי‪.‬שינוי בגודל‪ ,‬הימצאות‪ ,‬הגברת מקטע ואז חיתוכו‬ ‫באנזים הגבלה ולראות אם האנזים חותך או לא וכ'‪.‬‬ ‫כמובן גם אנליזה של קיום וירוסים שהחומר הגנטי שלהם הוא ‪.DNA‬‬ ‫‪.5‬‬ ‫טביעות אצבע גנטיות‪ -‬זאת אנליזה לכל דבר אך מבוססת על סיפור מעניין‪.‬בגנום האדם‬ ‫‪.6‬‬ ‫(וגם בעוד גנומים) יש אזורים רבים שאינם מקודדים לחלבון‪ ,‬בין האזורים הללו ישנם אזורים‬ ‫שככל הנראה כל מטרתם היא רווח מסוים בין אזורים פונקציונאליים ב‪.DNA-‬אזורים אלו‬ ‫מאופינים בחזרה על קצף מסוים מספר רב של פעמים בצורה עוקבת למשל‪:‬‬ ‫‪ ACTGACTGACTGACTG‬מכאן שמו ‪ Short Tandem Repeats STR‬יש כמה כאלה ידועים‪.‬‬ ‫לאחר מחקר ארוך מצאו חוקרים כמה חזרות של הרצף אפשריות בכלל האוכלוסיה ומצאו‬ ‫שיש שונות וקבעו כמה שונות כזו ישנה‪.‬‬ ‫אז ניקח לדוגמה רצף כזה על כרומוזום ‪ ,6‬אצל אנשים שונים יש אתר כזה עם חזרות‬ ‫שונות‪ ,‬לכל אדם יש שני כרומוזומי ‪ 6‬כך שעל כל כרומזום יהיו מספר חזרות שונות‪.‬עם‬ ‫נעשה ‪ PCR‬לאזורים אלה נמצא לכל בן אדם שני פסים המראים על מספר החזרות בכל‬ ‫כרומוזום‪(.‬כמובן שאם זה בדיוק אותו מספר חזרות נקבל פס אחד)‪.‬‬  ‫‪37‬‬ ‫אנחנו מכנים זאת שני אללים‪ ,‬כמו שתי תכונות אלטרנטיביות לתכונה מנדלית‪.‬אך כאן אין‬ ‫מדובר בתכונה אלה פשוט חזרות והכל תקין מבחינת המופע של הבן אדם‪.‬‬ ‫עכשיו יש כמה אתרי ‪ STR‬אז ניתן לעשות במקביל כמה תגובות ‪ PCR‬ולקבל כמה פסים לכל‬ ‫בן אדם‪.‬למשל אם נשתמש בשמונה זוגות של פריימרים אנחנו יכולים לקבל ‪ 16‬פסים עם‬ ‫גדלים מסוימים‪.‬המדענים יכולים להגיד לנו מה הסיכוי למצוא מופע כזה בשני אנשים‬ ‫אקראיים באוכלוסייה והתשובה היא שהסיכוי די אפסי למצוא צירוף מסוים אלא אם כן אלו‬ ‫תאומים זהים‪.‬אז משתמשים בזה כמו טביעת אצבעות‪.‬ולמבחני אבהות‪.‬‬ ‫הנה מזירת פשע מחפשים מי הפושע‪...‬האם תוכלו לזהות?‬ ‫בכמה פריימרים השתמשו החוקרים?‬  ‫‪38‬‬ ‫מי האבא?‬ ‫האם החיננית של תינוקי לא יודעת מי האבא שלושה מועמדים נבחנו?‬ ‫(אני לא מאפשרת שאלות על החלק הזה‪)....‬‬ ‫אבל אני כן רוצה שתקבעו מי האבא?‬ ‫אז שימו לב שדי באופן נוח רואים שיש לאם שישה פסים וכך גם לתינוקי אז כנראה אין פס‬ ‫שמציין שני אללים‪.‬התינוק קיבל מאמא שלושה אללים וצריך לראות מי תרם את שלושת‬ ‫האחרים‪.‬‬ ‫עד כאן שימושים ל‪ PCR-‬רגיל‪.‬עכשיו‬ ‫‪RT-PCR‬‬ ‫בעצם שיטה זו עונה על הצורך לעשות ‪ PCR‬ל‪ RNA-‬אבל ‪ RNA‬הוא חומר לא יציב ולא בודד מנגנון‬ ‫בינתים להרבות אותו (יש בוירוסים אתם מוזמנים לפתח‪....‬אבל כבר יש מנגנון)‪.‬אז לפני תגובת ה‪-‬‬ ‫‪ PCR‬עושים תגובה עם אנזים ממקור ויראלי בשם המתעתק לאחור ‪ reverse transcriptase‬האנזים‬ ‫המגניב הזה עושה תעתוק לחד גדיל של ‪ RNA‬ויוצר ממנו דו גדיל של ‪ DNA‬על מנת להדגיש שזה‬ ‫‪ DNA‬שהוא תוצר של תעתוק לאחור אנו מכנים אותו ‪cDNA‬זה חשוב גם לשים לב לכך‬ ‫בביואינפומטיקה‪ ,‬הרבה פעמים כתוב לכם שעשו רצף ל‪ cDNA-‬זה בעצם אומר שעשו רצף לגדיל‬ ‫משלים לזה של ה‪ mRNA-‬אתם לא צריכים לזכור את התגובה כולה אך הנה שקף ואז כמה דברים‬ ‫שצריך לזכור‪.‬‬  ‫‪39‬‬ ‫תיאור השיטה‪:‬‬ ‫‪.1‬בידוד ‪ mRNA‬מהרקמה‪.‬‬ ‫‪.2‬יצירת תחל )‪ (primer‬של ‪.poly T‬‬ ‫‪.3‬יצירת ‪ cDNA‬בעזרת האנזים ‪.)RT( Reverse Transcriptase‬‬ ‫‪.4‬עיכול ה‪ RNA‬בעזרת תמיסה של ‪.NaOH‬‬ ‫‪.5‬בעזרת ‪ DNA polimerase‬יוצרים ‪ DNA‬דו‪-‬גדילי‪.‬‬ ‫‪.6‬עיכול הלולאה בעזרת אנזים ‪.nuclease‬‬ ‫אז כמה דברים שצריך לזכור‬ ‫המתעתק לאחור מתנהג כמו ‪ DNA‬פולימראז ולכן דורש פריימר לפעולתו‪.‬מה שמשותף לכל תעתיקי‬ ‫ה‪ mRNA-‬בתא אאוקריוטי הוא שיש להם בקצה '‪ 3‬שלהם "זנב" של ‪ A‬באורך די גדול‪(.‬אתם בטח‬ ‫זוכרים מהעמודים הראשונים) אז זה מסתדר נהדר לעשות פרימר של ‪ Poly dT‬תסתכלו בתמונה‬ ‫להבנה‪.‬זה מה שחשוב להבין מהשלבים‪.‬‬ ‫מפה ואילך עושים תגובת ‪ PCR‬כמו שלמדנו‪.‬‬ ‫מה שנחמד זה שהכל ניתן לעשייה באותה מבחנה‪.‬מתחילים ב‪ 42OC -‬שזו הטמפרטורה‬ ‫האופטימלית של המתעתק לאחור‪.‬כמובן ש‪ Taq-‬לא חולם לעבוד בטמפ' זו‪ ,‬זה ממש קר לו‪...‬‬  ‫‪40‬‬ ‫ואז שמתחילים את תגובת ה‪ PCR-‬העליה בטמפ' תהרוס את המתעתק לאחור‪.‬אז פשוט שמים את‬ ‫החומרים לשתי התגובות במבחנה קטנטונת ומכניסים למכשיר ומתכנתים אותו ל‪ 42OC -‬בערך לחצי‬ ‫שעה ואז לשלושת תגובות ה‪ PCR-‬שעליהן כותבים לו לחזור כמה פעמים שנחפוץ‪.‬‬ ‫שימושי ה‪RT-PCR-‬‬ ‫השימושים של שיטה זו הם בעיקר אנליזה של ביטוי של ‪mRNA‬‬ ‫נזכור בכל תא מתאי הגוף שלנו יש פחות או יותר אותו רצף של ‪( DNA‬חוץ מתאי מין‪ ,‬קצת מוטציות‬ ‫סומטיות ותאי מערכת החיסון קצת) אז ‪ PCR‬רגיל אמור לתת תוצר דומה בכמות ובגודל בכל התאים‪,‬‬ ‫ההבדל בין תא לתא בגוף של רב תאיים הוא איזה ‪ mRNA‬מתועתק וכמה‪.‬אז כל השאלות כיצד‬ ‫משפיעה תרופה‪ ,‬מה ההבדל בין תאים‪ ,‬מה ההבדל בין תאים בשלבי התפתחות שונים ועוד ניתן‬ ‫לענות עם שיטה זו‪.‬‬ ‫שימו לב כל השאלות שניתן לשאול על הבדלים בין ‪ DNA‬ל‪ RNA-‬יכולות לבוא כאן‪.‬אינטרונים‬ ‫פרומוטרים רצפי בקרה יופיעו רק ב‪( DNA-‬כאשר הכל תקין כמובן)‪.‬רק תזכרו ש‪ mRNA-‬הוא לא רק‬ ‫נושא רצף מקודד לחלבון יש לו גם לפני קודון התחלת התרגום רצף הכרה לריבוזום ולאחר קודון‬ ‫הפסק רצף הכרה לאנזים פוליאדנילאט ציקלאז שמוסיף את כל זנב ה‪.A-‬‬ ‫עוד שימושים כמובן זה הגברת רצף לשיבוט ואז זה יהיה רצף שיהיה קל יותר לגרום לביטויו‬ ‫בחיידקים‪.‬‬ ‫וזיהוי של וירוסים שמטענם הגנטי הוא ‪.RNA‬ואם בוירוסים עסקינן בואו נראה כיצד התפתחה השיטה‬ ‫להיות מהירה יותר ויעילה יותר‬ ‫‪Real time PCR or Quantitative PCR‬‬ ‫אז ככה‬ ‫לבדוק תוצרי ‪ PCR‬ו‪ RT-PCR -‬זה על ידי הרצה בג'ל‪.‬אפשר לבדוק כמות על ידי עובי פס והשוואתו‬ ‫לתוצר של בקרה חיובית שכבר הזכרתי‪.‬מריצים במקביל זוג פריימרים לגן שחייב להיות בכל תא ותא‬ ‫או ‪ RNA‬של גן שיודעים שכמותו בכל תא אמורה להיות קבועה‪.‬‬ ‫כמו כן לוקח זמן להריץ תוצרים בג'ל‪.‬צריך להכין ג'ל (לא לכולם יש כסף לקנות אותו מוכן כמו‬ ‫בבלמונטה‪ )....‬לוקח זמן להריץ ואז לבדוק תוצרים‪.‬‬  ‫‪41‬‬ ‫כבר לפני היות הקורונה השתמשו בשיטות יותר מדויקות לבדיקות כמותיות של בעיקר ‪ RNA‬אבל‬ ‫לפתע פשטה בעולם מגפה שגרמה לצורך דחוף לבדוק מיליוני אנשים בזמן קצר לנוכחות של נגיף‬ ‫שהחומר הגנטי שלו הוא ‪.RNA‬עד אז היו בארץ מספר מעבדות קטן שהשתמשו בשיטות שתיכף נציג‬ ‫אך מאותה מגפה היתה עליה עצומה בדרישה לשיטות אלה (ולזום)‪.‬‬ ‫אל תתבלבלו בראשי תיבות קוראים לזה ‪ qPCR‬על מנת לא לבלבל עם ‪ RT-PCR‬הישן והטוב‪.‬‬ ‫אז איך ניתן לכמת במדויק ובזמן אמיתי (לפי שם השיטה) את כמות ה‪.RNA-‬‬ ‫התשובה מוצאים שיטה שכל יצירה של תוצר במעגלי ה‪ PCR-‬תיצור זהירה פלואסצנטית אותה קל‬ ‫למדוד במכשירים שקוראים קרינה שהם מאד רגישים‪.‬אז יצרו מכשיר שגם עושה ‪ PCR‬גם קורא את‬ ‫הקרינה הנוצרת וגם יוצר גרפים‪(.‬אם יום אחד מישהו מכם יצליח מאד הוא מוזמן לתרום כזה‬ ‫למעבדה שלנו‪ -‬רק אומרת)‪.‬‬ ‫אז על מנת לעשות שהזריחה הפלואורסצנטית לא תהיה כמו זו של אתידיום ברומיד שנקשר לכל גדיל‬ ‫של נאוקלאוטידים מצאו שתי שיטות‪.‬‬ ‫‪ - Syber green.1‬זהו חומר שנקשר רק ל‪ DNA -‬דו גדילי ולא ל‪ DNA-‬חד גדילי כאשר הוא‬ ‫נקשר הוא מתחיל לזהור‪.‬אז מכניסים אותו לתגובת ‪ PCR‬או ‪. RT-PCR‬נזכיר שב‪PCR-‬‬ ‫בתחילת התגובה רק התבנית שנמצאת בכמות קטנטונת היא חד גדילית וב‪ RT-PCR-‬נוצר‬ ‫בהתחלה ‪ cDNA‬אך גם בכמות קטנה יחסית להגברה‪.‬הפריימרים הם חד גדיליים‪.‬כך בכל‬ ‫מחזור הגברה נוצר יותר ‪ DNA‬דו גדילי והחומר סייבר גרין נכנס אליו ואז מתחיל לזהור‪ ,‬ניתן‬ ‫לעקוב אחר הזהירה במכשיר ‪ PCR‬שגם עושה תגובה וגם קורא זהירה‪.‬‬ ‫סרטון שמסביר ‪https://www.youtube.com/watch?v=GCzH2Wcvd8E‬‬ ‫עוד תמונה שממחישה‬  ‫‪42‬‬ ‫הבעיה היא שב‪ PCR-‬כפי שאתם זוכרים בודאי‪ ,‬יש תמיד תוצרים לא ספציפים‪ ,‬על הג'ל רואים זאת‬ ‫בבירור וניתן לזהות מה התוצר הרצוי אם ידוע גודלו וגם כמובן להעריך כמה תוצרים בלתי ספציפים‬ ‫היו לפי כמות הפסים בגודל שונה‪.‬אך כאן רואים רק זהירה מעל רקע‪.‬אז אם רוצים להכניס בן אדם‬ ‫לסגר צריך משהו יותר ספציפי‪.‬‬ ‫‪ – Taq- man.2‬גם בשיטה זו תגדל הזהירה עם התקדמות התגובה אבל כאן זה ספציפי‪.‬‬ ‫הכיצד? יוצרים בנוסף לפריימרים שהם ספציפים לשולי האזור שנועד להגברה‪ ,‬גם עוד‬ ‫אוליקונאוקלאוטיד (רצף קצר של ‪ )DNA‬הספציפי לאזור בתוך האזור שנועד להגברה‪.‬לרצף‬ ‫הזה מוסיפים שתי מולקולות כימיות מולקולה אחת היא בעלת יכולת לזרוח פלוארסצנטית‬ ‫ומולקולה שניה מעכבת את הזהירה (שמה ‪.) quencher‬כאשר המולקולה הזו עוברת‬ ‫היברידיציה עם האזור המתאים לה היא מפריעה ל‪ taq-‬לעשות את פעולת הפולימריזציה‬ ‫והוא מפרק אותה‪.‬זה יגרום לזהירה כי עכשיו המולקולה הזורחת תתרחק מה‪. quencher-‬‬  ‫‪43‬‬ ‫היתרונות של שיטה זו הן ספציפיות רק אם מוגבר התוצר שאנו מכוונים אליו יתפרק הגלאי הפנימי‬ ‫הטק מן ונקבל פלואוסצנציה‪.‬אבל זה יקר כי צריך להכין טקמן ספציפי לתגובה‪.‬‬ ‫בשתי השיטות האבחון הופך לכמותי בשל המדידה המדויקת של ההארה המתקבלת‪.‬‬ ‫היות שתמיד בשיטות כאלה יש קצת רקע אז קובעים הארה מעל רקע מסוים שעליו מחליטים‪.‬‬ ‫והכלל פשוט ככל שכמות ה‪ DNA-‬ההתחלתית קטנה יותר כך צריך יותר מחזורי ‪ PCR‬על מנת‬ ‫לקבל הארה מעל הרקע‪.‬‬ ‫זה לעיתים מבלבל כי זה יחס הפוך אבל תתרכזו בשאלות האלה‪.‬‬ ‫מספר המחזורים שבהם מתקבל סיגנל מעל הרקע ‪threshold cycle no Ct‬‬ ‫אז ניתן לעשות עקום כיול שכולנו מכירים ואוהבים מהמעבדה‪.‬אפשר להריץ במקביל (יש לרוב ‪96‬‬ ‫מקומות במכשיר ‪ PCR‬סטנדרטי) כמויות ידועות התחלתיות של ‪ DNA‬ולראות כמה מחזורים צריך על‬ ‫מנת לקבל הארה‪.‬אז‪ ,‬בדוגמא של הניסוי נדע לפי מספר מחזורי ה‪ PCR-‬שנתנו אות מעל הרקע‪ ,‬מהי‬ ‫הכמות ההתחלתית‪.‬‬  ‫‪44‬‬ ‫בתמונה למעלה אתם רואים איך עשו עקום כיול‪.‬משמאל רוא?