Diagnóstico Genético Preimplantacional PDF

Comisión 19 03/12/2024 Comisionista 1: Yael Rodríguez Frías Corrector: Marcos David Cabrera Reyes Comisionista 2: Eduardo Gándara Martín Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo...

Comisión 19 03/12/2024 Comisionista 1: Yael Rodríguez Frías Corrector: Marcos David Cabrera Reyes Comisionista 2: Eduardo Gándara Martín Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz (Continuación tema 7: DIAGNÓSTICO CITOGENÉTICO Y MOLECULAR) Diagnóstico genético preimplantacional En caso de sospecha o riesgo de tener descendencia con alguna patología se llevan a cabo técnicas de diagnóstico genético preimplantacional. Están relacionadas con la fecundación in vitro. Hay dos aproximaciones: Tras realizar la fecundación in vitro, tres días después se ha formado una masa de entre 8 a 16 células de la que se toma una única célula, llamada blastómero. La otra opción es esperar 5 o 6 días, lo que implica un desarrollo un poco más avanzado, y de un número mayor de células (mínimo 5 células) se extrae ADN para llevar a cabo un estudio genético. La ventaja de la primera opción es que es más rápida, sin embargo, al coger solamente un blastómero puede que no se detecte la variante alterada. Se emplea principalmente la PCR, dirigida a variantes concretas o con sospecha de aneuploidía, FISH o emplear microarrays. Las personas que se pueden beneficiar de estas técnicas pueden ser: - parejas cuya descendencia tiene riesgo de presentar alguna enfermedad genética - parejas estériles - un recién nacido como donante de médula para un hermano mayor afectado Cabe mencionar que la técnica en sí de fecundación in vitro puede conllevar un riesgo mayor a lo esperado comparado con la fecundación natural. Esto se debe a que puede afectar los patrones de metilación del ADN, que se encarga de regular la expresión génica. Este es el caso de enfermedades como el síndrome de Angelman, de herencia materna o síndrome de Prader-Willi, de herencia paterna (por una alteración en una región del cromosoma 15 los dos). 1 Comisión 19 03/12/2024 Comisionista 1: Yael Rodríguez Frías Corrector: Marcos David Cabrera Reyes Comisionista 2: Eduardo Gándara Martín Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz Ejemplos de diagnóstico genético preimplantacional (Las que están en negrita son las más frecuentes en la población) Ligada al X: solo determinación del sexo. Con una única célula no es posible realizar un genotipado completamente preciso, pero sí nos da la combinación de alelos de los cromosomas sexuales. Cuando nos es posible analizar una variante concreta podemos elegir qué embriones son XX o cuáles XY. Esto puede ser útil si tenemos sospecha de que algún descendiente puede padecer una patología ligada al cromosoma X recesivo (se elegiría XX si el padre es sano) o si es dominante (se elegiría XY si el padre es el afectado). Enfermedades ligadas al genoma mitocondrial: es de vía materna. Se puede emplear la micromanipulación para fecundación in vitro triparental ( aprobado en Reino Unido). Si una mujer con patología por variantes mitocondriales decide tener descendencia con su pareja, mediante micromanipulación sacamos el núcleo del óvulo de la mujer donante e incorporamos el núcleo del óvulo de la mujer que desea tener descendencia, quedándose así con las mitocondrias sin variantes de la mujer donante. Indicaciones para realizar pruebas genéticas (El profesor no lo comentó pero sale en la presentación del aula virtual) - Para individuos asintomáticos: cribado de portadores heterocigotos. - Para mujeres embarazadas y nenonatos: cribado/diagnóstico pre- o post-natal. - Para individuos con alguna enfermedad: diagnóstico sintomático. Por lo que se utiliza cribado para la población sana y diagnóstico para los pacientes. 2 Comisión 19 03/12/2024 Comisionista 1: Yael Rodríguez Frías Corrector: Marcos David Cabrera Reyes Comisionista 2: Eduardo Gándara Martín Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz Diagnóstico sintomático basado en el genoma Búsqueda de la razón de la enfermedad mediante técnicas genéticas. Se realiza a partir de sangre periférica para detectar variación genética en línea germinal, o si queremos detectar variantes en un conjunto de células concreto en línea somática. Utilizamos biopsias, o, mediante cribados para pacientes oncológicos, denominadas biopsias líquidas. Estas técnicas, no solamente son útiles para diagnóstico sino para cualquier otro aspecto ya visto en clase, así como para la farmacogenética. Por ejemplo: Secuenciación de ADN para ver variantes genéticas en un ADN libre circulante a partir de un tumor para poder guiar la terapia. - Secuenciación dirigida: se puede plantear si hay antecedentes en la familia. No se secuencia el genoma completo ya que buscamos posibles variantes del individuo que haya podido heredar por lo que nos dirigimos concretamente a un gen en específico. Se hace mediante diseño de cebadores que permitan identificarlo. - Secuenciación de exoma: Versión ampliada de la secuenciación anterior en la que se puede ampliar por PCR todos los expones de los genes codificantes de proteínas del genoma. - Secuenciación del genoma completo. Estas técnicas no se aplican siempre, ya que suponen un gran coste y requiere personal cualificado. En el caso de enfermedades genéticas, como por ejemplo, ¿qué proceso se lleva a cabo si una mujer tiene sida? Para ello en la Candelaria se encuentra un secuenciador masivo de ADN que permite vigilar el virus. Es importante hacer un seguimiento en tiempo real de cómo va variando la secuencia de los genomas del virus que está causando el problema. En función del seguimiento sabemos si el virus es más patogénico o más invasivo, y así saber qué terapia usar y cuál funciona de forma más eficaz. Y, para que una mujer pueda tener un hijo, ¿se puede seleccionar aquellos óvulos que no afecten a la descendencia? Sí, con las herramientas ya mencionadas se podría llevar a cabo. 3 Comisión 19 03/12/2024 Comisionista 1: Yael Rodríguez Frías Corrector: Marcos David Cabrera Reyes Comisionista 2: Eduardo Gándara Martín Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz Secuenciación dirigida ¿Y por qué están seleccionados en este panel? Porque se ha visto previamente que para las variantes genéticas que respecta a estos genes están relacionados con cada uno. De esta manera, se trata de un panel de secuenciación masiva dirigida a genes que están relacionados con diferentes tipos de cáncer. Se pone de ejemplo tres de ellos (KRAS, BRAF y EGFR), que suelen estar vinculados con un montón de tipos de cánceres diferentes, pero hay otros 47 en ese panel. El profesor procede a citar algunos genes de dicha tabla: ALK → inversión de genes que ocurre en pacientes con cáncer de pulmón concreto, en el cromosoma dos del individuo, se aprecia como un bloque se invierte y se genera un gen de fusión. TP53 → “vigilante del genoma”. FGFR3 → se ha visto que también tiene que ver con algún problema oncológico. 4 Comisión 19 03/12/2024 Comisionista 1: Yael Rodríguez Frías Corrector: Marcos David Cabrera Reyes Comisionista 2: Eduardo Gándara Martín Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz ¿Qué ocurriría si en lugar de una pareja de cebadores se ponen dos parejas con un diseño racional? En el momento en el que se amplifique, se van a amplificar dos regiones diferentes del genoma ¿qué pasaría si se ponen tres parejas? En ese caso, serán tres regiones. ¿Qué pasa si se desea amplificar 207 regiones diferentes del genoma en un solo tubo de PCR? ¿Cuántos cebadores harían falta para 207 amplicones o regiones a amplificar? El doble, por tanto en ese tubo se tiene que poner físicamente una mezcla de más de 400 cebadores, que permitan amplificar la región concreta del genoma que representa los exones de estos 50 genes. No son 50 porque no se está amplificando todo el gen completo, sino los exones de esos 50 genes. Es preciso saber por las prácticas informáticas, que cada gen tiene un número de exones diferentes (el promedio es de 7 en todo el genoma), pero hay genes muy pequeños o muy grandes con pocos o muchos exones. Ejemplo: ¿Cuántos exones tiene el gen ABL1? 12, pues diseño cebadores para amplificar esos 12 exones, ¿el siguiente, ALK? 29, diseño cebadores para esos 29 exones, mezclo todo y se amplifica en un sólo tubo de reacción de PCR. 5 Comisión 19 03/12/2024 Comisionista 1: Yael Rodríguez Frías Corrector: Marcos David Cabrera Reyes Comisionista 2: Eduardo Gándara Martín Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz El caso es que no se dirige a una región concreta, sino a muchas regiones. Una vez amplificado, se modifican esas moléculas para añadir adaptadores de secuenciación y a posteriori son llevadas a una plataforma de secuenciación masiva, de manera que se leen cada una de los exones muchas veces para tener alta resolución de lectura. Dependiendo de la plataforma de secuenciación utilizada, se podrá secuenciar este panel de exones de estos 50 genes. No sólo para un individuo, sino que se pueden combinar diferentes individuos en el mismo canal de secuenciación para abaratar costes. Ejemplo: Un servicio de oncología, no tiene un paciente, sino que tiene un montón de pacientes. Entonces, puedo coger ADN de todos esos pacientes y aplicar este panel mediante indexado a nivel molecular, en secuencia con una plataforma de Ilumina que te dice que podemos hacer 96 combinaciones de índices (dobles además). ¿Esto qué quiere decir? A la hora de preparar la librería de secuenciación, amplifico estos 207 productos de PCR para cada ADN de cada individuo que quiero estudiar y pego los adaptadores para secuenciar en la plataforma, a cada uno de estos adaptadores irán pegados una secuencia adicional con 8 nucleótidos (suficiente). El paciente 1 tiene el índice “ACGTGTGT” (inventado) y el paciente 2 tiene otra combinación “CTGATGTG”, en primera instancia de la secuenciación el equipo va a leer ese índice que se ha puesto de manera racional (parecido a un apellido o DNI), por tanto todas las moléculas que hemos amplificado del paciente 1 tendrán en un extremo una secuencia artificial cuya consecución de base conozco y ponemos nosotros a la carta. De esta manera, en el momento en que el secuenciador lea esa secuencia me la “introduce” en la carpeta 1 (paciente 1) y las moléculas que se están leyendo en el clúster de al lado tiene otra secuencia para el paciente 3, 8, 7 o cualesquiera. Lo que ocurre es que se lo pongo todo junto, pero en las lecturas al principio pasan por una secuencia que es un índice, que dictamina que cierta molécula de ADN viene de X paciente, así reducimos costes y tenemos más información. La clave es tener un mínimo de lectura por muestra, sobre todo para detectar variantes que sean poco frecuentes en una biopsia o depende del tipo de muestra que estemos procesando (sangre periférica). En este caso podemos apreciar un 500x, refiriéndose a la cantidad de veces que se lee la misma posición en el genoma, me da más fiabilidad y seguridad. Secuenciación de exomas En el caso del exoma, el objetivo no es ir a un panel de 50 genes, sino que quiero todos los genes (20.000) ¿cómo lo podemos hacer? De diferentes maneras, pero una de las estrategias es la misma utilizada anteriormente, sabiendo el genoma humano puedo dirigir cebadores en pareja a todos los exones de todos los genes del genoma que codifican proteínas. En este contexto, con unos pocos tubos de PCR podemos amplificar todo el exoma de un individuo, y de promedio el número de amplicones de regiones está en torno a 20.000, porque se encuentran presentes 40.000 cebadores dentro de esa mezcla de PCR (es posible amplificar cada exón de cada uno de los genes codificantes). 6 Comisión 19 03/12/2024 Comisionista 1: Yael Rodríguez Frías Corrector: Marcos David Cabrera Reyes Comisionista 2: Eduardo Gándara Martín Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz ¿Qué hacemos con esa información? Tendríamos la secuencia completa de todos los exones, comparamos con un genoma de referencia y buscamos en que exones hay variantes patogénicas. Ejemplo: Somos el servicio de nefrología y tenemos 307 pacientes con sintomatología (problema a nivel renal), pero no podemos dar un diagnóstico claro al paciente porque no sabemos a nivel genético/molecular que está ocurriendo. En un artículo que se ha publicado en la revista New England of Medicine (alto impacto en el mundo de la medicina), se aplica una secuenciación del exoma completo a los 307 pacientes con sintomatología renal y apreciamos donde caen variantes patogénicas en todos esos exomes de los genes que hemos secuenciado. Enfermedad poliquística autosómica dominante debido a mutaciones en PKD1 o PKD2. Glomerulopatía debida a mutaciones en COL4A3, COL4A4 o COL4A5. Enfermedad tubulointersticial asociada a UMOD. A partir de ahí, dependiendo de qué variante estemos identificando y en qué gen, podríamos realizar el diagnóstico y plantear terapias más dirigidas. De esta manera, haciendo la procesión de ADN, podemos afinar el diagnóstico a nivel molecular y validar que no todos los pacientes que a priori pueden tener una sintomatología similar o compartida, tienen variantes en el mismo gen (principio de unicidad). Secuenciación de genomas completos ¿Cuándo se aplican estas técnicas de secuenciación de genomas completos? Situaciones dónde después de llevar a cabo diferentes tipos de aproximaciones, no se ha sido capaz de detectar variantes que den pistas acerca de por qué el individuo tiene una patología concreta, ni siquiera con secuenciación de exomas. Entonces, en el exoma mostrado en la diapositiva anterior de la presentación del profesor, se representa un porcentaje pequeño del genoma (2%) que está representado por los exones de los genes que codifican proteínas ¿Qué pasa con el 98% restante del genoma? En el hipotético caso de hacer secuenciación del exoma no se estaría explorando, por ello es necesario que se realice una secuenciación del genoma completo. Así mismo, puede que hayan variantes que no caigan en los exones, sino en las regiones reguladoras o desconocidas hasta la fecha, siendo ese paciente la causa del problema. 7 Comisión 19 03/12/2024 Comisionista 1: Yael Rodríguez Frías Corrector: Marcos David Cabrera Reyes Comisionista 2: Eduardo Gándara Martín Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz El planteamiento con la secuenciación del genoma completo es que la ventana no solamente se extienda a los exones de los genes, sino a todos los intrones, proteínas promotoras y cualquier región del genoma en la que puedan haber variantes que informen de “algo raro”. Incluso, a nivel mitocondrial y de cromosomas sexuales porque se tiene al alcance todos los datos. De igual manera, analizar estos datos es complicado porque precisa de un montón de información, pero nos da la posibilidad de encontrar variantes nuevas que no se han identificado anteriormente. La profundidad de lectura mínima que se recomienda para la secuenciación del genoma completo es de 30x, es decir, 30 veces cada posición del genoma. Por otro lado, la desventaja de aplicar esta técnica al día de hoy, que se espera que a medida que transcurra el tiempo se vaya reduciendo, está en encontrar una variante nueva que anteriormente no se había observado en un individuo y de la que no hay información en la base de datos. La mayoría de variantes que se detectan en esta clase de secuenciación, no sabemos qué impacto tienen en el genoma y por tanto a nivel clínico no se puede hacer nada. En su caso, el profesor insiste en la importancia de financiar en la ciencia para poder investigar. Ejemplo: Enfermedad neurológica rara por acumulación de hierro en tejido cerebral, causada por mutación de novo en el gen WDR45 (https://www.youtube.com/watch?v=CB5FeAdd7sk). Básicamente, Sofía era una niña que padecía de una mutación de novo implicada en el metabolismo de hierro a nivel del vestido neuronal, pese a que sus padres no tenían ninguna patología. ¿Existe una cura para esta enfermedad? No, son casos muy raros en todo el planeta. De hecho, Sofía es la primera a la que han detectado variantes en ese gen, de modo que permite colaborar que en los siguientes casos con una sintomatología similar se pueda relacionar con dicha variante. ¿Qué beneficio tiene saber el diagnóstico? Alivio en cierto modo para la familia, después de estar muchos años intentando saber la causa del problema e incluso llegando a consultar diferentes especialistas médicos, por fin saber un diagnóstico y realizar un seguimiento a largo del tiempo con el fin de si es necesario tratarla (enfermedad incurable) mediante estímulos para aliviar la sintomatología. Existen muchos genes para los cuales se desconoce su función y cuál es su relación con el metabolismo, patología o estado de salud. La clave está en la secuenciación de un genoma completo, pues antes de tener herramientas que permitieran realizar dicha técnica, se accedía a la literatura para buscar qué genes estaban asociados, siendo en algunos casos indescriptible. Concretamente en 2016, el programa de Ilumina de secuenciación de genomas experimental, se interesaron en el tema y realizaron la secuenciación del genoma de Sofía. A día de hoy, es posible tener un análisis más o menos básico de nuestros datos de manera muy asequible. 8 Comisión 19 03/12/2024 Comisionista 1: Yael Rodríguez Frías Corrector: Marcos David Cabrera Reyes Comisionista 2: Eduardo Gándara Martín Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz PREGUNTAS COMI X 1. Indique cuál de las siguientes afirmaciones es cierta en relación al cribado de portadores: a. Todas son correctas. b. Consiste en la búsqueda de variantes genéticas patogénicas en individuos de la población que pueden transmitir enfermedades mendelianas a los descendientes. c. Ninguna es correcta. d. Los portadores son sanos, pero muestran un riesgo reducido (25% o menor) de tener hijos con un trastorno autosómico recesivo o ligado al cromosoma X grave. e. La frecuencia de individuos portadores es homogénea, razón por la que la incidencia de neonatos afectados es comparable entre diferentes grupos de población. 2. Indique cuál de las siguientes afirmaciones es cierta en relación al diagnóstico sintomático basado en herramientas genómicas: a. Independientemente del tipo de mutaciones a detectar (somáticas vs línea germinal), se debe garantizar la misma cobertura de secuenciación. b. Se pueden dirigir a regiones concretas del genoma (whole-exome sequencing, WES) pero también a todos los genes del genoma (targeted sequencing). c. La aplicación de esta tecnología supone costes elevados aunque no requiere de personal cualificado. d. Existen estrategias para analizar múltiples muestras (p. ej. varios pacientes) de manera simultánea. e. Permiten identificar variantes de interés por secuenciación masiva de ADN, sólo a partir de muestras obtenidas mediante métodos no invasivo. 3. En relación a las técnicas de diagnóstico sintomático, cuál o cuáles de las siguientes afirmaciones son correctas: a. Se debe de garantizar la misma cobertura de secuenciación independiente del tipo de mutación que se quiera detectar. b. La aplicación de esta tecnología supone costes elevados pero no de personal cualificado. c. Existen estrategias para analizar múltiples muestras de manera simultánea. d. Permiten identificar variantes de interés por secuenciación masiva de ADN, sólo a partir de muestras obtenidas con métodos invasivos. e. Se pueden dirigir a regiones concretas del genoma (targed sequencing) o a regiones más amplias (WES o WGS). 9 Comisión 19 03/12/2024 Comisionista 1: Yael Rodríguez Frías Corrector: Marcos David Cabrera Reyes Comisionista 2: Eduardo Gándara Martín Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz 4. Indique cuál o cuáles de las siguientes afirmaciones son ciertas en relación a las técnicas de detección de variación genética en humanos: a. La PCR en tiempo real implica la utilización de los mismos componentes de mezcla de reacción que una PCR convencional, pero además han de añadirse didesoxirribonucleótidos trifosfato marcados con fluoróforos. b. La secuenciación de ADN de tercera generación es una técnica basada en el proceso de síntesis de ADN que permite obtener lecturas de hasta 350 pb de longitud. c. El análisis por hibridación in situ inmunofluorescente(FISH) se basa en el uso de sondas que hibridan con ADN genómico que ha sido marcado previamente con moléculas fluorescentes. d. Todas son ciertas e. En los arrays de genotipado se detectan simultáneamente una gran cantidad de SNPs (desde miles a unos pocos millones). 5. El diagnóstico sintomático de enfermedades humanas puede beneficiarse del uso de herramientas genómicas. Seleccione las respuestas correctas: a. Existen estrategias para analizar múltiples muestras (p. ej. sangre y saliva) pero de un solo paciente en cada carrera de secuenciación. b. Permiten identificar variantes de interés solo a partir de muestras obtenidas mediante métodos invasivos. c. La aplicación de esta tecnología supone costes reducidos pero requiere de personal cualificado. d. Se debe garantizar una cobertura mínima de secuenciación dependiendo, por ejemplo, del tipo de mutaciones a detectar (somáticas vs línea germinal). e. Se pueden dirigir a regiones concretas del genoma (conocido como WGS, del inglés whole-genome sequencing) o al genoma completo (WES, whole-exome sequencing). f. 6. El diagnóstico sintomático de enfermedades humanas puede beneficiarse del uso de herramientas genómicas. Seleccione las respuestas correctas: a. Existen estrategias para analizar múltiples muestras (p. ej. sangre y saliva) pero de un solo paciente en cada carrera de secuenciación. b. Permiten identificar variantes de interés solo a partir de muestras obtenidas mediante métodos invasivos. c. La aplicación de esta tecnología supone costes reducidos pero requiere de personal cualificado. d. Se debe garantizar una cobertura mínima de secuenciación dependiendo, por ejemplo, del tipo de mutaciones a detectar (somáticas vs línea germinal). e. Se pueden dirigir a regiones concretas del genoma (conocido como WGS, del inglés whole-genome sequencing) o al genoma completo (WES, whole-exome sequencing). Respuestas: 1.D, 2.D, 3. C y E, 4. E, 5. D, 6. D. 10